Descripción: Se estudiaron los mecanismos antioxidantes y antihipertensivos del flavanol (?)-epicatequina, abundante en la dieta humana.In vitro se demostró que la capacidad de (?)-epicatequina atrapando radical alcoxilo y anión superóxido (mecanismo antioxidante directo)es alta, pero poco relevante comparadacon la deotroscompuestos a las concentraciones habituales en los tejidos. La (?)-epicatequina ejerció un efecto vasodilatador en aorta aislada, pero no significativo a la concentración que el compuesto alcanza en sangre. In vivo, en modelos experimentales de incremento de presión arterial en ratas por administración de L-NAME o por sobrecarga de fructosa, la (?)-epicatequina previno el aumento en presión arterial producido por los tratamientosa través del restablecimiento de la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO)en aorta a valores controles asociado a: i) mayor actividad de NOsintasa, sin modificación en expresión de NO sintasa endotelial (con mayor fosforilación de Ser1177 y normalización de caveolina-1, en el modelo de fructosa) y ii) prevención del estrés oxidativo mediado por NADPH-oxidasa, regulando la expresión de p47phox (y de p22phox en el modelo de fructosa). Se concluye que la acción antihipertensiva de la (?)-epicatequina no involucra, al menos exclusivamente, mecanismos antioxidantes directos sino un conjunto de mecanismos antioxidantes indirectos.

Descripción: En los últimos años, ha cobrado importancia el estudio de los contaminantes ambientales en relación al desarrollo de cáncer, en especial para el cáncer de mama, debido a que muchos de los plaguicidas de uso corriente pueden actuar como disruptores endócrinos (DEs), afectando la fisiología de la glándula mamaria. En este trabajo, demostramos que bajas concentraciones del plaguicida organofosforado clorpirifos (CPF) inducen la proliferación de la línea celular MCF-7 en forma dependiente del RE?, mientras que, concentraciones mayores, conducen a una disminución de la capacidad clonogénica celular mediada por un incremento en los niveles de ERO y la fosforilación de la proteína ERK1/2. Asimismo, el CPF modificó la histología de la glándula mamaria de rata conduciendo a la aparición de lesiones proliferativas como la adenosis y la hiperplasia ductal, afectó el sistema endócrino modificando los niveles circulantes de las hormonas esteroideas e hipofisarias y alterando la esteroidogénesis ovárica. Finalmente, evidenciamos un efecto estimulante del CPF sobre la carcinogénesis mamaria mediante estudios en un modelo experimental en rata. Nuestros resultados aportan nueva información acerca de los mecanismos de acción del plaguicida CPF en las células mamarias. Además de interferir con el metabolismo redox, el CPF regula la activación de diferentes vías de señalización, desregula el sistema endócrino, modifica la histología del tejido mamario y afecta la carcinogénesis en este tejido.

Descripción: Biomphalaria tenagophila (d´Orbigny, 1835), es un vector de la esquistosomiasis mansónica en América del Sur. Argentina no presenta casos autóctonos de esquistosomiasis, pero la Provincia de Misiones, que limita con los Estados Brasileños de Paraná, Santa Catarina y Río Grande si poseen; además, tiene el clima favorable, las condiciones socio-económicas y la presencia de Biomphalaria tenagophila que pueden favorecer la propagación de la enfermedad. La esquistosomiasis se controlar por métodos quimioterapéuticos pero presentan inconvenientes tales como elevados costos y no evita la reinfección. La OMS prioriza el empleo de molusquicidas de origen vegetal para su control por el bajo costo y biodegradabilidad. Lemma, A. 1970 comprobó la propiedad molusquicida de Phytolacca dodecandra L?Herit sobre Biomphalaria pfeifferi ruppellii (Dunker). Como no se conoce el efecto molusquicida de Phytolacca dioica L sobre Biomphalaria tenagophila; se resolvió investigar dicha propiedad siguiendo a Lemma 1970 y WHO 1961 para los órganos crudos y decocciones, determinándose el LD50 y LD90 en los distintos estadio de su ciclo vital. Como resultado se pudo determinar que los cocimientos de hojas, frutos y flores tienes efecto molusquicida sobre Biomphalaria tenagophila. Así, se contaría con un medio adecuado para controlar el avance de la enfermedad.

Descripción: La enfermedad de Chagas, la leishmaniasis y el cáncer son tres patologías que afectan a millones de personas causando una gran carga ecónomico-sanitaria en relación a su morbi-mortalidad. Las diferentes quimioterapias disponibles para su tratamiento comparten muchos inconvenientes y es por ello que se necesitan nuevas drogas. Los productos naturales han sido una fuente productiva de moléculas líderes para el desarrollo de fármacos, en especial, aquellos metabolitos secundarios provenientes del reino vegetal. El objetivo del presente trabajo fue obtener compuestos bioactivos frente a Trypanosoma cruzi, Leishmania mexicana y células tumorales a partir de especies vegetales que crecen en nuestro país. La selección de las plantas se llevó a cabo según un criterio quimiotaxónomico. Se eligieron tres especies vegetales de la familia Asteraceae (Smallanthus sonchifolius, Vernonia rubricaulis y Vernonia scorpioides) por su composición fitoquímica, principalmente lactonas sesquiterpénicas (SLs). A partir del material vegetal se obtuvieron diferentes extractos acuosos y orgánicos y se evaluó su actividad tripanocida in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi. A partir de los extractos orgánicos, que resultaron más activos (inhibición del crecimiento mayor al 75% a 100 ?g/ml), se llevaron a cabo sendos fraccionamientos guiados por bioensayo de actividad anti-T. cruzi. De los extractos orgánicos obtenidos a partir de V. rubricaulis y V. scorpioides se identificaron las fracciones y subfracciones más activas in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi y se caracterizó su composición por técnicas cromatográficas. El fraccionamiento guiado por bioensayo del extracto orgánico obtenido a partir de las hojas de S. sonchifolius (clon LIEY 97-2) permitió identificar las fracciones más activas in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi. A partir de ellas se aislaron 5 compuestos (1 - 5) con una pureza mayor al 90% que fue determinada por cromatografía instrumental. Los compuestos aislados (1 ? 5) fueron identificados por técnicas espectroscópicas como las SLs uvedalina (1), polimatina B (2), enhidrina (3), sonchifolina (4), que son metabolitos conocidos de S. sonchifolius. La SL 5 fue identificada como 8?-angeloiloxi-9?-hidroxi-14-oxo-acantospermólido, la cual no ha sido previamente aislada de fuentes naturales y por lo tanto se trata de un nuevo compuesto identificado por primera vez en la naturaleza. A partir de S. sonchifolius (clon LIEY 97-1) mediante un aislamiento dirigido se aisló otra SL conocida como fluctuanina (6). Todas estas lactonas pertenecen al grupo de los germacranólidos del tipo melampólido. Con el objetivo de aislar mayor cantidad de fluctuanina (6) se purificó por medio de técnicas cromatográficas una mezcla semipurificada de lactonas obtenida de Smallanthus connatus. Así, además de fluctuanina (6) se obtuvieron la mezcla ? compuesta por fluctuanina (6) y su derivado 2-metilbutirato; y la mezcla ? compuesta por fluctuanina (6), uvedalina (1) y otra SL que no pudo ser identificada aún. Se determinó la actividad in vitro de los compuestos puros así como de las mezclas ? y ? sobre T. cruzi. Los ensayos sobre la forma epimastigote (cepa RA) mostraron que uvedalina, polimatina B, enhidrina, sonchifolina y fluctuanina son activos frente a este estadio con valores de concentración inhibitoria 50% (CI50) menores a 8 ?M. Las mezclas ? y ? también son activas frente a epimastigotes de T. cruzi de esta misma cepa (CI50 < 0,25 ?g/ml). Por otra parte, uvedalina, polimatina B y enhidrina mostraron ser activas frente a otra cepa (Dm28c) con CI50 menores a 1,5 ?M. Uvedalina y enhidrina fueron menos activas frente a tripomastigotes de T. cruzi que frente a los epimastigotes (CI50 = 25,0 ?M y 33,4 ?M, respectivamente) y polimatina B no mostró actividad a las concentraciones y condiciones ensayadas. Sin embargo, las SLs uvedalina, polimatina B, enhidrina y fluctuanina resultaron activas sobre la forma intracelular del parásito con CI50 < 10 ?M. Las mezclas ? y ? fueron también activas (CI50 < 0,8 ?g/ml). La citotoxicidad de estos compuestos se evaluó frente a células de mamífero (Vero y células mononucleares de sangre periférica) y se observó que las lactonas 1 ? 6 presentan selectividad hacia los parásitos (concentraciones citotóxicas 50% > 20 ?M). De acuerdo a estos resultados, se evaluó la actividad in vivo, en un modelo murino agudo de enfermedad de Chagas, de los compuestos más activos in vitro: uvedalina y enhidrina. Se observó que los ratones tratados mostraron mejorías respectos al grupo control de manera similar a los ratones tratados con benznidazol. Se determinó también la toxicidad hepática de estos compuestos en un modelo murino. Asimismo se determinó el efecto in vitro de uvedalina, polimatina B y enhidrina sobre L. mexicana. Las tres lactonas fueron activas frente a la forma promastigote (CI50 < 1,1 ?M) mientras que uvedalina y enhidrina inhibieron también el crecimiento de la forma amastigote (CI50 < 4 ?M). Por medio de microscopia electrónica de transmisión se analizó el efecto de uvedalina, polimatina B y enhidrina sobre la utraestructura de T. cruzi y L. mexicana, observándose marcadas alteraciones en ambos parásitos incluyendo hinchamiento mitocondrial, y formación de vesículas multilamelares. El efecto citotóxico de las SLs 1 ? 6 se evaluó in vitro sobre tres líneas celulares tumorales pancreáticas y leucémicas. Todas las lactonas mostraron actividad siendo polimatina B y fluctuanina las más activas (CI50 = 0,6 ? 4,4 ?M). Se estudiaron los posibles mecanismos de acción de polimatina B sobre las líneas celulares observándose que el mecanismo de muerte celular es céluladependiente, y que se ve involucrado más de un tipo de muerte celular. Los resultados obtenidos muestran que las lactonas sesquiterpénicas aisladas de S. sonchifolius poseen potencial como moléculas líderes para el desarrollo de fármacos con actividad antiparasitaria y antitumoral.

Descripción: La búsqueda de nuevos antivirales es una necesidad actual y constante. Una estrategia para la identificación de nuevos compuestos bioactivos es el estudio de los metabolitos secundarios presentes en la flora mundial. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antiviral en diferentes plantas medicinales argentinas frente a diversos virus de interés clínico, como ser poliovirus y herpes simplex virus. Para ello, se realizó un screening de actividad antiviral en dos extractos diferentes, un extracto orgánico (EO) y un extracto acuoso (EA), de siete especies argentinas de la familia Asteraceae: Baccharis gaudichaudiana, B. spicata, Bidens subalternans, Eupatorium buniifolium, Pluchea sagittalis, Tagetes minuta y Tessaria absinthioides. La concentración efectiva 50 (CE50) del EO de B. gaudichaudiana y E. buniifolium frente a PV-2 fueron de 14,8 ± 1,5 ?g/ml y 9,5 ± 3,5 ?g/ml; respectivamente, valores que justificaron su fraccionamiento bioguiado frente a PV para la identificación de el/los compuesto/s responsables de la actividad antiviral observada. A partir del EO de B. gaudichaudiana, fue posible el aislamiento e identificación de un flavonoide conocido, la apigenina, previamente ya reportado en esta especie. La actividad antiviral de este compuesto fue de CE50= 12,2 ± 3,3 ?M. A partir de E. buniifolium se aisló un benzofurano, la euparina, cuya CE50 frente a PV-2 fue de 0,6 ± 0,2 ?M. Del estudio del mecanismo de acción de la euparina, se pudo demostrar que su mecanismo de acción era la interferencia en la etapa de penetración y/o desnudamiento del virus y el blanco de acción fue el sitio hidrofóbico conocido como pocket hidrofóbico en la cápside viral, localizado por debajo de la región del canyon. La selección de mutantes resistentes y dependientes a la euparina, y su caracterización biológica permitió demostrar las mutaciones asociadas a cada fenotipo localizadas en las diferentes proteínas de la cápside viral. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis, aportan al conocimiento de las especies medicinales estudiadas respecto a su potencial antiviral e identifica a la euparina como un inhibidor de cápside, altamente selectivo para los tres tipos de poliovirus humano.

Descripción: S. aureus coloniza asintomáticamente a más del 20% de la población sana y es el agente causal de un amplio espectro de infecciones, tanto intrahospitalarias como adquiridas en la comunidad. Tal versatilidad se debe a la adaptación de S. aureus a vivir en un entorno dinámico donde varía la disponibilidad de nutrientes y la presencia de varias moléculas. Frente a condiciones hostiles S. aureus puede formar biopelículas lo que hace refractarias al tratamiento a las infecciones con estas características. La matriz extracelular que encierra a la comunidad bacteriana está constituida por el polisacárido intercelular de adhesión (PIA), proteínas de superficie y el ADN extracelular liberado por la autolisis. La formación de biopelícula por S. aureus está sujeta a una regulación compleja y aún no dilucidada en su totalidad. En este trabajo se propuso estudiar el efecto de señales del microambiente, como el ácido salicílico (SAL) y concentraciones subinhibitorias (Csub) de vancomicina (VAN) o ciprofloxacina (CIP), sobre los principales factores y reguladores de S. aureus involucrados en la formación de biopelícula y su implicancia como estrategia adaptativa hacia la persistencia de la bacteria en el hospedador. Al respecto, la disminución de la biodisponibilidad de hierro por acción del SAL contribuyó al incremento de la síntesis del exopolisacárido PIA, debido al descenso de la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y al direccionamiento del metabolismo hacia la ruta fermentativa del lactato. Asimismo, el SAL provocó la disminución transcripcional de codY (regulador negativo de los genes que codifican para formar el PIA) y de los genes del sistema agr (regulador positivo de moléculas encargadas del desensamble de la biopelícula). Por medio de estos mecanismos, el SAL indujo el aumento de la biomasa de las biopelículas formadas por cepas de S. aureus relacionadas a los linajes genéticos USA100 y USA300 independientemente de la sensibilidad a la meticilina. Por lo cual, si bien el SAL aumentó la biomasa de las biopelículas de S. aureus, evita la dispersión de las bacterias que la conforman y por ende la posible generación de nuevos focos de infección. Además, la presencia del SAL propició el aumento de la colonización de este patógeno en narinas murinas debido a la generación de un fenotipo bacteriano más adherente. Por su parte, la VAN y la CIP en bajas concentraciones afectaron la formación de biopelícula de un modo cepa-dependiente. La inducción de la biomasa de la biopelícula por acción de Csub de ambos antibióticos, ocurrió por mecanismos que involucran principalmente el incremento de adhesinas. Al respecto, ambos antibióticos incrementaron la transcripción de sae, el cual regula positivamente la expresión de diversas adhesinas. Además, la VAN afectó negativamente al regulador MgrA el cual reprime la expresión de adhesinas. S. aureus responde a la acción de éstas señales adoptando una forma de vida sésil más robusta, al adaptar el metabolismo, la expresión de factores de virulencia y la red regulatoria de forma dinámica. Dicha respuesta podría modificar el curso de las infecciones causadas por S. aureus y conducir a la persistencia o cronicidad. A través de este trabajo se comprenden los mecanismos por los cuales S. aureus incrementa la biopelícula, aportando una pieza de conocimiento importante para ulteriores investigaciones basadas en el diseño de compuestos o estrategias que bloqueen o interfieran con el/los principal/es actor/es que participan en la formación de la biopelícula.

Descripción: Las hormonas tiroideas (TH) coordinan muchas respuestas fisiológicas y procesos madurativos durante el desarrollo; sin embargo, todavía no se conocen claramente los mecanismos por los cuales su deficiencia conduce a alteraciones en el mismo. Las mitocondrias juegan un papel esencial en la fisiología celular como productoras de energía y actuando como organelas de señalización, y su actividad y estructura se ve altamente regulada por la acción de TH. En trabajos previos en nuestro laboratorio, observamos que el hipotiroidismo condujo a un confinamiento de la enzima óxido nítrico sintasa neuronal en mitocondrias y que el aumento del óxido nítrico (NO) mitocondrial se asocia a la disminución del metabolismo basal observado en el hipotiroidismo. Además de los cambios metabólicos producidos por el NO, el aumento matrical del mismo en mitocondria conduce a un aumento en los niveles de oxidantes y la activación de vías de señalización asociadas a proliferación, diferenciación o muerte celular. La hipótesis de este trabajo se basa en que la modulación positiva de la mtNOS en el desarrollo de la rata hipotiroidea y el concomitante aumento de NO mitocondrial podrían estar ligados a las alteraciones en el crecimiento observadas frente a la deficiencia de hormonas tiroideas durante el periodo perinatal, que en humanos, resulta en el retardo físico y mental, conocido como cretinismo. En esta tesis nos propusimos analizar la utilización mitocondrial de NO como causa de alteraciones moleculares y fenotípicas definitivas en el hipotiroidismo neonatal. Nuestros estudios en hígado y cerebro de rata confirmaron que el hipotiroidismo congénito conduce a una modificación del patrón de expresión de la enzima óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) y su confinamiento mitocondrial respecto al desarrollo normal. Demostramos que en el hígado de rata, el hipotiroidismo alteró el metabolismo oxidativo a través del incremento de NO mitocondrial y estimuló la transcripción temprana de mitofusina 2 y tardía de Drp1, proteínas involucradas en la dinámica mitocondrial pero no afectó su localización mitocondrial. En este órgano la respuesta que ejerce el NO sobre la actividad de los complejos de la cadena respiratoria y la producción de oxidantes parece estar más relacionada a un efecto metabólico generado por la deficiencia de HT. Comprobamos que en el desarrollo perinatal del cerebro de rata, el incremento de NO mitocondrial se efectúa de forma temprana, y a través de la producción de ROS, aumenta la expresión de la proteína de fisión mitocondrial Drp1, la activación de JNK en la etapa perinatal tardía y la liberación de citocromo c al citosol que iniciaría la apoptosis por la vía mitocondrial. Estos resultados nos condujeron al análisis de apoptosis y proliferación hipocampales mediante las técnicas histológicas de BrdU y TUNEL donde se comprobó que el hipotiroidismo congénito generó una modificación del patrón apoptótico/proliferativo en el hipocampo de cerebro consecuente temporalmente con la liberación de ciotcromo c. En los días 5 y 30 perinatales los animales hipotiroideos presentaron aumento en la apoptosis hipocampal respecto al desarrollo eutiroideo. Comprobamos que el tratamiento de los mismos con el inhibidor de la producción de NO fue capaz de revertir tanto la apoptosis observada a nivel mitocondrial como la muerte de células de hipocampo. Finalmente, ensayando la expresión de genes de estrés involucrados en el establecimiento de la memoria y aprendizaje comprobamos que se ven modificados por el hipotiroidismo en forma NO dependiente, y que finalmente algunos de los trastornos conductuales del hipotiroidismo como ansiedad y memoria espacial pueden ser regulados por el NO y revertidos por el tratamiento con inhibidor. Estos hallazgos nos permiten establecer nuevos mecanismos de acción para el NO mitocondrial en vías de señalización específicas durante el desarrollo perinatal en el hipotiroidismo congénito.

Descripción: El término insuficiencia hepática, independientemente de su etiología, se define como la claudicación en las funciones del hígado que resulta en un amplio espectro de alteraciones clínicas, bioquímicas y neurofisiológicas. La enfermedad hepática puede presentarse de forma aguda o crónica. La etapa crónica, y con menor frecuencia la aguda, tiene como complicaciones de mayor importancia el síndrome de Hipertensión Portal y la Encefalopatía Hepática. La Encefalopatía Hepática es un cuadro clínico sobre el cual la ciencia médica ha tenido menos control que sobre otras patologías que surgen como complicaciones de la cirrosis hepática. Se define a la Encefalopatía Hepática como un síndrome potencialmente reversible que se manifiesta por un amplio espectro de alteraciones en la conciencia, que pueden ir desde sutiles cambios en el comportamiento hasta el coma profundo y la muerte. Este síndrome neuropsiquiátrico es secundario a una disfunción hepatocelular, al desarrollo de circuitos porto-sistémicos o a una combinación de ambos. El cuadro clínico es complejo y puede afectar a cualquier área cerebral. La alteración es una reacción mental orgánica con un trastorno neurológico y psiquiátrico. Un hallazgo importante es la variabilidad, especialmente en las formas crónicas. Los hallazgos dependen de la naturaleza e intensidad de los factores etiológicos y predisponentes. Actualmente, se considera a la Encefalopatía Hepática un gran desafío intelectual en los diferentes campos de la medicina debido a su cuadro clínico variado, a su fisiopatología compleja, a la multiplicidad de factores precipitantes, a la carencia de un fenómeno causal único, así como también debido a la falta de estudios complementarios confirmatorios y diagnósticos. La Encefalopatía Hepática Mínima es un estadio subclínico que presenta un desarrollo fisiopatológico crónico asociado a un proceso adaptativo cerebral. El estudio exhaustivo de la Encefalopatía Hepática Mínima es una herramienta de gran utilidad para identificar las vías que inician o desencadenan los mecanismos fisiopatológicos que posteriormente se interrelacionan en los estadios avanzados. Una vez disparada esta interrelación se establece una condición muy compleja que dificulta el poder dilucidar cuál ha sido el mecanismo o su vía iniciadora. La presente Tesis Doctoral tuvo como objetivo principal estudiar las alteraciones tempranas del Sistema Nervioso Central en un modelo experimental de Hipertensión Portal Prehepática y caracterizar la Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta, a partir de un estudio morfológico y funcional a nivel neuronal, astrocitario y vascular. Por primera vez, en esta Tesis, en un modelo experimental de Encefalopatía Hepática Mínima, se describen alteraciones estructurales y funcionales en el hipocampo y en la corteza cerebral de animales con de Hipertensión Portal Prehepática y Encefalopatía Hepática Mínima. A los 10 días de la cirugía, el grupo de animales con Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta cumple con las características principales de la Encefalopatía Hepática de tipo B asociada con derivaciones porto-sistémicas sin enfermedad hepatocelular intrínseca. Los hallazgos descriptos en esta Tesis Doctoral sugieren que en la Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta, existen alteraciones a nivel del Sistema Nervioso Central que son focales y diferenciales según la zona afectada y que se encuentran asociadas con la hiperamonemia moderada, característica principal de la Encefalopatía Hepática. Comprender la patogénesis de la Encefalopatía Hepática Mínima proporcionaría un marco teórico que aportaría a la comprensión de la fisiopatología de la Encefalopatía Hepática con el fin de encontrar un marcador bioquímico precoz. Además aportaría en gran medida al desarrollo de terapéuticas adecuadas para su diagnóstico y tratamiento.

Descripción: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de terapias combinadas de nanoquimoterapéuticos con mifepristona (MFP) utilizando modelos experimentales que expresan distintas relaciones de isoformas A y B del receptor de progesterona (RP). Demostramos utilizando el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos por MPA y xenoinjertos de las líneas celulares T47D modificadas para expresar sólo RPA o RPB, que MFP mejora los efectos terapéuticos de liposomas pegilados de doxorubicina (DOX) o de paclitaxel (PAX) unido a albúmina, sólo en los tumores con niveles mayores de la isoforma A (RPA) que de la isoforma B del RP (RPB). En estos tumores MFP incrementa la remodelación tisular y el número de vasos funcionales favoreciendo la acumulación de drogas en el tumor. En estudios preliminares utilizando cultivos tisulares de cáncer de mama humano con distinta relación RPA/RPB no se observaron efectos aditivos de MFP y DOX corroborando los resultados obtenidos con los modelos in vivo. Se observó asimismo que los tumores con niveles de expresión de RPA ? RPB serían más sensibles a DOX que los de proporción opuesta quienes son más sensibles al PAX. Postulamos que MFP podría ser utilizada junto con nanoquimioterápicos en carcinomas mamarios con RPA?RPB.

Descripción: Los agentes quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas luego del período agudo son poco efectivos y con graves efectos secundarios por lo que es prioritario el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para controlar la infección. En este trabajo de tesis evaluamos la inmunoterapia con el ADN de Cruzipaína (Cz) para controlar una infección en ratones infectados con T. cruzi. Se evaluaron tratamientos con plásmido desnudo (d) por vía intramuscular, y por vía oral usando Salmonella (S) como sistema de transporte de los antígenos; tanto en etapas tempranas como tardías de la infección. La coadministración de Cz+GM-CSF, por ambas vías logró reducir la parasitemia, aumentando la sobrevida con incremento de la respuesta humoral y celular, esencial para la protección del daño en tejidos musculares. Ambas vacunas dCz+dGM-CSF y SCz+SGM-CSF, al ser aplicadas durante la etapa crónica de la infección desencadenaron una fuerte respuesta celular y una mejora en el estado general de los tejidos musculares, respecto a los controles que presentaban daños característicos de la patología chagásica. Incorporamos Chagasina (Chg), inhibidor fisiológico de Cz, en la inmunoterapia combinada SCz+SChg+SGM-CSF, logrando mejorar la eficacia protectora de Cz+SGM-CSF, presentando menores niveles de parásitos en sangre y un mejor estado de cortes histológicos de tejidos musculares, con una menor actividad de enzimas séricas marcadoras de daño tisular. La vacuna terapéutica multicomponente SCz+SChg+SGM-CSF, aplicada durante la fase crónica de la infección, previene la patología tisular. Nuestros resultados indican que la inmunoterapia de la infección por T. cruzi con el ADN codificante para Cz, Chg y GM-CSF, tanto al ser administrado en etapas tempranas como tardías de la infección, estimula la respuesta inmune, reduce la carga parasitaria y disminuye la inflamación tisular característica de la enfermedad. El empleo de SCz+SChg+SGM-CSF podría ser una promisoria alternativa para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

Descripción: La OMS en el 2008 incluyó una nueva entidad provisoria, el LDGCB EBV+ del adulto mayor, en pacientes mayores de 50 años inmunocompetentes, probablemente por la inmunosenescencia inherente al envejecimiento. Nuestro objetivo fue determinar la participación del virus de EBV en la patogénesis del LDGCB en pacientes pediátricos, adultos menores y mayores de 50 años de nuestro país, y caracterizar ciertos marcadores del microambiente tumoral. Se analizaron 102 casos de LDGCB. Se realizó hibridación in situ para EBERs e inmunohistoquímica para los antígenos virales y marcadores del microambiente tumoral. Se determinó la expresión relativa de transcriptos virales y de citoquinas y quimioquinas por PCR en tiempo real y se compararon los casos EBV+ y ? en los 3 grupos. El LDGCB EBV+ (con ?20% de células tumorales EBERs+) se vio en todos los grupos etarios y prevaleció el perfil de latencia II y III junto con perfil lítico. PD-1 prevaleció en todos los LDGCB, mientras que los casos EBV+ tuvieron un aumento significativo en la población de células citotóxicas GrB+ y una tendencia a una menor sobrevida libre de eventos. El virus cumpliría un rol en la patogénesis del LDGCB EBV+ en todos los grupos etarios. Este hallazgo avala la sugerencia de revisión del criterio de edad definido por la OMS.

Descripción: La complejidad de la vagina humana hace que su microbioma cambie en periodos cortos de tiempo. El riesgo de infección y de contraer enfermedades en una mujer puede modificarse a lo largo de los años. El balance del contenido vaginal o BACOVA es el estudio morfológico integral del contenido vaginal y contribuye al control, seguimiento clínico y terapéutico de las disfunciones vaginales en laboratorios de todo tipo de complejidad. Se invitó a participar del proyecto a las mujeres en edad fértil de Posadas (Misiones), que concurrieron entre los años 2011 y 2013 al laboratorio del Instituto de Previsión Social-Misiones con el objetivo de caracterizar los estados vaginales básicos (EVBs), identificar y determinar la frecuencia de Levaduras, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Virus Papiloma Humano (VPH), analizar posibles asociaciones y la utilidad del BACOVA frente a estos agentes. Se estudiaron 505 muestras de mujeres que aceptaron participar, 265 correspondieron a mujeres sintomáticas incorporadas de manera consecutiva y 240 fueron asintomáticas. Ciento seis (20,99%) estaban embarazadas, y de éstas 57 presentaron síntomas. El 45,42% de las mujeres que no refirieron síntomas presentaron disfunciones vaginales. La distribución de los EVBs en mujeres sintomáticas y asintomáticas respectivamente fue: EVB I (microbiota normal) 20,75% y 54,58%; EVB II (microbiota normal con respuesta inflamatoria) 20,37% y 10,41%; EVB III (microbiota intermedia) 6,79% y 10,83%; EVB IV (vaginosis bacteriana) 26,41% y 15,83%; y EVB V (vaginitis microbiana inespecífica) 25,66% y 8,33%. El porcentaje de agentes infecciosos en mujeres sintomáticas y asintomáticas respectivamente fue: HPV 29,4% y 32,1%; Levaduras 12,5% y 4,6%; C. trachomatis 11,3% y 5,4%; y T. vaginalis 4,5% y 0,8%. En este estudio no se obtuvo desarrollo de N. gonorrhoeae en ninguna de las muestras estudiadas. La detección de levaduras se observó con mayor frecuencia en mujeres sintomáticas comparado con las asintomáticas, tanto en toda la población de estudio (p=0,002) como en las embarazadas (p=0,019). Se observó una mayor frecuencia de infección por T. vaginalis y C. trachomatis en mujeres sintomáticas y en mujeres con EVB V. La infección por HPV se asoció a mujeres con mayor número de parejas sexuales. Al genotipificar los HPV, predominaron los genotipos de alto riesgo y el más frecuente fue el HPV16 (35,13%). Los resultados de valores predictivos y de razones de verosimilitud indican la escasa utilidad del manejo sindrómico en la consulta médica para predecir correctamente la VB. Los VPP resultaron bajos para infección por T. vaginalis (6,58%), C. trachomatis (11,97%) y HPV (31,66). El VPN resultó 99,11% en la infección por T. vaginalis indicando que en presencia de EVB sin RIV la probabilidad de padecer esta infección es muy baja. Del análisis de los parámetros de exactitud de la prueba de RIV en mujeres sintomáticas y asintomáticas se observó que la mayor fuerza de esta prueba como poder discriminante, correspondió a los valores obtenidos para predecir infecciones por T. vaginalis respecto a infección por C. trachomatis o HPV. Los resultados obtenidos en el estudio de la distribución de los EVBs en muestras de mujeres atendidas en la mayor obra social de la Provincia de Misiones mostraron, una frecuencia elevada de disfunciones vaginales con predominio de vaginosis bacteriana y vaginitis microbiana inespecífica. El EVB V mostró una fuerte asociación con la infección por T. vaginalis (p<0,001, OR=19,70 IC95%=5,30-72,30) y en menor grado con C. trachomatis (p<0,001,OR=3,21 IC95%=1,64-6,25) y con levaduras (p=0,036,OR=2,15 IC95%=1,07-4,31) El BACOVA permitió una diferenciación eficaz de vaginosis y vaginitis independientemente de la presencia de síntomas clínicos en el grupo de estudio. El conocimiento epidemiológico de las disfunciones vaginales en las mujeres estudiadas contribuirá a la optimización de medidas de prevención y control de las infecciones transmitidas sexualmente y a la protección de la salud sexual y reproductiva en las mujeres afiliadas al Instituto de Previsión Social de Misiones El hallazgo de un porcentaje elevado de disfunciones vaginales sin etiología demostrada, mediante BACOVA, promueve la búsqueda de agentes de transmisión sexual. Del mismo modo sería importante avanzar en la implementación de métodos más sensibles en la investigación de T. vaginalis y en la investigación de genotipos de C. trachomatis circulantes en la región.

Descripción: El reciente hallazgo de transcriptos primarios carentes de capacidad para codificar proteínas provee una nueva perspectiva acerca de la centralidad funcional del RNA en la regulación génica. Estructuralmente, los RNAs no codificantes (ncRNA) se subdividen en dos grandes categorías: los ncRNAs pequeños (sncRNA) y ncRNAs largos (lncRNAs). Los microRNAs (miRNAs) constituyen la categoría de mayor representación dentro de los sncRNAs pudiendo regular la expresión génica y participando en diversos procesos como proliferación, apoptosis, desarrollo, diferenciación y metabolismo celular entre otros. Por otra parte, los lncRNAs, constituyen una clase novel de moléculas reguladoras ampliamente distribuidas y escasamente caracterizadas en nuestro genoma. Los mismos representan la mayor parte de nuestro transcriptoma, constituyendo importantes modificadores de la expresión génica, involucrados en numerosos procesos de nuestra economía celular. Numerosas evidencias han establecido una coordinada relación entre la expresión aberrante de miRNAs y lncRNAs en el desarrollo de numerosos tipos de cáncer. Paralelamente, el clúster SOXC constituido por SOX4, SOX11 y SOX12 integran un grupo de 20 factores de transcripción de la superfamilia HMG. SOX11 y SOX12 poseen importantes funciones en el desarrollo del sistema nervioso central, participando en el control de la proliferación celular, diferenciación y mantenimiento de la identidad celular durante la embriogénesis. Ambos genes no se expresan en tejido linfoide normales, pero se ha visto que SOX11 muestra expresión aberrante en diversos tipos de cáncer. SOX4 es el único miembro de la familia con función definida y de relevancia durante el desarrollo y diferenciación de células B. En el presente trabajo se realizó el análisis de expresión génica de los genes SOXC y del clúster miR17-92 en 70 pacientes con Linfoma de Células del Manto (LCM). En paralelo se analizó el perfil transcripcional del set completo de los 481 Transcribed Ultraconserved Regions (T-UCRs) en 85 pacientes con Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) tratadas (T) y no tratadas (NT) in vitro con agonistas de TLRs (Toll like receptors) oligo CpG ODN2006. Asimismo se realizó una indagación exhaustiva de los perfiles transcripcionales de lncRNAs y genes codificantes en 76 pacientes con Linfoma Folicular (LF). El análisis de los clústeres SOXC y miR17-92 permitió evidenciar dos grupos de pacientes: con sobreexpresión de SOX11/SOX12/miR19b/miR92a (Clúster A) y con aumento de los niveles de SOX4/mir17/miR18a (Clúster B). La correlación con características clínicas mostró diferencias significativas en la localización ganglionar, niveles de proliferación, morfología blastoide y sobrevida más corta, con peor pronóstico para el Clúster A respecto del Clúster B, permitiendo distinguir por primera vez en LCM, pacientes asociados a un perfil de expresión de genes codificantes y no codificantes específico. El análisis transcripcional de T-UCRs en pacientes con LLC T y NT con ODN2006 permitió identificar que la expresión del lncRNA uc.70 estratifica de manera más precisa la progresión de los pacientes con LLC, tanto en individuos asociados a buen pronóstico, como aquellos asociados a una enfermedad agresiva. En relación a los patrones transcripcionales de lncRNAs y genes codificantes descubiertos en pacientes con LF, se seleccionaron lncRNAs candidatos potencialmente involucrados con vías y caminos de señalización relacionados a la agresividad y heterogeneidad de la patología, haciendo foco en lncRNAs diferencialmente expresados (DE) que pudieran ser reguladores putativos de genes codificantes DE basándose en la coexpresión de los mismos. Los hallazgos encontrados en el presente trabajo apuntan a una íntima relación entre los perfiles de expresion de ncRNAs y las patologías analizadas, sugiriendo a este nuevo estrato transcripcional del genoma como potenciales nuevos targets en cáncer. Estos resultados constituyen un aporte original al conocimiento de las características biológicas de las entidades en estudio permitiendo así, evidenciar con mayor especificidad la diversidad y heterogeneidad de procesos involucrados en su desarrollo.

Descripción: El presente trabajo describe aspectos de la epidemiología de las meningitis agudas pediátricas, en el departamento Capital de la provincia de Misiones, dirigido a sus principales agentes etiológicos. Para ello se diseñó un estudio descriptivo, transversal para el período 1994-2009, que incluyó todos los casos atendidos en el Hospital Provincial de Pediatría. Se utilizó la definición de meningitis aséptica y bacteriana, según criterios internacionales propuesto por la OMS, investigándose por diversas técnicas los agentes etiológicos. Para el almacenamiento y análisis de datos se utilizó el programa Epi Info 6; y la prueba de Chi2 (error de estimación de 0,05%) para determinar asociación significativa entre las variables. El análisis factorial de correspondencias múltiples (AFCM) se realizó utilizando el paquete estadístico SPAD-N V 4.01 1987-1999 (CISIA CERESTA) del programa PRESTA (Programme de Recherche et D´Esignement en Statistique Apliquee). En este período se detectaron 1.073 casos de meningitis de etiologías infecciosas en pacientes pediátricos. La distribución de los mismos y las tasas de incidencia no siguieron un patrón uniforme denotándose picos; mientras las meningitis bacterianas (MB) variaron entre 77,8 (1995) y 14,8 (2009) casos/105 niños, con una tendencia en disminución, las meningitis asépticas (MA) lo hicieron entre 153,1 (2005) y 13,7 (1998) casos/ 105 chicos con una tendencia en ascenso. Ambos afectaron más a los varones que a las niñas con una razón de género de 2,4 en MB y 1,6 en MA niños por cada chica. La morbilidad media para ambos tipos de meningitis fue superior entre los niños < 1 año y su incidencia respecto a cualquier grupo fue significativamente mayor. Las tasas de MB corregidas por edad, fueron más elevadas que las asépticas salvo para los niños > 4 años. De los 581 episodios de MB se documentó agente etiológico en el 73%. Los patógenos detectados fueron Streptococcus pneumoniae (Spn) en 167 (39%) episodios, Neisseria meningitidis (Nme) 22% (95), Haemophilus influenzae (Hin) 19% (80) y 86 (20%) microorganismos diferentes a los capsulados. Todos mostraron una tendencia en disminución, con variaciones importantes en las frecuencias anuales. La incidencia de meningitis por Spn cada 105 niños varió entre 19,2 (1997) y 4,3 (2009), con una media de 10,6. El grupo más afectado fue el de niños entre 1 y 11 meses (94/167, 56 %). El 30,7 % de los aislamientos (46/150) fueron resistentes a penicilina y el 16,7 % (25/150) no sensibles a cefotaxima. Se detectaron 19 serotipos, predominó el 14 (32%; 40/125). El 84,8% de los aislamientos quedaron circunscritos a nueve serotipo: 14, 5, 1, 7F, 18C, 6B, 9N, 9V y 4. La resistencia a penicilina estuvo reducida a 8 (14, 6B, 6A, 9V, 4, 23B, 1 y 19A), y la no sensibilidad a cefotaxima a 3 (14, 9V y 1), el más importante fue en ambos casos el serotipo 14. La incidencia por Nme varió entre 23,7 (1996) y 1,7 (2009)/105 niños, con una media de 5,6. Afecto especialmente a los niños > 2 años (62,1%; 59/95), aunque las tasas más elevadas se observaron en niños < 1 año. Durante 1996 se detectó un brote por Nme C que comprometió a niños de todas las edades, aunque los más perjudicados fueron los > 4 años. Circularon 4 serogrupos: C (50%; 47/94), B (33%; 31/94), W135 (15%; 14/94) y en el 2% Y (2), con variaciones temporales. La tasa por Hin varió entre 17,5 (1995) y 0,87 (2009)/105 niños, con una media de 5,6. Los más afectados, con tasas más elevadas, fueron los niños < 1 año (59/80, 73%). Observamos una reducción de la incidencia, superior al 90%, en todos los grupos una década después de la implementación de la vacuna. Todos los aislamientos fueron seroagrupados como H.influenzae b, no detectándose ningún otro tipo capsular o aislamientos no tipables. La tasa para los otros agentes etiológicos varió entre 10,1 (1995) y 0,8 (2009)/105 niños. La mediana de edad fue de 2 años y 3 meses y el 78% (57/73) de los aislamientos se efectuaron en niños < 1 año. La tasa de meningitis tuberculosa varió entre 2,19 (1995)/105 niños y 0,87 (2009), con una media de 0,81 y una tendencia leve al descenso. Comprometió a 1,16 varones por cada niña implicada, con una mediana de edad de 4 años y 4 meses. El mayor número de aislamientos se obtuvo en los niños de más de 4 años de edad (7/13, 54%). En el 42% (207/492) de las MA se logró arribar a un diagnóstico etiológico. Los enterovirus (EV) constituyeron un importante agente etiológico de estas meningitis en el departamento Capital al detectar 62 episodios (73%) en el período 2005-2009 y confirmar un brote epidémico, que comprometió a 143 niños, entre agosto y diciembre de 2005. El mismo, provocado por EV Echo 4, elevó la tasa a 136 casos /105 niños. El 79,8% de los niños afectados fueron > 4 años y el 55,2% varones, con una mediana de edad de 8 años. Durante el resto del período la tasa varió entre 22,3(2008) y 5,3 (2006) casos/105 niños, con una media de 13,9 y una tendencia en ascenso. La mediana fue de 6 años y 7 meses; el 62% de los niños tenían más de 4 años y el 56,8% eran varones (razón V:M = 2,1:1). La tasa más elevada se registró para < 1 año (69,6) grupo responsable del incremento observado. El presente trabajo constituye un aporte a la epidemiología de la región, y contribuye a mejorar la situación de la salud en la provincia, brindando herramientas para la toma de decisiones en cuanto a prevención y el establecimiento de normas para tratamiento empírico adecuado.

Descripción: Dentro de las acuaporinas vegetales, las PIPs son una de las principales responsables del intercambio eficiente de agua a través de la membrana plasmática (MP). Existe un subtipo - PIP1- que si bien se expresan ampliamente, su rol y propiedades restan de ser dilucidados, dado que no llegan a la MP salvo que se co-expresen junto con una PIP2. Nuestro trabajo fue demostrar que una PIP1 específica de fruto (Fragaria x ananassa, FaPIP1;1)- contribuye a modular la permeabilidad al agua de la membrana (Pf). Utilizando un modelo matemático aplicado a resultados de Pf obtenidos experimentalmente co-expresando FaPIP1;1 y FaPIP2;1 o una mutante de FaPIP2;1 en diferentes relaciones de masa se logró dilucidar la contribución individual de cada PIP a la Pf de la MP. Demostramos que: i) FaPIP1;1 tiene alta capacidad de transporte de agua; ii) la Pf de FaPIP2;1 aumenta al interaccionar físicamente con FaPIP1;1; iii) entre FaPIP1;1 y FaPIP2;1 se produce heterotetramerización aleatoria a partir de monómeros. Finalmente, caracterizamos la sensibilidad del gatillado dependiente de pH citosólico para ambas acuaporinas y cómo influye el estado de fosforilación de una Serina específica. Proponemos que existe una interacción entre los diferentes mecanismos de regulación que gobernarían la permeabilidad de una membrana que expresa ambas PIPs.

Descripción: La familia de genes Asr (ABA, stress, ripening) está implicada en las vías de respuestas generales a estrés y en el control del transporte de hexosas. Para profundizar en el estudio funcional del parálogo ASR1 en Solanáceas, se evaluaron plantas de tabaco y tomate que sobreexpresan y silencian Asr1 desde una perspectiva metabólica, fisiológica y molecular. El estudio de las plantas de tabaco silenciadas mostró que tienen alteraciones en los niveles foliares de glucosa así como disminuciones en los niveles de expresión del transportador de hexosas Ht1. Asimismo, esas mismas plantas muestran modificaciones en los niveles de las hormonas ABA y giberelinas. Por el contrario, el principal efecto metabólico observado en los frutos de tomate es a nivel del metabolismo de los aminoácidos. Los niveles de expresión de los genes asociados a vías de respuesta frente a estrés en los frutos de las líneas silenciadas sugieren que ASR1 reprime esas vías en esos tejidos. Asimismo se encontraron evidencias que indican que ASR1 estaría relacionado con el metabolismo de la pared celular y con la vía de las citoquininas en los frutos de tomate. En conclusión, ASR1 está involucrado en el metabolismo primario, hormonal y en vías de respuesta a estrés en las Solanáceas estudiadas.

Descripción: PER-2 fue históricamente la segunda ß-lactamasa de espectro extendido plasmídica más frecuente en aislamientos clínicos de enterobacterias en Argentina. Si bien no se han reportado variantes mutacionales de PER-2, debido a las constantes presiones selectivas ejercidas por el uso masivo de antibióticos e inhibidores, y a los antecedentes de evolución en otras enzimas, nos planteamos si la misma puede evolucionar y modificar sus aptitudes hidrolíticas y/o ser menos susceptible a la inhibición. Por modelados computacionales se pudo apreciar que Arg220 de PER-2 ocupa estructuralmente un espacio equivalente a Arg244 en TEM-1/SHV-1. Ya que en enzimas resistentes a inhibidores derivadas de TEM/SHV la sustitución en Arg244 es suficiente para conferir el fenotipo resistente, se postula que modificaciones en Arg220 de PER-2 podrían tener un efecto similar. También postulamos que Thr237, cercana a Arg220 según nuestros modelos, tendría un potencial papel en la estructura-función de PER-2. En el presente trabajo se realizó la caracterización bioquímica de variantes mutacionales en posiciones 220 y 237 obtenidas in vitro determinando la participación de estos residuos en la hidrólisis e inhibición, la resolución de la estructura cristalográfica de PER-2 y la caracterización preliminar de un plásmido portador del gen blaPER-2.

Descripción: Las Distrofinopatías son enfermedades monogénicas, recesivas ligadas al X, originadas por mutaciones en el gen DMD. El objetivo principal del trabajo consistió en realizar una caracterización genética/molecular del gen DMD. La identificación de la alteración molecular resulta clave para la confirmación del diagnóstico clínico presuntivo, establecer la prognosis del paciente y establecer la estrategia terapéutica mutación-dependiente que se adecúe a cada caso particular. No obstante, continúa siendo necesario brindar un completo asesoramiento genético a las familias afectadas empleando estudios de detección de portadores, prenatales y preimplantatorios de modo de evitar el nacimiento de varones enfermos. En este trabajo fueron analizados 200 varones con diagnóstico clínico de Distrofinopatía y 12 mujeres con sintomatología, corroborándose el cuadro en el 71,7% (152/212). Se estableció la prognosis, identificó a los candidatos para las terapias disponibles y caracterizaron las mutaciones halladas. Se estableció el estado de portadora de 69/240 (28,8%) mujeres y se descartó a 132/240 (55%). Se realizaron 15 estudios prenatales: 7 descartados de ser afectados, 4 no portadoras y 3 portadoras. Pudimos además demostrar que la expresión de distrofina se encuentra alterada en tumores no miogénicos, corroborando la implicancia fisiopatológica del gen DMD en el desarrollo tumoral.

Descripción: La enfermedad de Chagas es una zoonosis transmitida al hombre por Triatoma infestans, un insecto hematófago que se encuentra en América Central y América del Sur. El control de este insecto depende principalmente del uso de insecticidas. Sin embargo en lo últimos años aumentó en Argentina y Bolivia los informes del fracaso de los rociados con insecticidas asociados a resistencia a insecticidas piretroides. Si bien existen algunos trabajos sobre expresión y mecanismos de resistencia en ninfas de T. infestans, existen muy pocos estudios sobre la expresión de la resistencia en huevos de poblaciones resistentes, y no existe estudios sobre la expresión de la resistencia a lo largo del desarrollo embrionario y sus posibles causas. El objetivo de este trabajo de tesis fue analizar la expresión de resistencia a deltametrina en el huevo en desarrollo de dos poblaciones de campo provenientes de Campo Largo-Argentina, y Entre Ríos-Bolivia. Además analizar los mecanismos enzimáticos y moleculares potencialmente asociados con la resistencia a deltametrina durante el desarrollo embrionario. Las ninfas de ambas poblaciones de campo mostraron niveles altos de resistencia a deltametrina comparadas con la población susceptible de referencia (Entre Ríos: 173x y Campo Largo: 1.108X) Los grados de resistencia a deltametrina estimados para ambas poblaciones resistentes en huevos de 4, 7 y 12 días de desarrollo, indicaron que la resistencia se expresa desde el desarrollo temprano en huevos de T. infestans, y que a lo largo de todo el desarrollo embrionario los niveles de resistencia fueron mayores en Campo Largo que en Entre Ríos (1.144x, 1.193x y 822x para Campo Largo y 21x, 15x y 39x para Entre Ríos). Tanto para la población de referencia como para las poblaciones de campo, la efectividad de la deltametrina fue menor en huevos de 12 días respecto a huevos de 4, y 7 días de desarrollo. La actividad de las enzimas monooxigenasas P-450 no mostró incremento significativo en las poblaciones resistentes. Este resultado sugiere que no es un mecanismo contributivo a la resistencia a deltametrina. O bien que la metodología empleada no permitió detectar un incremento de alguna fracción de ese complejo enzimático. La actividad de piretroide-esterasas mostró un incremento durante el desarrollo embrionario de todas las poblaciones estudiadas, siendo los valores más altos de actividad los correspondientes a huevos de 12 días. La actividad promedio se incrementó de 13,60 a 16,27, y a 22,21 picomoles de 7- hidroxicumarina/minuto (7-OHC) en huevos de 4-, 7-, y 12 días de la población de referencia. Los valores medios para las poblaciones resistentes fueron de 16,17, 21,44 y 26,14 picomoles de 7- OHC/minuto en el caso de Entre Ríos, y de 16,04, 17,98 y 28,87 picomoles de 7-OHC/minuto para la población Campo Largo en huevos de 4-, 7- y 12 días respectivamente. Los estudios moleculares detectaron la presencia de la mutación kdr (knockdown resistance) L1014F en las dos poblaciones de campo, indicando que el sitio de acción alterado es un mecanismo de resistencia a deltametrina en las poblaciones de campo estudiadas. La mutación kdr L925I descripta en otros hemípteros no fue detectada en ninguna de las poblaciones estudiadas. Los resultados de este trabajo de tesis, demuestran que la resistencia a deltametrina expresada en huevos en desarrollo, se deben en parte a la mayor actividad de las piretroide-esterasas y a la modificación del sitio de acción. El avance del conocimiento sobre los mecanismos de resistencia a insecticidas involucrados, permitirán optimizar las campañas de control de T. infestans, vector de la enfermedad de Chagas.

Descripción: Los oligonucleótidos cuya función se encuentra asociada a procesos catalíticos o de reconocimiento molecular se los conoce como oligonucleótidos funcionales (ribozimas, DNAzimas, aptámeros) y sus aplicaciones abarcan el silenciamiento génico, el desarrollo de herramientas de diagnóstico y sensores, la biocatálisis y la nanotecnología. En este trabajo se estudió cómo optimizar el uso de estos oligonucleótidos mediante la incorporación de modificaciones químicas. Inicialmente, se estudió el efecto modulador de 2?-desoxi-2?-C-metilpirimidín nucleósidos sobre: la actividad hidrolítica y estabilidad en medios biológicos de la DNAzima 8-17 al ser incorporados en distintas posiciones de su núcleo catalítico; la potencia silenciadora y la especificidad de siRNAs al ser incorporados en distintas posiciones de las cadenas antisentido y sentido; la estabilidad termodinámica de oligonucleótidos de ADN formadores de dúplex e i-motif. Por último, se amplió el estudio a la DNAzima peroxidasa utilizando el oligonucleótido modificado en su totalidad con L-nucleótidos y el oligonucleótido inmovilizado, empleando un amplio repertorio de sustratos, entre ellos sulfuros y paracetamol.

Descripción: Se evaluó el aporte potencial de hierro, calcio y zinc en alimentos y/o dietas destinados a diferentes grupos vulnerables: niños entre 6 meses y 2 años, embarazadas y adultos mayores de contextos socioculturales diversos. Se analizaron dietas caseras, alimentos de planes sociales, alimentos comerciales y regionales y matrices alimentarias no tradicionales. El aporte potencial se calculó en base al contenido total y la dializabilidad mineral, evaluada mediante un método in vitro. Se estudió el efecto de diversos promotores (ácidos cítrico y ascórbico, Na2EDTA) e inhibidores (fitatos, polifenoles, calcio, proteínas lácteas y oxalatos) y la efectividad de distintas fuentes de hierro (sulfato ferroso, bisglicinato férrico y NaFeEDTA). El aporte potencial de los alimentos infantiles mostró diferencias significativas, debido a las interacciones en las diversas combinaciones estudiadas y con los promotores o inhibidores presentes. En los alimentos complementarios comerciales sería adecuada una reformulación. Los alimentos regionales aportan cantidades importantes de hierro y moderadas de zinc y calcio. Las harinas de plátano verde y snacks resultaron pobres aportadores de minerales. En las infusiones de yerba mate la dializabilidad de hierro fue mínima pero el ácido ascórbico podría aumentarla. Estos resultados aportarían una base apropiada para formular recomendaciones relativas a dietas de grupos vulnerables.

Descripción: La resistencia natural (R) a ciertas enfermedades se refiere a la capacidad inherente del animal de resistir la enfermedad cuando queda expuesto al patógeno que la origina. Se sabe que un componente significativo del carácter R es heredable y, si bien la R es poligénica, se ha observado que hay genes individuales que tienen un efecto mayor sobre este carácter. El gen SLC11A1, Solute Carrier Protein 1 of 11 (inicialmente denominado NRAMP1 -Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1-) es el mejor candidato en estudios de resistencia natural a infecciones por patógenos intracelulares. En las especies pecuarias, los polimorfismos mayormente estudiados se encuentran en la región 3´ no codificante (3´ UTR) del gen SLC11A1 y están determinados por la existencia de dos microsatélites, cuyos alelos se definen por la cantidad de repeticiones cortas en tándem de un dinucleótido (guanina-timina), quedando los diferentes alelos establecidos por las longitudes de los microsatélites. En esas especies, los polimorfismos de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 se han asociado con R a Brucella abortus en bovinos y en bubalinos, a Brucella melitensis en caprinos, a Mycobacterium avium subsp paratuberculosis en bovinos y caprinos, y a M. bovis en bovinos. En la región 3´UTR del gen SLC11A1 bovino se han identificado dos microsatélites, llamados en el transcurso de este trabajo Ms1 (microsatélite 1, el más próximo a la región codificante) y Ms2 (microsatélite 2, el más lejano a la región codificante). El objetivo general de este trabajo fue evaluar el grado de asociación de los polimorfismos en los microsatélites de la región 3? UTR del gen SLC11A1 con la R a las infecciones bacterianas intracelulares que afectan a los bovinos. En primera instancia, se analizó la frecuencia de distribución de los polimorfismos en los microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 en diversas razas puras de ganado bovino de las especies Bos taurus (razas Criolla, Angus, Hereford y Holando Argentina), Bos indicus (razas Brahman y Nelore) y razas cruzas B. taurus X B. indicus (Braford y Brangus). Se encontró una diferencia significativa en la distribución de los polimorfismos de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 entre las especies bovinas y entre las razas índicas, las razas cruzas y las europeas. Coincidentemente, para ambos microsatélites, se encontró la mayor variabilidad alélica en las razas bovinas pertenecientes a la especie Bos indicus, una variabilidad intermedia en las razas resultantes de cruzas, y la menor variabilidad se detectó en las razas Bos taurus. Como dato relevante de esta investigación, se detectaron dos nuevos alelos para el Ms1 de la región 3´ UTR del gen SLC11A1: los alelos 161 y 163, y una nueva variante para el Ms2 en Holando: el alelo 177. Posteriormente, se evaluó el grado de asociación entre los polimorfismos en los microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 y la ausencia o presencia de infección natural (como indicadores del carácter de resistencia o susceptibilidad, respectivamente). Se llevaron a cabo estudios casos-controles en rodeos Bos taurus con alto riesgo de infección natural por brucelosis y tuberculosis. Los resultados indicaron falta de asociación (p>0,05) entre las variantes de ambos microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 y la ausencia o presencia de infección natural por Brucella abortus y Mycobacterium bovis en los bovinos Bos taurus analizados. Como la capacidad de los fagocitos de restringir el crecimiento intracelular de B. abortus está relacionada con la resistencia a la infección, se planteó corroborar los resultados previos mediante un estudio in vitro. Lamentablemente, la homogeneidad genotípica encontrada en los rodeos Bos taurus evaluados (la gran mayoría de los animales presentaban los genotipos 159/159 -Ms1, 100%- y 175/175 -Ms2, 96%-), impidió seleccionar animales portadores de distintos polimorfismos para la región 3? UTR del gen SLC11A1 y poder comparar la capacidad brucelicida natural de sus fagocitos mononucleares. Ante la imposibilidad de continuar con el objetivo original, el trabajo se enfocó en evaluar la influencia de los parámetros sexo, edad y vacunación con Brucella abortus S19 sobre la capacidad brucelicida natural de los fagocitos mononucleares en bovinos Bos taurus portadores de un mismo genotipo (159/159 - 175/175) para la región 3´ UTR del gen SLC11A1. Los resultados obtenidos indicaron que las hembras adultas presentaron la menor capacidad para restringir el crecimiento intracelular de B. abortus, resultando las más susceptibles al desafío in vitro con este patógeno. Además, se observó que la capacidad natural de los macrófagos para restringir el crecimiento intracelular de B. abortus, estuvo influenciada por el sexo y la madurez sexual de los animales estudiados. Como conclusión, los resultados de este trabajo no muestran asociación entre los polimorfismos en los microsatélites de la región 3? UTR del gen SLC11A1 con la resistencia natural a la infección por B. abortus y M. bovis en el ganado bovino Bos taurus.

Descripción: Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista que causa enfermedad en el hombre y en los animales. Desde 1997 se han reportado a nivel mundial cepas de S. aureus con sensibilidad disminuida a vancomicina (VISA), y cepas con resistencia heterogénea (hVISA). El mecanismo responsable de dicha resistencia aún no ha sido completamente elucidado. Sumado a esto, la detección del fenotipo hVISA es dificultosa en laboratorios clínicos. Este trabajo describe por primera vez la prevalencia y la caracterización molecular de aislamientos hVISA en un hospital de Argentina y evalúa distintas metodologías para su detección. Adicionalmente, se estudian las bases moleculares posiblemente implicadas en la susceptibilidad disminuida a vancomicina. No se encontraron aislamientos VISA y el fenotipo hVISA ocurrió en el 3,3% de las bacteriemias por S. aureus estudiadas. Se encontró una asociación entre el fenotipo hVISA y episodios múltiples de bacteriemias, y se propuso la combinación de métodos para alertar de un posible hVISA en aquellos laboratorios en donde no se puede realizar la metodología confirmatoria de rutina. La modificación en el metabolismo del peptidoglicano en cepas hVISA/VISA hallada en esta tesis podría deberse a diversos cambios genéticos. Asimismo se encontró un aumento de la transposición de IS256 asociado a dicho fenotipo.

Descripción: Microorganismos poco frecuentes tales como Achromobacter spp., Pseudomonas putida y Sphingobacterium spp. son recuperados cada vez con mayor frecuencia de muestras clínicas de diversos tipos de pacientes, tanto inmunocompetentes como inmunosuprimidos. Esto se debe probablemente a un incremento en la sobrevida de los pacientes, a la mejora de las técnicas de aislamiento e identificación bacteriana en el laboratorio así como a la presión ejercida por la exposición repetida a la terapia antibiótica. Achromobacter, particularmente A. xylosoxidans puede asociarse a neumonía, bacteriemia e incluso meningitis. Generalmente se presenta en pacientes inmunodeprimidos, pero también se ha descripto en pacientes inmunocompetentes. Los pacientes con fibrosis quística tienen una mayor predisposición de padecer infección por este microorganismo. La identificación certera de las especies del género Achromobacter resulta difícil y generalmente los aislamientos clínicos de dicho género son referidos como A. xylosoxidans. Asimismo, otras especies del género, diferentes a A. xylosoxidans, son habitualmente consideradas microorganismos ambientales y en escasas ocasiones fueron asociadas a infecciones en humanos. Esta dificultad en la identificación determina que no sea posible evaluar la prevalencia real y el impacto clínico de las diferentes especies, siendo necesario contar con métodos confiables y específicos para identificar de manera certera las especies de Achromobacter. Uno de los objetivos del presente estudio fue contribuir a la identificación de estas especies a través de técnicas rápidas y sencillas que permitan un rápido diagnóstico y la implementación de terapias adecuadas. Hemos evaluado la eficiencia de diferentes técnicas feno y genotípicas empleadas en la identificación de aislamientos de Achromobacter spp. Las técnicas basadas en la secuenciación de múltiples alelos (MLST) y la secuenciación de nrdA resultaron las más apropiadas para arribar a la correcta identificación de las especies de Achromobacter. Asimismo, como parte de este trabajo, hemos descripto la presencia de nuevos genes blaOXA, ubicuos y específicos de A. ruhlandii, A. insuavis y A. dolens, que resultaron útiles en la identificación, constituyendo marcadores especie específicos. La correcta identificación de las especies de Achromobacter ha permitido reportar el hallazgo de especies diferentes a A. xylosoxidans en muestras clínicas, tales como A. ruhlandii, A. dolens, A. spiritinus, A. marplatensis, A. insolitus, A. spanius, A. pulmonis. Achromobacter spp. presenta naturalmente multirresistencia a antibióticos como muchos ?-lactámicos de amplio espectro, fluoroquinolonas, aminoglucósidos y trimetoprima-sulfametoxazol. En este trabajo se reporta la emergencia de aislamientos que presentaron resistencia a carbapenemes, cuyos mecanismos fueron parte del estudio. Distintos ensayos indicaron la presencia de una enzima con actividad de carbapenemasa. Se caracterizó una de las enzimas identificadas en el estudio, OXA-258a, la cual no sería responsable de dicha resistencia. Asimismo se identificó una nueva enzima de tipo AmpC, la cual se pretende caracterizar. Si bien son poco frecuentes, en este estudio hemos caracterizado dos brotes debidos a aislamientos de Achromobacter genogrupo 20, identificando en uno de ellos el posible nexo epidemiológico. Cabe señalar la importancia de contar con herramientas que permitan un rápido análisis de estas situaciones con el fin de instaurar medidas tendientes a evitar la diseminación de este microorganismo. Las especies del género Sphingobacterium son bacilos gram negativos no fermentadores ubicuos en la naturaleza, y que rara vez producen infecciones en humanos. Los carbapenemes resultan activos frente a aislamientos de este género si bien hemos detectado en este estudio la emergencia de cepas con resistencia disociada (resistentes a imipenem y sensibilidad a meropenem). Se evidenció que esta resistencia podría deberse a la pérdida o disminución de la expresión de una proteína de membrana externa (OMP) de aproximadamente 50 kDa, la cual se intentó identificar por distintas metodologías. La proteína fue digerida y los péptidos resultantes se analizaron mediante MALDI-TOF. Aún no se ha podido dilucidar la secuencia completa de la proteína dado que hasta el momento en la base de datos empleada no existe ninguna proteína que comparta cierto grado de identidad. Pseudomonas putida es un bacilo gram negativo no fermentador que se encuentra con frecuencia en el medio ambiente. Sin embargo, durante las últimas tres décadas, se ha reportado como agente causal de diferentes infecciones asociadas al cuidado de la salud. La resistencia a carbapenemes es infrecuente en esta especie y no se ha reportado previamente la resistencia disociada a estos agentes. Se estudiaron 3 aislamientos de P. putida, recuperados de pacientes internados que presentaron resistencia a meropenem y sensibilidad a imipenem. Se estudió fenotípicamente la expresión de bombas de eflujo empleando inhibidores y se evaluó el nivel de expresión de la bomba de eflujo ArpABC por RT-PCR. Se determinó que la sobreexpresión de la misma podría contribuir a la resistencia a meropenem en aquellos aislamientos de P. putida que presentan resistencia disociada a carbapenemes, similar a lo observado para los sistemas de eflujo en Pseudomonas aeruginosa.

Descripción: Se analizaron más de 700 muestras de pacientes con fenotipos hematológicos portadores de hemoglobinopatías estructurales, de talasemias menor, mayor y no transfusión dependiente.nSe actualizó la frecuencia de ?-talasemia en 417 familias: 9 mutaciones se describieron por primera vez en Argentina.nSe caracterizaron 5 mutaciones con fenotipo de talasemia dominante: Hb Durham-N.C., y 4 nóveles: Hbs Tavapy(HBB:c.182_187delCTCATG), JC-Paz(HBB:c.34_42delGTTACTGCC), Wilde (HBB:c.270_273delTGAG) y Patagonia(HBB:c.296_297dupGT).nLas deleciones son las mutaciones ?-talasémicas más frecuentes (-?3,7, --MEDI, --CAL/CAMP y ?SEA). Se detectaron 3 deleciones nóveles: --BA, --PA y --LU, esta última en un paciente con retraso mental y rasgos de ATR-16. Se caracterizaron mutaciones puntuales, 3 nóveles: HBA1:c.301-2A>T, HBA1:c.187delG(p.W62fsX66) y HBA1:c.237delC(p.Asn78Lysfs*6).nLa Hb S fue la hemoglobinopatía estructural prevalente y en forma esporádica se detectaron hemoglobinas inestables, con afinidad aumentada por el oxígeno y metahemoglobinas.nSe hicieron estudios de asociación genotipo-fenotipo para marcadores asociados a variación de Hb F.nEn pacientes con talasemia intermedia, se estudiaron modificadores primarios, secundarios y terciarios. Se detectaron 2 duplicaciones del cluster de ?-globina, una caracterizada por array-CGH, ((arrChr16(16p13.3; 88165- 230724)x3).nSe confeccionaron perfiles genotipo-fenotipo, y algoritmos de trabajo para la caracterización molecular.nSe espera que estos conocimientos sean en beneficio de las familias afectadas.

Descripción: El flujo de agua en la raíz se describe como un circuito hidráulico donde la vía celular es poco conductora que no evidencia las propiedades de las membranas biológicas (selectividad y especificidad). En esta tesis, se caracterizaron las propiedades hidráulicas de la raíz de Beta vulgaris en la respuesta a corto plazo desencadenada ante el incremento de salinidad del suelo. El órgano raíz, presentó una estrategia hidráulica en forma bimodal, supeditada a un sistema tipo interruptor (switch) mediado por el gradiente de potencial hídrico (??????? ????? ). En cambio, a nivel celular la capacidad de transporte de agua de la raíz estaría acoplada a un transporte de solutos que resultó independiente de ??????? ?????. Estos resultados sugieren una vía celular activa en la raíz que puede sostener el flujo de agua hacia a la parte aérea, mediante un reducido apoplasto radial y el acoplamiento de flujo de agua a un mecanismo de transporte activo. De esta manera, la dirección del flujo de agua no se encuentra simplemente sujeta al gradiente de potencial hídrico y da cuenta de la existencia de mecanismos sumamente específicos para sostener y garantizar la entrada de agua desde el medio externo hacia la parte aérea.

Descripción: Los receptores de glutamato NMDA (RNMDA) están involucrados en aprendizaje y formación de una nueva memoria. Son fundamentales en la codificación y ?almacenamiento? de información y necesarios en la evocación. Juegan un rol crítico en el establecimiento y mantenimiento de plasticidad sináptica y en la formación y estabilización de las sinapsis durante el desarrollo. Los RNMDA son heterotetrámeros compuestos por dos subunidades GluN1, obligatorias para el ensamblado, y dos subunidades regulatorias: GluN2 (A, B. C o D) o GluN3 (A o B). GluN2A y GluN2B son las subunidades regulatorias más abundantes en telencéfalo, especialmente en regiones del SNC relacionadas con memoria y aprendizaje, como hipocampo, amígdala y corteza prefrontal (CPF). En este trabajo de Tesis, nos propusimos evaluar si la adquisición de distintos tipos de aprendizaje y la inducción de plasticidad sináptica producían cambios en los niveles de las subunidades GluN1, GluN2A y GluN2B del RNMDA. En la primera parte, se analizaron posibles cambios en las subunidades del RNMDA durante la consolidación y luego de la evocación de una memoria. Se entrenaron ratas Wistar en distintos paradigmas: habituación al campo abierto (CA), reconocimiento de objetos (RO) y localización espacial de objetos (LO). Luego del entrenamiento o del testeo, los animales fueron eutanasiados y se extrajeron hipocampo, CPF y amígdala para ser analizadas por western blot (WB). Los animales de 1, 2, 3 y 12 meses se habituaron al CA durante la sesión de 5 minutos. En los animales de 1, 2 y 3 meses pero no en los de 12 meses, los niveles de las subunidades GluN1 y GluN2A aumentaron en hipocampo, 70 minutos después de una sesión de CA capaz de generar habituación al ambiente. Este aumento es transitorio, ya que los niveles disminuyen significativamente, siendo indistintos del control a los 90 minutos. Por otro lado, 70 min luego de la evocación de una memoria reciente (1 día) o de una memoria remota (2 meses), hubo un aumento en los niveles de GluN1 y GluN2A en la CPF, involucrando a esta estructura en ?el almacenamiento? o ?persistencia de la traza? de esa memoria del ambiente. También hubo aumento de GluN1 y GluN2A en hipocampo, 70 min luego del entrenamiento en el CA con dos objetos novedosos (igual para RO y LO), lo que permite sugerir que podría tratarse de un mecanismo general relacionado con la formación de una memoria espacial. Por otra parte, 70 min después del test de LO, hubo un aumento de GluN1 y una disminución de GluN2B en hipocampo, mientras que no se detectaron cambios luego del testeo de RO, lo que podría ser explicado porque el RO es independiente del hipocampo (en esta etapa, en que se trata de la discriminación de objetos), mientras que LO sí depende de dicha estructura. Aunque los cambios detectados indican un posible aumento del RNMDA, aparece una disminución de GluN2B; podría tratarse de un mecanismo diferente relacionado con la formación de una memoria espacial sobre un ?engrama similar?. En la segunda parte, evaluamos el efecto de la inducción de plasticidad sináptica en los RNMDA, utilizando un modelo in vitro. Cultivos primarios de neuronas hipocampales (14DIV) fueron estimulados mediante pulsos de KCl. Las neuronas fueron fijadas a distintos tiempos y se evaluaron las subunidades del RNMDA mediante inmunofluorescencia. Comprobamos que existen aumentos de GluN1 y Glun2A similares a los observados in vivo. Sin embargo, dada la compartimentalizacion en la expresión proteica, el análisis de este aumento debe ser considerado por separado, ya que también los mecanismos moleculares involucrados son distintos según la subunidad y el compartimiento analizado. a. En somas, similar a lo observado in vivo, el aumento resulta significativo a los 70 min del estímulo, b. mientras que en dendritas, el aumento ocurre a partir de los 30? para GluN2A y de los 45 min para GluN1. c. En ambos compartimientos, a los 90 min los valores fueron similares a los controles, mostrando su carácter transitorio. d. El aumento de GluN1 en el soma, depende principalmente de: síntesis de novo de mensajeros y de traducción, mientras que a nivel de dendritas, depende de movilización desde pooles ya traducidos, retenidos en el RE a ese nivel. e. El aumento de GluN2A en el soma depende exclusivamente de traducción de mensajeros silenciados, mientras que en las dendritas, el aumento a los 75 min del estímulo tiene dos componentes: transporte de receptores GluN2A-RNMDA ya ensamblados y traducción de mensajeros locales silenciados. Estos aumentos, así como los aumentos in vivo, fueron transitorios, ya que disminuyeron a niveles no diferentes del control a los 90 min, tanto en dendritas como en los cuerpos neuronales. Los resultados in vivo e in vitro muestran que, luego de inducción de plasticidad o luego de un aprendizaje espacial novedoso, hay incremento de las subunidades GluN1 y GluN2A en hipocampo con curso temporal semejante, lo que permite hipotetizar que: ?habría un aumento en los RNMDA posiblemente conteniendo GluN2A, que podría actuar como una señal duradera, contribuyendo a marcar sinapsis involucradas (tagging?), dando lugar al establecimiento y mantenimiento de la plasticidad sináptica, que constituiría parte de la traza de una nueva memoria.? Como última parte, desarrollamos vectores derivados de virus adeno-asociados (AAV), capaces de codificar para un short-hairpin RNA (sh-RNA) anti- GluN2A (sh2A). Pudimos demostrar que la infección con el vector AAV-sh2A disminuyo la expresión de GluN2A, por lo que constituiría una herramienta útil para el estudio de los RNMDA conteniendo GluN2A, tanto in vitro como in vivo. Además, observamos que la disminución de GluN2A en las neuronas transducidas, produjo aumento del número total de espinas, principalmente de espinas inmaduras.

Descripción: Los interferones tipo I (IFN I) son elementos claves en la respuesta inmune antiviral que regulan diferentes procesos de varios tipos celulares gracias a su capacidad inmunomoduladora y antiproliferativa. Varios tipos de interferones han sido aprobados para su uso en humanos para el tratamiento de la hepatitis C y, junto con la quimioterapia y la radioterapia, en el tratamiento del cáncer entre otros. A pesar de sus efectos beneficiosos, uno de los efectos no deseados es la inducción de trombocitopenia debido a su efecto antiproliferativo. Además, la disminución del número de plaquetas es un fenómeno frecuentemente observado durante el curso de diferentes infecciones virales. Estudios previos incluyendo reportes de nuestro grupo, mostraron que los IFN I eran capaces de regular selectivamente la producción plaquetaria abriendo nuevos mecanismos sobre el modo de acción de esta citoquina. De esta manera, en este trabajo de Tesis profundizamos el conocimiento del rol de los IFN I sobre el proceso de megacario/trombopoyesis. Utilizando un modelo de generación de megacariocitos y producción de plaquetas humanas in vitro encontramos que el Poly (I:C) (mimético de los productos ARN doble cadena de replicación viral e inductor de la síntesis de IFN I), además de alterar cuantitativamente la biogénesis plaquetaria, también produce alteraciones a nivel cualitativo ya que las plaquetas de cultivos tratados con este ARN doble cadena presentaron una menor capacidad de unir fibrinógeno, una de sus principales funciones hemostáticas. Esta alteración fue reproducida por IFN? y ??recombinante humano y no estuvo asociada a una menor expresión de su principal receptor, la integrina ?IIb?3. Los hallazgos in vitro fueron confirmados en modelos experimentales in vivo en los cuales se observó que la administración de Poly (I:C) en ratones indujo un aumento en los niveles de IFN? tanto plasmáticos como medulares. Este aumento se vio acompañado de una disminución en el recuento plaquetario y un aumento en el volumen plaquetario medio (VPM). La trombocitopenia no fue debida a un mayor consumo de plaquetas ni a un menor número de megacariocitos, sino a un aumento en el tamaño de los mismos y un menor contacto con los sinusoides medulares. Las plaquetas de los animales tratados mostraron disminuida su función hemostática (unión de fibrinógeno y liberación de factor von Willebrand) y pro inflamatoria (exposición de P-selectina, formación de agregados mixtos y liberación de RANTES). La alteración en el recuento y la funcionalidad plaquetaria tuvieron un fuerte impacto en la hemostasia primaria prolongando el tiempo de sangría y disminuyendo la adhesión de las plaquetas. Sin embargo, de manera contraria, el spreading plaquetario y la retracción del coágulo fueron mayores. Las alteraciones observadas tanto en el tamaño de los megacariocitos como en su distribución en la médula ósea, así como en las respuestas efectoras de las plaquetas mostraron una correlación lineal con los niveles de IFN I producidos, fueron reproducidas por la administración de Imiquimod (un inductor de IFN I estructural y funcionalmente diferente al Poly (I:C)) y ninguna de ellas se observó en ratones deficientes del receptor de los IFN I que fueron tratados con ambos inductores. En conjunto, estos datos presentan a los IFN I como nuevos reguladores de la megacario/trombopoyesis y señalan que el aumento de estas citoquinas podría ser uno de los mecanismos asociados a la trombocitopenia que subyace a las infecciones virales u otras patologías que cursan con altos niveles de IFN I. Además, estos hallazgos abren nuevas avenidas para la investigación de los procesos que subyacen a la fisiopatología de la biogénesis plaquetaria.

Descripción: Para llevar a cabo este estudio, se purificaron los antígenos a homogeneidad, se sometieron a tratamientos de desulfatación y se inmunizaron conejos y ratones con las moléculas tal cual y desulfatadas. La cruzipaína, cisteína proteinasa principal de Trypanosoma cruzi, contiene oligosacáridos sulfatados de alta manosa como componentes de esta glicoproteína. Hemos determinado previamente que estos grupos sulfato son blancos de respuestas inmunes específicas. Con el fin de evaluar los requerimientos estructurales para el reconocimiento inmune y teniendo en cuenta que el epitope de Cz sulfatado aislado no esta disponible en cantidades suficientes para desarrollar estudios sistemáticos de estructura-actividad, llevamos a cabo un análisis indirecto de las características químicas necesarias para la unión de los anticuerpos al epítope sulfatado de la Cz mediante inmunoensayos. Con este objetivo, diferentes moléculas sintéticas fueron acopladas a la/las proteínas BSA y aprotinina y confrontadas con: i) sueros de ratones específicos para Cz y C-T, ii) anticuerpos producidos en conejos inmunizados con Cz y C-T , y iii) IgGs purificadas a partir de sueros de pacientes con Enfermedad de Chagas crónica. Nuestros resultados indicaron que una glucosamina conteniendo un grupo sulfato esterificado en posición O-6 y un grupo N-acetilo fue el epítope preferido para el reconocimiento inmune del suero específico para Cz y su dominio Cterminal. Si bien en menor grado, otros compuestos que contienen diferentes grupos aniónicos cargados fueron también reconocidos. Finalmente, nuestros hallazgos mostraron que la afinidad del C-T por los anticuerpos IgGs purificados de suero de ratón específico para este dominio, así como también de sueros de pacientes con Enfermedad de Chagas es inhibida por el azúcar sintético aniónico NAcGlc6SO3, evidenciando que estos motivos carbohidrato sulfatados juegan un rol central en la unión de este antígeno mayoritario a sus anticuerpos específicos, imitando al epitope sulfatado de la Cz ubicado en los N-glicanos de la extensión C-terminal de la molécula de Cz. La caracterización del epítope sulfatado de la cruzipaína hizo posible el estudio de una serie de inmunizaciones con el dominio C-T, el epítope sulfatado y con IgGs sulfato-específicos. Se inmunizaron ratones BALB/c con C-T y C-Td. Los inmunizados con C-T mostraron relación IgG2a/IgG1<1, bajos niveles de IL-4 y elevada concentración de IFN-?.por ELISA de captura usando C-T como estímulo y un perfil de citoquinas compatible con una respuesta mixta con tendencia Th2 con niveles excesivamente elevados de IFN? e IL-17. Los inmunizados con C-Td presentaron una IgG2a/IgG1<1; IL-4 indetectable, bajo nivel de IFN-? y un perfil de citoquinas similar al control con IL-10 significativamente elevado. Se observaron alteraciones ultraestrucurales cardíacas y mayor inmunoreconocimiento de fibrillas y mitocondrias en inmunizados con C-T con suero policonal anti-Cz y anti-Cz/d ads con miosina. Luego del desafío subletal se observaron parasitemias elevadas. La mortalidad fue del 20% en inmunizados con C-T y 80% en inmunizados con C-Td, observando severas alteraciones musculares en los sobrevivientes del grupo C-Td. Se acopló a BSA NAcGlc6SO3 y NAcGlc. Los inmunizados con BSA-NAcGlc6SO3 montaron una respuesta inmune con predominio de IgG1 e IgG2b seguido de IgG2a, y respuesta celular T de memoria, mientras en el grupo BSANAcGlc predominó IgG2a. Luego de la infección subletal, los inmunizados con el epítope sulfatado desarrollaron parasitemias excesivamente elevadas y niveles similares de IFN-? que el grupo BSANAcGlc que presentó ~70 % de mortalidad. Se purificaron IgGs a partir del suero de los inmunizados con BSA-NAcGlc6SO3 y de ratón pre-inmune y se hizo tratamiento por tranferencia pasiva de anticuerpos. Los ratones que recibieron IgGs sulfato-específicos presentaron alteraciones ultraestructurales en tejido cardíaco. Luego del desafío, los que recibieron IgGs sulfato-específicos presentaron mayores parasitemias que los controles. Se determinó la variación de los nivesles de IgG2 sulfato específicos en pacientes con enfermedad de Chagas crónica durante la progresíon de la enfermedad cardíaca. Los ensayos realizados permitieron evaluar el rol de los epítopes sulfatados presentes en glicoconjugados de T. cruzi en la infección y patogenia de la enfermedad de Chagas.

Descripción: La Na+/K+-ATPasa es una enzima multimérica integral de la membrana plasmática de células animales. Su función es catalizar el trasporte activo de tres iones Na+ desde el citoplasma hacia el medio extracelular y de dos iones K+ en sentido inverso, empleando la energía proveniente de la hidrólisis de una molécula de ATP. Como consecuencia de su actividad, la Na+/K+ ATPasa juega un papel esencial en la homeostasis celular y diversos procesos de transporte.nDurante su funcionamiento la enzima alterna entre dos conformaciones (E1 y E2) que exponen sitios de unión hacia los lados intracelular y extracelular de la membrana, respectivamente, y que difieren en su afinidad por el Na+ y el K+. El transporte de los iones requiere que en algún momento éstos se encuentren ?ocluidos?, es decir, que sean inaccesibles desde ambos lados de la membrana. La liberación del K+ ocluido en E2 es el paso limitante del ciclo de reacciones, y es acelerada marcadamente por la unión de ATP a un sitio de baja afinidad, sin ser hidrolizado.nLa acción moduladora del ATP sobre la desoclusión de K+ ha sido extensamente estudiada, aunque en condiciones experimentales dispares. Por otro lado, se cuenta con información escasa y contradictoria sobre el efecto del nucleótido sobre la reacción inversa, que conduce a la oclusión de K+ a través de la llamada ruta directa, ya que la elevada velocidad de las reacciones involucradas limita el espectro de técnicas aplicables a su estudio. Como consecuencia, no se han propuesto modelos cinéticos detallados que expliquen de forma integral cómo el ATP ejerce sus efectos modulatorios, y que contribuyan a describir los pasos involucrados en el transporte de K+ en presencia del nucleótido.nCon el objeto de resolver esa falencia, en este trabajo nos hemos propuesto caracterizar cinéticamente tanto la desoclusión de Rb+ (uncongénere del K+) comosu oclusión a través de la ruta directa, en un amplio intervalo de concentraciones de Rb+ y de ATP. Para ello se empleó una técnica desarrollada en nuestro laboratorio que permite el estudio de reacciones en el rango de los milisegundos. Los experimentos mencionados se complementaron con el análisis de las modificaciones que el ATP induce en la cantidad de Rb+ ocluido en condiciones de equilibrio.nLos resultados mostraron que el ATP cambia de hiperbólica a sigmoide la curva de Rb+ ocluido en el equilibrio versus , induciendo a su vez una disminución de la afinidad aparente por el catión sin alterar la capacidad de oclusión de la Na+/K+ ATPasa. La cantidad de Rb+ ocluido extrapolada a una concentración infinita del catión correspondió a 2 moles de Rb+ por mol de enzima activa independientemente de la concentración de ATP.nLas curvas de incremento en el tiempo de la cantidad de Rb+ ocluido, tanto en presencia de ATP como en su ausencia, presentaron dos fases mayoritarias y alcanzaron un valor de equilibrio en aproximadamente un minuto. De dichas fases, la más rápida fue la de mayor amplitud, siendo esto más marcado en medios de reacción con ATP, y estuvo asociada a la oclusión de más de un Rb+. El nucleótido produjo una disminución o un aumento de la velocidad inicial de oclusión cuando la concentración de Rb+ fue menor o mayor que 500 ?M, respectivamente. No obstante, en todos los casos la velocidad de la segunda fase de oclusión fue mayor en presencia de ATP.nLa desoclusión de Rb+ en ausencia de ATP se produjo a lo largo de curvas bifásicas de amplitudes similares, compatibles con una liberación secuencial y ordenada de los cationes. El ATP hizo que se perdiera esa secuencialidad y que ambos cationes fueran liberados rápidamente, independientemente del sitio de oclusión que ocupaban. Se consiguió una adecuada descripción de la información experimental con un modelo que propone que la oclusión del Rb+ puede ocurrir desde accesos intra o extracelulares. En el primer caso la unión a los sitios ocurre al azar, mientras que en el segundo es secuencial y ordenada existiendo un paso lento entre la unión de ambos cationes. La unión de ATP a la enzima promueve el cambio conformacional E2 ? E1, desfavoreciendo la oclusión y favoreciendo la desoclusión de Rb+.

Descripción: El estudio de microdeleciones en la región AZF del cromosoma Y se solicita de rutina a pacientes azoospérmicos u oligozoospérmicos severos, para predecir la recuperación de espermatozoides mediante biopsia testicular. En distintas poblaciones se ha demostrado variación en la prevalencia y efecto de estas microdeleciones. Con el objetivo de estudiar a la población argentina, se analizaron 240 hombres fértiles del haplogrupo Q3, 170 pacientes infértiles y 90 azoospérmicos. A partir de los resultados obtenidos, se descartaron deleciones constitutivas en el haplogrupo Q3, así como la asociación entre deleciones parciales y disminución del recuento espermático. Se observó una prevalencia del 11,1% de microdeleciones completas que se correlacionaron con alteraciones severas del recuento espermático, independientemente del haplogrupo del paciente. Sin embargo, las deleciones parciales se correlacionaron con determinados haplogrupos sin efecto patogénico. Únicamente las deleciones AZFbc y AZFabc presentaron ausencia de espermatozoides a nivel testicular. La existencia de pacientes azoospérmicos sin deleciones indicaría que existen otros factores que afectan la espermatogénesis. Dado que no es posible predecir la recuperación de espermatozoides empleando únicamente los marcadores recomendados, el presente trabajo culminó con el desarrollo de una herramienta para la detección de genes candidatos de la espermatogénesis. La identificación de nuevos marcadores permitirá tomar decisiones clínicas apropiadas y asesorar genéticamente a la pareja infértil.

Descripción: El cedrón (Aloysia citrodora) es la especie aromática nativa más difundida en el mundo. La fracción volátil es una de sus características más destacadas. El principal componente de su aceite esencial (AE) es el citral, que, junto con el limoneno, son los responsables del olor característico. Desde el punto de vista de su uso medicinal, es también muy importante la fracción no volátil. El verbascósido, compuesto mayoritario, ha sido determinado como uno de los responsables de sus distintas bioactividades. El desarrollo de este trabajo permitió conocer la variabilidad fitoquímica en poblaciones silvestres y cultivadas en la Argentina y establecer parámetros de calidad para sus diferentes usos. Se determinó la composición química de AE de 135 muestras por cromatografía GC-MS. Observando las diferencias en los perfiles cuali-cuantitativos, fueron agrupadas en 6 quimiotipos. El compuesto sabinona fue aislado e identificado por primera vez en un AE. Se determinó el contenido de verbascósido por HPLC en 52 muestras. El resultado promedio fue 2.1% P/P. Con esta información se espera contribuir con la redacción de normas de calidad para el cedrón argentino, las que favorecerán la elección del material genético para cultivo, permitiendo un buen manejo agrícola y compitiendo con la oferta de otros países.

Descripción: Introducción: Acinetobacter baumannii (Ab) es un patógeno principalmente intra-hospitalario. La capacidad de colonizar diversos hábitats y la versatilidad en su metabolismo ha ocasionado el incremento del número de infecciones nosocomiales. Ab no solo presenta la facultad de resistir a todas las clases de antibióticos, sino también la de adquirir fácilmente determinantes de resistencia continuamente, lo que dificulta el tratamiento adecuado y contribuye a aumentar su potencial epidémico. La hipótesis de trabajo que hemos planteado radica en que los clones de Ab circulantes en nuestra región provienen de un linaje diferente a los clones denominados ?internacionales?, los cuales se hayan ampliamente diseminados en el resto del mundo y que estos poseen rasgos y características peculiares. Asimismo, creemos que Ab posee una plasticidad genética particular, siendo esta cepa dependiente, lo cual estaría relacionado con la capacidad de adquisición de material exógeno que le permitiría evolucionar hacia la multirresistencia por mecanismos inherentes a la especie. Objetivos: 1) Realizar la secuenciación del genoma completo de al menos una cepa de Ab relevante en nuestro medio. 2) Llevar a cabo estudios de genómica comparativa de la/s cepa/s por nosotros secuenciadas con el fin de evidenciar características relevantes de dichas cepas y regiones o huellas de intercambio génico. 3) Investigar el rol de la transformación natural y su contribución en la adquisición de mecanismo de resistencia antibiótica en diferentes cepas de Ab. Materiales y Métodos: Para la secuenciación genómica, se seleccionaron dos cepas Ab (Ab33405 y A118), las cuales presentaron características particulares. La secuenciación genómica se realizó mediante Illumina MiSeq y se efectuó el ensamblado mediante el software SPAdes assembler. La anotación del genoma se realizó mediante RAST y la curación manual mediante el software BLAST con la Base de datos GenBank. Para el análisis genómico se utilizaron diferentes herramientas bioinformáticas: BLAST, Ortho-MCL, ARG-ANNOT, ISFinder, PlasmidFinder, PHAST, JmodelTest2, PhyML, etc. El MLST fue realizado según los dos esquemas disponibles. Para la investigación del rol de la transformación natural se utilizaron 10 cepas clínicas, Ab A118 y la cepa de referencia Ab ATCC 17978 y se siguió la metodología reportada por Ramirez et al 2010. Resultados: Los resultados obtenidos de la secuenciación genómica total de Ab Ab33405 y Ab A118 mostraron un tamaño de 3.923.578 pb y 3.853.242 pb, respectivamente. Se identificaron 3741 y 3633 marcos abiertos de lectura en Ab Ab33405 y Ab A118, respectivamente. Se determinó la presencia de dos genes relacionados con resistencia antibiótica compartidos entre los dos genomas y 10 genes exclusivos en Ab Ab33405. Además, observamos la presencia 35 genes relacionados con virulencia compartidos y 52 genes exclusivos en Ab Ab33405 y 53 genes exclusivos en Ab A118. Los genes de resistencia identificados como exclusivos de Ab Ab33405 se identificaron asociados a IS y transposones. También se identificó la presencia del gen comM interrumpido por la isla genómica (IG) TnAbaR en Ab Ab33405, mientras para la cepa Ab A118 dicho gen se encontró intacto. Además en ambos genomas se identificó la presencia de las islas de virulencia Locus K y Locus OC. Sumadas a las islas de resistencia y virulencia identificadas, se detectaron 13 y 7 IGs con función biológica desconocida para Ab Ab33405 y Ab A118. Además se predijeron la presencia de 8 y 2 profagos en Ab Ab33405 y Ab A118 respectivamente. La cepa Ab Ab33405 presentó un fenotipo con un pigmento azul-índigo, se identificó que el gen iacA es el responsable de dicha pigmentación por una conversión lisogénica negativa en uno de los genes en el operón que se encuentra integrado. Además, se evidenció la capacidad de Ab como transformante natural, presentando 17 genes homólogos de transformación natural. Más aún, se demostró que Ab presentaba una gran variabilidad en cuanto a la capacidad de competencia natural en las distintas cepas analizadas. Sumado a ello, se detectó para la cepa modelo Ab A118 la capacidad de adquisición de diferentes rasgos fenotípicos, como ser resistencia antibiótica, de otras especies bacterianas. Se evaluaron además, distintos factores físico y químicos que influyen sobre la frecuencia de transformación natural en Ab. Se demostró que Ab tiene la capacidad de adquirir de forma rápida ADN exógeno en un entorno con un pH 7, similar al presente en el huésped humano. A su vez, demostramos la capacidad de Ab de utilizar albumina y el calcio como moléculas inductoras de la competencia natural. Conclusión: El presente trabajo nos permitió evidenciar que la adquisición de nuevos rasgos mediante transferencia horizontal genética como por cambios puntuales permite a Ab adaptarse y evolucionar en ambientes que presentan condiciones cambiantes. Particularmente, se evidencio una gran variabilidad en el contenido de determinantes de resistencia antibiótica como de virulencia que posibilita la mayor eficiencia de sobrevivir en el huésped humano haciéndolo un patógeno nosocomial mortal. Cabe destacar la descripción de un nuevo posible factor de virulencia (iacA) que expresa un fenotipo pigmentado azul-índigo, que podría tener un rol clave en la patogénesis en infecciones urinarias. Por otro lado, el análisis de homología de genes vinculados a la transformación, así como la detección de la capacidad transformante de diferentes aislamientos de Ab nos sugiere que la transformación natural juega un importante rol en la adquisición de nuevas características que le facilitarían la adaptación y la evolución hacia la multirresistencia antibiótica. A su vez dicho proceso, se encontraría regulado por variables físicas y químicas, como puede ser la presencia de albumina sérica, calcio y un pH 7.

Descripción: La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, se caracteriza por una intensa miocardiopatía inflamatoria, cuya fisiopatogenia aún no se conoce acabadamente. Nuestro objetivo fue examinar la contribución de distintos mediadores inflamatorios a la inmunopatogénesis de la miocardiopatía chagásica y evaluar el efecto modulador que el tratamiento etiológico con benznidazol pudiera ejercer sobre estos mediadores y la patología inflamatoria. Estudiamos factores potenciales de patogenia chagásica inexplorados, como la citoquina proinflamatoria MIF, analizando su relevancia biológica en el modelo animal y en pacientes infectados con distinto grado de compromiso cardíaco. Los resultados obtenidos indican que las citoquinas y quimioquinas proinflamatorias y sus receptores específicos participan en los mecanismos inmunopatogénicos de la miocardiopatía chagásica crónica. Particularmente, destacamos el rol de MIF que, más allá de resultar fundamental para la protección en la etapa aguda de la infección por T. cruzi, mediante su persistente inducción se asocia con la evolución hacia las formas más severas de disfunción cardíaca por enfermedad de Chagas. El potencial inmunomodulador del tratamiento con benznidazol durante la fase crónica podría ayudar a equilibrar los niveles de MIF y la patología inflamatoria en esta etapa de la infección, limitando así el riesgo de daño cardiovascular a largo plazo.

Descripción: Las poblaciones naturales de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, están compuestas por múltiples clones. Se ha postulado que el polimorfismo genético de T. cruzi podría estar implicado en su respuesta diferencial a drogas. En este trabajo se caracterizó la variabilidad genética de las poblaciones de T. cruzi detectables en pacientes crónicos antes y después del tratamiento con diferentes drogas tripanocidas . Un método estandarizado de qPCR fue utilizado como marcador de falla terapéutica y sólo se incluyeron pacientes con resultados positivos en el tamizaje. Las muestras qPCR positivas pre- y pos-tratamiento fueron caracterizadas mediante análisis de patrones de secuencias de ADN satélite (ADNSat) y perfiles de PCR-RFLP de las regiones hipervariables del ADN de kinetoplasto (ADNk). El BZN y el FXN mostraron un mayor efecto tripanocida que el E1224. Los pacientes refractarios al E1224 tuvieron una variabilidad tan alta en sus poblaciones de T. cruzi pre- y pos-tratamiento como la observada en los pacientes del grupo Placebo. Nuestros hallazgos sugieren que la composición genética de las poblaciones T. cruzi circulantes durante el seguimiento reflejan la fluctuación natural de poblaciones policlonales en la infección crónica.

Descripción: La infección crónica por el virus de la hepatitis C (HCV) es un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). CORE y NS5A modularían procesos celulares potencialmente oncogénicos. Se caracterizaron molecular y biológicamente variantes de HCV de diferentes tejidos de pacientes con HCC. El genotipo predominante de la cohorte analizada (n=20) fue HCV-1b. Las secuencias de CORE y NS5A de HCV-1b presentaron diferencias moleculares frente a pacientes sin HCC. Se realizó un estudio de compartimentación a partir de 5 muestras de tejido hepático tumoral y no tumoral mediante clonado de la región CORE-E1-E2. Los resultados de los análisis filogenéticos y del test de asociación bayesiano demostraron la compartimentación del HCV entre estos tejidos. Esto sugiere que existiría un proceso de selección de las poblaciones virales durante la hepatocarcinogénesis. La expresión in vitro de CORE reveló su capacidad de estimular la proliferación celular, pero esta habilidad no difirió entre las distintas variantes analizadas. Esto indicaría que las diferencias moleculares entre los compartimentos resultarían de la adaptación viral a los diferentes microambientes hepáticos, y no estarían asociadas directamente con el fenotipo tumoral. En suma, este trabajo contribuye a la comprensión de la carcinogénesis mediada por la infección por HCV.

Descripción: Los espermatozoides de mamífero son capaces de fertilizar a un ovocito sólo luego de sufrir el proceso de ?capacitación? que ocurre en el tracto femenino y que tiene como consecuencia un aumento en la fosforilación de proteínas en tirosina (Tyr), la ocurrencia de la reacción acrosomal y el desarrollo de la hiperactividad. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar los mecanismos moleculares involucrados en las cascadas de señalización conducentes a la capacitación del espermatozoide de mamífero. Los resultados obtenidos indican que la capacitación implica la activación de PKA y la inactivación de serina/treonina fosfatasas a través de Tyr quinasas de la familia de Src, vías que convergen tempranamente a nivel de la fosforilación de los sustratos de PKA. Nuestros resultados también demuestran que la Tyr quinasa PYK2, regulada por calcio, sería la responsable de integrar distintas señales río abajo de PKA, conducentes tanto a la fosforilación en Tyr como al estado funcional del espermatozoide. Considerando que la capacitación requiere la liberación de ?factores decapacitantes? entre los cuales se encuentra la proteína epididimaria CRISP1 (Cysteine Rich Secretory Protein 1) identificada por nuestro grupo, estudiamos las vías de señalización por las cuales esta proteína regula la capacitación. Nuestros resultados utilizando CRISP1 purificada y ratones ?knockout? para dicha proteína desarrollados en el laboratorio, muestran que CRISP1 inhibe los principales canales de calcio presentes en el espermatozoide de mamífero, regulando la capacitación y el desarrollo de la hiperactividad. En conjunto, estos estudios contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos moleculares por los cuales los espermatozoides adquieren su capacidad fertilizante y al futuro desarrollo de métodos de regulación de la fertilidad y tratamiento de la infertilidad humana.

Descripción: A medida que avanzan los conocimientos y la competencia en el mercado internacional de vinos, aumentan las exigencias en cuanto a la certificación de la calidad de los mismos. En la actualidad, a nivel internacional no solo se exige que el vino sea elaborado exclusivamente a partir del jugo de uva fermentado, sino que se incluye dentro de esta exigencia los conceptos de certificación varietal y certificación del origen geográfico y cobra mayor importancia determinar si el ?Terroir? de los vinos le otorga características especiales que los distinga de otros vinos del mismo cultivar provenientes de otras zonas geográficas. Por estas razones es necesario establecer procedimientos analíticos de clasificación, diferenciación varietal y geográfica, no solo para la defensa de las exportaciones sino también para proteger las transacciones de los productores de uvas ante los elaboradores de vinos. En la presente tesis se logró optimizar un método de extracción, concentración y cuantificación mediante cromatografía gaseosa, de 73 componentes volátiles que forman parte de los aromas del vino. La caracterización analítica del perfil aromático de los vinos permitió determinar no solo componentes volátiles mayoritarios que inciden directamente sobre la percepción de los aromas de los vinos sino aquellos que se encuentran por debajo del umbral de percepción y que inciden en la percepción global de los aromas del vino diferenciándolos no solo en cuanto a su pertenencia varietal, sino también a su procedencia geográfica. Para obtener un sistema de clasificación varietal y de procedencia geográfica de los vinos blancos se trabajó sobre muestras de vino microvinificados en idénticas condiciones de maceración en frío y fermentación alcohólica de uvas provenientes de cepajes Chardonnay, Sauvignon blanc, Cereza y Torrontés riojano, de las zonas geográficas Mendoza, Valle de Uco, Zona Este, y La Rioja para la construcción del banco de datos de vinos de variedad y origen indudable. Se contrastaron con 25 muestras comerciales de diferentes variedades y zonas geográficas referidas en sus etiquetas. Mediante análisis estadístico discriminante se logró la clasificación varietal y predicción de muestras de vinos blancos comerciales y su correspondencia con la variedad indicada en sus etiquetas. Las muestras microvinificadas clasificaron el 100 % y de las muestras de vinos comerciales, el 90 % clasificaron correctamente según la variedad declarada en sus etiquetas. Respecto del estudio para establecer la posible clasificación y predicción del origen geográfico, mediante análisis discriminante se comprobó que los vinos pudieron ser diferenciados entre las provincias de Mendoza y La Rioja. Dentro de la Provincia de Mendoza se diferenciaron 3 áreas geográficas (agrupados en Zona Mendoza, Valle de Uco y Zona Este) con el 100 % de vinos de referencia correctamente clasificados. Para demostrar la influencia del ?Terroir?, es decir si los vinos de una zona en particular fueron únicos, e incapaces de ser reproducidos en otro lugar, aun cuando la variedad y técnica de elaboración se repitan con exactitud, se realizaron estudios individuales sobre las variedades (Torrontés riojano, Chardonnay y Sauvignon blanc) implantadas en la provincia de Mendoza (Zona Este, Valle de Uco) y en La Rioja utilizando la misma metodología analítica y estadística, obteniendo como resultado que 19 componentes volátiles, que conforman un ?Terroir?, tienen una influencia determinante en la tipicidad de los vinos, a través de aromas que pueden o no ser percibidos aun cuando la variedad cultivada sea la misma. Mediante este estudio se posibilita la obtención de un sistema analítico y estadístico confiable para la aplicación de la ley de Denominación de Origen, en sus artículos referidos a Indicaciones de Procedencia (IP), Indicaciones Geográficas (IG) y Denominación de Origen Controlada (DOC) Como consecuencia del estudio anterior, se encontraron en vinos cinco componentes: trans-Anetol, p-Anisaldehído, Timol, Carvacrol y Mentol, que no tienen registradas rutas metabólicas en vinos y se los relacionó con la flora autóctona como fuente externa de procedencia. Los mismos fueron encontrados en las diferentes partes de las jarillas en altas concentraciones superando ampliamente el OAV, es decir, tienen un alto impacto odorífero ambiental. Se pudo comprobar que algunos de los compuestos volátiles que diferenciaron zonas geográficas fueron absorbidos a través de las raíces de las vides con una permanencia disímil durante 4 semanas en las partes verdes de las plantas. Se verificó la existencia en la pruina de las bayas, aunque en diferentes concentraciones, de los 5 compuestos, coincidiendo sus abundancias relativas a la mayor densidad arbustiva de las jarillas. Por medio del estudio de conglomerados se observó una relación jerárquica entre las jarillas, los viñedos, las pruinas y los vinos en cuanto a la composición y concentración de compuestos aromáticos presentes en todos ellos, existiendo además, una fuerte relación entre los compuestos hallados en vinos y pruinas con las hojas, raíces y polen de jarillas llegando a los viñedos a través del polen y sus frutos para ser luego absorbidos por raíces de las vides y también por adsorción sobre las pruinas para llegar finalmente a los vinos. Por lo que se concluye que existe una unidad de ecosistema interactivo por el traslado a través del viento del polen y sus frutos hacia la zona geográfica de influencia. Finalmente se concluye que el paisaje, entendido en este trabajo como la flora autóctona y específicamente las jarillas, integran un ?Terroir?, mediante interacciones con los viñedos a través de intercambios, contribuyendo junto con el resto de otras variables que definen un ?Terroir?, a la obtención de vinos que sean únicos e irrepetibles aun cuando la variedad de origen sea la misma.

Descripción: El estudio de las interacciones entre los cultivos y los insectos plaga es de suma importancia a nivel mundial, ya que permite la generación de herramientas tecnológicas para lograr una producción agrícola sustentable sin perder rentabilidad. La soja es el principal cultivo de Argentina y el complejo de chinches es unas de las principales plagas de este cultivo, frente a la que no se tienen tecnologías alternativas a los pesticidas químicos. Los insectos plaga han logrado desarrollar mecanismos para tolerar las defensas de las plantas y, en algunos casos esta tolerancia es debida a la presencia de ciertas bacterias intestinales. A pesar de la importancia de la chinche verde como plaga de soja, se conoce muy poco sobre su flora intestinal, y las consecuencias de la presencia de estas bacterias sobre la biología de la chinche verde. En esta tesis se analizó la relación bacteria-chinche verde-soja, con el objetivo de estudiar el papel de las bacterias en el intestino de la chinche verde en la interacción planta-insecto. Para ello se caracterizó la comunidad microbiana del insecto en zonas productoras de soja y se puso a prueba la funcionalidad in vitro e in vivo. Para la caracterización de las comunidades microbianas se utilizó el análisis automático del espaciador intergenico (ARISA) y cultivos en placas, y las bacterias aisladas se identificación por secuenciación del 16S ARNr. Los resultados indican que los ventrículos (V2-V3) donde se produce la digestión de la dieta pueden presentar bacterias con una riqueza variable entre 0 y 5 especies. La frecuencia en la presencia de bacterias en el intestino medio fue del 24% y se encontró una mayor abundancia relativa de enterobacterias y enterococos, entre 103 y 106 UFC/mg de intestino, y una menor abundancia relativa de una microbiota transitoria conformada por Bacillus, Micrococcus, actinobacterias y otros, y que no superó 100 UFC/mg intestino. Se vio que los géneros Yokenella y Enterococcus fueron los más frecuentes y la probabilidad de encontrarlos aumentó con el índice de agriculturización. Además, estos géneros estuvieron estrechamente emparentadas con las aislados en Brasil. También se confirmó la presencia de un simbionte alojado en la cloaca (V4) de la chinche verde y filogenéticamente emparentado con Erwinia. Para evaluar la funcionalidad in vitro de las bacterias aisladas del intestino medio V2-V3 de la chinche verde se utilizaron pruebas bioquímicas y medios específicos. También se realizaron ensayos de fermentación de harina de soja, para evaluar el efecto de la fermentación sobre los inhibidores de cistein proteasas que pueden afectar las enzimas digestivas de la chinche verde. Los resultados indicaron que las yokenellas no tienen la capacidad de degradar los componentes de la dieta más importantes: proteínas de reserva y sacarosa. Sólo algunas cepas pudieron degradar lípidos. Los enterococos no pudieron degradar proteínas ni lípidos, aunque sí degradaron sacarosa. De todas maneras, el proceso fermentativo redujo el poder inhibitorio de la harina de soja frente a la cistein proteasa Papaína, in vitro. Para evaluar la interacción bacteria intestinal-chinche verde se utilizaron metodologías de eliminación de las bacterias intestinales y reinfección con cepas puras. Los resultados mostraron que el índice de infección de los ventrículos V2-V3 de las ninfas de 1er estadio en cautiverio es baja, lo que indica una transferencia ineficiente de estos simbiontes desde la madre hacia la descendencia. En ensayos de reinfección se vio que Yokenella sp. NvU02 afecta negativamente el desarrollo de las ninfas en 2do estadio y 4to estadio generando un índice de mortalidad del 80% en 6 y 20 días respectivamente. Los adultos infectados con Yokenella sp NvU02 no se vieron afectados en su supervivencia, ni se ven alterados los índices de peroxidación lipídica o actividad proteolítica intestinal. Se vio además, que la ausencia del simbionte ubicado en la cloaca (v4) no afecta la supervivencia, ni el desarrollo de las ninfas que se alimentan de soja en cautiverio. Para los experimentos en los que se evaluó la interacción bacteria intestinal-chinche verde en plantas de soja los resultados indicaron que las bacterias tienen un efecto negativo sobre el desarrollo de las chinches cuando se alimentan de plantas de soja, ya que disminuyen el peso final alcanzado por las ninfas en 5to estadio. Se vio que afectan negativamente la actividad proteolítica del intestino y aumentan la peroxidación lipídica. La supervivencia de las ninfas infectadas con Yokenella sp. NvU02 sólo se vio afectada en los estadios más jóvenes. Además, cuando la chinche verde infectada con Yokenella sp NvU02 se alimenta sobre plantas de soja a campo, el insecto puede eliminar estas bacterias del intestino. Los resultados de esta tesis demuestran que las bacterias encontradas en el intestino de la chinche verde en zonas productoras de soja de Argentina, no tienen un efecto positivo sobre los insectos que facilite su alimentación de la soja. Contrariamente a lo esperado, las bacterias mostraron efectos negativos sobre las chinches, disminuyendo su supervivencia, crecimiento y desarrollo. Tanto en cautiverio como en plantas de soja, los estadios ninfales jóvenes fueron más susceptibles a la infección bacteriana, mientras que los estadios más avanzados (adultos) toleran la infección y la presencia de bacterias en el intestino medio. La presencia de bacterias en el intestino está relacionada con la diversidad de hospederos y el índice de agriculturización, por lo tanto las bacterias deben tenerse en cuenta cuando se estudia la interacción entre la chinche verde y la soja.

Descripción: RAC3 es un coactivador de la transcripción de ciertos factores y receptores nucleares que colabora en la actividad biológica de estas moléculas facilitando la expresión génica. Originalmente fue descripto como específico de receptores de hormonas esteroideas, con actividad acetilasa de histonas y la capacidad de remodelar la cromatina facilitando la expresión de genes blanco de estas hormonas. Se lo encontró sobre-expresado en tumores dependientes de las mismas y por esta razón se lo asoció a tumorigénesis hormono-dependiente. Sin embargo, años más tarde, nuestro grupo y otros investigadores hemos demostrado que RAC3 es un coactivador para otros factores de transcripción y tiene además otras funciones a nivel citoplasmático por las cuales contribuye al desarrollo tumoral de una gran variedad de tumores dependientes o no de hormonas, por lo cual hoy día se define como un oncogén. Hemos demostrado previamente que RAC3 es un coactivador de NF-?B, aumentando su actividad transcripcional, así como la expresión de algunos de sus genes blanco. Muchos de estos genes están vinculados a la respuesta inflamatoria, así como al control de ciclo celular, proliferación, expresión de moléculas de adhesión y otros responsables de la supervivencia celular, todos ellos a su vez relacionados con el proceso de tumorigénesis. Estos hallazgos motivaron la búsqueda de niveles elevados de RAC3 en otros tumores no específicamente respondedores a hormonas esteroideas y hoy día se sabe de su alto título en una gran variedad de tumores como el de hígado, páncreas, estómago y la lista crece. También demostramos que su sobre-expresión contribuye al desarrollo tumoral inhibiendo la apoptosis inducida por vía de membrana y mitocondrial, en células tumorales y no tumorales. Su acción protectora de la supervivencia se debía no solo a su actividad remodeladora de la cromatina aumentando la expresión de genes anti-apoptóticos, sino también a acciones citoplasmáticas como la regulación de actividad de kinasas y el transporte de moléculas como AIF desde la mitocondria hasta el núcleo celular, demorando su ingreso a núcleo por asociación con la maquinaria motora de citoesqueleto. A diferencia de otros oncogenes conocidos, en el caso de RAC3, su rol oncogénico no depende de la expresión de variantes por mutación, sino que, la sola sobre-expresión es suficiente. Consecuentemente, su expresión en células normales, no tumorales, es limitante y en ocasiones indetectable por técnicas habituales de determinación de proteínas. Sin embargo, sus altos niveles de expresión en tumores, en la mayoría de los casos no se debe a amplificación génica y los mecanismos que controlan su expresión aún no han sido esclarecidos. En este trabajo de tesis, se investigaron los posibles mecanismos responsables del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Demostramos que la respuesta inflamatoria inducida por administración de LPS in vivo en ratones produce el aumento en los niveles de RAC3 en bazo y que ésto ocurre a nivel transcripcional, lo cual, además y como era esperado, fue antagonizado por glucocorticoides, dada su conocida acción anti-inflamatoria. Resultados similares fueron obtenidos in vitro por tratamiento de la línea celular HEK293 con TNF (una de las citoquinas inflamatorias inducidas por LPS in vivo). Se realizó una búsqueda de posibles secuencias regulatorias de la expresión génica de RAC3 en su promotor y encontramos sitios de unión para NF-?B, pero no para GR. Clonamos un fragmento de promotor conteniendo estas secuencias y por ingeniería genética diseñamos un plásmido en el que el promotor de RAC3 fue subclonado río arriba del gen reportero de Luciferasa. A través de estudios in vitro, por ensayos reporteros en células transfectadas con esta construcción, demostramos que TNF o una sobre-expresión de Rel-A (uno de los componentes del dímero de NF-?B) activa el promotor de RAC3. Por ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina, confirmamos que los sitios de unión para NF-?B en el promotor de RAC3 son funcionales y que, efectivamente, la activación de la expresión génica de RAC3 inducida por la respuesta inflamatoria ocurre a través de estas secuencias que unen NF-?B. De acuerdo con las evidencias previas de inhibición de la apoptosis por una sobre-expresión de RAC3, se investigó además su posible rol en autofagia, cuyo rol en tumorigénesis es dual. En principio, el proceso opera con el objeto de eliminar desde moléculas mal plegadas hasta organelas dañadas y de este modo preservar la supervivencia celular, sin embargo, cuando ocurre de modo exacerbado puede llevar a la muerte celular. En situaciones de estrés, ayuno o falta de oxígeno a los cuales la vía de señales dependiente de mTOR es sensible, se activa la autofagia con el objeto de obtener energía para la supervivencia celular a partir del reciclado de moléculas propias. Esto es precisamente lo que les ocurre a las células menos expuestas en una masa tumoral. En estos estudios demostramos que RAC3 tiene un rol protector de autofagia inducida tanto por ayuno como por inhibición de la vía mTOR por Rapamicina. Demostramos además, que la hipoxia inhibe la expresión de RAC3 generando un ambiente permisivo para que la autofagia ocurra, permitiendo la supervivencia tumoral. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis, demuestran que la participación de RAC3 como regulador de la autofagia es un mecanismo adicional a los ya descriptos por los cuales promueve tumorigénesis y el microambiente inflamatorio tumoral podría contribuir en la regulación de la expresión de RAC3 y su acción oncogénica.

Descripción: La definición clásica de estrés oxidativo lo presenta como un desbalance entre las especies oxidantes y antioxidantes, a favor de las primeras. Estas incluyen a las especies reactivas del oxígeno (ROS) tales como el peróxido de hidrógeno (H2O2), peróxidos orgánicos (ROOH), oxígeno singulete (1O2) y radicales libres como anión superóxido (O2??) radical hidroxilo (HO?), radicales peroxilo (ROO?), entre otros. La ?hipótesis redox? amplía este concepto al postular que el estrés oxidativo se debe a procesos oxidativos que alteran el balance redox celular dado por los grupos tioles (-SH), compuestos de bajo peso molecular como el glutatión (GSH) o proteínas involucradas en las vías de señalización y funciones fisiológicas. El objetivo de este trabajo fue estudiar el estrés y daño oxidativo considerado como un mecanismo común en la toxicidad celular y tisular generada por la exposición a agentes tóxicos oxidantes en diferentes modelos experimentales, y comprobar el efecto del tratamiento con sustancias antioxidantes. Se postula que la exposición a material particulado (PM) de la combustión de biomasa produce daño oxidativo celular e inflamación mediante la producción de ROS, produjo una disminución de la viabilidad y aumento de la producción de ROS en células de pulmón, dependiendo del tamaño y de la composición del material particulado. Sin embargo, no se pudieron prevenir los efectos tóxicos del material particulado en células epiteliales y macrofagos al suplementarlas con sustancias antioxidantes. Se estudió el daño oxidativo en hígado y cerebro de rata en un modelo in vivo por sobrecarga de hierro (Fe) y cobre (Cu), dado que se sabe que estos metales son capaces de producir el radical HO? mediante la reacción de Fenton/Haber-Weiss. Se observaron aumentos de la producción de ROS, daño oxidativo a biomoléculas, consumo de antioxidantes endógenos y alteraciones de las defensas antioxidantes enzimáticas dependientes de la dosis y el tiempo de exposición, para la sobrecarga aguda y crónica de ambos metales, acompañados siempre de un incremento de la concentración del metal en los órganos estudiados. En la sobrecarga aguda de Fe y Cu se encontró que los aumentos de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y catalasa, responsables de detoxificar las células de O2?- y H2O2, están relacionados con un aumento de la expresión de dichas enzimas, probablemente regulada por el factor de transcripción nuclear Nrf2. Dado el creciente interés en la toxicidad del Cu, su relación con la enfermedad de Wilson, y su posible participación en enfermedades neurodegenerativas, se focalizó el estudio en este metal. No se encontró, sin embargo, que la sobrecarga crónica de este metal en ratas produzca efectos deletéreos en las mitocondrias del cerebro. El antioxidante liposoluble ?-tocoferol fue capaz de proteger a los fosfolípidos contra el daño oxidativo inducido por Cu, pero no tuvo efecto en la prevención aumento de la oxidación de proteínas y GSH producidos por el metal en el hígado y corteza cerebral de rata, tanto en los experimentos de toxicidad aguda como crónica, indicando que el daño oxidativo por la sobrecarga de Cu puede estar asociado, además de la oxidación de fosfolípidos, a otros mecanismos independientes de las reacciones en cadena mediadas por radicales libres. Por último, con el objetivo de comparar y analizar las posibles diferencias entre los mecanismos asociados a la toxicidad del Fe y el Cu, se estudió el efecto que tienen estos metales cuando se los expone a las mitocondrias aisladas de hígado de rata (sistema biológico funcional). Los resultados obtenidos indicaron que ambos metales son capaces de disminuir la función mitocondrial necesitándose concentraciones mucho menores en el caso del Cu. Este fenómeno está indicando que el Cu(II) es más tóxico que el Fe(III) o que los mecanismos de protección para los efectos del Fe(III) son suficientes para prevenir el daño. La disminución del consumo de oxígeno y control respiratorio se ven mucho más afectados cuando la mitocondria se expone al metal en condiciones de producción de H2O2/ O2??, indicando la participación de estas especies en la toxicidad del metal. Ambos metales producen oxidación de fosfolípidos de manera dependiente de la concentración del metal pero únicamente en condiciones donde la mitocondria dispone de sustratos para la respiración. En el caso del Cu, el antioxidante glutatión (GSH) fue el más eficaz en la prevención de la disfunción mitocondrial y oxidación de fosfolípidos. Esto se explica por la capacidad de esta molécula de interaccionar con el metal, formando complejos muy estables. Para el caso del Fe, estos efectos protectores se observaron únicamente con el butil-hidroxitolueno (BHT). El Cu es capaz de reaccionar en forma directa y en relación estequiométrica con los tioles mitocondriales, no así el Fe. Conclusión: En este trabajo de tesis doctoral se estudió el rol del daño oxidativo y producción de ROS en diferentes modelos de exposición a agentes tóxicos oxidantes. Se comprobó la oxidación de biomoléculas en todos los sistemas estudiados y la alteración de enzimas antioxidantes in vivo. El efecto protector de las sustancias ?antioxidantes? depende de la naturaleza química de la sustancia y del tipo de estrés oxidativo involucrado. Los efectos tóxicos de los metales de transición Fe y Cu presentan un mecanismo en común, mediado por la reacción de Fenton y generación del radical OH?, sin embargo, el Cu participa en mecanismos intracelulares oxidativos y de interacción directa con los grupos tioles de las proteínas y con la molécula de GSH, cuya relevancia en la toxicidad del metal debería ser aun más estudiada.

Descripción: En Argentina las plantas aromáticas y medicinales han sido tradicionalmente cosechadas del medio ambiente, sin ninguna limitación provocando una importante erosión del germoplasma. Lippia integrifolia es una de las especies bajo esta situación. Para evitar el avance de este proceso, sería importante cambiar el modelo extractivo por un paradigma de producción. Una posible estrategia es generar y transferir a los colectores/productores, materiales genéticamente mejorados. La combinación de técnicas de cultivo in vitro de tejidos con la autopoliploidización, han traído mejoras en la producción de metabolitos secundarios. En este trabajo se obtuvieron autotetraploides de L. integrifolia que mostraron diferencias significativas respecto a la planta madre (tamaño de hojas, inflorescencias, tricomas, estomas, y granos de polen). Además, se incrementaron los rendimientos de aceites en los tetraploides, y se detectaron diferencias cuantitativas en la composición de todos los individuos recuperados de cultivo in vitro (tetraploides y diploides) con respecto a la madre. Por otra parte, se detectó variabilidad genética (polimorfismos) en todas las plantas ex vitro (diploides y tetraploides). Debido a las diferencias fenotípicas (mayor tamaño de la parte usada), y los incrementos en los rendimientos de aceites y la composición, un individuo tetraploide se convirtió en una nueva variedad de ?incayuyo?.

Descripción: Los alineamientos múltiples de secuencias (MSA) contienen al menos dos tipos de información; una está dada por la conservación de aminoácidos en ciertas posiciones, mientras que la otra habla sobre la interrelación o coevolución entre dos o más posiciones. La coevolución entre sitios se inére utilizando métodos estadísticos que estiman la covariación entre posiciones a partir de un MSA. En esta tesis, se desarrolló web de acceso libre y gratuito que permite a usuarios no expertos calcular covariación en familias de proteínas. Los resultados se presentan en una interfaz interactiva que permite explorar la red de covariación e integrarla con la estructura 3D de la proteína. La coevolución entre sitios también puede ser detectada en la interfaz de contacto de dos proteínas que interactúan y han requerido mantener esta interacción durante su evolución. Hasta ahora, este tipo de análisis estaba restringido a secuencias de genomas bacterianos y se requerían conocimientos avanzados para la generación de un MSA concatenado adecuado para este tipo de cálculo. La herramienta I-COMS fue desarrollada con esto en mente, y facilitar a los usuarios este tipo de análisis, extender el rango de aplicabilidad y analizar los resultados de manera gráfica. Por último, se estudió cuál es el alcance de la información capturada en la topología de las redes de covariación para detectar familias de proteínas relacionadas. Este estudio sienta las bases para el desarrollo de nuevos métodos para agrupar y clasificar proteínas en familias.

Descripción: El trabajo de la presente tesis versa sobre el desarrollo de un material híbrido compuesto por quitina como matriz o base de polisacárido con la incorporación de diferentes cantidades de nanohojas de óxido de grafeno (nGO), una nanopartícula obtenida a partir de la exfoliación oxidativa del grafito. Por su parte, la quitina es un biopolímero de elevada resistencia química e insoluble en la mayoría de los solventes conocidos. Esta aparente desventaja motiva su estudio para lograr la manipulación y la obtención de materiales que resistan en diferentes medios. Los materiales sintetizados se obtuvieron en forma de gel y en polvo seco. Los materiales fueron exhaustivamente caracterizados y posteriormente aplicados en procesos de adsorción con dos fines u objetivos principales: la remoción de contaminantes (fin medioambiental) y, por otro lado, la adsorción de una proteína de interés comercial (fin biotecnológico). Para el objetivo medioambiental del primer caso se utilizaron geles de quitina (Chi) y geles híbridos de quitina:nGO (Chi:nGO) para la adsorción en batch de colorantes contaminantes. Luego se utilizó un sistema continuo para la adsorción de ciprofloxacina como contaminante emergente. Finalmente se estudió la adsorción de una peroxidasa recombinante presente en un medio de expresión y la desorción de la misma.

Descripción: Introducción: Existe escasa evidencia respecto al efecto combinatorio y a largo plazo del polimorfismo en el intrón 3 de la isoforma CYP3A5 6986G>A en la farmacocinética del TAC en pacientes trasplantados hepáticos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar distintas variables genéticas y clínicas asociadas a la variabilidad farmacocinética/farmacodinámica del Tacrolimus en pacientes postrasplante hepático en población argentina. Métodos: Se evaluó la correlación entre el polimorfismo en el intrón 3 de la isoforma CYP3A5 6986G>A y los niveles de TAC y TAC XL en sangre de pacientes 24 adultos trasplantados hepáticos estables y 77 pacientes pediátricos trasplantados hepáticos durante un periodo de 2 años. Resultados: Se encontró una frecuencia de expresores (CYP3A5*1) entre el 17% al 37% .El genotipo CYP3A5 del receptor juega un papel más importante en la Co/dosis en etapas tempranas, mientras la importancia genotipo del donante se incrementa con el tiempo postrasplante. Conclusión: El papel que juega cada polimorfismo es distinto según avanzan los días luego del trasplante y deben ser tenidos en cuenta con el fin de optimizar los beneficios del TAC durante la fase de inducción y mantenimiento postrasplante.

Descripción: El virus de influenza, que causa infecciones epidémicas en el hombre y diversas especies de animales susceptibles, evoluciona continuamente por la acumulación de mutaciones puntuales, así como por el intercambio de segmentos genómicos entre distintas cepas. Las vacunas antigripales estacionales en uso actualmente para la prevención son eficaces para neutralizar una infección con cepas homólogas, pero su capacidad de cobertura heterosubtípica es variable o nula. El presente trabajo está orientado a desarrollar, por un lado, vacunas antigripales de nueva generación, a través de la expresión de la proteína inmunodominante hemaglutinina por tecnología de ADN recombinante, en un sistema de expresión eucariota (baculovirus/ células de insectos). Por otro lado, se propone la generación de una vacuna ?universal? de amplio espectro de protección a través de dirigir la respuesta inmune del huésped hacia regiones más conservadas del virus. En este sentido, se ha buscado en la segunda parte de este trabajo lograr una vacuna de más amplia cobertura basada en las proteínas internas del virus, en particular en la proteína de matriz M2 y en la nucleoproteína. Se demuestra que las vacunas experimentales basadas en el ectodominio de M2 pueden inducir inmunidad humoral o celular capaces de proteger animales vacunados de una descarga de dosis letal de virus de influenza.

Descripción: La infección por el parásito Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, es un importante problema de salud pública, principalmente en los países endémicos de América. Con una prevalencia estimada de 8 millones de personas infectadas, esta enfermedad muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con manifestaciones clínicas. Las poblaciones naturales de T. cruzi están compuestas por clones múltiples, distribuidos en seis unidades discretas de tipificación (UDTs TcI-TcVI), de diferente distribución geográfica y circulación en los ciclos de transmisión. La relación entre las UDTs y los diferentes patrones de infectividad y patogenicidad, susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos y manifestaciones clínicas, es actualmente sujeto de estudio. Se han desarrollado numerosos esquemas de tipificación de UDTs, con mayor o menor grado de complejidad y sensibilidad analítica, aunque no se ha definido aún un método certero de referencia. Con el objetivo de desarrollar un esquema sencillo de tipificación molecular, que involucre el menor número posible de reacciones de PCR secuenciales, en este trabajo de Tesis se han desarrollado y validado estrategias de PCR en tiempo real multiplex con sondas TaqMan, basadas en la detección de genes polimórficos nucleares y mitocondriales del parásito, que permitieron la caracterización de las seis UDTs de T. cruzi de manera altamente específica. El método desarrollado evidenció una sensibilidad analítica comparable a la del algoritmo de tipificación por PCR convencional utilizado en nuestro laboratorio, siendo capaz de caracterizar correctamente al 100% de las cepas de referencia de T. cruzi y a un elevado porcentaje de las muestras biológicas analizadas. El esquema de PCR TaqMan identificó más eficientemente a las UDTs presentes en muestras con elevada carga parasitaria, derivadas de triatominos, reservorios, pacientes con infección aguda o congénita, o con reactivación de la enfermedad de Chagas, mientras que evidenció limitaciones en la tipificación de muestras provenientes de pacientes crónicos. Una de las estrategias del nuevo algoritmo fue adaptada para la cuantificación de ADN genómico o carga parasitaria en forma específica de UDT. Por otro lado, se ha diseñado y validado una metodología de PCR en tiempo real dúplex para el diagnóstico diferencial de T. cruzi y T. rangeli, potencialmente aplicable en las regiones co-endémicas para ambos tripanosomátidos. Las nuevas metodologías de PCR en tiempo real, como así también las estrategias tradicionales de PCR convencional, fueron aplicadas en la caracterización de las UDTs de T. cruzi y en el diagnóstico diferencial con T. rangeli en distintos escenarios eco-epidemiológicos y clínicos de las regiones endémicas. Por otra parte, se realizó un estudio sobre la diversidad genética dentro de las Udas TcI y TcIII. En este sentido, y en base a estudios previos realizados en Colombia utilizando la secuencia intergénica del miniexón (SL-IR), se extendió la caracterización de los genotipos de TcI a muestras procedentes de trece países del continente americano. El aporte principal del trabajo consistió en la identificación de un nuevo grupo de genotipos, no descripto hasta el momento, TcIe, y la realización de un análisis detallado de la distribución de los grupos TcIa-TcIe en los diferentes ciclos de transmisión y regiones geográficas. El estudio de aislamientos y clones de TcIII confirmó la variabilidad de secuencia en el gen multicopia SL-IR dentro del genoma de T. cruzi.

Descripción: El silenciamiento de genes por interferencia con ARN (iRNA) es un mecanismo específico que puede ser mediado por la administración de pequeños ARN de interferencia (siRNA) sintéticos. El objetivo del presente trabajo fue tomar como ventajas la biocompatibilidad y propiedades fisicoquímicas de la fosfatidilcolina (PC) y las sales biliares para el desarrollo, optimización, caracterización y evaluación in vitro de nanotransportadores basados en PC para la vehiculización de siRNA en células MCF-7 de cáncer de mama y células normales MDCK. Lipoplexos formulados en distintas condiciones fueron capaces de unir siRNA y vehiculizarlo eficientemente a las células, sin presentar signos de citotoxicidad. Su caracterización fisicoquímica exhibió partículas de tamaño nanométrico y morfología pH-dependiente, aunque de escasa estabilidad física. Se optimizaron, entonces, sistemas mixtos compuestos por PC y sales biliares, obteniéndose vehículos de baja citotoxicidad, alta capacidad de unión de siRNA y eficiencia de transfección / silenciamiento. Se observaron partículas menores a 150 nm que mediante evaluaciones fisicoquímicas se describieron como pequeñas vesículas unilamelares o sistemas micelares mixtos, dependiendo de la composición del vehículo y el medio de formulación, lo que las haría adecuadas para posteriores evaluaciones in vivo. Ensayos preliminares también sugieren su uso promisorio para vehiculización de DNA plasmídico.

Descripción: El Síndrome de Hiperestimulación Ovárica (OHSS) es una complicación severa de la estimulación ovárica con gonadotrofinas en tratamientos de fertilización asistida. La relación entre la gonadotrofna coriónica humana (hCG) y OHSS esta mediada en parte por la producción de factores angiogénicos, como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Sin embargo, durante la angiogénesis además del VEGF, otros sistemas participan en la formación de una vasculatura madura y funcional. En base a estos antecedentes, se postularon las siguientes hipótesis: * La inhibición del sistema de VEGF o del sistema de Angiopoyetinas (ANGPTs) en el OHSS afecta la angiogénesis ovárica, disminuyendo la permeabilidad vascular que conduce al desarrollo de ascitis y por consiguiente, mejora la función ovárica. * Los niveles de S1P se encuentran disminuidos en pacientes con riesgo a desarrollar OHSS, siendo en parte responsable de la alta permeabilidad vascular observada en estas pacientes. En conclusión, los resultados de esta Tesis aportan conocimientos para dilucidar la etiología del OHSS como también para detectar biomarcadores (VEGF, ANGPT-1, S1P) que podrían ser utilizados para prevenir el desarrollo de OHSS y por consiguiente, ayudar a los médicos a elegir la mejor estrategia de estimulación ovárica para cada paciente.

Descripción: Este trabajo de Tesis aborda la obtención y caracterización de materiales bio-inspirados, particularmente complejos de coordinación con Co(II) y Cu(II) que emulan la actividad selectiva de moléculas biológicas, así como los estudios de aplicabilidad de estos nuevos productos en procesos de interés ambiental, industrial, biotecnológico y analítico. Se procedió a la obtención y caracterización de los complejos denominados Co(II)-Poly(EGDEMAA- 2MI) y Co(II)-Poly(EGDE-DA), a la vez que se completó la caracterización del complejo Cu(II)-Poly(EGDE-DA). Para los polímeros insolubles en agua y sus complejos se efectuó una caracterización exhaustiva por FT-IR, NMR en sólidos, análisis térmico (DSC y TG), microscopía electrónica (SEM y EDS), y estudios de las propiedades ácido-base. A partir de esta información experimental fue posible confirmar la coordinación de los iones metálicos mediante los grupos donores de electrones de la red polimérica, el aumento en el grado de reticulación y rugosidad de los materiales, y la disminución en su estabilidad térmica. Sobre los materiales poliméricos insolubles se efectuaron estudios de los equilibrios de captación de los iones metálicos (Co(II) y Cu(II)), que contribuyeron a elucidar la naturaleza de la interacción y la energía asociada. Se estudió la captación del colorante Direct Blue 273 sobre Poly(EGDE-MAA-2MI), como modelo de compuesto orgánico con sustituyentes cargados negativamente en su interacción con un polianfolito. Llevando más adelante esta idea, se estudió la adsorción de la enzima SBP sobre otro lote de Poly(EGDE-MAA-2MI) con el fin de preconcentrarla e inmovilizarla para la preparación de un biorreactor en sistema de flujo. Una de las propiedades más interesantes de los complejos de coordinación obtenidos fue su actividad catalítica en la activación de H2O2 para dar lugar a la formación de radicales libres y O2. Era ya conocida la actividad activadora de los complejos con Cu(II), que fue verificada para el sistema heterogéneo Cu(II)-Poly(EGDE-DA). Para todos los sistemas heterogéneos con Co(II) y Cu(II) se efectuaron estudios de ESR que permitieron identificar los radicales libres producidos, mediante la estrategia de atrapamiento de spin con DMPO. Para el caso de los complejos con Co(II), se pudo verificar que se obtenían radicales O2 ?? y OH?. Esta evidencia junto con la detección de O2 y con la información de los ensayos de XPS permitió delinear mecanismos de producción de radicales libres por activación de H2O2 en sistema heterogéneo. La modificación del proceso de síntesis de polianfolitos insolubles permitió obtener un nuevo producto bio-inspirado, soluble en agua. Se trata de un nuevo material bio-inspirado porque posee en su estructura residuos ?COO¯ y restos imidazol (IM) polimerizados, que emulan la composición de biomoléculas. La modificación en concreto consistió en el agregado secuencial de los reactivos, comenzando por la obtención a 60º C de Poly(EGDE-IM) cuyas propiedades habían sido descriptas en trabajos precedentes del grupo. A continuación se agregó MAA, y el tiempo de incubación a 60º C por más de 12 horas resultó determinante de la solubilidad en agua del producto final. Con el agregado de peróxido de benzoilo se obtuvo un material gomoso que se disolvió lentamente en agua destilada. 11 Una estructura probable para el producto heterogéneo obtenido es de una mezcla de oligómeros constituidos por dos bloques, donde el tamaño de los bloques podría ser diferente en cada molécula. Este modelo en bloque sería válido para la mayoría de las fracciones. En una segunda etapa se abordó la exploración de posibles aplicaciones de los productos obtenidos. Se utilizaron los sistemas heterogéneos Co(II)-Poly(EGDE-MAA-2MI) / H2O2, Co(II)- Poly(EGDE-DA) / H2O2 y Cu(II)-Poly(EGDE-DA) / H2O2 en la decoloración de soluciones de MO, modelo de efluentes de la industria textil. Se determinó que la decoloración ocurría por los procesos paralelos de captación y degradación oxidativa, a través de una cinética de pseudoprimer orden. De los sistemas heterogéneos probados, el complejo con Cu(II) resultó ser el más eficiente en cuanto a la velocidad de decoloración y a la proporción de MO oxidada. Se verificó la actividad catalítica de los complejos en la activación, a partir del reciclado del material. Se evaluó la disminución en la eficiencia del material por pérdida del Co(II) unido, y se estableció que mediante recarga del ion se recupera la actividad. Los sistemas generadores de O2 ?? fueron empleados para un proceso de oxidación parcial de interés industrial: la conversión de epinefrina en adrenocromo. Los oligómeros (EGDE-IM-co-MAA) fueron utilizados como agentes precipitantes en conjunto con Fe(II) para la co-precipitación in situ del colorante azo-aniónico DB273, y resultaron más eficientes que los adsorbentes poliméricos insolubles. La adición de oligómeros (EGDE-IM-co-MAA) a una solución de Fe(II) y ácido cítrico en proporciones adecuadas dio lugar a la formación de esferas huecas, por coordinación y agregación de los oligómeros en la interfase por efecto del pH ácido. Su solubilidad a valores de pH iguales o superiores a 7.0 las vuelve potencialmente adecuadas para la liberación intestinal de fármacos en el contexto de liberación controlada. Finalmente, se exploró la aplicabilidad del biorreactor basado en SBP-Poly(EGDE-MAA-2MI) en la clasificación de alimentos, particularmente en bebidas. Las muestras de yerba mate pudieron ser discriminadas por marca comercial, relacionadas con su origen geográfico y/o diferente método de elaboración. El reactor también generó resultados de utilidad analítica en muestras de vino libre de sulfito. Las muestras produjeron inhibición de la respuesta a catecol. Este comportamiento pudo ser explotado para mejorar la autenticación de vino mediante análisis multivariado, por combinación de estos datos con otros parámetros enológicos. Estos son los primeros estudios de aplicabilidad de SBP en el ámbito analítico.

Descripción: Los enormes niveles de producción y consumo de combustibles derivados del petróleo a lo largo de todo el mundo generan indefectiblemente episodios de contaminación. La Antártida no se ve exenta de esta problemática, con numerosos eventos registrados a lo largo de los años en suelos, aguas y sedimentos de este continente, como consecuencia de las actividades de almacenamiento y transporte de combustible que allí se realizan para la generación de electricidad y el movimiento de vehículos. Para recuperar estos suelos de la contaminación se cuenta con numerosas técnicas, basadas en diferentes fundamentos. Entre ellas, la biorremediación resulta la más adecuada, al remover el contaminante en niveles elevados, de forma amigable con el medio ambiente, a un costo considerablemente bajo, y sobre todo, sin un requerimiento significativo de infraestructura y logística, característica clave para el desarrollo de estos tratamientos en el continente antártico. Particularmente para los suelos de este continente, la biorremediación es llevada a cabo principalmente por microorganismos. Dada la legislación que rige sobre la Antártida, dichos microorganismos deben ser autóctonos, lo que junto con las estrictas condiciones ambientales obliga al desarrollo de procesos de biorremediación con microorganismos sicrófilos o sicrotolerantes. El desafío consta, por ende, en alcanzar una alta eficiencia de remoción on-site que permita la recuperación de la matriz contaminada, a partir de la utilización de dichos microorganismos. Este desarrollo presentaría la ventaja de no requerir costosos procesos de calefacción ni de traslado del suelo. El objetivo de este trabajo de tesis fue el desarrollo de procesos eficientes de recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos, mediante una optimización previa de las variables clave del proceso de bioestimulación, y el posterior escalado del proceso a campo en condiciones operativas reales en una base antártica argentina. La optimización comprendió hallar la relación C:N:P que maximizara la remoción de los hidrocarburos por parte de la flora microbiana habitante del suelo, utilizando la metodología estadístico-matemática de Superficie de Respuesta a escala laboratorio. Una vez obtenida esta relación que optimizó la remoción, se evaluó el desempeño de la estrategia a campo, bajo condiciones operativas y ambientales reales y a escalas mayores.. Para ello, se conformaron biopilas in-situ en una base antártica argentina durante los meses de verano 2013/2014. El diseño de las biopilas fue en forma de pirámide truncada debido a su buena relación superficie/volumen. En ellas, el suelo se dispuso sobre geomembranas de alta densidad, inertes frente a hidrocarburos y que evitan el lixiviado o diseminación del contaminante. El diseño probó ser adecuado para el tratamiento on-site de los suelos, así como también lo fue la relación C:N:P optimizada, alcanzándose niveles de remoción del contaminante superiores al 75% en apenas 40 días de tratamiento. A fin de evaluar la reproducibilidad de este desarrollo, el diseño fue replicado al año siguiente, durante el verano 2014/2015. Además de analizar el desempeño del nuevo tratamiento, se evaluó la influencia de distintas variables sobre la eficiencia del mismo, sobre todo de factores como la temperatura ambiente, la temperatura de las biopilas y del suelo, las horas de sol, la concentración inicial del contaminante y la conductividad, entre otras. Estas variables, a diferencia de lo que ocurre en el laboratorio, donde la posibilidad de control es mucho mayor, frecuentemente no son controlables en los ensayos a campo. Este estudio permitió dilucidar no sólo el rol que las variables ambientales y fisicoquímicas tienen en los ensayos de biorremediación a campo en la Antártida, sino también su influencia sobre los aspectos biológicos del proceso. En ese sentido, las temperaturas alcanzadas dentro de las biopilas (vinculadas fuertemente a las horas de sol totales recibidas) resultaron clave en los valores de eficiencias alcanzadas. Además, si bien el nivel inicial de contaminación del suelo mostró influir sobre la eficiencia del proceso, esta variable no puede ser controlada en el desarrollo elegido, pero bien puede conocerse de antemano el desempeño que dichos niveles puedan tener a lo largo de distintos niveles de contaminación. Esta comprensión permitirá planear y diseñar los tratamientos on-site con mayor conocimiento de la situación, buscando maximizar su eficiencia. Adicionalmente, el estudio de los géneros microbianos habitantes de estos suelos, así como el conocimiento de sus capacidades catabólicas puede contribuir enormemente al desarrollo de esquemas mixtos y/o secuenciales de biorremediación. Por un lado, conocer las dinámicas de las comunidades bacterianas en los suelos tratados permite dilucidar y comprender el rol que cada género o grupo bacteriano cumple en cada uno de los estadíos del tratamiento. Este estudio permitió entender que las alternancias en la comunidad bacteriana entre estrategas r (como Pseudomonas sp.) y estrategas k (Rhodococcus sp.) resultaron ser los principales cambios que sufre la comunidad a lo largo de un proceso de biorremediación. Estos cambios se deberían por ende a una degradación diferencial de los hidrocarburos a manos de cada uno de esos grupos. Por otro lado, el aprovechamiento de cepas con capacidad de producción de biosurfactantes o aquellas con una alta velocidad de crecimiento y amplias capacidades catabólicas, puede considerarse de un gran interés para complementar la bioestimulación previamente ensayada. El bioaumento secuencial (posterior a la bioestimulación) realizado con cepas con estas capacidades presenta el potencial de poder aumentar la eficiencia de remoción total del tratamiento, al verse favorecida la degradación de aquellos compuestos que resultaron recalcitrantes en la primera etapa de bioestimulación. Las cepas de Pseudomonas sp. y Penicilium sp. aisladas, identificadas y caracterizadas en este trabajo de tesis presentan dicho potencial. Los resultados, herramientas biológicas y conclusiones obtenidos de este trabajo de tesis permiten afrontar exitosamente el tratamiento de suelos antárticos contaminados (y de regiones frías en general a lo largo de todo el mundo) en procesos on-site en Antártida, haciendo innecesario el transporte de los mismos fuera del área antártica para su tratamiento, reduciendo el costo de su tratamiento y, por ende, aumentando su factibilidad.

Descripción: Para agregar valor a la leche se realizaron ensayos para mejorar la capacidad antioxidante a través de la dieta de los animales. Para obtener datos basales se ensayaron leches de tambos comerciales y de los alimentos utilizados encontrándose una correlación entre ellos, además de una relación estacional. Ensayos de cinética de incorporación de compuestos antioxidantes de pastura fresca en la leche, determinaron que en 20 días su composición se modificaba, lográndose una leche con mayor capacidad antioxidante. Dado que las condiciones productivas no permiten altas asignaciones de pastura en la dieta, se ensayaron dos niveles de alfalfa y dos épocas del año. Para determinar la transferencia de los compuestos incorporados a productos lácteos, se estudiaron en leche entera en polvo y en queso duro. Se vio que un nivel de 50% de pastura lograba la modificación diferencial de las leches y que la estación influye sobre la incorporación de estos compuestos. Las características de la leche cruda se transfirieron a los productos lácteos. Al realizar el seguimiento de la leche en polvo para ver la implicancia en la vida útil, se observó que el aumento de los antioxidantes liposolubles sirvió para preservarla de los efectos de la oxidación.

Descripción: Los modelos desmielinización son herramientas útiles en el estudio de nuevas terapias aplicables a enfermedades desmielinizantes. El modelo inducido por intoxicación con CPZ es altamente reproducible, simple y de baja mortalidad. Nos propusimos estudiar los mecanismos que controlan la viabilidad y la diferenciación oligodendroglial, y que conducen a la desmielinización utilizando este modelo. Nuestros resultados muestran que la desmielinización y muerte de OLGs maduros inducida por CPZ es mediada por la producción de citoquinas pro-inflamatorias desde la microglia, con disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial y generación de EROs. Así, animales transgénicos expresando EGFP bajo el promotor de CNPasa presentan una hipomielinización basal y una mayor susceptibilidad a la desmielinización con CPZ debida a la alta expresión de EGFP que lleva al estrés oxidativo y la apoptosis de los OLGs maduros. En concordancia, la inhibición parcial de la actividad del proteasoma mejora la remielinización, disminuye en el reclutamiento de microglia y la activación de NF?B recuperando la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial. Finalmente, nuestros resultados muestran a Gal-3 como una nueva molécula secretada desde la microglia, capaz de inducir diferenciación oligodendroglial y de modular la mielinización y la respuesta a la desmielinización. En conclusión, podemos afirmar que la viabilidad y la diferenciación oligodendroglial dependen de la producción de radicales libres así como de la presencia de mediadores provenientes de la microglia.

Descripción: La ateroesclerosis es un proceso espacialmente no aleatorio, y temporalmente no lineal que afecta inicialmente áreas del árbol arterial. Estas áreas presentan una disfunción endotelial caracterizada por estado pro-inflamatorio, pro-trombótico y angiogénico. El fenotipo endotelial atero-protectivo y atero-propenso están asociados a diferentes patrones de expresión génica, vías de señalización y remodelados de la matriz extracelular (MEC). El efecto de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) sobre la función endotelial ha sido escasamente estudiado, particularmente el remodelado de la MEC endotelial inducido por las VLDL y la influencia que estas partículas ejercen en el desarrollo de la ateroesclerosis. Los resultados obtenidos en esta tesis indican significativas modificaciones en la producción de los principales proteoglicanos vasculares en las células endoteliales humanas, dependiendo del fenotipo endotelial, en presencia de niveles fisiológicos de VLDL. Junto con estos resultados, demostramos modificaciones estructurales en las cadenas de condroitín/dermatán sulfato y cambios en las enzimas que regulan sus características químicas, luego del tratamiento con las VLDL, en un endotelio atero-resistente. Esta tesis demuestra que las VLDL podrían inducir el remodelado de la MEC a través de los receptores de VLDL y enfatiza una potencial aplicación terapéutica basada en el remodelado de la matriz extracelular endotelial para prevenir la ateroesclerosis.

Descripción: La familia Frataxina está compuesta por un conjunto de proteínas pequeñas de tipo a/ß. El primer representante descripto de esta familia fue la frataxina humana, descubierta debido a que el gen que la codifica se encuentra alterado en personas afectadas con ataxia de Friedreich, una enfermedad caracterizada por el deterioro neurológico y el desarrollo de miocardiopatía. Desde entonces se han descripto homólogos en muchas especies de bacterias y eucariotas. La actividad biológica de las proteínas depende de su estructura tridimiensional, codificada en la secuencia de aminoácidos. Entendemos a la estructura como un conjunto dinámico de conformaciones que pueden estabilizarse mediante cambios sutiles en el entorno, o por interacción con otras proteínas o con moduladores alostéricos. Existe un gran consenso sobre la existencia de relaciones entre la movilidad interna, la estabilidad y la función biológica. Se conocen muchos ejemplos que ponen de manifiesto la importancia de la flexibilidad estructural, el desplegado local y la presencia de estados intermediarios en diferentes procesos biológicos, en especial aquellos que involucran interacciones de tipo proteína-ligando y proteína-proteína. En este trabajo abordamos el estudio general de los mecanismos de plegado y las relaciones entre la estabilidad termodinámica y la flexibilidad, que determinan la dinámica y el grado de heterogeneidad del conjunto de conformaciones del estado nativo de la Frataxina humana. Nos focalizamos en definir qué rol juega la región C-terminal sobre dichos determinantes estructurales, y en identificar posibles correlaciones entre alteraciones de la movilidad de distintas regiones de la cadena polipeptídica y cambios en las estabilidades locales y globales. Además, examinamos las bases moleculares del proceso de multimerización, mediado por la región N-terminal del precursor de la proteína. En conjunto, los resultados que presentamos en esta tesis representan un aporte a la comprensión de las bases moleculares de la consolidación estructural y la dinámica del fold Frataxina.

Descripción: Se diseñó y elaboró un alimento para individuos de mayor edad, teniendo en cuenta el aporte, de energía y el incremento de proteínas, ácidos grasos esenciales y vitaminas A, D y E. Se evaluó el impacto biológico del producto elaborado en modelos experimentales y sus características sensoriales y aceptabilidad Materiales y métodos: Se elaboró un budín, utilizando harinas de trigo, lino y soja semi desengrasadas, aceites de maíz y oliva, mantequilla, ovoalbúmina, azúcar y una mezcla de vitaminas A, D y E. Se determinó: composición centesimal (AOAC), ácidos grasos (CG), vitaminas A y E (HPLC). La evaluación biológica en relación a proteínas, vitaminas A, D y E se realizó en modelos experimentales en ratas. Ensayos sensoriales: Análisis Descriptivo Cuantitativo (QDA) y Aceptabilidad por parte de los consumidores. Resultados: una porción de 120 g aporta 24 % de los requerimientos energéticos, 9.4 g de PUFA (4.5% de las calorías totales, relación ?3/?6 de 1/7), 38 % de los requerimientos de proteínas, 75 % de la IR de vitamina A y 100 % y de vitaminas D y E. El modelo experimental comprobó la eficiencia biológica de la fortificación con las 3 vitaminas. Los descriptores significativos del QDA y los datos de aceptabilidad por los consumidores fueron satisfactorios. Conclusiones: el alimento incrementó el aporte de proteínas, fibra, ácidos grasos esenciales, vitaminas A, D y E, resultando sensorialmente aceptable.

Descripción: Dentro de este paradigma desarrollamos un modelo de acción con el objetivo de diseñar y sintetizar moléculas que inhiben la tripanotiona reductasa, una enzima específica del Trypanosoma cruzi que resulta esencial para su supervivencia en el huésped. Se emplearon técnicas de acoplamiento molecular para predecir la o las formas en las cuales las sustancias podrían unirse a la proteína, inhibiendo su acción, así como las fuerzas relativas con la cual se efectuaba esa unión. Estas técnicas han servido para establecer tres forma de desarrollo de fármacos: la predicción de actividad biológica, el cribado virtual de librerías comerciales de compuestos y el diseño de novo de drogas anti-tripanosomiasis. Las tres técnicas arrojaron diferentes núcleos estructurales de compuestos químicos. Sin embargo, a pesar de estas diferencias químicas, las sustancias sintetizadas/compradas han demostrado poseer la actividad predicha mediante los sistemas informáticos tanto en las evaluaciones con la enzima blanco, como con los ensayos in vitro con el parásito. Se buscaron alternativas terapéuticas mediante la síntesis de derivados de ftalazin-1,4-diona pequeñas. Los resultados arrojaron una actividad biológica moderada, poniendo a estos compuestos como líderes en la búsqueda de la mejora de sus propiedades farmacológicas. Nos enfocamos en el desarrollo de antiinflamatorios no esteroideos (AINE) para su uso como co-tratamiento sintomático en la enfermedad de Chagas, la cual cursa en su etapa crónica con procesos de inflamación y daño tisular. Los resultados fueron prometedores con dos núcleos ftalimídicos líderes y un derivado de ftalazina con actividad AINE in vitro e in vivo.

Descripción: Los ciclobutanos se encuentran presentes en numerosos derivados, naturales y sintéticos, con demostrada y variada actividad biológica, por lo que resultan atractivos en la búsqueda de nuevos compuestos con potencial aplicación terapéutica. Teniendo esto en cuenta, en este trabajo de Tesis se ha abordado el diseño y la síntesis de análogos de nucleósidos con potencial aplicación terapéutica en el campo de la quimioterapia antiviral y antitumoral. El anillo ciclobutánico se presenta en la naturaleza contenido en algunos monoterpenos, tales como (-)-(1S)-verbenona y (-)-(1S)-?-pineno, los cuales forman parte del pool quiral y permiten acceder a compuestos ciclobutánicos enantiopuros. En este trabajo se ha puesto especial énfasis en la preparación de intermediarios homoquirales útiles en la obtención de análogos de nucleósidos, empleando los mencionados terpenos como materia prima. Los compuestos sintetizados fueron caracterizados empleando diversas técnicas mono y bidimensionales de resonancia magnética nuclear. Por otra parte, algunos de ellos fueron empleados en la preparación de análogos de nucleósidos hidantoínicos, sobre algunos de los cuales se inició el estudio de la posible actividad como agentes antileucémicos, dejando abierta la posibilidad de realizar ensayos posteriores sobre otras líneas celulares y diversos virus. En el Capítulo 1 de la presente tesis, correspondiente a la Introducción, se hace una descripción de los diferentes tipos de análogos de nucleósidos que actúan como agentes antivirales y anticancerígenos, poniendo especial enfasis en los que presentan una estructura carbocíclica, así mismo se marcan las tendencias en el diseño de análogos nucleosídicos que surgen de la modificación del azúcar. Finalmente, se reseñan las dos estrategias más comunmente empleadas para la preparación de estos análogos, una de ellas basada en una síntesis lineal y la otra en una síntesis convergente. Al final del capítulo se describen los objetivos de este trabajo de Tesis. En el Capítulo 2 se evalúan las metodologías existentes para la obtención de análogos de nucleósidos 1,3-trans sustituídos a partir de intermediarios ciclobutánicos, derivados de (-)- (1S)-?-pineno y (-)-(1S)-verbenona, con el objeto de emplear los mismos en una síntesis convergente que permita producir diversos nucleósidos carbocíclicos a partir de un intermediario común. En lo referente a la preparación de análogos de nucleósidos 1,3-cis sustituídos se optimizó la metodología sintética previamente descripta en la literatura de dos aminoalcoholes homoquirales, que ya habían sido empleados en la síntesis de análogos ciclobutánicos de nucleósidos (ACBN), lo cual constituye una síntesis formal de los mismos. El Capítulo 3 aborda la obtención de ciclobutanonas y ?-butirolactonas como sintones apropiados para la síntesis de análogos de nucleósidos, en particular aquellos con una estructura ciclobutánica en reemplazo del azúcar. En primer lugar, se presenta el estudio de diversos agentes oxidantes para la transformación de ciclobutanoles en ciclobutanonas, etapa durante la cual puede conseguirse la conversión selectiva de los mismos en las correspondientes ?-butirolactonas. Por otro lado, se desarrolla una ruta sintética para generar análogos nucleosídicos conteniendo un anillo hidantoínico como base. En cada capítulo se presentan los avances científicos producidos hasta el momento en el respectivo tópico, se analizan los resultados obtenidos durante el desarrollo de este trabajo y sus perspectivas. Los Capítulos 2 y 3 contienen su propia sección experimental y las referencias bibliográficas correspondientes. En la última parte, Conclusiones generales y perspectivas, se da cuenta de las conclusiones generales y se señalan las perspectivas que surgen del trabajo realizado.

Descripción: Las quinoxalinas constituyen un sistema heterocíclico presente en numerosos compuestos con demostrada y variada actividad biológica. Con el fin de contribuir al diseño de nuevos compuestos con potencial actividad anti-HIV y/o antichagásica, ya sea a través su acción inhibitoria sobre la transcriptasa reversa del virus de la inmunodeficiencia humana o su inhibición de la cruzipaína, enzima esencial para el desarrollo del ciclo de vida del Trypanosoma cruzi, en este trabajo de Tesis Doctoral de han empleado varias estrategias de diseño de fármacos asistido por computadora para diseñar posibles inhibidores de los mencionados sistemas enzimáticos con estructura quinoxalínica. A partir de los resultados alcanzados mediante el diseño de novo o a través del cribado virtual se propusieron un total de 25 compuestos quinoxalínicos que podrían resultar inhibidores de la transcripsa reversa y/o de la cruzipaína. Estos compuestos fueron sintetizados empleando algunas metodologías habituales para la síntesis de quinoxalinas a las cuales se les introdujeron modificaciones que permitieran su optimización, tales como el empleo de radiación microondas como fuente de energía. De esta manera se aporta una ruta sintética lineal, sencilla y eficiente para la obtención de 29 compuestos quinoxalínicos, muchos de ellos no descriptos previamente en la bibliografía. Se iniciaron los estudios de la potencial actividad antichagásica de los compuestos diseñados y sintetizados dejando planteada la posibilidad de que ensayos posteriores contribuyan a demostrar la actividad de los mismos y la utilidad de los métodos computacionales en el diseño de nuevos compuestos quinoxalínicos activos.

Descripción: Las células mioides peritubulares (células MP) se encuentran en la pared del túbulo seminífero (TS) y participan en su contracción. Poseen un citoesqueleto particular, organizado en dos capas independientes: una capa interna y otra externa con miofilamentos perpendiculares y paralelos al eje del TS, respectivamente. Esto difiere de la malla ortogonal de filamentos propuesta anteriormente para las células MP. Por ello, en animales adultos se evaluó además de la organización del citoesqueleto, la distribución de otras estructuras y proteínas implicadas en la contracción. Se analizaron los efectos del estímulo con endotelina-1 sobre el TS, especialmente en la célula MP. En el desarrollo testicular postnatal, se evaluó la maduración de este citoesqueleto y el inicio de la respuesta contráctil. Por diferentes microscopios se observó que la célula MP a pesar de ser plana dispone de una maquinaria altamente organizada, con estructuras como caveolas y receptores de endotelina-1 orientadas según las dos capas de miofilamentos que coexisten en la misma célula y que le permite contraerse en dos direcciones. En el desarrollo la organización de los filamentos cambia según progresa la espermatogénesis. Las dos capas no aparecen simultáneamente. Aún con una capa la célula MP se contrae pero de una manera diferente

Descripción: El estudio y monitoreo de poblaciones sujetas a disturbios humanos es esencial para poder identificar y cuantificar los impactos sobre los animales y determinar estrategias de manejo y conservación adecuadas. Los indicadores fisiológicos pueden alertar sobre cambios en el estado de los individuos aún antes de que estos afecten negativamente su capacidad reproductiva o su supervivencia, permitiendo así la detección temprana del problema y la toma de medidas para mitigarlo. Existen diferentes indicadores fisiológicos para medir los efectos de la alteración del ambiente en los organismos. Entre ellos se destacan los marcadores de estrés oxidativo, los parámetros hematológicos, que pueden actuar como sensibles señales del estado de salud y algunas enzimas del metabolismo de aminoácidos o carbohidratos, que son indicativas del daño tisular provocado por compuestos tóxicos. Entre los impactos de origen humano que pueden afectar a los pingüinos de Magallanes se encuentran las actividades que se desarrollan en la costa, como el ecoturismo y la generación de contaminantes en el mar, especialmente los derrames de hidrocarburos. El estrés producido por las visitas en las colonias reproductivas podría provocar cambios fisiológicos que disminuyen la condición física de los animales, volviéndolos más susceptible a contraer enfermedades. En tanto que los contaminantes ambientales pueden producir peroxidación lipídica desencadenando la pérdida de la funcionalidad celular bajo condiciones de estrés oxidativo. Para medir el efecto de estos estresores, se estudiaron dos colonias de pingüinos, una expuesta al turismo (Estancia San Lorenzo, Chubut) y otra cercana a un puerto y a la ciudad y por lo tanto exhibida a contaminantes (Isla Quiroga, Santa Cruz). El objetivo en la primera sección fue determinar si el turismo tiene efectos negativos sobre los pingüinos, comparando individuos que anidan cerca de los senderos por donde circulan los visitantes con nidos en zonas no disturbadas (control). Para ello se midieron diferentes parámetros hematológicos y de estrés oxidativo. No se observaron diferencias significativas en ninguno de los parámetros hematológicos. Sin embargo, se observó que animales expuestos al turismo presentaron mayores niveles del biomarcador de daño oxidativo ROMs y menores niveles de tioles, un reconocido antioxidante, conjuntamente con un aumento de las actividades de las enzimas antioxidantes glutatión transferasa y catalasa, probablemente para compensar el aumento del estrés oxidativo. Por otra parte, se consideró la influencia de otros factores como el sexo, la edad y la zona de anidación. Los pichones mostraron valores significativamente mayores de glucemia y colesterol, mientras que exhibieron menores valores de proteínas totales y de hematocrito que los adultos. También presentaban menores niveles de aspartato aminotranferasa, mientras que mostraron mayor actividad de la fosfatasa alcalina y de la pseudocolinesterasa, sin observar diferencias significativas en la alanina transaminasa y lactato deshidrogenasa, comparado con los individuos adultos. El estudio de OXY demostró menor capacidad antioxidante en pichones comparado con adultos, apreciándose diferencias significativas en los niveles de ROMs. Además, se observaron mayores niveles de TBARS y tioles en pichones y menor actividad de la enzima catalasa respecto de los adultos. Las hembras adultas presentaron mayores niveles de proteínas totales, niveles de aspartato y alanina aminotransferasas, además de un aumento en el número de leucocitos totales respecto de los machos. En la segunda sección de resultados se analizaron los parámetros hematológicos y de estrés oxidativo en pingüinos de la Isla Quiroga. Se registraron diferencias hematológicas entre adultos y pichones. Los pichones mostraron valores significativamente mayores de glucemia y colesterol, mientras que exhibieron menores valores de proteínas totales y de hematocrito. Además, los pichones mostraron niveles mayores de fosfatasa alcalina y pseudocolinesterasa. Con respecto a los parámetros de estrés oxidativo, no se registraron diferencias significativas entre pichones y adultos en ninguno de los parámetros estudiados excepto por una menor actividad de la enzima catalasa en pichones. En la anteúltima sección se compararon los parámetros hematológicos y de estrés oxidativo de pingüinos que anidan en las colonias de San Lorenzo y de Isla Quiroga. El único parámetro que presentó el mismo comportamiento, independientemente del sexo y edad de los pingüinos, fue la glucemia que demostró menores niveles en los animales de IQ. En individuos adultos de ambos sexos se registraron mayores niveles de peroxidación lipídica en plasma, conjuntamente con una reducción de antioxidantes, en los individuos provenientes de IQ. Sólo en machos se observaron niveles de actividad de las enzimas alanina aminotrasferasa y fosfatasa alcalina significativamente mayores en IQ. Los pichones de la colonia IQ presentaron menores niveles de TBARS y tioles en glóbulos rojos, pero contrariamente se registraron mayores niveles de tioles en plasma, OXY, hematocrito y proteínas totales. En la última sección se evaluaron 3 pingüinos con manchas de petróleo que fueron rehabilitados. Los resultados mostraron que los pingüinos con ese leve empetrolamiento tenían valores hematológicos (excepto para hematocrito y proteínas totales) y de estrés oxidativo (excepto la actividad de enzima catalasa y tioles en glóbulos rojos) mayores en comparación con pingüinos de Magallanes de la zona control de la colonia San Lorenzo. En el presente trabajo se reportan los datos de los parámetros hematológicos y de estrés oxidativo de los pingüinos de Magallanes, con el fin de reportar los rangos fisiológicos en los pingüinos, tanto los afectados por turismo y contaminantes, como de individuos que pueden considerarse normales. Estos resultados serán una herramienta indispensable para poder realizar una correcta evaluación del impacto ambiental sobre la especie.

Descripción: Los consumidores demandan frutas mínimamente procesadas libres de aditivos y con apariencia fresca. Sin embargo, el daño provocado por el procesamiento a los tejidos acorta su vida útil. El presente trabajo se realizó con la finalidad de estudiar el efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas (APH) para preservar duraznos mínimamente procesados. Cubos/cilindros de durazno fueron procesados combinando inmersión en solución de ácidos orgánicos, envasado al vacío y tratamiento por APH a temperatura ambiente. Se optimizaron las condiciones del tratamiento, determinándose que con 600MPa-5min se lograba la mayor inactivación de enzimas, con la mínima alteración de la textura y el color. También se estudió la importancia de seleccionar como materia prima variedades con baja actividad de la polifenoloxidasa, para controlar el pardeamiento enzimático del producto. Se encontró que en los duraznos presurizados se mantienen activos ciertos procesos bioquímicos (expresión y actividad de enzimas) y aunque se modifican algunas características de los tejidos vivos, el producto final mantiene la apariencia, textura y flavor de la fruta fresca. Finalmente, se determinó que la temperatura óptima de conservación es de 4°C, pudiendo mantenerse el producto sin deterioro microbiológico ni sensorial por 42 días. Notablemente, a 20°C el producto podría ser conservado con calidad comercial adecuada.

Descripción: En Argentina, las infecciones asociadas a Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) producen la mayor incidencia mundial de Síndrome Urémico Hemolítico (SUH). Evidencias epidemiológicas demuestran un alto número de adultos portadores de STEC. Alrededor del 15 % de los abortos espontáneos son producidos por infecciones. La hipótesis de este trabajo es que las infecciones por STEC durante el embarazo pueden provocar complicaciones mediadas por la toxina Shiga tipo 2 (Stx2). La dosis subletal de 0,5 ng Stx2/g administrada a ratas en etapa temprana de gestación provocó daños irreversibles en los tejidos fetales, hipoxia, inflamación local, restricción del crecimiento intrauterino y finalmente aborto. La inmunización de ratas con BLS-Stx2B resultó en altos títulos séricos anti-Stx2B con capacidad neutralizante de Stx2. Las madres inmunizadas inyectadas con Stx2 tuvieron un parto normal y a término y las crías amamantadas por madres inmunizadas, desafiadas al destete con una dosis letal de Stx2 sobrevivieron en un 100%. Estos resultados indican que Stx2 produce aborto y que la inflamación local y la hipoxia decidual jugarían un papel importante en la pérdida de la preñez. La presencia de anticuerpos neutralizantes anti-Stx2 en los sueros maternos son una herramienta eficaz para prevenir los daños de Stx2.

Descripción: Deshidroleucodina (DhL) es una lactona sesquiterpénica aislada de las hojas de la planta Artemisia douglasiana Besser, que crece en Argentina. Previamente, nuestro laboratorio ha demostrado que DhL inhibe la proliferación de células tumorales en cultivo y el crecimiento de tumores en ratones. Con el fin de demostrar que DhL posee potencial para el desarrollo de fármacos antitumorales, en esta tesis analizamos las propiedades antimigratorias de DhL en células tumorales. Como modelo de estudio utilizamos células en cultivo, arrestadas en la fase G1/S del ciclo celular. En las células tratadas con DhL fueron analizadas las propiedades de adhesión, invasión y migración. Como resultado, observamos que DhL no indujo apoptosis ni senescencia y no afectó la viabilidad celular. Luego, en una superficie recubierta con fibronectina, comprobamos que DhL inhibió la adhesión y la formación de adhesiones focales. Posteriormente, observamos que DhL inhibió la invasión del matrigel por las células tumorales y la migración celular. Además, DhL inhibió la protrusión de la membrana en el frente de avance, por la alteración de la organización del citoesqueleto de actina y la actividad de proteínas señaladotas como Rac1, ERK y p38. Estos resultados indican que DhL, a través de la inhibición de la señalización de ERK, afecta la adhesión, invasión y migración de las células tumorales en cultivo, confirmando la hipótesis que esta lactona sesquiterpénica tiene un gran potencial farmacológico como agente antimetastásico.

Descripción: El péptido natriurético atrial (ANP) es un factor hipotensor y natriurético fuertemente involucrado en la regulación de la función cardiovascular y renal. El presente trabajo de tesis estudió los efectos cardiovasculares y renales de una infusión de ANP (100ng/h) durante 14 días en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) machos y hembras adultas jóvenes, y determinó si existen diferencias entre sexos. El ANP disminuyó la presión arterial al aumentar la diuresis y la natriuresis; redujo el tamaño de los miocitos, el número de células apoptóticas cardíacas y renales, el contenido de colágeno intersticial y perivascular en corazón, riñón y aorta; estimuló la actividad del sistema del NO y disminuyó el estado oxidativo en corazón y riñón. Los efectos beneficiosos del ANP sobre la morfología cardiovascular y renal serían mayores en machos que en hembras SHR. Esto se debería a que las hembras SHR controles presentaron menores valores de presión arterial e índices de daño cardiovascular y renal, así como una mayor actividad de la NOS y capacidad antioxidante en estos tejidos. Los resultados de este estudio sugieren la potencial utilidad del tratamiento crónico del ANP para prevenir el daño cardiovascular y renal que desarrollan estos animales con el avance de la hipertensión.

Descripción: La acidosis está presente en el microambiente inflamatorio isquémico, donde la formación de nuevos vasos ocurre activamente. Considerando que las células formadoras de colonias endoteliales (CFCE) tienen un papel clave en la vasculogénesis, nuestro objetivo fue investigar el efecto de la acidosis en la sobrevida y funcionalidad de estos progenitores endoteliales. Demostramos que la exposición de las CFCE a un medio ácido (pH 6,6) durante 6 horas, seguida de la restauración del pH a valores normales (7,4), procedimiento conocido como preacondicionamiento ácido, indujo una expansión ex vivo más eficiente y una mayor actividad angiogénica, ya que aumentó la proliferación, quimiotaxis, adhesión, tubulogénesis y el potencial regenerativo in vivo, en un modelo murino de isquemia de miembro inferior. La acidosis aumentó la proliferación por activación de ERK1/2 AKT y la tubulogénesis mediante la inhibición de p38. Además, el preacondicionamiento ácido protegió de la muerte y aumentó las respuestas angiogénicas de las CFCE en condiciones inflamatorias y de alta glucosa. En conclusión, el preacondicionamiento ácido representa una estrategia efectiva para optimizar la expansión ex vivo de CFCE, las cuales resultan más resistentes a condiciones adversas como la inflamación y la alta glucosa, y con un mayor potencial terapéutico.

Descripción: El aumento de actividad del sistema renina-angiotensina, contribuye al desarrollo de hipertensión sensible a la sal (HTA-SS), que afecta al 50% de los pacientes hipertensos. Los fármacospara controlar la presión arterial (PA) que disminuyen la síntesis de Ang II o bloquean su receptor específico AT1 son menos efectivos en pacientes con HTA-SS por lo que comúnmente se combinan con un diurético. Esto sugiere la HTA-SS transcurre con una reabsorción renal de sodio y fluidos aumentada. La rama ascendente gruesa (RAG) del Asa de Henle reabsorbe -30% del sodio filtrado en el glomérulo, y es fundamental en la generación del gradiente osmótico necesario para reabsorber agua en el túbulo colector. Estudios epidemiológicos y en animales indican que la RAG contribuye a la HTA-SS. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral muestran que la infusión de Ang II durante una semana eleva la actividad de la Na+/K+-ATPasa en la RAG. Además, la Ang II disminuye la capacidad de producción NO en respuesta a estímulos natriuréticos. En conclusión, se ha demostrado que durante la hipertensión inducida por Ang II, el transporte neto de Na+ en la RAG se encuentra aumentado, posiblemente por la disminución de la vía de señalización del NO. Estos cambios pueden dificultar la excreción de Na+ y contribuir a la HTA-SS.

Descripción: Enterococcus faecalis CECT7121 es una bacteria de origen ambiental que ha demostrado modular la respuesta inmune en diversos modelos biológicos, convirtiéndose en un atractivo candidato a ser empleado como microorganismo probiótico. Sin embargo, aún es necesario definir los mecanismos a través de los cuales ejerce sus efectos inmunomodulatorios. En el presente trabajo de Tesis Doctoral se evaluaron los efectos de E. faecalis CECT7121 sobre las células dendríticas (DCs), analizando no solo su activación como efectores centrales de la respuesta inmune innata sino también sus consecuencias sobre la inmunidad adaptativa. También se estudió la estimulación que este microorganismo ejerce sobre los macrófagos. Además, se evaluaron las consecuencias del tratamiento intragástrico con este probiótico en ratones BALB/c. Por último, dadas las características inmunoestimulantes de E. faecalis CECT7121 hacia un perfil inflamatorio, se utilizó un modelo tumoral para contextualizar los efectos benéficos de esta cepa. E. faecalis CECT7121 indujo en forma dosis-dependiente una fuerte activación in vitro de DCs generadas a partir de precursores de médula ósea, induciendo la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias (IL-6, TNF?, IL-12p40 e IL-10). En comparación con otras cepas bacterianas analizadas, se observaron diferencias significativas en los niveles de TNF? e IL-10 producidos in vitro. Además, E. faecalis CECT7121 estimuló la expresión de marcadores celulares de activación como MHC-II, CD80 y CD40. Las preparaciones antigénicas obtenidas de E. faecalis CECT7121 indujeron diferentes respuestas de citoquinas en cultivos de DCs. En particular, los ácidos lipoteicoicos estimularon la producción de todas las interleuquinas pro-inflamatorias testeadas, mostrando características interesantes como moléculas inmunoestimulatorias. La estimulación con E. faecalis CECT7121 sobre DCs generadas a partir de precursores de médula ósea de ratones genéticamente modificados remarcó la importancia de los mecanismos de reconocimiento y las moléculas que participan en la señalización intracelular. La eliminación de la proteína adaptadora MyD88 en DCs MyD88-/- impidió su maduración y la producción de citoquinas. Por su parte, ni la expresión de DC-SIGN humano (hSIGN) ni la ausencia del receptor de manosa (MR-/-) en DCs murinas pareció haber modificado el efecto estimulatorio de esta cepa bacteriana. En el estudio de las consecuencias generadas sobre la respuesta inmune adaptativa, las DCs previamente estimuladas con E. faecalis CECT7121 estimularon la proliferación de linfocitos T CD4+ e indujeron la producción de IFN? en co-cultivos in vitro. Los ensayos in vivo permitieron evidenciar que la inoculación intraperitoneal de DCs pulsadas con E. faecalis CECT7121 en ratones naïve generó una acumulación sistémica de células que específicamente produjeron IFN?. In vitro, E. faecalis CECT7121 promovió la activación de macrófagos hacia el perfil clásico M1, estimulando la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-6 y TNF?. En comparación con las demás cepas estudiadas, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de citoquinas secretados. Al analizar los mecanismos intracelulares desencadenados, se observó que esta cepa probiótica activó la vía de señalización que involucra al factor de transcripción NFAT. El tratamiento intragástrico con E. faecalis CECT7121 en ratones BALB/c ejerció un efecto estimulante sobre el sistema inmune local y sistémico. Este probiótico indujó mayores respuestas proliferativas y torció la respuesta inmune hacia la producción de IFN?. La producción de esta citoquina fue mayor al día 4 y disminuyó para el día 11 luego del tratamiento, mostrando signos de una respuesta cinética que tiene lugar tanto a nivel local como sistémico. En las condiciones experimentales utilizadas, E. faecalis CECT7121 no afectó la generación ni el reclutamiento de Tregs o MDSCs. Al contextualizar los efectos benéficos E. faecalis CECT7121 empleando modelos anti-tumorales, este probiótico inhibió de manera dosis-dependiente la proliferación in vitro de las células tumorales murinas (LBC) y humanas (Raji y PL104). Las cepas control mostraron un comportamiento dosis-dependiente similar al de E. faecalis CECT7121. Sin embargo, no todas las bacterias testeadas mostraron el mismo nivel de inhibición de la proliferación celular. Resultados similares fueron observados en los efectos directos de las paredes bacterianas purificadas. La administración in vivo por vía intraperitoneal de E. faecalis CECT7121 o las cepas control testeadas protegió de la muerte al 90 % de los animales desafiados con una dosis letal del linfoma LBC, probablemente debido a la acción conjunta de la estimulación in situ de la respuesta inmune innata y la inhibición tumoral directa. En resumen, estos resultados demuestran que la estimulación inmunológica generada por E. faecalis CECT7121 involucra la activación de la respuesta inmune innata (teniendo como blanco principal a las DCs y los macrófagos) y el consecuente desarrollo de respuestas celulares adaptativas del perfil Th1. Estos resultados demuestran que E. faecalis CECT7121 puede, en definitiva, constituir una novedosa estrategia adyuvante tanto en planes de vacunación oral como sistémica, o incluso como agente modulador en terapias anti-tumorales.

Descripción: El inflamasoma NLRP3 participa en muchos procesos de inflamación crónica yde mantenimiento de la homeostasis en varios tejidos. En el tejido óseo, interviene en la pérdida ósea asociada a enfermedades auto-inflamatorias y a patologías inflamatorias crónicas de bajo grado. En este trabajo,se demostró que las partículas óseas aceleraron la osteoclastogénesis de manera parcialmente dependiente de NLRP3, una respuesta que correlacionó con los niveles de activación de este complejo. Además, se observó que en ausencia de NLRP3 se podían generar mecanismos compensatorios que activen otros inflamasomas. Por otro lado,el estrés oxidativo inducido por arsenito de sodio indujo la diferenciación dependiente de NLRP3, y la presencia de éstefue necesaria para mantener los niveles de ROS generados por arsenito y por RANKL. Finalmente, en el modelo in vivo, los animales Nlrp3-/- perdieron menos masa ósea con relación a los wild type antela inyección sistémica de RANKL. Además, estos últimos produjeron más IL-1? en el microambiente óseo, un fenómeno revertido por la administración de zoledronato.En conjunto, estos resultados sugieren que NLRP3 juega un papel preponderante el mantenimiento de la homeostasis ósea a través de la producción de IL-1? y desus efectos intrínsecos sobrela osteoclastogénesis.

Descripción: La proteína adaptadora p66shc ha demostrado que los genes reguladores delenvejecimiento y las especies reactivas del oxígeno (ROS) están estrechamenteinterconectados. Su ausencia modifica la homeostasis metabólica proporcionando resistenciaal estrés oxidativo y promoviendo la longevidad. En este estudio, las mitocondrias de tejidonervioso de ratones envejecidos p66shc(-/-) presentan una alteración reducida del equilibrioredox con una disminución tanto en la generación de ROS como en su desintoxicación.Demostramos un fuerte vínculo entre las especies reactivas de nitrógeno y la función, la morfología y la biogénesis mitocondrial. Bajos niveles de formación de peroxinitrito resultanen una menor nitración de las proteínas mitocondriales de ratones p66shc(-/-) envejecidos,retrasando la pérdida de funciones biológicas característica del proceso de envejecimiento.Sirt3 modula la biología mitocondrial asociada a la edad y la función a través de ladesacetilación de proteínas. Mostramos que su actividad depende de su estado de nitración yque altos niveles de NAD, como los observados en mitocondrias de ratones p66shc(-/-) durante elenvejecimiento, retrasarían el declive de su función. Los bajos niveles de nitración yacetilación de proteínas en estos ratones, podrían ser responsables de prevenir el desbalancede la homeostasis metabólica durante el envejecimiento, aumentando la esperanza de vida.

Descripción: En el presente trabajo de tesis, demostramos que las endotelinas-1 y -3 (ET-1 y ET-3) se comportan como neuropéptidos moduladores de la actividad del transportador de noradrenalina (NET) en el hipotálamo anterior y posterior de ratas normotensas. La regulación del mismo por las ETs es compleja e involucra diferentes subtipos de receptores de ETs, incluyendo los llamados no convencionales o atípicos y múltiples vías de señalización. En el hipotálamo anterior se observa que la ET-1 disminuye la captación neuronal de noradrenalina (NA) a expensas de la reducción de la actividad del NET debido a una disminución en los sitios de unión. Las modificaciones producidas en la actividad del NET son específicamente sobre la capacidad máxima de transporte de NA o sea número de transportadores funcionales sin alterar su afinidad. El efecto inhibitorio de la ET-1 es mediado por el receptor ETB e involucra diferentes vías que incluyen la NOS neuronal, la PKA y la PKC. En general estas vías activan los sitios de fosforilación del transportador en los aminoácidos serina y tirosina interactuando entre Sintaxina A1 y NET. Esto produce la regulación del transportador en la superficie neuronal aumentando la internalización del NET, por lo tanto disminuye su número en la membrana de la terminal nerviosa. En esta misma región hipotalámica, la ET-3 incrementa la captación neuronal de NA por aumento de la actividad del NET debido a un incremento del número de transportadores expresados en la membrana de la neurona. Este efecto se basa en una movilización del NET desde los compartimentos intracelulares hacia la superficie de la membrana. Este neuropéptido ejercería su efecto a través de la activación de un receptor atípico o no convencional el cual está acoplado a una proteína G. La activación del complejo receptor atípico/proteína G involucra diferentes mecanismos intracelulares Ca2+ dependientes. En el hipotálamo posterior, ambos neuropéptidos disminuyen la captación neuronal de NA a expensas de la reducción de la actividad del NET como consecuencia de una disminución en los sitios de unión. Este efecto es consecuencia de un incremento en la internalización del transportador desde la superficie de la membrana neuronal hacia los depósitos intracelulares. En el caso de la ET-1 el efecto inhibitorio es mediado por el receptor ETB unido a proteína G y la ET-3 a través de la activación de un receptor atípico o no convencional el cual está acoplado a una proteína G. En ambas situaciones, independientemente del receptor que se active, el efecto inhibitorio de ambas ETs involucra diferentes vías intracelulares que incluyen a la NOS neuronal, PKA y PKC. Esto produciría el mismo efecto descripto previamente en el caso de la ET-1 en el hipotálamo anterior. Sobre la base de los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral sumado a los trabajos previos de nuestro grupo permiten demostrar contundentemente que tanto la ET-1 como la ET-3 se comportan como neuromoduladores de la transmisión noradrenérgica en el hipotálamo anterior como en el posterior, de animales normotensos, a través de la regulación de tres procesos importantes, la actividad del NET, la regulación de la liberación neuronal de NA y la actividad y expresión de la tirosina hidroxilasa. Por lo tanto, y a la luz de todos estos resultados, podemos inferir que los efectos producidos por las ETs a nivel central sobre la fisiología cardiovascular son consecuencia de la reducción en la simpatoinhibición a nivel del hipotálamo anterior y un incremento de la simpatoexitación del hipotálamo posterior. Todo esto daría respuesta al aumento de la actividad simpática central, producido por las ETs, que fuera observado por diversos autores.

Descripción: Estudios epidemiológicos muestran una disminución en la incidencia de enfermedades cardiovasculares (ECV) y de hipertensión (HT) en sujetos que consumen regularmente una dieta rica en frutas y hortalizas. Estos estudios apoyan la idea de que los beneficios podrían estar causalmente relacionados con la presencia de ciertos flavonoides en las frutas y hortalizas. Los flavonoides han sido ampliamente reconocidos por tener una acción antioxidante in vitro y por ello se les adjudicó su efecto beneficioso sobre la salud. Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado la evidencia acerca de otros posibles mecanismos de acción (interacción con membranas y receptores; regulación de actividades enzimáticas, entre otros efectos) que serían compatibles con los efectos observados in vivo y con la baja concentración de flavonoides presente en los tejidos El óxido nítrico (NO) modula varios aspectos de la fisiología cardiovascular participando en la regulación de la presión arterial, la frecuencia y contractibilidad cardíaca, así como la vasorelajación. La disminución de la biodisponibilidad de NO es considerado un marcador temprano de desarrollo de ECV. La concentración de NO en los tejidos dependerá tanto de su producción por parte de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) como de su metabolización. Una de las vías de metabolización del NO es su reacción con el anión superóxido. La enzima NADPH oxidasa es considerada una de las fuentes principales de producción de anión superóxido en el sistema cardiovascular y existe evidencia de su participación en el desarrollo de la ECV. El objetivo general del presente trabajo de tesis fue estudiar los efectos de dos flavonoides suplementados en la dieta, (?)-epicatequina (EC) y quercetina (QC), sobre el metabolismo del NO y del anión superóxido, y los posibles mecanismos de acción involucrados, en tejido cardíaco. Para ello se seleccionaron dos modelos animales en donde se desarrolla un aumento de la PA y en los cuales se encuentra comprometida la biodisponibilidad de NO. En el primer modelo se indujo el aumento de la PA por inhibición de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) con L-NAME. Este inhibidor se administró en el agua de bebida (360 mg/L) durante 4 días a un grupo de animales, mientras que a otros dos grupos se les coadministró EC o QC (4 g/kg de dieta). La administración de dichos compuestos fue efectiva en prevenir el aumento de la PA y del estrés oxidativo inducido por L-NAME, así como los cambios en el metabolismo del NO (en el caso de la EC) y del anión superóxido (para ambos compuestos). Así, tanto la EC como la QC fueron eficaces en prevenir la disminución de la biodisponibilidad de NO en corazón, siendo los mecanismos implicados en su restablecimiento a valores controles los siguientes: i) un aumento de la actividad de NOS y de los niveles de fosforilación de eNOS en presencia de EC, ii) una disminución de la producción de anión superóxido dependiente de NADPH oxidasa, asociada a una menor expresión de la subunidad regulatoria p47phox en presencia de EC y QC. En conjunto, dichos eventos conducen a un menor consumo de NO a través de su reacción con el anión superóxido y a un aumento de su biodisponibilidad en tejido cardíaco en este modelo experimental. En el segundo modelo se indujo el aumento de la PA por administración de fructosa en el agua de bebida, que promueve alteraciones funcionales y metabólicas similares al síndrome metabólico en humanos. La fructosa se administró en el agua de bebida (10% p/v) por 8 semanas y a un grupo de ratas se les coadministró EC (0,2 g/kg de dieta). La administración de EC en la dieta fue eficaz para prevenir el aumento de la PA y del estrés oxidativo y mejorar parámetros metabólicos alterados por la sobrecarga de fructosa. Así, la EC fue eficaz para prevenir la disminución de la biodisponibilidad de NO en corazón, siendo los mecanismos implicados en su restablecimiento a valores controles los siguientes: i) el aumento de la actividad de NOS sin modificación en la expresión de eNOS, pero con incremento en la fosforilación de eNOS en Ser1177 y ii) la prevención del estrés oxidativo como consecuencia de una menor producción de anión superóxido dependiente de NADPH oxidasa, asociado a una menor expresión de la subunidad regulatoria p47phox en presencia de EC. En conjunto, dichos eventos conducen a un menor consumo de NO a través de su reacción con el anión superóxido y a un aumento de su biodisponibilidad en tejido cardíaco en este modelo experimental. De acuerdo a los resultados obtenidos en los distintos estudios de esta tesis, se puede concluir que el efecto antihipertensivo de la EC y la QC involucra un conjunto de mecanismos alternativos a una acción antioxidante clásica. Podemos inferir que los flavonoides estudiados serían los responsables, al menos en parte, de los efectos beneficiosos sobre el sistema cardiovascular y la hipertensión. Los hallazgos descriptos en esta tesis proporcionan nueva e importante información para diseñar dietas enriquecidas en dichos compuestos y/o realizar estudios de intervención dirigidos a la prevención y/o tratamiento de enfermedades metabólicas y crónicas no transmisibles en las cuales la biodisponibilidad de NO esté comprometida

Descripción: Estabilidad y actividad catalítica del dominio de unión a ATP de una ATPasa transportadora de Cu (I) del arquea hipertermófila Archaeoglobus fulgidus (Af. CopA). En este trabajo, se determinaron las condiciones necesarias para las hidrólisis de ATP y p-nitrofenil-fosfato catalizadas por el dominio catalítico asilado (ATP-PN) de Af. CopA. Las actividades catalíticas del ATP-PN son modulables por sus sustratos, la temperatura, el pH, el Mg+2 y la fuerza iónica. El Mg+2 es un activador esencial de ambas actividades. La estabilidad térmica del ATP-PN, fue evaluada monitoreando su actividad y estructura. Este posee una elevada estabilidad en altas temperaturas, presentando al menos dos intermediarios con un elevado contenido de estructura secundaria residual y un producto final de inactivación térmica carente de ella. Se evaluó el desplegado-replegado del ATP-PN inducido por urea mediante diferentes técnicas espectroscópicas, sugiriéndose un mecanismo reversible con al menos un intermediario de reacción en equilibrio rápido en el estado nativo. La estabilidad neta del ATP-PN es inferior a las de proteínas mesófilas de cercano peso molecular a 25 C. Se sugiere un posible mecanismo de adaptación térmica para el ATP-PN en base a la conservación de un alto porcentaje de estructura secundaria en su estado desplegado, el cual justificaría los bajos valores de H, S y Cp respecto de los valores usualmente observados en proteínas mesófilas de similar peso molecular.

Descripción: La tendencia en alimentación saludable incentiva a la demanda de alimentos donde se incluyen los llamados "alimentos funcionales", con altas cantidades de compuestos bioactivos y efectos beneficiosos sobre la salud, como son los polifenoles. Los polifenoles presentes en alimentos de origen vegetal, son estudiados por sus propiedades captadoras de radicales libres, que le confieren actividad antioxidante. La producción de frutos rojos o berries constituye un negocio en expansión en la Patagonia, donde las condiciones agroecológicas son ideales para su producción. En los últimos años ha aumentado la demanda de estas frutas para su uso como ingredientes en la industria, solos o en mezclas con otros alimentos como productos lácteos. El nivel considerable en compuestos bioactivos como antocianinas reportado para estas frutas las hace interesantes para su uso en el desarrollo de alimentos funcionales. El objetivo de este trabajo fue realizar una caracterización fisicoquímica y determinar los niveles de compuestos bioactivos (contenido de polifenoles totales-PT, antocianinas-AMT) capacidad antioxidante-CAT y color (parámetros CIELab, índices de color polimérico) en pulpas de arándano, sauco, cassis y maqui originarios de El bolsón, solas, en productos comerciales existentes en el mercado y en formulaciones en base a azúcares y maltodextrina (MD). Se estudió también el efecto del almacenamiento y procesos de preservación en las características y estabilidad de los productos. Mediante ensayos de almacenamiento acelerado se analizaron cambios fisicoquímicos y sensoriales y a través de la evaluación sensorial su aceptación por parte del consumidor. Se determinaron los parámetros cinéticos de deterioro de AMT y color durante el almacenamiento y tratamientos térmicos (velocidades de degradación, tiempos medios, Energías de activación Ea y Q10). También se evaluó la adición de ácido ascórbico en la estabilidad de los sistemas. Se estudió la estabilidad de compuestos bioactivos y color en productos obtenidos por concentración al vacío, liofilización y secado spray. Entre las frutas estudiadas, el arándano presentó el contenido más bajo de polifenoles y antocianinas totales en las pulpas naturales, cerca de 3000 mg/l de PT y 290 mg/l en AMT. En sauco y maqui poseen valores intermedios de PT, entre 5500 y 6000 mg/l y en el cassis los valores son significativamente más elevados, de 10300 mg/l en la pulpa natural. En cuanto a AMT, presentaron en orden creciente sauco 923 mg/l, cassis 1222 mg/l y maqui 1795 mg/l. Las características fisicoquímicas de los jugos fueron similares, destacándose el cassis en cuanto al mayor contenido en ácido ascórbico natural de la fruta. La capacidad antioxidante fue mayor para el cassis, seguida por sauco y maqui en niveles similares y por último el arándano. Durante almacenamiento a 40 °C de los jugos comerciales los parámetros estudiados mostraron cambios significativos, observándose una importante disminución de AMT. En cuanto PT se observó una disminución máxima de un 40 % y un descenso máximo del 50 % en CAT. Las correlaciones entre PT y parámetros de color mostraron valores positivos para el color rojo (a*) y negativos para color amarillo (b*) y luminosidad (L*). Se observó en general un aumento en el parámetro h° y en porcentaje de color polimérico lo que indica el corrimiento hacia tonos más amarronados. En el almacenamiento, se obtuvieron energías de activación en el rango 53-86 kJ/mol para el sauco y cassis, y valores de Q10 entre 1,5-1,85 en el rango 25-38 °C lo que indica un considerable efecto de la temperatura de almacenamiento en la estabilidad de los parámetros estudiados. En los jugos adicionados con ácido ascórbico, los resultados revelaron un aumento en las velocidades de deterioro de AMT y a*. Los parámetros cinéticos de la degradación durante tratamientos térmicos entre 70-90 °C evidenciaron velocidades de deterioro mayores para AMT en relación a la degradación del color. Las Ea de degradación determinadas estuvieron en el rango entre 81 y 118 kJ/mol lo que muestra un efecto considerable de la temperatura de tratamiento térmico para estos sistemas. En cuanto a la degradación de PT y CAT, los resultados fueron similares a los obtenidos durante el almacenamiento, observándose una considerable retención. El proceso de concentración no afectó el contenido de AMT, PT y color pero durante el almacenamiento se observó un importante descenso sobre todo en AMT y color y un aumento en el porcentaje de color polimérico. Las muestras con agregado de sacarosa+MD tuvieron mayor aceptabilidad que las adicionadas con trehalosa o stevia. Los polvos obtenidos por liofilización almacenados a 38 °C mostraron una muy buena retención de AMT (mayor al 75 %) y para los PT sólo se observó un descenso máximo del 15% en el caso de arándano, manteniéndose para las demás frutas. El color rojo de las muestras reconstituidas en base al polvo almacenado también permaneció estable. En cuanto a las muestras obtenidas por secado spray en base a arándano y sauco, las características físicas obtenidas fueron buenas, mostrando también relativamente altos valores en la temperatura de transición vítrea. En las muestras de sauco obtenidas por secado spray se observó una excelente estabilidad de AMT y color luego de 45 días a 38 °C, observándose sólo una disminución del 4% en AMT y del 1% en el parámetro a*. Los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al conocimiento de la estabilidad de antocianinas y polifenoles en jugos de frutos rojos sometidos a diversas condiciones de almacenamiento y procesamiento y pueden ser aplicados para el desarrollo de alimentos con beneficios para la salud humana.

Descripción: La sobrecarga y la deficiencia de hierro fueron asociadas a mayor riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV). Sin embargo, los mecanismos involucrados y su impacto clínico resultan poco conocidos. Asimismo, aún no ha sido evaluado el potencial terapéutico del mantenimiento de la homeostasis del hierro sobre los factores de riesgo de ECV. El objetivo de la tesis fue evaluar el rol de los niveles de hierro sobre la inflamación, la disfunción endotelial y la aterosclerosis a través del estudio de sus bioindicadores en pacientes con sobrecarga y deficiencia de hierro en comparación con controles sanos, y estudiar el impacto de sus respectivos tratamientos. Se evaluó el metabolismo de los glúcidos y los lípidos, la actividad de enzimas asociadas a lipoproteínas, la composición química y funcionalidad de las lipoproteínas aisladas, y bioindicadores de inflamación y aterosclerosis. En ambos trastornos del metabolismo del hierro, se observaron: alteraciones en el perfil lipoproteico, presencia de lipoproteínas modificadas y disfuncionales, y un estado proinflamatorio caracterizado por una mayor actividad de fosfolipasa-A2 asociada a lipoproteínas. Estas alteraciones revirtieron en respuesta a los tratamientos respectivos de cada condición. En conclusión, las alteraciones del metabolismo del hierro se asocian a procesos proinflamatorios capaces de promover el desarrollo de ECV.

Descripción: Las deficiencias o la inexistencia de sistemas de información en salud es una problemática internacional. En esta tesis se plantea la pérdida de información de gran parte del sector privado y de obras sociales en la atención sanitaria argentina. Se busca esbozar una solución al problema de la notificación privada al sistema de vigilancia en salud. Para ello se fundamentan los diseños y se evalúan los resultados de dos experiencias de notificación por parte un sector de bioquímicos privados, demostrando la factibilidad de repetirlas y extenderlas. Este diseño de la notificación bioquímica privada permitiría, de extenderse, utilizar personal científico capacitado, contribuir a hacer más accesible el acto de salud y ampliar la información apta para la vigilancia epidemiológica de un amplio sector cuyos datos se pierden, a condición de que el Estado asuma un rol central en la estructura sanitaria más allá de los cambios de gobierno. Los resultados de la tesis y el análisis de las principales fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas en las experiencias presentadas permiten afirmar que los agentes de salud privados de pequeña envergadura pueden integrarse en un sistema nacional de salud e información, de directriz estatal, y que su capacidad instalada no debe desecharse.

Descripción: El género Valeriana (Valerianaceae) está constituido por aproximadamente 250 especies. En la región patagónica Argentina hay especies nativas de valeriana que se utilizan en medicina tradicional. Los usos populares de las ?valerianas? son: tratamiento de los estados neuróticos, trastornos menores del sueño y dolores gástricos. Los estudios anatómicos se realizaron con las técnicas de corte y coloración. En el estudio de polifenoles se cuantificaron fenoles totales, ácidos hidroxicinámicos y flavonoides. Los aceites esenciales se analizaron por GC-FID-MS. El estudio de la actividad antioxidante in-vitro se midió con las técnicas de DPPH y ABTS. En V. clarionifolia la estructura primaria de la raíz forma una protóstela ectofloica. La estructura secundaria una actinostela hexarca. El rizoma de V. carnosa posee estructura anómala. Ambas especies presentan escasos granos de almidón. Las mayores concentraciones de polifenoles se cuantificaron en el estadio fenológico de la floración. Los aceites esenciales mayoritarios son beta-sesquifelandreno alfa-pineno, acetato de bornilo y ácido isovaleriánico. Asimismo se reporta la presencia de dolichodial y epidolichodial. La actividad antioxidante de los cocimientos es mayor en las dos especies en el estadio de la floración. El presente estudio aporta importante información que puede ser utilizada en control de calidad de medicamentos herbarios.

Descripción: Brucella abortus es una bacteria patógena que infecta al ganado bovino y al humano, causando una enfermedad conocida como brucelosis. Esta bacteria se caracteriza por una gran versatilidad metabólica que le permite sobrellevar las condiciones adversas que encuentra durante su ciclo de infección, entre las que se destaca la baja concentración de oxígeno de su nicho replicativo intracelular. Se ha descripto que una vía de señalización formada por la histidina quinasa NtrY y el regulador de respuesta NtrX participa en el la respuesta adaptativa que lleva adelante B. abortus frente a la microaerobiosis. Puesto que existe muy poca información respecto al funcionamiento de dicha vía, el objetivo de esta tesis doctoral ha sido dilucidar las bases moleculares del mecanismo de activación del sistema de señalización formado porNtrY y NtrX de B. abortus. Para ello, se llevó adelante una caracterización bioquímica y estructural del sistema. Se ha demostrado que NtrY es una enzima bifuncional (quinasa y fosfatasa) y se probó larelevancia de un residuo de cisteína (C569) en su regulación in vitro en respuesta al estado al estado redox. Además, se han reportado las primeras estructuras cristalográficas del dominio REC de NtrX y de la proteína completa, así como una descripción de su estado oligomérico, su capacidad para unir ligandos e interactuar con el ADN. Los resultados obtenidos implican un avance importante en el conocimiento respecto de esta vía de señalización y proporcionan antecedentes para continuar indagando los detalles de su activación.

Descripción: La influencia del nivel de exposición al arsénico (As) sobre su perfil metabólico urinario se evaluó en población Argentina, expuesta crónicamente al As. Se investigó el perfil metabólico urinario (As inorgánico, ácido monometilarsónico y ácido dimetilarsínico) y se utilizó el As urinario (suma de todos los metabolitos) como medida del nivel de exposición. Se investigó la presencia de tres polimorfismos: T860C en el gen codificante de la arsenito metiltransferasa, y C677T y A1298C en el gen codificante de la metilentetrahidrofolato reductasa. Se observó influencia de la edad, el género, el nivel de exposición y la presencia del polimorfismo T860C sobre el perfil metabólico urinario del As. No se observó influencia de los polimorfismos C677T o A1298C. La influencia del nivel de exposición sobre el perfil metabólico urinario del As mostró ser diferente entre niños y adultos, hombres y mujeres y entre individuos portadores de los genotipos silvestre y heterocigota para el polimorfismo T860C. La exposición al As debe reducirse drásticamente, no sólo para reducir los efectos nocivos para la salud del As, sino también porque la capacidad de metabolizar el As de ciertos subgrupos de población, podría verse afectada potenciando el riesgo de desarrollo de enfermedad.

Descripción: Lurbinectedin (Lur) es un alcaloide sintético que induce daño en el ADN de células proliferantes y quiescentes. Se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase II/III para tumores sólidos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la citotoxicidad de Lur en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con LLC y donantes sanos, y determinar si puede alterar la relación entre las células LLC y su microambiente. Encontramos que Lur indujo la muerte de todos los tipos celulares estudiados en forma tiempo y dosis-dependiente, siendo los linfocitos B, los monocitos y las células mieloides supresoras las poblaciones más susceptibles. Curiosamente, las célulasNurse Like Cells diferenciadas in vitro a partir de monocitos fueron las células más resistentes. Además, a dosis subapoptóticas, Lur disminuyó la expresión de CCR7 en las células LLC afectando su migración en respuesta a CCL19 y CCL21. Estas concentraciones no tóxicas también estimularon la síntesis de pro-IL1? en monocitos y macrófagos. Los resultados obtenidos indican que Lur podría tener actividad antitumoral en LLC gracias a la combinación de su acción directa sobre las célulasleucémicas y su efecto sobre el microambiente tumoral. Estos hallazgos alientan a continuar la investigación de Lur como potencial terapia en LLC.

Descripción: En trabajo previo de nuestro laboratorio se demostró que la proteína nuclear no histónica HP1y se concentra transitoriamente en el polo del núcleo opuesto al centro organizador de microtúbulos al inducir la diferenciación de preadipocitos 3T3-L1. Nos preguntamos si la polarización nuclear de HP1y ocurría en otros procesos de diferenciación celular, y para ello analizamos la distribución de HP1y durante el proceso de miogénesis. Empleando inmunofluorescencia indirecta y microscopía confocal observamos que en mioblastos C2C12, HP1y además de localizarse en regiones nucleares eucromáticas y heterocromáticas como ya se había reportado (Minc et al., 1999; Minc et al., 2000), llamativamente se localiza en el citoplasma. Luego de 4 días de inducida la diferenciación, los mioblastos dan lugar a la formación de miotubos donde HP1y se localiza mayoritariamente en el citoplasma adoptando un aspecto filamentoso muy marcado, que se dispone en forma longitudinal al miotubo. En cambio, HP1a, otro miembro de la familia de las HP1 altamente homóloga a la isoforma y, se encuentra sólo presente en el núcleo tanto de mioblastos como de miotubos. Análisis por Western blot de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de mioblastos y miotubos confirmaron que HP1y se encuentra en ambas fracciones. De manera relevante, observamos que HP1y se localiza en el citoplasma en forma de filamentos que se estructuran transversalmente tanto en miotubos C2C12 maduros como en miofibrillas aisladas de músculo esquelético de ratón. En función de su distribución filamentosa observada en miotubos y en miofibrillas de músculo de ratón, investigamos su posible asociación con proteínas que forman el citoesqueleto, y así encontramos que HP1y interacciona con actina y tubulina, hallazgo muy novedoso descripto por primera vez. Finalmente, para investigar la importancia funcional de HP1y durante el proceso de miogénesis, se generaron mioblastos C2C12 en los que se interfirió la expresión de HP1y de manera estable empleando ARNsh, células que luego fueron inducidas a diferenciarse. Al cabo de 4 días de diferenciación, las C2C12 HP1y- mostraron diferentes fenotipos, desde la formación de miotubos delgados atróficos hasta la inhibición del proceso miogénico, dependiendo ello del nivel de interferencia de HP1y. En síntesis, HP1y no es una proteína de exclusiva localización nuclear y cumple un rol esencial en la correcta formación del miotubo.

Descripción: La llama (Lama glama) es un herbívoro que posee un sistema digestivo conformado por 3 compartimentos. El primer compartimento (C1), similar al rumen en los rumiantes, posee un ecosistema microbiano complejo que incluye bacterias, protozoos, arqueas y hongos, y es donde ocurre la fermentación del forraje consumido, un proceso fundamental para la nutrición del animal. El C1 de la llama se encuentra pobremente caracterizado debido a las dificultades que involucra trabajar con los microorganismos que lo habitan. El objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de los microorganismos presentes en el C1 de la llama procedentes de dos zonas geográficas distintas (Buenos Aires y Jujuy). Se cuantificaron parámetros tales como pH, amoníaco y ácidos grasos volátiles. Se pudo revelar a las principales bacterias y arqueas metanogénicas que habitan el C1. Se detectaron potenciales nuevas especies bacterianas, además se logró la cuantificación y detección de géneros y especies de protozoos. Este es el primer trabajo en proveer información sobre la cuantificación, detección y diversidad genética de microorganismos anaerobios presentes en el C1 de la llama. Este estudio provee una visión del ecosistema bacteriano del C1 de la llama y sienta las bases para futuros estudios.

Descripción: Las MSCs (mesenchymal stem cells) se pueden diferenciar a células del linaje mesenquimal, incluyendo adipocitos y osteoblastos. Al activarse la vía Hippo, TAZ, efector de la vía y coregulador transcripcional, se fosforila en Ser 89, lo que provoca su unión a las proteínas reguladoras 14-3-3 en el citoplasma. Esto impide la represión de genes implicados en adipogénesis (que por ende se expresan). En mamíferos, la familia 14-3-3 está compuesta por 7 parálogos que se unen específicamente a residuos fosforilados en serina o treonina (pS/T) en sus proteínas blanco. Nuestra hipótesis fue que la interacción con TAZ era específica de un o algunos parálogo/s de 14-3-3. Se observaron variaciones en los niveles de los parálogos de 14-3-3 durante la adipogénesis de células hASCs y 3T3-L1. La variación se produjo tanto a nivel del ARNm como de la proteína, siendo específica para los parálogos 14-3-3y, (B), (n) y E. El parálogo más variable fue 14-3-3y, cuyos valores aumentaron durante la adipogénesis de hASCs y 3T3-L1. Tras el silenciamiento de 14-3-3B los resultados sugerirían que ésta podría regular la localización subcelular de TAZ. Nuestro análisis apoya el concepto actualmente creciente de funciones moleculares específicas para los diferentes parálogos de 14-3-3.

Descripción: La población de la provincia de Misiones es resultado de un proceso de miscegenación que involucró indígenas de la familia lingüística Tupí Guaraní, conquistadores españoles del siglo XVI e Inmigrantes de diversos lugares de Europa (SXX); además su posición geográfica también ha favorecido la migración fronteriza, tanto de Brasil como de Paraguay. Actualmente, las comunidades Guaraníes se concentran en pequeños asentamientos asociados al remanente de selva, mientras que la población mestiza habita regiones urbanas y rurales. Esta situación supone un escenario único para estudios de Antropología y Epidemiología. El ADN mitocondrial es un marcador genético ampliamente utilizado para la determinar la ancestralidad de las poblaciones en estudios de Antropología Molecular. La secuenciación de la región hipervariable del ADNmt ha permitido clasificar al mismo en 3 grandes linajes de origen asiático-americano, europeo y africano. El estudio de su frecuencia, distribución y evolución ha permitido comprender los patrones migratorios y el poblamiento antiguo y contemporáneo. Además, los virus JCV y HPV también han sido propuestos como modelos adecuados para estudios de Antropología, reconociéndose genotipos africanos, europeos, asiáticos y amerindios. El estudio del origen y dispersión de los virus que infectan a las poblaciones humanas resulta útil para comprender la historia demográfica de los mismos como así también la historia evolutiva de las poblaciones hospedadoras. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue realizar un aporte desde la genética a la historia del poblamiento de Misiones, mediante el análisis de un marcador genético humano y dos marcadores genéticos virales. Con este fin se realizó la caracterización genética de la población a través del ADN mitocondrial, como así también la determinación de las variantes circulantes de HPV-16 y de JCV presentes en población urbana de Misiones. Se realizaron muestreos en 3 zonas geográficas de la provincia (sur, centro y norte). Los análisis moleculares se realizaron sobre el ADN total extraído a partir de estas muestras. Los linajes mitocondriales fueron determinados por amplificación de la región HV-I del ADNmt con posterior secuenciación. La caracterización genética del Poliomavirus JC, estuvo determinada por la amplificación del gen VP1 (proteína mayor de la cápside) y posterior análisis filogenético con secuencias disponibles en Genbank para determinar el origen geográfico de los tipos circulantes en la provincia de Misiones. Respecto a la caracterización de variantes circulantes de HPV-16, la misma se realizó a través de la amplificación y secuenciación del gen L1 (proteína mayor de la cápside);posteriormente se realizó un análisis con la herramienta online Blast para asignar la variante geográfica correspondiente a cada secuencia. Además, se llevaron a cabo análisis estadísticos de estructura genética poblacional mediante análisis de varianza molecular, análisis bayesianos para datar el Ancestro Común Más Reciente de cada set de datos, sus reconstrucciones demográficas y finalmente un análisis de Redes para evidenciar procesos demográficos asociados a cada marcador en la población. La historia del poblamiento de la provincia de Misiones se ve reflejada en los patrones genéticos arrojados por el ADNmt. Los 3 grandes linajes: asiático-americano, europeo y africano, están presentes en el pool génico de su población actual. Además, los marcadores genéticos virales también reflejaron los procesos demográficos propios de la provincia. En un contexto histórico, HPV-16 podría interpretarse como una fuerte irrupción del virus durante la colonización española (Siglo XVI) y/o la inmigración europea del Siglo XIX-XX. Por otra parte, la coexistencia de variantes introducidas y autóctonas de JCV en la población, refleja el perfil tri-híbrido de los procesos de poblamiento de Misiones, incluyendo nativos americanos (Guaraníes), inmigrantes europeos y migrantes fronterizos de Paraguay y Brasil. Estos resultados aportan nuevas perspectivas sobre el origen y composición genética de la población de Misiones, y las corrientes migratorias implicadas en el establecimiento de su población actual.

Descripción: Los triptanos son fármacos antimigrañosos diseñados a partir de serotonina (5-HT). Son agonistas selectivos de receptores 5-HT1 pero difícilmente atraviesan la barrera hemato-encefálica (BHE) para acceder a receptores centrales. Si bien el prototipo sumatriptan es de los triptanos más usados y está disponible en distintas formas, resulta necesario optimizar su eficacia y seguridad. Teniendo en cuenta que los poloxámeros son nanomateriales adecuados para vehiculizar fármacos, mejorarían la farmacocinética de sumatriptan, favorecerían su liberación prolongada y potencialmente su permeación a través de membranas. Aquí, realizamos simulaciones computacionales para entender el comportamiento de triptanos en membranas modelo. La interfase cumplió un papel clave en el anclaje de los compuestos indólicos: los grupos fosfato y colina favorecieron la distribución interfacial de estos compuestos, mediante múltiples interacciones. Confirmamos estos resultados experimentalmente. El comportamiento observado indica que estos compuestos no difunden fácilmente a través de membranas, como la BHE, con lo cual otro mecanismo de transporte sería necesario. También estudiamos la agregación de poloxámeros en agua y la encapsulación de sumatriptan en micelas poliméricas (resultaron adecuados). Los poloxámeros estudiados interactuaron con fosfatidilcolina dependiendo del entorno y su balance hidrofílico-lipofílico. Sería necesario profundizar en los efectos de estos poloxámeros sobre la permeación de fármacos.

Descripción: El objetivo de esta Tesis fue estudiar la ocurrencia de infección de Virus Papiloma (PVs) en primates no humanos (Platirrinos) del nordeste argentino y proponer los posibles escenarios implicados en la evolución y dispersión de estos virus en el linaje de los primates. Resultados: Se identificaron dos nuevos PVs del Género-Gamma en las especies A. caraya y S. nigritus (denominados AcPV1 y SnPV1 respectivamente). El origen y emergencia de estos PVs se estimó 32.395.860 años y ofrece un marco temporal factible para la radiación adaptativa en los Platirrinos. Sin embargo, la hipótesis de coespeciación fue cuestionada, fundamentalmente debido a la falta de congruencia entre las topologías de los árboles hospedador/huésped. En particular, el análisis de reconciliación filogenética indicó que los eventos de duplicación y la duplicación con cambio de hospedador fueron los eventos más frecuentes (46.5% y 34.8% respectivamente) mientras que los procesos de coespeciación y pérdida o extinción del virus en un linaje fueron menos frecuentes (alrededor del 10% cada uno). Este estudio representa el primer reporte de infección por PVs en platirrinos de Argentina, amplía el rango de huéspedes descripto para estos virus y propone nuevos escenarios para evaluar el origen y emergencia viral.

Descripción: La organogénesis del riñón es un proceso secuencial cuyo principal evento es la mutua inducción entre las células del mesénquima metanéfrico (MM), y las células epiteliales del brote ureteral (BU). Como resultado, el MM experimenta una transición mesénquima?epitelio (TME) para dar origen al nefrón, y el BU sufre sucesivas ramificaciones que originarán el sistema de túbulos colectores. Durante la nefrogénesis, la síntesis de bradiquinina (BK) aparece muy temprano, y la expresión del ARNm para su receptor B2 (RB2) es mucho mayor en el riñón en desarrollo que en el adulto. Asimismo, el bloqueo farmacológico del RB2 durante la etapa fetal provoca una diferenciación anormal de los túbulos renales, pero aún no se han descripto las causas bioquímicas ni morfológicas que lo justifiquen. Por lo tanto, se planteó como objetivo general estudiar el papel que cumple la hormona intrarrenal BK en el desarrollo posnatal de la papila renal. Se eligió como modelo de estudio cultivos primarios de células de TCd de papila renal de ratas neonatas, puesto que en la rata, el riñón completa su desarrollo en el periodo posnatal. La primera parte de esta tesis se centró en la caracterización morfológica y fenotípica de las células de TCd en el cultivo primario. Mediante ensayos de inmunofluorescencia de doble marcación se observó que las células de TCd en cultivo poseen una gran tendencia a unirse entre sí para formar colonias migratorias, que se evidenció por la presencia de lamelipodios en las células del borde de la colonia. Durante el desarrollo renal, los cambios morfológicos ocurren aceleradamente. En los cultivos primarios, estos cambios se ven reflejados en el alto nivel de heterogeneidad que exhiben las colonias, en relación con el grado de asociación, y de maduración o diferenciación de las células de TCd. Por otra parte, el análisis fenotípico de las células que aparecen en los cultivos primarios como células aisladas, brindó la información necesaria para concluir que se trata de células mesenquimáticas. Las reconstrucciones 3D y perfiles xz permitieron deducir que estas células se localizan de forma adyacente o por debajo de las células de la monocapa. La baja velocidad y cortos tiempos de centrifugación aplicados durante el aislamiento de los TCd de la papila, evitó la contaminación con células individuales. Por lo tanto, se interpreta que estas células con características mesenquimáticas se originan in situ en el cultivo primario mediante un proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) de las células de TCd. El conjunto, los resultados sugieren la existencia de un ?equilibrio dinámico? entre las células de TCd que forman parte de las colonias, y las células que no lo hacen, fuertemente desplazado hacia las primeras. Las reconstrucciones 3D, perfiles xz y experimentos en tiempo real muestran claramente que las células mesenquimáticas generadas in situ, finalmente se insertan entre las células de la colonia, y, como consecuencia de la inducción por parte de las células de TCd, experimentan una TME para quedar definitivamente integradas en la monocapa. Sobre la base de los resultados expuestos, se plantea un modelo en el cual las células mesenquimáticas que se originan de novo funcionarían de nexo entre el modelo de nefrogénesis propuesto más recientemente que incluye dos conversiones fenotípicas (TEM-delaminación-TME), y el modelo clásico de mutua inducción. En la segunda parte de la tesis se estudió el efecto de la BK sobre las células de TCd. Para ello, las células se estimularon con BK en presencia o en ausencia de un antagonista específico de RB2, HOE-140, o de un inhibidor específico de PI3K, LY294002. El análisis de las células de TCd tratadas con BK reveló la formación de un córtex continuo de filamentos de actina alrededor de la colonia, y la presencia de bordes ondulatorios o ?ruffles? de membrana en las células de la periferia. Los experimentos realizados en tiempo real confirmaron tales fenómenos y mostraron un aumento en la velocidad de formación y tamaño de lamelipodios y ?ruffles?, así como la adquisición de un mayor nivel de compactación celular, reflejado por la disminución del área total de las colonias. El pre-tratamiento con HOE-140 afectó la adhesión célula-célula inducida por BK y la formación de ?ruffles?. El análisis conjunto de las imágenes de inmunofluorescencia y los resultados de experimentos realizados en tiempo real en presencia de LY294002, demostraron la participación de PI3K en la asociación célula-célula, y en la formación de estructuras migratorias inducidas por BK. Asimismo, el análisis por Western blot evidenció que la activación de PI3K mediada por la unión de BK a RB2 induce en la células de TCd la activación de su efector ?corriente abajo? Akt, debido a un incremento de su forma fosforilada (Akt-P), hecho que ocurre solo en ausencia de HOE-140, y de LY294002. Esta situación se vio reflejada en las imágenes de inmunofluorescencia, donde se observa una mayor intensidad de marcación de Akt-P, y también de Rac1, un conocido efector ?corriente abajo? de PI3K que participa en la formación de lamelipodios. Resumen 3 En conclusión, los resultados presentados en este trabajo de tesis doctoral ofrecen nuevas evidencias experimentales que resaltan el rol que ejerce la BK durante el desarrollo postnatal del riñón, a través de su unión a RB2 y posterior activación de la vía PI3K/Akt/Rac1, mecanismo que favorece la migración colectiva del BU durante la nefrogénesis, desde la zona donde se origina en la papila, hasta la corteza renal donde ocurre la mutua inducción entre el MM y el BU, para dar origen al nefrón y al sistema de túbulos colectores, respectivamente.

Descripción: La nicotina es el principal componente activo del tabaco y juega un papel importante en la adicción al mismo. En roedores, la administración aguda de nicotina modifica la locomoción, ansiedad y nocicepción; mientras que administraciones repetidas producen respuestas conductuales relacionadas con sus propiedades adictivas, como el efecto reforzante y la dependencia física. En nuestro estudio, se utilizó un abordaje genético y farmacológico para evaluar la hipótesis de que los receptores GABAB modulan las propiedades adictivas de la nicotina. Con este fin, respuestas conductuales agudas (hipolocomoción, antinocicepción y conductas relacionadas con la ansiedad), efecto reforzante y síndrome de abstinencia (manifestaciones somáticas y motivacionales) de la nicotina se investigaron en ratones pretratados con baclofen (agonista GABAB) o 2-OH-saclofen (antagonista GABAB) (abordaje farmacológico) y en ratones deficientes de la subunidad GABAB1 (GABAB1 knockout) (abordaje genético). En estos animales, exploramos posibles alteraciones neuroquímicas (concentraciones de dopamina, noradrenalina y serotonina) y moleculares (expresión de c-Fos y receptores nicotínicos). En resumen, observamos que alteraciones conductuales, neuroquímicas y moleculares inducidas por las propiedades adictivas de la nicotina fueron modificadas por la estimulación (baclofen), el bloqueo (2-OH-saclofen) o la falta (ratones GABAB1 knockout) de receptores de GABAB. En conclusión, estos resultados sugieren que los receptores GABAB juegan un papel en las propiedades adictivas de la nicotina y apoyan la hipótesis de que agonistas de los receptores GABAB podrían ofrecer ventajas terapéuticas para el tratamiento de la dependencia al tabaco.

Descripción: La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, afecta aproximadamente 6-8 millones de personas en el mundo y otras 100 millones se encuentran en riesgo de infectarse. Si bien es endémica en América Latina, debido a los movimientos migratorios, esta enfermedad ha comenzado a ser una preocupación global. Ya han pasado más de 100 años desde su descubrimiento, sin embargo, las escasas alternativas terapéuticas disponibles, con múltiples efectos adversos y solo efectivas en la fase aguda de la infección, hacen que el desarrollo de vacunas capaces de controlar la infección por el parásito sea una estrategia de control prometedora. La prolíl oligopeptidasa de 80 kDa de T. cruzi (Tc80), es un factor de virulencia presente en todos los estadíos del parásito. Su actividad enzimática le permite degradar la matriz extracelular facilitando así la invasión tisular. Al respecto, se ha demostrado que su inhibición bloquea la infección del parásito a células no fagocíticas. Estas características nos impulsaron a estudiar a Tc80 como un candidato vacunal, analizando su inmunogenicidad y capacidad protectiva frente a un desafío con T. cruzi. Luego de clonar y expresar Tc80 en vectores de expresión procariotas y eucariotas ensayamos distintos protocolos de vacunación. Se inmunizaron así, ratones con: GI: ?rTc80 im? 4 dosis de Tc80 recombinante adyuvada con oligonucleótidos CpG (ODN-CpG) por vía intramuscular. GII: ?STc80? 4 dosis por vía oral de Salmonella atenuada transportando el ADN codificante de Tc80. Por último, el grupo ?P.boost? se inmunizó mediante una estrategia de Prime Boost heterólogo con: 2 dosis orales de Salmonella trasportando el gen de Tc80 y 2 dosis de rTc80 adyuvada con ODN-CpG por vía intramuscular. Se incluyó además un grupo control (SaroA), que recibió 2 dosis por vía oral de Salmonella atenuada transportando el plásmido pcDNA+3.1 vacío y luego 2 dosis de PBS + ODN-CpG por vía intramuscular. Al evaluar posteriormente la respuesta humoral desencadenada, encontramos que todos grupos inmunizados alcanzaron mayores títulos de anticuerpos anti-rTc80 respecto al grupo control. Más importante aún, estos anticuerpos fueron capaces de inhibir la actividad enzimática de Tc80, bloquear la invasión de tripomastigotes sanguíneos a células no fagocíticas y mediar la lisis de parásitos por activación de la vía clásica del sistema complemento. Al estudiar la respuesta inmune celular estimulada, observamos mediante ensayos in vivo y ex vivo, una fuerte activación de linfocitos T específicos contra Tc80. Los esplenocitos de todos grupos inmunizados secretaron IFN-? e IL-2 en respuesta al estímulo ex vivo con rTc80. Esta respuesta fue significativamente mayor en los grupos que recibieron al menos 2 dosis de la Salmonella atenuada transportando el gen de Tc80 (STc80 y P.boost). También observamos, por citometría de flujo, que los linfocitos T CD4+ de todos los grupos inmunizados producían TNF-? además de IFN-? frente al estímulo con rTc80. Debe destacarse que STc80 no sólo presentó el mayor porcentaje de células CD4 productoras de estas citoquinas, sino que expandió células polifuncionales (IFN-?+ TNF-?+) capaces de producir mayores niveles de citoquinas que el producido por células monofuncionales. La respuesta de linfocitos T CD8, estudiada mediante ensayos de citotoxicidad ex vivo e in vivo mostró que los esplenocitos del grupo STc80 presentaron la mayor capacidad de lisar células blanco cargadas con un péptido específico de Tc80. Por último, demostramos que estos protocolos de inmunización eran capaces de conferir protección frente al desafío con el parásito. Así, en un modelo de infección letal, todos los grupos inmunizados presentaron menores parasitemias respecto al grupo control. Sin embargo la sobrevida fue significativamente mayor solo en los grupos que recibieron alguna dosis del ADN de Tc80 transportado por Salmonella. Adicionalmente, en un modelo de infección crónica observamos que los grupos inmunizados presentaron menores niveles séricos de enzimas indicadoras de daño tisular, alteraciones electrocardiográficas, inflamación y carga parasitaria en los tejidos blancos de la infección, respecto al grupo control. En conjunto estos resultados establecen a Tc80 como un candidato vacunal contra la infección por T. cruzi que no solo incrementa la sobrevida de los animales infectados sino que es capaz de evitar la progresión hacia las formas sintomáticas de la enfermedad de Chagas.

Descripción: Los túbulos colectores (TC) renales están formados por un epitelio simple, y su organización tisular y función requieren de la presencia de estructuras de adhesión celular, como son los contactos focales (CF) y las uniones adherentes (UA), que conectan el citoesqueleto de actina con la matriz extracelular, o con los complejos de unión célula-célula, respectivamente. Esta conexión se establece básicamente debido a la presencia de vinculina, molécula que posee sitios de unión a lípidos de membrana, a actina y a proteínas que forman parte de ambas estructuras de adhesión celular. En trabajos previos realizados con células de TC de papila renal, se demostró que la hormona bradiquinina (BK) provoca una reestructuración reversible de los CF, induciendo la movilización de vinculina, con la aparición simultánea en el citosol de vesículas conteniendo esta proteína. Estos trabajos pioneros sirvieron de base para la realización del presente trabajo de tesis. Se eligió como modelo de estudio cultivos primarios de células de TC de papila renal de ratas adultas. Se observó que estas células conservan in vitro las características típicas de las células de TC en el tejido intacto. Este comportamiento se vio reflejado por el crecimiento en monocapas, la expresión de los glicoconjugados (DBA+) característicos de este tipo celular, filamentos intermedios constituidos por citoqueratina-7, la formación de UA y el desarrollo de un cilio primario. En la primera parte de la tesis se realizaron estudios bioquímicos y morfológicos de las vesículas que contienen vinculina. Para ello, se utilizaron muestras enriquecidas en vesículas obtenidas de cortes delgados de papila renal, estimulados con BK. Para el aislamiento de las vesículas se puso en práctica un método inmunomagnético, utilizando un anticuerpo dirigido contra vinculina. Se demostró que la vinculina se asocia de forma periférica a la membrana de las vesículas, orientada hacia el citosol, a través de interacciones electrostáticas. El análisis por Western Blot y espectrometría de masa demostró que contienen, además de vinculina, PI(4,5)P2, componentes del retículo endoplasmático (RE) y del citoesqueleto, y marcadores del compartimiento endosomal de reciclaje (Rab 5, Rab 11 y el receptor de transferrina), poniendo en evidencia la heterogeneidad de las mismas. Sobre la base de los resultados obtenidos, se propuso un modelo dinámico de distribución intracelular de vinculina. Es sabido que cuando no forma parte de las estructuras de adhesión, la vinculina conforma un pool citosólico. Los resultados obtenidos demostraron que, además de una forma libre, la vinculina también presenta una forma asociada a vesículas. Se planteó la existencia de dos poblaciones de vesículas: una localizada muy cerca del núcleo cuya función sería de reservorio, denominada circuito de tránsito restringido de vesículas entre el RE y el aparato de Golgi; y otra localizada en la zona marginal de la célula, que representa un circuito corto de reciclaje de endosomas tempranos, los que participarían del recambio basal de la vinculina asociada a los CF. Cuando se estimulan las células con BK, ocurren dos fenómenos. Por un lado, vinculina se disipa de los CF, la que es captada por las vesículas Rab 5+ preexistentes, que forman parte del circuito corto de reciclaje localizado en la región marginal, y a tiempos prolongados de estimulación, estas vesículas adquieren Rab 11. Esto indica que la estimulación con BK promueve una movilización de vesículas del reservorio, desde el aparato de Golgi hacia la membrana plasmática, para lograr reestablecer las condiciones basales. Además, se demostró que los microtúbulos participan en el transporte de las vesículas que contienen vinculina. Por lo tanto, BK induce una reestructuración reversible de los CF y no su desarmado. Trabajos previos demostraron que las proteínas que forman parte de los CF y UA, entre ellas vinculina, se localizan en microdominios rafts enriquecidos en colesterol y esfingomielina (SM). En la segunda parte de la tesis se estudió la participación de vinculina en el mantenimiento de las estructuras de adhesión celular. Para ello, las células de TC fueron incubadas en presencia de un inhibidor farmacológico, o transfectadas con un ARN de interferencia específico para las enzimas SM sintasa 1 y 2, presentes en el aparato de Golgi y membrana plasmática respectivamente, con el objetivo de disminuir su expresión. Solo la inhibición de la SM sintasa 1 produjo un deterioro de las UA, provocando la pérdida de unión entre las células. Paralelamente, se observó un incremento de la cantidad de CF que contenía vinculina, pero no talina. Puesto que la SM sintasa 1 se localiza en el aparato de Golgi, y su actividad es esencial para la formación de vesículas, el deterioro observado sobre las UA podría deberse a modificaciones en la formación de vesículas que participan en el proceso de transporte y reciclado de los complejos adherentes. Mientras que el aumento de los CF cumpliría un mecanismo compensatorio de las células ante la disolución de las uniones intercelulares, con el fin de mantenerse adheridas a la matriz extracelular, y de esta forma asegurar su supervivencia. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo de tesis doctoral aportan nuevas evidencias experimentales que resaltan la participación de la molécula de vinculina en los mecanismos que regulan la plasticidad celular, como lo es la pérdida o mantenimiento de estructuras de adhesión, para responder a cambios que se producen en su entorno sin perder la viabilidad

Descripción: Este trabajo analiza la relación estructura-función y el efecto de una familia de ligandos (sustratos propios de la enzima y moléculas efectoras), sobre la modulación de la conformación, y la función biológica de la hipoxantina fosforribosiltransferasa de T. cruzi (TcHPRT), una enzima propuesta como blanco de drogas para el tratamiento de enfermedades causadas por protozooarios. Presentamos evidencias sobre el papel la región C-terminal (CTR) en la consolidación de la estructura cuaternaria y su efecto sobre la actividad enzimática. La proteína adopta naturalmente un estado tetramérico en solución, que se desensambla en dímeros luego de una remoción proteolítica de su CTR, tal como predicen nuestros datos cristalográficos. Como resultado de este proceso, el dímero resultante muestra un incremento de actividad. También, abordamos el análisis cinético detallado de la actividad de la enzima y explicamos su inhibición frente a un conjunto de bisfosfonatos (BPs). El efecto bimodal observado a bajas y a altas concentraciones de estos compuestos, se corresponde con nuestro modelo de cooperatividad, descripto por primera vez para esta enzima, y resulta más evidente en el tetrámero, que en el del dímero. Cultivos de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a los BPs, muestran una inhibición del crecimiento concordante con los resultados sobre la enzima aislada. Resulta muy interesante el hecho de que los BPs posean efecto inhibitorio nulo o muy disminuido sobre la variante humana de la enzima. Confiamos en que el conocimiento celular y molecular aquí presentado, resulte útil para el diseño de futuras terapias antiparasitarias.

Descripción: La podredumbre húmeda del capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum, es una de las limitante más importantes para el cultivo del girasol. Este trabajo tuvo como objetivo identificar las regiones del genoma de girasol asociadas a resistencia a PHC a partir de una estrategia de mapeo de QTL sobre una población de líneas recombinantes endocriadas. Se construyó un nuevo mapa genético incorporando marcadores de tipo SNP sobre un mapa existente, se caracterizó el comportamiento fenotípico de la población utilizando infecciones asistidas del patógeno durante cuatro campañas. Se registraron los datos de incidencia, severidad, intensidad y período de incubación. El mapa resultante posee 2823,8 cM y una densidad media de 4,57 cM por loci. Se identificaron 36 QTLs distribuidos en 13 grupos de ligamiento, destacándose dos regiones sobre los GL10 y 15, por su expresión consistente en las diferentes campañas. Los marcadores asociados a estas regiones podrán ser usados por los programas de mejoramiento en el desarrollo de genotipos con mejor desempeño ante el PHC. Asimismo, estos QTL se presentan como candidatos a ser estudiados en profundidad para caracterizar los componentes funcionales responsables de la expresión del fenotipo de interés.

Descripción: La HSC por déficit de la enzima P450c21, es un desorden hereditario autosómico recesivo, que presenta una forma clásica, de expresión temprana durante la vida fetal, y una forma no clásica (NC) de expresión tardía postnatal. La forma clásica incluye, una forma severa en la cual está alterada la síntesis de cortisol y aldosterona (forma perdedora de sal, PS) y una forma en la cual la función mineralocorticoidea está conservada (forma virilizante simple, VS). En la forma NC, el exceso de producción de andrógenos adrenales se manifiesta en la prepubertad o adolescencia. Si bien estos pacientes poseen deficiencias parciales de la enzima P450c21, la razón por la cual presentan manifestaciones clínicas más tardías no se conoce. Sin embargo la edad en que se expresa fenotípicamente, coincide con la edad en que se produce la adrenarca, caracterizada por el aumento fisiológico en la producción de andrógenos adrenales. En el humano ha sido descripto un gen activo que codifica para la enzima 21 hidroxilasa, el CYP21B, y un pseudogen inactivo, el CYP21A, duplicados en tandem junto con los genes que codifican para los componentes C4 del complemento, C4A y C4B. Estos genes, ubicados en el brazo corto del cromosoma 6 banda 21.3, presentan un 98% de homología entre sí, lo cual dificulta su análisis a nivel molecular. En pacientes con HSC por déficit de la enzima P450c21, en poblaciones norteamericana y europeas, ha sido descripto que el 25 % de las alteraciones del gen CYP21B representan deleciones, o macroconversiones del gen CYP21B en una forma similar al CPY21A . El 75 % restante representan mutaciones puntuales (MP). Existe escasa información acerca de la frecuencia de estas alteraciones génicas en población latinoamericana Los objetivos del presente estudio fueron :1-Caracterizar las alteraciones del gen CYP21B en pacientes con HSC por déficit de la enzima P450c21, en población argentina. 2- Evaluar las implicancias de la enzima 3?-HSD en la regulación de la síntesis de andrógenos en la adrenal humana, y analizar su vinculación con el inicio de la adrenarca y la expresión fenotípica de la forma NC de HSC por déficit de la enzima P450c21. Nueve alteraciones descriptas del gen CYP21B (deleciones o macroconversiones génicas, P30L, In2, I172N, Ex3, ClEx6, V281L, Q318X y R356W) fueron analizadas en 73 pacientes (146 alelos) con diagnóstico de HSC por déficit de la enzima P450c21, ( 38 con la forma PS, 15 con la forma VS y 20 con la forma NC). Se elaboró una estrategia de estudio del gen CYP21B, que nos permitió caracterizar un 85% de los alelos de pacientes con las formas clásicas, y un 77.5% en pacientes con la forma NC. En las formas clásicas de HSC las alteraciones más frecuentes fueron, al igual que en otras poblaciones, las deleciones o macroconversiones génicas (20.7%), y la MP In2 (24.5%). En los pacientes con la forma NC, la MP más frecuente fué la V281L (57%). La correlación entre el fenotipo y el genotipo mostró que la expresión fenotípica de la patología estaría vinculada a la severidad de la mutación presente en el alelo menos afectado. El análisis de MP poco frecuentes o no descriptas del gen CYP21B, permitió detectar en dos pacientes una sustitución de GG por C en el codón 483, que provocaría un corrimiento de marco de lectura abierto. Esta MP fue descripta previamente en un paciente en población sueca. Sin embargo, los efectos de esta alteración sobre la funcionalidad de la proteína no han sido determinados. Por otro lado, la abundancia del ARNm de las enzimas 3?-HSD y P450c21 fue analizada en 15 tejidos adrenales normales prepuberales. El análisis de los resultados se realizó dividiendo a los sujetos en 2 grupos : Grupo1(Gr1), menores de 8 años, y Grupo2 (Gr2), mayores de 8 años. La abundancia del ARNm de 3?-HSD también fue analizada en 2 tejidos adrenales tumorales virilizantes (TV) y un tumor sindrome de Cushing (TSC). Se observó que la abundancia del ARNm de la enzima 3?-HSD fue significativamente mayor en el Gr1 que en el Gr2, mientras que la abundancia del ARNm de la enzima P450c21 no mostró diferencias entre ambos grupos. Además, la abundancia del ARNm de la enzima 3?-HSD en los TV fue significativamente menor que en el TSC. La caracterización de las alteraciones del gen CYP21B en pacientes con HSC por déficit de la enzima P450c21 en población argentina, representa un aporte de relevancia ya que existe escasa información disponible en poblaciones latinoamericanas. Por otro lado, se vincula a la transferencia asistencial, dado que nos ha permitido realizar diagnóstico prenatal, e implementar conductas terapéuticas destinadas a evitar la virilización genital en los fetos femeninos afectados. Además, posibilitó precisar el diagnóstico en pacientes con la forma NC, en los cuales las técnicas bioquímicas clásicas no son concluyentes. Por otro lado el descenso de la expresión de la enzima 3?-HSD en función de la edad cronológica, podría ser responsable del incremento de la secreción de DHEA y DHEA-S, observado durante la adrenarca. En pacientes con la forma NC de HSC por déficit de la enzima P450c21, probablemente el descenso fisiológico de la expresión de la enzima 3?-HSD ocasione un incremento en la producción de DHEA y DHEA-S de mayor magnitud, dado que ha sido descripta una mayor sensibilidad de la glándula adrenal al ACTH en este grupo de pacientes. Finalmente, los resultados obtenidos sugieren que la expresión del ARNm de la enzima 3?-HSD sería la llave síntesis androgénica en la adrenal humana.

Descripción: La mayoría de los microorganismos productores de ?-lactamasas CTX-M suele ser resistente a cefotaxima pero sensible a ceftazidima. Por esta razón, estas enzimas se conocen como ?cefotaximasas?. Sin embargo, existen variantes ?emergentes? que poseen la mutación Asp240Gly y son capaces de conferir resistencia a cefotaxima y ceftazidima simultáneamente. En este trabajo demostramos que la mutación Asp240Gly se asocia a un fenotipo claro de resistencia a ceftazidima sólo cuando clones hiperproductores de Escherichia coli carecían de porinas OmpF en la membrana externa. La sustitución de glicina en la posición 240 no afecta visiblemente la conformación ni la estabilidad de la enzima, lo que se traduce en eficiencias catalíticas conservadas frente a los ?-lactámicos. Sin embargo, otorgaría mayor flexibilidad conformacional a la enzima, de manera tal que ceftazidima podría acomodar su sustituyente voluminoso en la cavidad del sitio activo para ser hidrolizado más eficientemente. Las ?-lactamasas CTX-MAsp240Gly tienen eficiencias catalíticas frente a ceftazidima entre 5 y 15 veces mayores que las de sus respectivas variantes salvajes, aunque éstas continúan siendo por lo menos 200 veces más bajas que las de cefotaxima. Es decir que a pesar de ejercer efectos sutiles en el comportamiento cinético, la mutación Asp240Gly puede otorgar una gran ventaja selectiva cuando se combina con impermeabilidad en el ambiente de selección adecuado.

Descripción: Los receptores NMDA (RNMDA) participan en plasticidad sináptica y memoria. El hipocampo participa en la formación de memoria de largo plazo (MLP),y se encuentra afectado en la Enfermedad de Alzheimer (EA). Investigamos subunidades regulatorias del RNMDA luego de formación de memoria de trabajo (MT) y de MLP dependiente de hipocampo en ratas de genotipo salvaje (Controles) y transgénicas (Tg) modelo de EA (McGill-­?R-­?Thy1-­?APP), jóvenes y de 1 año. Todas tuvieron MT y MLP, pero los aumentos transitorios en GluN1 y GluN2A, detectados en ratas jóvenes luego de habituación, no ocurrieron en ratas añosas. Controles ni Tg, sugiriendo un mecanismo alterado, que no sería requerido para la MLP. Para evaluar la participación de dichas subunidades en memoria, desarrollamos vectores amplicón que expresan ARN antisentido (AS) contra GluN2A y GluN2B. Ratas inoculadas en hipocampo con vectores 2A(AS), mostraron MT y MLP. Las inoculadas con vectores 2B(AS) mostraron MT más tardía y deficiente, y no formaron MLP. Entonces, GluN2B, a la que se unirían los oligómeros de péptidos amiloides-­?? (o?A) en etapas tempranas de EA, no constituirían un blanco terapéutico aceptable. Desarrollamos un anticuerpo monocatenario contra o?A, construimos el plásmido para su expresión en células eucariotas y los vectores amplicón, como posible terapia experimental contra la EA.

Descripción: El objetivo general de esta Tesis Doctoral consistió en evaluar el efecto de eritropoyetina (EPO) y kit ligando (KITL), durante la maduración in vitro (MIV) de ovocitos. Se utilizaron dos modelos, bovino y murino. En bovinos se estudió el efecto de EPO y KITL en el medio de MIV, en presencia de suero fetal bovino (FCS) o seroalbúmina bovina (BSA), sobre la maduración nuclear y citoplasmática del ovocito, la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) en ovocitos y embriones y la presencia de células apoptóticas en el cumulus. En murinos se evaluó la acción de ambos factores durante la MIV de ovocitos obtenidos a partir del cultivo in vitro de folículos. En presencia de EPO o KITL, el porcentaje de embriones bovinos clivados y de blastocistos se incrementó o tendió a incrementarse respecto al control con BSA, respectivamente. No se observaron diferencias significativas en la maduración nuclear. El número de blastómeras por embrión de 48 hs. fue mayor, se observó un aumento en la producción de ROS por embrión y disminuyó significativamente el porcentaje de apoptosis en las células cumulus respecto al control con BSA. En ratón, la presencia de KITL durante la MIV de ovocitos obtenidos a partir del cultivo in vitro de folículos preantrales aumentó el porcentaje de blastocistos. EPO no mostró diferencias significativas. En conclusión, EPO y KITL no tendrían impacto en la maduración nuclear de los ovocitos bovinos o murinos, sin embargo podrían ejercer un efecto positivo sobre la maduración citoplasmática en las condiciones estudiadas.

Descripción: Las proteínas del virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo, se expresan a partir de ARN mensajeros subgenómicos (ARNm), los cuales contienen estructura Cap en su extremo 5?, carecen de cola de poli(A) en el extremo 3?, pero presentan una región 3? no codificante que puede potencialmente formar una estructura secundaria de horquilla (hairpin II), con un presunto papel en la traducción. Para analizar la contribución de las secuencias no codificantes en la traducción de los ARNm de TCRV, se generó un transcripto sintético que imita al ARNm de la Nucleoproteina viral (NP), y que contiene el gen de la Luciferasa de luciérnaga (FLUC). Además, se generaron transcriptos mutantes con modificaciones en la secuencia 3' o 5? no traducible. La eficiencia de traducción de esos transcriptos en células transfectadas fue evidenciada mediante la determinación de la actividad FLUC, junto con la determinación de su estabilidad mediante PCR cuantitativa. En conjunto, los datos sugieren que la estructura secundaria en la secuencia hairpin II y/o su contenido de residuos G/C juegan un papel modulador en la traducción. Por otra parte, tanto la secuencia proximal al codón de terminación en la región 3? no traducible, como la región 5' no codificante contienen motivos de secuencia o estructura que estimulan la traducción. Se encontró que la presencia de NP u otras proteínas virales no afectan la eficiencia de traducción, y que este proceso requiere del factor de traducción eucariota eIF4GI. Además, en este trabajo se desarrolló un sistema de genética inversa que dirige la generación de TCRV recombinante, una herramienta valiosa que permitirá la realización de estudios mecanísticos en el contexto de la infección viral.

Descripción: La acumulación intracelular de cobre (Cu) resulta tóxica para las células, como se observa en la enfermedad de Wilson. Sin embargo, aún no se conocen los mecanismos moleculares que conducen a la muerte celular en la sobrecarga intracelular de Cu. Objetivo: determinar si el estrés oxidativo constituye la fuerza impulsora de la muerte celular inducida por Cu, identificar procesos adicionales que puedan estar involucrados y comprender el mecanismo de protección endógena. Resultados: si bien la sobrecarga de Cu genera estrés oxidativo en ratas y células en cultivo, ésta no mantuvo correlación con la sensibilidad de las células al metal y el tratamiento con N-acetilcisteína no protegió a las células. El transcriptoma de las células mostró una intensa respuesta de choque térmico en ausencia de una respuesta antioxidante. Los iones Cu2+/Cu1+ promueven la agregación proteica de manera directa y la toxicidad del metal se potencia con estímulos pro-agregantes, pero no pro-oxidantes. Por su parte, el glutatión resultó ser una molécula endógena protectora capaz de inactivar al Cu y prevenir un amplio espectro de reacciones bioquímicas, independientemente de sus propiedades antioxidantes. Conclusión: la muerte celular inducida por Cu es impulsada por la alteración de la proteostasis, mientras que el glutatión previene esta interacción.

Descripción: Los adenocarcinomas ductales pancreáticos (PDAC), el subtipo histológico más frecuente de cáncer de páncreas, es uno de los tipos de tumores más letales, representando la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en los países desarrollados. Distintos componentes de la cascada del AMPc se encuentran frecuentemente alterados en este tipo de neoplasias e incluso en sus lesiones previas. La falta de terapias efectivas para su tratamiento hace necesaria la búsqueda y validación de nuevos blancos terapéuticos y biomarcadores para su detección temprana. En este trabajo de tesis demostramos que la exclusión de AMPc mediada por MRP4 cumple un papel crítico en el proceso de proliferación de células de PDAC, producto de la participación de este nucleótido cíclico en un circuito mitogénico al interactuar con receptores específicos en la membrana plasmática. Asimismo, los resultados obtenidos indican que el AMPc regula la transcripción de MRP4 a través de un mecanismo dual, en el cual, el balance entre los niveles intra- y extracelulares de este segundo mensajero, juega un papel clave en la regulación de la expresión del transportador. Por lo tanto, los resultados experimentales descriptos en este trabajo de tesis, junto a los reportes bibliográficos analizados, permiten postular al proceso de exclusión de AMPc mediado por MRP4 como un blanco validado para futuras intervenciones terapéuticas en PDAC.

Descripción: En la Leucemia Mieloide Crónica la resistencia al tratamiento puede deberse, entre otras causas, a mutaciones en el BCR-ABL1, a la sobreexpresión de Src kinasas o subexpresión de genes oncosupresores. La presencia del BCR-ABL1 en la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) confiere mal pronóstico, por ello se han desarrollado protocolos más agresivos que incluyen inhibidores de tirosina kinasa (ITK). La hipótesis de este trabajo fue determinar si la detección temprana de las mutaciones en BCR-ABL1 y la expresión de los genes LYN y PTEN estarían involucradas en la resistencia al tratamiento. Mediante high resolution melting y ARMS-qPCR se incrementó la detección de mutaciones en un 16% respecto de la secuenciación directa. Se analizó la dinámica del clon mutado y de los transcriptos BCR-ABL1, permitiendo definir el rol de la mutación en la resistencia, seleccionar el ITK adecuado y evaluar respuesta al tratamiento. El análisis de la expresión LYN/PTEN en pacientes resistentes a imatinib o nilotinib y sin mutaciones, permitió asociar la falta de respuesta al tratamiento con la expresión alterada de estos genes. La cuantificación de BCR-ABL1P190 en LLA demostró ser una herramienta importante para evaluar la respuesta al tratamiento y definir enfermedad mínima residual, previo al trasplante de médula ósea.

Descripción: El receptor Mas (MasR) es un receptor de membrana acoplado a proteínas G (GPCR) que ha sido incluído dentro del grupo de GPCRs de tipo A huérfanos. A pesar de que la hormona peptídica angiotensina-(1?7) perteneciente al sistema renina-angiotensina (SRA) ha sido propuesta como su ligando endógeno, la clasificación del MasR no ha sido modificada. En este trabajo de tesis se presentan resultados enfocados en dilucidar la participación de las vías de señalización dependientes de proteínas G y dependientes de kinasas activadas por mitógenos (MAPK) en la respuesta del MasR. En particular, se demostró que el MasR es capaz de modular los niveles de AMPc de forma constitutiva y mediante la activación de la proteína G?i. La Ang-(1-7) y un agonista sintético AVE 0991 actuaron como agonistas para esta vía. Sin embargo, la Ang-(1-7) no fue capaz de activar la vía G?q. Por otro lado, esta hormona provocó la fosforilación de ERK1/2 en células HEK293 control y el MasR atenuó este efecto. Debido a la presencia endógena del receptor de angiotensina II de tipo 1 en dichas células, podría postularse que el MasR ejerce una modulación negativa sobre dicha vía.

Descripción: En esta Tesis se evaluó la activación de células Tyd empleando anticuerpos anti-CD3, fosfoantígenos y cristales de urato monosódico (MSU). Además, se investigó el rol inmunomodulador de los neutrófilos sobre células Tyd. Observamos que la expresión de CD69 y la producción de IFN-y y TNF-a inducida por anticuerpos anti-CD3 fueron potenciadas por neutrófilos. La inhibición de serin proteasas previno la potenciación de la activación de células Tyd y la adición de elastasa, catepsina G y proteinasa3 acélulas Tyd incrementó su activación. El efecto de las serin proteasas sobre las células Tyd fue mediadopor el receptor activado por proteasas, PAR1. Además, se demostró que los cristales de MSU activaron a las células Tyd aumentando la expresión de CD25 y CD69, y la producción de IFN-y y TNF-a. El efecto estimulador de los cristales de MSU fue dependiente de Spleen tyrosinekinase Syk, ya que el tratamiento de las células con el inhibidor GS-9973 disminuyó su activación; asímismo la estimulación de las células con cristales de MSU gatilló la fosforilaciónde Syk.Por otro lado, se observó que los neutrófilosinhibieron la activación de células Tyd inducida por cristales de MSU.

Descripción: B. abortus puede persistir en su hospedador a pesar del desarrollo de una potente respuesta T. La infección de monocitos/macrófagos humanos con B. abortus disminuye la expresión inducida por IFN-? de las MHC-I en superficie por retener dichas moléculas dentro del aparato de Golgi (AG). Sin embargo, aún desconocíamos varios aspectos relevantes de dicho fenómeno. En este trabajo, demostramos que la disminución de MHC-I depende de que B. abortus esté metabólicamente activa pero no de sus factores de virulencia más relevantes. Un factor involucrado es un PAMP asociado a viabilidad (vita-PAMP), el ARN de B. abortus. Sorprendentemente, los productos de la digestión del ARN fueron también capaces de disminuir MHC-I. Asimismo, el ARN y sus productos de degradación provocaron la retención de MHC-I en el AG y demostramos que el receptor involucrado es el TLR8 humano. Respecto a la vía de señalización, demostramos que el fenómeno es disparado de manera temprana. El bloqueo de los receptores de la vía del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) resultó en una reversión parcial de la disminución de la expresión de MHC-I. Respecto al mecanismo de retención de MHC-I, una acidificación alterada del AG causada por monensina previene el transporte de MHC-I a la superficie celular. Por último, los macrófagos tratados con el ARN de B. abortus muestran una disminuida capacidad de presentación antigénica a los LT CD8+. En conjunto, nuestros resultados establecen que B. abortus a través del vita-PAMP ARN disminuye la expresión de MHC-I, mecanismo por el cual podría evadir el reconocimiento inmune, persistiendo en el hospedador y estableciendo una infección crónica.

Descripción: La endometriosis se caracteriza por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina formando lesiones que se desarrollan y vascularizan en sitios ectópicos. Galectina-1 (Gal-1) es una lectina endógena que desempeña importantes funciones pro-angiogénicas e inmunomoduladoras en la biología tumoral. El objetivo principal de esta tesis fue estudiar el rol de Gal-1 en la etiopatogenia de la endometriosis. Demostramos que Gal-1 se expresa en las células estromales y endoteliales pero no en las células epiteliales endometriales eutópicas y ectópicas. Además, los niveles de Gal-1 son mayores en las lesiones que en el endometrio eutópico de las pacientes con endometriosis grado I/II, lo cual podría indicar que Gal-1 juega un papel primordial en los estadios tempranos del establecimiento de esta patología. Observamos también que Gal-1 juega un papel significativo en la fisiopatología de la endometriosis, dado que promueve la proliferación in vitro de las células estromales endometriales, además del desarrollo vascular y el crecimiento de las lesiones endometriósicas in vivo. También se demostró que el bloqueo específico a nivel peritoneal de esta lectina limita el crecimiento de las lesiones, lo cual lleva a sugerir que Gal-1 podría convertirse un blanco terapéutico potencial para combatir la progresión de esta enfermedad.

Descripción: El impacto de los residuos generados por la actividad del ser humano sobre el ecosistema ha sido motivo en los últimos años de innumerables esfuerzos en busca de soluciones. En este sentido, una de las áreas que más crecimiento experimentó es el desarrollo de nuevos biosorbentes para ser utilizados como sorbentes en remediación ambiental para la remoción de metales y/o contaminantes orgánicos, tanto en aguas naturales como en efluentes industriales. Existen más de 100.000 tipos de colorantes que se utilizan comercialmente en industrias, implicando esto el uso de más de 700.000 toneladas al año de los mismos. Pequeñas cantidades (1ppm) en agua de algunos colorantes ya modifican el color de la misma y la hacen no consumible. Muchos de ellos resultan poseer estructuras químicas estables térmicamente y resistentes a la biodigestión aeróbica. En particular, los azo colorantes son los colorantes más utilizados por la industria en la actualidad. Su estructura química particular los convierte en ideales para mantener el color de telas, alimentos, medicamentos, etc., inalterados por mucho tiempo. Se los conoce como colorantes recalcitrantes, es decir que permanecen en el ecosistema mucho más tiempo que colorantes con otra estructura. Es muy difícil que sean degradados por la luz o por los procesos estándares de las plantas de tratamientos de efluentes. Las aguas coloreadas llevan a un cambio total de la flora y la fauna, llegando en casos a la eutroficación. La remoción de azo colorantes de los cursos de agua es de primordial atención. El presente plan de tesis se dirige hacia promover el avance y la aplicación de la investigación científica relacionada con el manejo de contaminantes del medio ambiente, como también la formación de recursos humanos en el área de química ambiental y consolidar la inserción de esta temática de alta incumbencia social para el bienestar humano y ecológico. Los resultados obtenidos en el primer capítulo están referidos a la inmovilización de biomoléculas en nanopartículas magnéticas de silicio obtenidas mediante microemulsión inversa por la técnica sol gel. Ellos nos muestran que el material obtenido es monodisperso, con nanopartículas core/shell donde el interior posee el ferrofluido magnético y el exterior puede ser modificado sin perder las propiedades magnéticas. La enzima (ureasas como modelo) inmovilizada en la superficie de las nanoesferas mantiene su actividad en un largo período de tiempo. Por otro lado, el costo de las enzimas necesarias para decolorar azo colorantes y la necesidad de formar una cadena de reacción para que la decoloración vaya acompañada de una detoxificación mostraron ser económicamente inviables. El segundo capítulo trata de la inmovilización de microorganismos (Pseudomonas sp.) capaces de decolorar azo colorantes (negro de Remazol, naranja de metilo y naranja de bencilo) en una matriz de sílica obtenida por la técnica sol-gel. Los resultados obtenidos muestran que las células son capaces de mantener la viabilidad dentro del material polimérico, que el gel no impide la entrada de nutrientes ni la salida de enzimas y productos de desecho y que las bacterias mantienen la viabilidad por largos períodos de tiempo. Puede observarse también que la capacidad de decolorar los colorantes azoicos ensayados se acompaña también de la detoxificación de los mismos, dado que el ensayo realizado con semillas de lechuga mostró mejoras en la germinación de dichas semillas luego del tratamiento con el residuo decolorado. El tercer capítulo trata de la utilización de un biopolímero abundante, biodegradable y de muy bajo costo para la adsorción de azo colorantes reactivos (Remazol black) en solución acuosa. En el capítulo se muestra la excelente capacidad de adsorción del hidrogel de colágeno tipo I para este tipo de colorantes, el estudio de las interacciones entre sorbente y sorbato y la comparación entre diferentes azo colorantes con otras estructuras químicas (rojo Congo y marrón de Bismarck). Asimismo se muestra el efecto del agregado de nanopartículas de silicio obtenidas por la técnica sol-gel en las propiedades mecánicas del hidrogel de colágeno y como repercute este agregado en la adsorción de azo colorantes reactivos. En definitiva, el presente trabajo de tesis permitió, por un lado, abordar aspectos básicos relacionados con la técnica sol-gel y describir una nueva forma de obtener nanopartículas magnética huecas, por otro lado trabajar sobre la inmovilización de biomoléculas en superficie e inmovilización de microorganismos por atrapamiento y finalmente describir el uso de un biopolímero de muy bajo costo y muy abundante para abordar el tema de remediación de los azo colorantes en los cursos de agua. Cada capítulo incluye el análisis de costo de fabricación de cada material para realizar la comparación final entre ellos desde el punto de vista económico.

Descripción: El objetivo general de esta Tesis fue estudiar el comportamiento de sistemas nanométricos basados en lecitina, para ser utilizados como vectores de oligonucleótidos en el tratamiento del cáncer de mama. Los sistemas propuestos fueron Nanopartículas de Fosfatidilcolina (NPCs) y Nanopartículas Mixtas de fosfatidilcolina y colato de sodio (NMs). Se estudiaron sus características fisicoquímicas, y se demostró su capacidad de carga de siRNA. Las NPCs no resultaron citotóxicas, y lograron promover la internalización celular de oligonucleótidos, pero no mediaron el silenciamiento post-transcripcional de un gen blanco (PTGS) eficientemente. Las NMs también fueron capaces de vehiculizar oligonucleótidos al interior celular e incluso evidenciaron mediar PTGS, pero presentaron citotoxicidad dependiente de su concentración. Los resultados mostraron características promisorias, por lo que estos sistemas podrían optimizarse y proponerse como base tecnológica para su uso en terapia génica. Por otro lado, se estudiaron los efectos biológicos de los sistemas nanopartículados. Se evidenciaron distintos efectos sobre la activación de vías de señalización intracelular y viabilidad celular dependiendo de la composición y características fisicoquímicas de la nanopartículas. Esta novedosa caracterización en cuanto a su actividad biológica, demostró la importancia de evaluar sus acciones sobre sistemas vivos, aún cuando el material de origen sea considerado inerte y/o biocompatible.

Descripción: El virus respiratorio sincicial bovino (BRSV) es la principal causa de infección del tracto respiratorio bajo causando bronquiolitis y neumonía en terneros de temprana edad. Este virus afecta también a otras especies animales. Teniendo en cuenta el impacto sanitario y económico que genera esta enfermedad a nivel productivo en bovinos y dado que Argentina es uno de los principales países productores de carne y leche, es importante disponer de estudios epidemiológicos actualizados del BRSV en animales susceptibles, con el objetivo final de diseñar estrategias de prevención y control de la enfermedad. Los resultados obtenidos en este trabajo evidenciaron una elevada seroprevalencia con porcentajes mayores al 70 % en todos los sistemas productivos evaluados. Asimismo, se estudió la circulación del BRSV en bovinos de tambo y establecimientos de engorde a corral, mediante seroconversión. Los resultados mostraron que la infección por BRSV está ampliamente distribuida en la población bovina, sugiriendo que, probablemente, el papel del BRSV en la presentación de la enfermedad respiratoria en nuestro país, particularmente en la región estudiada, haya sido subestimado. A su vez, fue posible detectar la presencia de genoma viral en hisopados nasales de animales de engordes a corral que presentaron seroconversión para este agente viral y en pulmones de animales con lesiones compatibles con enfermedade respiratoria, reforzando la evidencia de circulación de este agente viral. Por otra parte, se detectó la presencia de AN contra BRSV en búfalos, camélidos, caprinos y ovinos de Argentina, evidenciando la circulación del virus en esas especies y abriendo el interrogante de su importancia como reservorios del BRSV. El control de la infección por el BRSV puede lograrse, por un lado, mejorando las medidas de bioseguridad y, por el otro, mediante la vacunación. Si bien existen numerosas vacunas disponibles en el mercado destinadas a la prevención de la infección por BRSV, aun, no se ha logrado controlar su circulación en animales de producción. En este sentido, el diseño de vacunas más eficientes es una de las necesidades que presenta el sector productivo. En este trabajo de tesis se obtuvo un candidato vacunal basado en el virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) que porta en la secuencia codificante del gen de la proteína F de BRSV (MVA-F). Esta proteína está altamente conservada entre las distintas cepas de BRSV y es la principal inductora de anticuerpos neutralizantes. La capacidad inmunogénica de MVA-F se confirmó en el modelo murino, empleando esquemas de vacunación prime-boost homólogos o heterólogos. Los resultados mostraron que tanto la vacunación homóloga (dos dosis de MVA-F) como la heteróloga (combinando el prime con MVA-F y el boost con una vacuna a subunidad que contiene la proteína F) indujeron tanto la producción de anticuerpos neutralizantes de BRSV como secreción específica de IFN-?, evidenciando una respuesta balanceada Th1-Th2. Los aportes de este trabajo de tesis permitieron actualizar los estudios epidemiológicos de BRSV en Argentina y evidenciar circulación viral. En base a estos resultados proponemos mejoras estratégicas en los cronogramas de vacunación actualmente utilizados contra BRSV, teniendo en cuenta los puntos críticos de infección dentro de los establecimientos y los momentos específicos de manejo según cada sistema productivo. Además, se obtuvo un nuevo inmunógeno recombinante capaz de inducir una respuesta inmunitaria (humoral y celular) específica contra BRSV en ratones, cuya eficacia deberá ser evaluada en el hospedador natural

Descripción: El género Acinetobacter está integrado por bacterias Gram-negativas no fermentativas de la clase Gammaproteobacteria y comprende tanto bacterias ambientales como patógenas oportunistas. El complejo A. calcoaceticus - A. baumannii (Acb) ha adquirido gran importancia debido a su persistencia en infecciones intrahospitalarias y su perfil de multirresistencia a los agentes antimicrobianos convencionales. Con la finalidad de proveer nuevas herramientas que puedan emplearse en el tratamiento de la infección, se propone el estudio de marcadores fenotípicos, genes de densidad poblacional (QS), y de dominios fotorreceptores con el objeto de evaluar su relación con la respuesta de virulencia en Acinetobacter. Nueve cepas clinicamente relevantes del género Acinetobacter fueron analizadas en cuanto a marcadores fenotípicos relacionados con virulencia. Si bien, ninguna de ellas mostró secreción de proteasas, ni síntesis de acil homoserino lactonas (AHL) de cadena corta, otros marcadores como la secreción de lipasa, la formación de biofilm, la motilidad celular, la resistencia antibiótica y la actividad hemolítica mostraron gran variabilidad. Por otra parte, la producción de sideróforos de tipo catecol fue significativamente mayor en las cepas aisladas de pacientes, por lo que podría ser considerado un marcador de virulencia en Acinetobacter. Todos los miembros del complejo Acb produjeron AHL de cadena mediana o larga y presentaron inhibición de la motilidad tipo twitching por luz azul. El análisis filogenético de las familias LuxI y LuxR demostró que las proteínas del sistema de QS poseen un origen ancestral dentro de la clase Gammaproteobacteria y se reforzó la hipótesis de la adquisición de genes reguladores de QS por transferencia horizontal. Muchos organismos han desarrollado fotorreceptores capaces de absorber la luz a través de sus cromóforos. Las proteínas BLUF mostraron una distribución predominante en la clase Gammaproteobacteria y bacterias quimitróficas, siendo la arquitectura BLUF corta la más frecuente. Mientras A. baumannii posee una única secuencia codificante para proteína BLUF, A. baylyi ADP1 presenta cuatro secuencias putativas para proteínas BLUF, reflejando la importancia de su conservación. La formación de biofilm en A. baylyi ADP1, a diferencia a lo descripto para A. baumannii, no mostró regulación por luz ni temperatura. Además, en A. baylyi la luz inhibió la producción de sideróforos de tipo catecol, la frecuencia de transformación y la motilidad tipo twitching. El análisis de la participación de las cuatro proteínas BLUF en la inhibición de la motilidad en A. baylyi ADP1 se realizó por noqueo de sus genes codificantes y posterior complementación, revelando que las proteínas codificadas por los genes ACIAD1499, ACIAD2125 y ACIAD2129 son activas y necesarias para la regulación de la motilidad tipo twitching y pueden complementarse unas a otras en su función, mientras que ACIAD2110 no participa en la regulación de este fenotipo. Esta conclusión fue también confirmada por el análisis de mutantes noqueadas en multiples genes (ACIAD1499, ACIAD2125 y ACIAD2129). Los cuatro genes se expresaron tanto en luz como en oscuridad. Sin embargo, los niveles de expresión de ACIAD1499, ACIAD2125 y ACIAD2129 fueron menores bajo la incidencia de luz azul, lo que explica la necesidad de que los tres genes sean expresados para alcanzar la cantidad de fotorreceptor requerida para provocar la inhibición de la motilidad. Este trabajo de tesis mostró la variabilidad que presentan los miembros del género Acinetobacter en cuanto a los marcadores fenotípicos relacionados con virulencia, el sistema de QS y las proteínas BLUF, reflejando la gran dificultad para controlar las infecciones generadas por este patógeno oportunista. La regulación de la motilidad tipo twitching mediada por proteínas BLUF en A. baylyi ADP1 revela una redundancia genética poco común en bacterias y constituye el primer ejemplo de acción conjunta de tres fotorreceptores en un organismo procariota.

Descripción: El dengue es un problema para la salud pública, siendo la enfermedad más importante transmitida por artrópodos. El virus del dengue (DENV) se clasifica en cuatro serotipos (DENV 1-4) que presentan variantes genotípicas. La transmisión del virus se produce principalmente por mosquitos de la especie Aedes aegypti. Hacia 1970, se había logrado la completa eliminación del vector en la mayoría del continente americano gracias a campañas implementadas por la OPS. Sin embargo, el deterioro de las mismas a lo largo del tiempo permitió la progresiva recolonización del mosquito y posterior reemergencia del dengue. Como consecuencia, en las últimas décadas se ha observado un aumento significativo en la incidencia del virus en el continente. En Argentina el dengue alcanzó nuevamente el territorio en los noventa, siendo las provincias del norte las más afectadas. En la ciudad de Buenos Aires y el Área Metropolitana (AMBA), la presencia del vector se registra desde 1995. Desde 1999, se han registrado casos de DENV de distintos serotipos sin evidencia de circulación local sostenida. En 2009 ocurrió un brote de DENV-1 de gran importancia en el país, donde se detectó transmisión local por primera vez en AMBA. Sin embargo, la magnitud del mismo fue superada recientemente en el 2016, donde también se registró transmisión local. El abrupto crecimiento que han tenido los casos de DENV en los últimos años en nuestro país, y en especial la ocurrencia de casos autóctonos detectados en AMBA, una región donde se creía poco probable la circulación local del DENV, evidencia la importancia que tiene la vigilancia del virus para la salud pública. El objetivo del presente trabajo fue ampliar el conocimiento sobre la epidemiología molecular del DENV que circuló en AMBA en el período 1999-2016; para poder inferir su historia y dinámica de dispersión, así como también determinar si existieran características únicas asociadas a su adaptación local. Hemos obtenido la secuencia del genoma completo de 46 DENV-1, -2 y -3 y de la secuencia que codifica para la proteína E de 82 DENV-1 detectados en AMBA durante los años estudiados. Hemos genotipificado las secuencias obtenidas y los estudios filogeográficos realizados nos permitieron estudiar la dispersión global y local de estos virus con el fin de inferir la introducción de los genotipos evaluados en América. El genotipo V de DENV-1 habría sido el primero en ingresar en 1966 por Puerto Rico. Luego, en 1980 habría ingresado al continente el genotipo Asiático/Americano de DENV-2 por las Islas Vírgenes Británicas. Finalmente, el genotipo III de DENV-3 habría ingresado en 1990 por Puerto Rico o Nicaragua. Esta tesis también aporta datos sobre las características de crecimiento de los aislamientos obtenidos durante el brote de DENV-1 del 2009, dado que fue la primera vez que se detectó circulación local en AMBA. A su vez, se compararon las cargas virales presentadas en infecciones primarias y secundarias, y se demostró la posible existencia de infecciones secundarias por DENV en un área no endémica. Respecto del brote del 2016 en AMBA, se encontraron dos linajes genéticos sin diferencias entre cepas locales e importadas. Se podría proponer que AMBA estaría sufriendo una transición de ser un área donde ocurrían brotes esporádicos a ser un escenario endémico propicio para el DENV. Se debería considerar también que otros arbovirus transmitidos por el mismo vector podrían emerger en AMBA. Como conclusión, esta tesis abarca aspectos epidemiológicos y evolutivos del DENV que contribuyen a un mejor conocimiento de la dinámica local del mismo. Estos datos podrían aportar información al sistema de salud para la planificación de medidas adecuadas de prevención y control, para evitar futuros brotes ocasionados por estos arbovirus.

Descripción: El crecimiento somático normal requiere de la integración de múltiples factores que actúan a nivel periférico, como factores metabólicos y hormonales, y a nivel central, como factores de trascripción involucrados en el eje hipotálamo-hipofisario-IGF-1. Se han descripto numerosos genes implicados en las alteraciones de dicho eje y todavía no se sabe la real prevalencia de estas alteraciones en los pacientes con déficit de talla. El fenotípico de déficit o falta de acción de hormona de crecimiento incluye un grupo de diferentes patologías que clasificamos en cuatro grupos: 1) Deficiencia aislada de GH, por alteración del gen GH1 o GHRHR, 2) Insensibilidad a la GH-1, por alteración de los genes GHR y STAT5b, 3) Resistencia a IGF-1, por alteración del gen IGF1R y 4) Deficiencia múltiple de hormonas hipofisarias por alteraciones en distintos genes que codifican para factores de transcripción que participan en la embriogénesis y diferenciación hipofisaria (PROP1, POU1F1, LHX3, LHX4, HESX1, OTX2, GLI2). Dado que la caracterización molecular de los genes relacionados con el eje Hipotálamo-Hipófiso-IGF-1 tiene implicancias diagnósticas que impactan directamente en la estrategia terapéutica y el consejo genético, el objetivo general de la presente tesis doctoral es la identificación molecular de pacientes pediátricos con alteración de dicho eje.

Descripción: La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un desorden hereditario, autosómico dominante, causado por mutaciones en el gen supresor tumoral VHL. La proteína VHL (pVHL) forma un complejo (VBC) con las Elonguinas B y C, Culina 2 y Rbx1. La función más descripta de pVHL es la de regular los niveles de las subunidades ? de HIF. La presente tesis consistió de la implementación de un método de detección de deleciones en este gen, para ofrecer un estudio genético completo, y la caracterización funcional de dos nuevas variantes génicas. Nuestros resultados destacan la importancia de realizar el estudio genético completo del gen de la enfermedad de VHL para la confirmación de enfermedad de VHL, no sólo en pacientes con diagnóstico clínico de la misma, sino también en pacientes que presentan una única manifestación típica de la enfermedad, permitiendo su diagnóstico y seguimiento apropiados. Mediante los estudios in vitro, in vivo e in silico hemos demostrado la patogenicidad de las variantes P138R y L163R que involucra mecanismos dependientes e independientes de HIF. Asimismo, estos resultados aportan la base para futuros estudios considerando el impacto de las alteraciones estructurales en las modificaciones post-traduccionales que determinan el destino y función de pVHL.

Descripción: La enfermedad cardiovascular (ECV) representa la primera causa de muerte en occidente; la obesidad, especialmente abdominal (OA) y el estado inflamatorio se asocian con la presencia de ECV e insulino-resistencia (IR). La adiponectina, considerada un sensibilizador de insulina tiene efectos anti-aterogénicas y anti-inflamatorios. Se estudió la relación entre la presencia de IR y factores de riesgo asociados, con la morbi-mortalidad por ECV mediante un estudio de cohorte prospectivo. Se estudiaron 315 individuos (247 mujeres (47,6 ± 9,1 años) y 68 varones (47,1 ± 9,2 años)) durante 5 años. Se incluyó un subgrupo de 70 individuos para el estudio de gen y receptores de adiponectina por biología molecular. Se encontró un predominio de sobrepeso (38,7%) y obesidad (27,3%) asociado a un perfil lipídico aterogénico. El 24,1% de los individuos tenía Síndrome Metabólico (SM) siendo col-HDL disminuido el parámetro más frecuente; según HOMA El 18% era IR. La obesidad aumento del 2007 al 2011 en un 8,1%. A lo largo de los 5 años, 58 individuos desarrollaron IR y 9 diabetes (DBT2). De las variables analizadas, OA predijo IR y obesidad DBT2. El 45,7% de los individuos, tenían adiponectina disminuida. Solo en mujeres la concentración sérica de adiponectina explicó la IR de forma independiente. En el análisis de las secuencias de genes ADIPOQ se encontró un SNP no descripto en la base de datos de SNPs (dbSNP) en la posición -11348 G>T de la región promotora en una frecuencia de 38% que se asoció con valores disminuidos de adiponectina circulante. El genotipo GG del SNP rs1029629 del ADIPOR2 presentó asociación significativa con IR y con disminución de adiponectina circulante.

Descripción: Las soluciones elaboradas en este trabajo son similares a las que se pueden encontrar en el mercado argentino que presentan distintas condiciones de conservación. Las muestras se prepararon con un valor teórico de 0,3 %. Las preparaciones se analizaron según USP 41 NF 36. Las condiciones de almacenamiento y los tiempos de análisis fueron los recomendadas por ICH. Para evaluar los resultados se utilizaron dos aplicaciones de software. La aplicación Excel y la otra aplicación usada, fue el paquete R-versión de software "stab" 3.0.1. La compatibilidad IFA:excipiente se evaluó por medio de DSC, FTIR y DRXp. También realiza el ensayo de estrés térmico a las mezclas binarias, con posterior análisis por HPLC y FTIR. Los estudios de estabilidad de las formulaciones de solución de tobramicina se correlacionan con los ensayos de compatibilidad. Estas metodologías pueden aplicarse en los estudios de preformulación. Con ellas se podría lograr disminuir el tiempo y el consumo de materias primas y de insumos que conlleva la elaboración de los lotes pilotos, necesarios para la realización de los estudios de estabilidad. Basándose en estos resultados, la tobramicina es incompatible con los siguientes excipientes: cloruro de benzalconio, ácido bórico, sorbato de potasio, fosfato sódico monobásico, EDTA disódico, metabisulfito de sodio y timerosal.

Descripción: La transición nutricional está caracterizada por la obesidad epidémica y deficiencia de micronutrientes como Ca. Ambos estarían inversamente relacionados, especialmente durante el crecimiento. Objetivos: Diagnosticar prevalencia de exceso de peso e insuficiencia cálcica, mediante IMC y relación Ca/crea (orina basal), en escolares sanos de 5 a 10 años. Analizar las interacciones entre ellos y sus efectos sobre la salud ósea. Materiales y métodos: Se estudiaron 695 escolares municipales de Vicente López. Puntos de corte del IMC: percentilo 85 para sobrepeso (SP) y 95 para obesidad (Ob). Ingesta calcica deficiente para Ca/Crea <0,07; adecuada 0,07?0,15; elevada >0,15. Se evaluó alfa-alfa CTX (?CTX) y beta-beta CTX (? CTX) y QUI. Resultados: Existió alta prevalencia de exceso de peso y deficiencia de Ca (24,9 % y 54%, respectivamente) sin diferencias por sexo. El IMC elevado y deficiencia de Ca no se asociaron. El ?CTX descendió con la edad, sin diferencias por sexo. El QUI no mostró diferencias por sexo ni edad. El análisis factorial asoció inversamente QUI con ?CTX y ?CT e IMC y directamente con Ca/crea Conclusiones: Es imprescindible fomentar hábitos alimentarios, para prevenir el sobrepeso y deficiencia de Ca que afectan los huesos, beneficiando la Salud Pública nacional.

Descripción: La Fiebre Aftosa es una enfermedad vesicular aguda de rápida propagación y amplio rango de huéspedes. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de simple cadena y polaridad positiva, perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para una poliproteína que es escindida por proteasas virales para generar 4 proteínas capsidales y 8 no capsidales (PNC). Se ha reportado que la proteína NC 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN, en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, así como en la virulencia y rango de huésped del VFA. El propósito de este trabajo fue estudiar el rol de la región N-terminal y la propuesta como transmembrana de la proteína NC 3A en la replicación del ARN y en su ubicación intracelular. La metodología utilizada fue la evaluación de mutantes puntuales y de deleción realizadas sobre un replicón del VFA (pRep), basado en la cepa O1/Campos, transcripto desde el promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Este replicón codifica la región completa de proteínas NC, y los extremos no traducibles, pero las proteínas capsidales fueron reemplazadas por el gen reportero de la Luciferasa de Luciérnaga. Se realizaron deleciones sobre pRep en la región N-terminal de 3A (pRep?6-11, pRep?6-17 y pRep?6-23) y posteriormente mutaciones puntuales (pQ18A/H19A/E20A y pE20A). Por otra parte, se mutó la zona predicha como transmembrana (aa 57-76), reemplazándola por una secuencia de 8 alaninas (pRep?TM). La evaluación de replicación/transcripción se realizó por medición de luminiscencia, luego de transfección de células BHK-21 con los plásmidos mutantes o controles, junto con los plásmidos que expresan T7pol y Luciferasa Renilla, este último para normalizar la medición. Las mutantes pRep?6-23, pQ18A/H19A/E20A, pE20A y pRep?TM presentaron una marcada disminución de actividad Luciferasa con respecto a pRep con 3A wt. La ubicación intracelular se evaluó mediante Inmunofluorescencia Indirecta, por microscopia de fluorescencia y confocal, utilizando el anticuerpo monoclonal 3H7 y un anticuerpo comercial contra la etiqueta Flag. Se construyeron plásmidos de expresión de 3Awt (p3AF) y de las mutantes analizadas anteriormente, unidas a la etiqueta Flag (p?6-11F, p?6-17F, p?6-23F y p?TMF). Con la mutante p?TMF, se demostró que la secuencia comprendida entre los aa 56 y 76 de la proteína 3A del VFA, estaría involucrada en la asociación a membranas citoplasmáticas, ya que luego de su deleción la proteína se localiza en el núcleo celular. Se concluye que la región comprendida entre los aa 18 a 23 de la proteína 3A, en especial el ácido glutámico en la posición 20, serian críticos para la replicación viral, mientras que los aa 56 a 76 están involucrados en la ubicación subcelular de la misma. Complementariamente, se mapeó el anticuerpo monoclonal 3H7 y se encontró que su epitope se ubica en la zona N-terminal de 3A y se desarrolló un ensayo de ELISA indirecto utilizando la proteína 3A unida a un péptido carrier (3AGFP-ELISA) para screening de circulación viral en bovinos. El 3AGFP-ELISA resulto rápido y específico, en la distinción de sueros de animales vacunados, de sueros de animales infectados o convalecientes. Se evaluó su performance en comparación con el ensayo 3ABC-ELISA actualmente en uso, (desarrollado también por nuestro Instituto), mediante el análisisde un grupo de 5 sueros positivos de referencia fuertes y débiles (cercanos al valor de corte del ensayo) y posteriormente el análisis de 363 sueros de animales vacunados/no infectados. Los resultados obtenidos con ambos ELISAs 3AGFP y 3ABC mostraron una muy buena correlación, por lo que 3AGFP-ELISA, se podría proponer como una técnica simple y rápida, para el screening inicial de sueros de campo.

Descripción: Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un protozoario hemoflagelado que posee una cisteína proteinasa mayoritaria denominada cruzipaina (Cz). Esta enzima además de un dominio catalítico, presenta un dominio C-terminal (C-T) de relevancia inmunológica. Nuestro grupo ha descripto previamente en este dominio, una O-glicosilación constituida por N-acetil glucosamina y una N-glicosilación compuesta por oligosacáridos de alta manosa, y un grupo sulfato constituyendo el primer reporte de glicoproteínas sulfatadas en Trypanosomátidos. Además, encontramos que los sulfatos presentes en la Cz presentan una marcada antigenicidad en pacientes con enfermedad de Chagas y también en modelos de infección murino donde además estarían directamente relacionados con el daño del tejido cardíaco. A pesar de la relevancia que muestran los motivos sulfatados del parásito nada se sabe del mecanismo de sulfatación ni acerca de su rol en el metabolismo del mismo. La sulfatación, modificación crítica en muchas instancias de reconocimiento biológico, es catalizada por enzimas denominadas sulfotransferasas las cuales dependen para llevar a cabo su función de una molécula denominada PAPS (3'- fosfoadenosina-5' fosfosulfato). En este trabajo, estudiamos el efecto del clorato de sodio, un reconocido inhibidor de la síntesis de PAPS. En epimastigotes tratados con dicho inhibidor, observamos tanto una disminución de la sulfatación de la Cz por western blot como un desplazamiento hacia puntos isoeléctricos más altos en electroforesis bi-dimensional. Además vimos un marcado descenso de sulfoglicoesfingolípidos en cromatografía de placa delgada, confirmado mediante el análisis por espectrometría de masa (UV-MALDI-TOF). Estos parásitos mostraron anormalidades estructurales en imágenes de microscopía electrónica, y cuando se utilizó el tratamiento sobre trypomastigotes, obtuvimos una disminución marcada en la capacidad infectiva de los mismos. Mediante ensayos de citometría de flujo vimos una fuerte presencia de los epitopes sulfatados de la Cz expuestos en la superficie de trypomastigotes y en ensayos de infección posteriores pudimos demostrar la participación de estos epitopes presentes en el dominio C-T de la Cz en dicho proceso. Las siglecs (sialic acid recognizing Ig-superfamily lectins), son un grupo de lectinas de reconocimiento a ácido siálico, expresadas en células del sistema inmune e involucradas en la regulación negativa de la activación de las mismas. Se ha demostrado que la señalización por vía de las Siglecs muchas veces depende del contexto glicosídico en el cual se encuentre el ácido siálico y que T. cruzi es reconocido por estas lectinas. Nuestros resultados con Siglec-E de ratón, ortóloga de la Siglec-9 humana, mostraron que los ligandos de esta lectina en el parásito están específicamente expuestos en proteínas de membrana. Además, existe un reconocimiento de esta lectina a Cz tanto lisosomal de epimastigotes como de Cz liberada al medio por trypomastigotes metacíclicos. La participación de los sulfatos de la Cz promoviendo esta interacción fue demostrada en ensayos de ELISA directo en los cuales Cz y C-T tuvieron un reconocimiento significativamente mayor al de Czd y C-Td. Estos resultados fueron confirmados en ensayos de ELISA de competencia entre Cz y Czd. Por último mediante tratamientos con clorato de sodio, demostramos que la presencia de sulfatos en la superficie del parásito incrementa el reconocimiento de Siglec-E por los mismos utilizando citometría de flujo. En conjunto nuestros resultados sugieren que las glicoproteínas silalidadas del parásito, que contienen grupos sulfatos como la Cz, interaccionan con Siglec-E modulando la respuesta inmune del hospedador, favoreciendo la parasitemia y la persistencia del parásito. Finalmente considerando los antecedentes detallados sobre la relevancia de la sulfatación tanto en el metabolismo del parásito como en el desarrollo de la enfermedad de Chagas; sumado a la ausencia de secuencias genómicas que podamos identificar como posibles sulfotransferasas del parásito, sostenemos firmemente que esta vía es un blanco potencial terapéutico de relevancia.

Descripción: Estudio traslacional de los mecanismos fisiopatológicos de la hipertensión y ECV en la menopausia (MNP) desde los aspectos experimentales y su correlación con la clínica. Objetivo: estudiar los efectos del enalapril sobre: eje hormonal, PA, función endotelial en MNP normotensas (NT) e HTA y, en modelos experimentales de MNP e HTA: receptores hormonales, estrés oxidativo, sistema del NO, remodelamiento cardíaco y renal, fibrosis tisular y vascular. Un estudio (1034 mujeres), mostró asociación entre HTA, dislipemia, hiperglucemia y obesidad. En 29 mujeres MNP (NT e HTA) el enalapril, en un año, elevó el estradiol disminuyendo los síntomas climatéricos. La evaluación de la función endotelial en 498 mujeres mostró que la HTA y la MNP aumentan precozmente el índice de rigidez vascular. En ratas SHR MNP el enalapril disminuyó el peso cardíaco, del VI y el diámetro de los miocitos. En riñón, VI y aorta se incrementó actividad de la NOS, mejoró la peroxidación y fibrosis con aumento de la expresión de receptores de estrógeno a (alfa) en médula y los ß (beta) en corteza y corazón. En ratas normotensas el efecto fue más atenuado. Esta serie de estudios básicos y clínicos confirman que las investigaciones traslacionales pueden aportar beneficios en el cuidado de la salud humana.

Descripción: El alarmante incremento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos (ATM) es sin duda, uno de los mayores problemas actuales de la salud pública. Estos compuestos constituyen una de las principales herramientas para controlar y prevenir infecciones bacterianas, tanto en medicina humana como veterinaria. La resistencia está directamente relacionada con el uso intensivo, muchas veces de forma indiscriminada, de los ATM. Las cefalosporinas de tercera generación (C3G), fluoroquinolonas (FQ) y colistina son ATM de importancia crítica en la medicina humana y se emplean en la medicina veterinaria con elevada frecuencia. El objetivo de trabajo fue evaluar los mecanismos de resistencia a C3G, FQ, colistina y otros ATM en aislamientos de Salmonella spp. y Escherichia coli recuperados de establecimientos de producción avícola, de bovinos y equinos. Los aislamientos pertenecen a la colección del área de Bacteriología del Instituto de Patobiología, incluyendo a E. coli productoras de toxina Shiga (STEC) de origen bovino, obtenidos entre los años 1998-2012. El resto de los aislamientos fueron recuperados de muestras de granjas avícolas de Buenos Aires y Entre Ríos durante los años 2010-2012 y 2014. Los aislamientos de Salmonella spp. recuperados de bovinos y equinos, mostraron altos niveles de sensibilidad a C3G, FQ, carbapenemes y colistina. Las dos poblaciones analizadas, mostraron bajos niveles de sensibilidad a TET y SXT. Se describió por primera vez la detección de la ?-lactamasa de tipo AmpC, CMY-2 de un único aislamiento con resistencia a C3G recuperado de equino. Se caracterizó la plataforma y el entorno genético de blaCMY-2. Posteriormente, se secuenció el plásmido completo de pST10-16. Se determinó el secuenciotipo presente en PST10-16, pero éste no ha sido definido en el esquema de pMLST. En los aislamientos recuperados de pollos parrilleros y gallina ponedoras, S. Heidelberg fue la serovariedad prevalente dentro de los aislamientos (55%) provenientes de diferentes granjas de Buenos Aires y Entre Ríos. Aproximadamente el 50% de los aislamientos presentaron sensibilidad a C3G, un menor porcentaje a FQ y el total de los aislamientos sensibles a carbapenemes y colistina. El mecanismo prevalente de resistencia a C3G observado en Salmonella spp. fue la producción de CMY-2, aunque se observó una menor proporción de BLEE provenientes del grupo CTX-M-14 y CTX-M2. El determinante PMQR prevalente en estos aislamientos fue qnrB (89,5%) y la variante alélica fue qnrB5, la cual no ha sido descripta previamente en aislamientos clínicos o veterinarios en nuestro país. Se describió en el 75% de los aislamientos de S. Heidelberg el mismo patrón de XbaI-PFGE, que demostró la propagación de un clon predominante entre las granjas. En los aislamientos de E. coli STEC no-O157 recuperados de bovinos, el serotipo prevalente fue O26 y O111, donde el 87% de los aislamientos portadores de stx1 contienen intimina, importante para la patogénesis de éstos aislamientos. Se observó un alto nivel de sensibilidad a las C3G ensayadas y solo dos aislamientos fueron productores de la cefalosporinasa CMY-2. De la misma manera presentaron un elevado porcentaje de sensibilidad a quinolonas y no mostraron resistencia a carbapenemes y colistina. Dentro de los genes PMQR detectados, qnrA fue el determinante prevalente. Al contrario, en los aislamientos de E. coli recuperados de pollos parrilleros se observó un elevado nivel de resistencia a C3G, FQ y colistina. La proporción de resistencia a otras familias de ATM fue elevada destacándose la descripción de un gran número de aislamientos con multirresistencia (MDR). El mecanismo de resistencia prevalente a C3G, fue la cefotaximasa CTX-M-2, presentándose en combinación con CTX-M-14 y CMY-2. El análisis de la clonalidad de los aislamientos resistentes a C3G reveló una distribución heterogénea de los grupos filogenéticos encontrados. Los marcadores PMQR prevalentes fueron qnrB y qnrS, siendo las variantes alélicas identificadas como qnrB5 y qnrA1, y se observó gran diversidad de otros determinantes PMQR. Se describió por primera vez en nuestro país, un elevado porcentaje de aislamientos con resistencia a colistina (COL) provenientes de animales y se detectó el gen mcr-1, mecanismo de resistencia de codificación plasmídica. En este trabajo, no se observó co-transferencia de mecanismos de resistencia a ?-lactámicos, pero si se detectó la transferencia del determinante qnrB5 en los aislamientos portadores, sugiriendo que comparte una localización en el mismo plásmido junto a mcr-1. Se identificó el plásmido IncK en las cepas salvajes y transconjugantes obtenidos, como el posible replicón que caracteriza el plásmido conjugativo portador del determinante de resistencia mcr-1. Debemos considerar la sensibilidad a los ATM como un recurso limitado y no renovable, de muy lenta recuperación cuando se ha perdido y debemos ser capaces de implementar un sistema de vigilancia de la resistencia antimicrobiana en las poblaciones animales y humana, ya que teniendo un mejor conocimiento de la ecología de bacterias resistentes y de los genes implicados en la resistencia, se podrá generar una mayor conciencia en las partes interesadas, sobre el uso prudente y responsable de los antimicrobianos en la población animal, en el ámbito clínico y sus consecuencias en el ambiente. Este problema, de origen multifactorial y de alcance global, trasciende fronteras, y requiere acciones inmediatas, integradas y multisectoriales. Los organismos internacionales dedicados a la salud (Organización Mundial de la Salud-OMS y la Organización de Sanidad Animal-OIE) han instado recientemente a los países a elaborar planes y a adoptar medidas para enfrentarlo, bajo el concepto de ?Una salud?, con una visión integral de la sanidad animal y la salud pública a escala mundial.

Descripción: Los objetivos fueron evaluar las alteraciones que se producen en el entorno redox en: superficie ocular, humor acuoso, humor vítreo, cabeza del nervio, cerebro y estructuras cerebrales (núcleo geniculado lateral y corteza visual primaria) de ratas sometidas al modelo experimental de glaucoma y evaluar el posible efecto neuroprotector del ácido lipoico administrado en una dosis diaria (100mg/kg) por siete días. Los parámetros evaluados para determinar el entorno redox fueron: niveles de prooxidantes, antioxidantes no enzimáticos y enzimáticos. En el glaucoma se observó: aumento de prooxidantes, disminución de antioxidantes no enzimáticos, disminución de enzimas que reciclan glutatión y aumento de algunas enzimas antioxidantes. El lipoico disminuye prooxidantes, aumenta el reciclado del glutatión y los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. En conclusión el glaucoma es una neuropatía óptica, cuyo daño se proyecta al cerebro, más allá de la retina y del nervio óptico. El desbalance oxidativo se manifiesta por cambios en el entorno redox de áreas cerebrales que son diana del nervio óptico. El ácido lipoico podría ser utilizado como neuroprotector ya que revierte ciertos marcadores de daño evaluados. Terapias que retrasen la progresión del daño neurodegenerativo redundaría en un beneficio en el tratamiento del glaucoma, la mayor causa de ceguera mundial.

Descripción: La introducción de la variable "proceso" como objeto de estudio en bioseguridad permitió un análisis cuantitativo del biorriesgo a nivel de procedimientos y operadores biomédicos. Se construyó un primer mapa de riesgo calculando el Riesgo Relativo (RR) a accidentes biológicos en una institución biomédica con 471 trabajadores; de un total de 82 accidentes/año, 41 correspondieron a accidentes biológicos (50%). Del total de operadores, 435 pudieron ser clasificados correctamente (92% especificidad) en tres categorías de riesgo con diferencias significativas (p<0,05): elevado (RR>2.5), moderado (RR aprox. 1) y bajo (RR< 0,50). Para el segundo mapa se utilizó una matriz multidimensional de análisis del riesgo biológico por exposición desarrollado en esta tesis (BioRIM optimizado). La distribución de frecuencias de 114 procesos analizados presentó tres máximos con diferencias significativas (p<0,05), correspondientes a tres categorías de riesgo: elevado (>50 UBRs/día), moderado (3 a 50 UBRs/día) y bajo (< 3 UBRs/día) con un 96% especificidad. La comparación entre métodos presento una correlación moderada (R²: 0,2302), sin embargo ambos clasificaron en las misma tres categorías al 74,1% de los operadores. Los mapas obtenidos son complementarios; el BioRIM optimizado analiza el riesgo previo al daño y los registros de accidentes evalúan la eficiencia de la bioseguridad implementada.

Descripción: La endometriosis es una enfermedad ginecológica benigna caracterizada por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina. Afecta al 10% de las mujeres en edad reproductiva siendo los síntomas más importantes el dolor pelviano crónico y la infertilidad. El tratamiento actual consiste en una intervención quirúrgica mediante la cual las lesiones endometriósicas son extirpadas, seguido de un tratamiento farmacológico que disminuye los niveles de estrógenos en sangre. Si bien inicialmente resulta efectivo, se sabe que la administración de estas drogas conlleva efectos adversos indeseados, retraso de la posibilidad de gestar un embarazo y aumento de la reincidencia de la enfermedad al interrumpir el tratamiento. Siendo así, resulta indispensable la búsqueda de alternativas terapéuticas que resulten inocuas, con compuestos que inhiban los mecanismos involucrados en el desarrollo de la enfermedad y que potencialmente puedan ser administrados por periodos prolongados sin interferir sobre la posibilidad de lograr un embarazo. Dado que los productos de origen natural cumplen con estas condiciones, hace algunos años nuestro grupo ha iniciado la búsqueda de posibles fitoterapéuticos para el control de la endometriosis. En esos trabajos, polifenoles derivados del té verde y de los frutos rojos demostraron poseer claros efectos inhibitorios sobre el desarrollo de la endometriosis experimental. La continuación de esta búsqueda, nos ha conducido a proponer como objetivo de este trabajo la evaluación de compuestos bioactivos de dos especies vegetales con probados efectos terapéuticos beneficiosos: Rosmarinus officinalis y Scutellaria baicalensis, sobre distintos modelos de endometriosis experimental. El ácido carnósico es un diterpeno fenólico y el ácido rosmarínico un polifenol. Ambos constituyen dos de las moléculas bioactivas más abundantes de las hojas del romero (Rosmarinus officinalis) y son responsables de la actividad antioxidante del arbusto. Se les han atribuido funciones antitumorales, antiinflamatorias y antinociceptivas. Estudios realizados en diversas líneas celulares tumorales han demostrado que son capaces de inhibir la proliferación, inducir apoptosis y así controlar su crecimiento. Los efectos antitumorales observados en modelos in vivo incluyen mecanismos antimetastásicos, antiinvasivos y antiangiogénicos. Si bien se conoce su acción inhibitoria tumoral, sus efectos en endometriosis no habían sido estudiados hasta el momento. Por otra parte, la medicina china a base de hierbas está siendo utilizada por millones de pacientes con endometriosis con excelentes resultados. La ventaja de esta medicina oriental es que no provoca efectos adversos y aún más, disminuye el dolor premenstrual y mejora los parámetros de fertilidad comparada a la medicina tradicional occidental. A pesar de estos claros beneficios, no se conoce el modo de acción específico de esta combinación de hierbas. Scutellaria baicalensis, conocida en China por su nombre Huang Qin, es una planta originaria del continente asiático cuya raíz contiene wogonina, un flavonoide que constituye una de las principales moléculas bioactivas de la medicina herbaria china. La acción de wogonina ha sido asociada con procesos antitumorales, antiinflamatorios y antiproliferativos. Se ha reportado que este compuesto es capaz de controlar el crecimiento celular, inducir apoptosis e inhibir la proliferación de células tumorales. A pesar de que conocemos los efectos favorables de la medicina china a base de hierbas, los mecanismos directos de sus moléculas activas sobre la inhibición del crecimiento de las lesiones endometriósicas no habían sido investigados hasta el momento. La importancia de este trabajo radica en que por primera vez se evaluó el efecto de tres compuestos naturales: ácido carnósico, ácido rosmarínico y wogonina, sobre modelos experimentales de endometriosis. Hemos evidenciado un potente efecto antiproliferativo sobre cultivos primarios de células endometriales estromales humanas provenientes de biopsias de mujeres controles y mujeres con endometriosis, así como también sobre la línea celular endometrial estromal humana T-HESC. El ácido carnósico y la wogonina además indujeron arresto del ciclo celular en el estadio G2/M en la línea celular T-HESC. Comprobamos además la actividad antioxidante del ácido rosmarínico sobre células T-HESC, y descubrimos la capacidad prooxidante de wogonina sobre estas células. Conociendo el papel clave de los estrógenos en la endometriosis, resulta novedoso que wogonina haya sido capaz de disminuir la expresión del receptor de estrógenos alfa en la línea celular T-HESC. Sin embargo no se detectaron diferencias en la secreción de estradiol, indicando que los efectos obtenidos sobre el crecimiento endometrial no estarían mediados por esta vía. Asimismo, dada la importancia que cumplen los mastocitos en los procesos de inflamación y dolor, y basándonos en los antecedentes observados en las células estromales sobre la inducción del arresto del ciclo, evaluamos la expresión de 5 genes que participan activamente en la progresión de G2 a mitosis en la línea celular de mastocitos humanos HMC1.1. Observamos un efecto similar al que habíamos visto sobre las células T-HESC. El ácido carnósico y la wogonina regularon la expresión de dichos genes, mientras que el ácido rosmarínico no provocó alteraciones. Complementariamente, en el modelo in vivo de endometriosis experimental pudimos demostrar que los tres compuestos inhibieron el crecimiento de las lesiones endometriósicas inducidas quirúrgicamente en los ratones. Luego de cada tratamiento observamos una disminución significativa de la proliferación de las células estromales y epiteliales de las lesiones y en el caso de los tratamientos con ácido rosmarínico y wogonina además se evidenció un efecto proapoptótico. Sin perder de vista que queda mucho camino por recorrer, consideramos a estos resultados como promisorios ya que aportan contundentes evidencias para continuar en la búsqueda de potenciales estrategias terapéuticas para el tratamiento para la endometriosis.

Descripción: Escherichiacoli O157:H7 es un patógeno zoonótico de importancia mundial y el agente causal delSindrome Urémico Hemolítico (SUH). El ganado bovino es el principal reservorio de esta y otras Escherichiacoli productoras de toxinas Shiga (STEC). Durante este trabajo se evaluó la protección conferida por la vacunación con proteínas recombinantes del Sistema de Secreción de Tipo III, la fracción carboxilo-terminal de Intimina? (Intimina?C280) y EspB; y la subunidad B de la toxina Shiga 2 fusionada a BrucellaLumazinaSintasa (BLS-Stx2B), frente al desafío experimental en terneros. La inmunización con estos antígenos generó anticuerpos específicos tanto en suero como en mucosas, que eficientemente neutralizaron diversas propiedades de virulencia de la bacteria in vitro. Frente al desafío experimental, se observó una reducción significativa en la excreción de E. coli O157:H7 en los animales vacunados respecto de los controles. Sin embargo, no se observaron diferencias entre los grupos inmunizados con Intimina?C280 + EspB respecto del grupo que, además de estos dos antígenos, incluyó a BLS-Stx2B. Estos resultados sugieren que la adición de este antígeno no confiere protección adicional respecto de la observada para Intimina?C280 y EspB, al menos en las primeras semanas luego del desafío experimental. Aún queda por determinarse si la inclusión de este antígeno altera los patrones deexcreción frente a condiciones de exposición naturales.

Descripción: Las levaduras del género Malassezia han sido reconocidas como miembros de la microbiota cutánea normal del hombre y otros animales. Se caracterizan por ser lipofílicas y la mayoría de ellas lipo-dependientes, razón por la cual requieren de una fuente externa de ácidos grasos para su crecimiento. Estas levaduras son agente etiológico de pitiriasis versicolor y foliculitis por Malassezia y puede participar como agente secundario o exacerbador de otras afecciones dérmicas. Además han sido asociadas a infecciones sistémicas en pacientes inmunosuprimidos. Los métodos disponibles para determinar la sensibilidad antifúngica in vitro de las levaduras son aplicables solo a especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Debido a los requerimientos nutricionales y condiciones de cultivos especiales de Malassezia sp., su estudio de sensibilidad antifúngica es complejo. El objetivo de esta investigación fue determinar la sensibilidad antifúngica de aislados de Malassezia de origen clínico frente a antifúngicos de uso tópico y sistémico. Se estudiaron cepas de Malassezia depositadas en la colección de cultivos, aisladas de muestras clínicas de pacientes con afecciones dérmicas y sistémicas. La sensibilidad se determinó por las técnicas de microdilución en caldo y de difusión en agar. Para asegurar el crecimiento de estas levaduras, se modificó densidad del inóculo, temperatura y tiempo de incubación y se suplementó el medio base de cultivo. Se evaluaron fluconazol, ketoconazol, itraconazol, voriconazol, miconazol, anfotericina B y terbinafina. Para correlacionar ambos métodos, se aplicó análisis de regresión lineal y se determinó acuerdo categórico. Se procesaron un total de 120 aislados de Malassezia spp. Las modificaciones realizadas a la técnica permitieron el desarrollo de todas las especies estudiadas. Las CIM y los halos de inhibición pudieron ser leídos a las 72 h de incubación. En general, las levaduras fueron inhibidas a bajas concentraciones de ketoconazol, itraconazol y voriconazol. Las sensibilidades frente al fluconazol, el miconazol, la anfotericina B y la terbinafina resultaron ser más variables y se obtuvieron altas CIM, especialmente frente a M. furfur y M. globosa. Con respecto a la difusión, la mayor dispersión de los halos de inhibición se observó para fluconazol, voriconazol y miconazol. En cambio, frente al ketoconazol y el itraconazol se observó menor variabilidad de los resultados. El análisis de regresión lineal no pudo ser realizado para el itraconazol, el ketoconazol y la terbinafina porque no existió, en estos casos, relación lineal entre las variables CIM y halo de inhibición. La concordancia más elevada fue observada para el itraconazol y la más baja para la anfotericina B y el fluconazol. Las modificaciones realizadas a las metodologías de referencia permitieron el desarrollo de las especies de Malassezia y la obtención de valores de sensibilidad en iguales condiciones de densidad de inóculo, temperatura y tiempo de incubación. M. furfur, M. sympodialis y M. globosa mostraron perfiles de sensibilidad variables frente a los antifúngicos probados, M. furfur demostró ser la especie menos sensible y M. sympodialis la más sensible. Este comportamiento diferente observado entre las especies de mayor prevalencia, enfatiza la necesidad de realizar la identificación de especies. El ketoconazol, el itraconazol y el voriconazol fueron las drogas más efectivas, observándose poca variabilidad de la sensibilidad intra-especie. Sin embargo las sensibilidades fueron muy variables frente al fluconazol, miconazol, anfotericina B y terbinafina, y esto es importante considerando que estas son drogas de uso frecuente. El análisis de correlación lineal no es aplicable para comparar ambas metodologías, debido a que las variables CIM y halo de inhibición no se relacionan linealmente. Debido a estos resultados y a la poca concordancia obtenida, el método de difusión en agar no sería adecuado para determinar la sensibilidad antifúngica de levaduras de Malassezia.

Descripción: El proceso de optimización de un compuesto líder obtenido a partir de una estrategia fenotípica, requiere de la caracterización del mecanismo molecular de acción involucrado. A partir de un cribado fenotípico realizado previamente sobre un grupo de compuestos pertenecientes a la familia de las tiosemicarbazonas (TSCs), se identificó el compuesto tiosemicarbazona 4,4?-dimetoxibenzofenona como un compuesto líder en la línea celular U937. La caracterización del mecanismo de acción de T44Bf, realizado sobre un panel de líneas celulares de leucemia aguda humana (U937, HL60, KG1a y Jurkat) mostró que su efecto antiproliferativo está asociado a un arresto mitótico reversible inducido por la inhibición de la polimerización de los microtúbulos, lo que eventualmente conduce a la muerte por apoptosis. Esta última resultó ser selectiva por células leucémicas en contraposición a células hematopoyéticas diferenciadas. Asimismo, la actividad apoptótica estuvo asociada a la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, fosforilación sostenida de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL y un incremento de la proteína pro-apoptótica Bad. Por último, la fosforilación de la MAPK ERK 1/2 demostró ser un requisito para la inducción de apoptosis. Los resultados describen un mecanismo novedoso para una TSC, y permiten establecer las bases racionales para la utilización de un biométodo para el desarrollo a fututo de los ensayos de optimización de este compuesto líder.

Descripción: El virus de hepatitis B (HBV), debido a su estructura poblacional de cuasiespecie, circula como un conjunto de subpoblaciones de variantes genéticamente relacionadas que evolucionan a lo largo de la infección crónica. Como resultado del proceso evolutivo, se fijan aquellas subpoblaciones virales que presenten el mayor fitness para cada situación particular durante la infección crónica. En este trabajo se presentó un nuevo método destinado a evaluar el fitness viral del HBV y se utilizó para la evaluación del fitnessreplicativodel HBV en dos escenarios evolutivos: proceso de seroconversión (intra hospedador) y ocupación del nicho ecológico (interhospedador). Este método facilita el análisis de las interacciones entre diferentes variantes virales en un proceso de cotransfección. En este trabajo se concluye que: El fitnessreplicativo está directamente relacionado con la capacidad replicativa de cada variante analizada. La cotransfección con sgtD1del y sgtD1mut constituye la primera evidencia dela interacción entre variantes virales en el transcurso de la replicación del HBV en un mismo sistema celular. El mayor fitness replicativo del sgtF1b comparado con sgtF4 como un aporte a la comprensión de la ocupación por el sgtF1b del nicho ecológico de nuevas infecciones en Argentina.

Descripción: La exposición a partículas de contaminación ambiental (MP) se encuentra asociada a incrementos en la morbilidad y mortalidad cardiovascular. El estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria han sido señalados como partícipes fundamentales en este contexto, aunque los mecanismos subyacentes no se conocen en detalle. El objetivo de este trabajo fue evaluar dicha hipótesis en modelos de exposición aguda in vivo e in vitro, utilizando MP derivado de la combustión del petróleo (ROFA). Se observó una alteración del metabolismo oxidativo y energético cardíaco, junto con una disminución de la reserva contráctil y diastólica. Estos cambios se acompañaron de incrementos en marcadores plasmáticos de estrés oxidativo e inflamación. La reacción inflamatoria producida por ROFA indujo la extravasación de leucocitos, por activación de células endoteliales y mieloides dependiente de TNF-?. Los monocitos circulantes parecerían desempeñar un rol central en los efectos observados, dado que su depleción previene la aparición de marcadores de inflamación local y sistémica. Asimismo, el bloqueo de TNF-? in vivo previno los efectos de ROFA a nivel cardíaco. Estos resultados indican que el estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria se encuentran asociados a la exposición a MP, y podrían explicar los efectos adversos reportados sobre el sistema cardiovascular.

Descripción: La piel es un órgano constituido por distintos tipos celulares, entre ellos muchos con funciones inmunológicas. Es, además, el órgano más expuesto a la radiación UV contenida en la luz solar; exposición que puede llevar a un estado de inmunosupresión. Sin embargo, también se conocen efectos benéficos de la exposición cutánea a RUV. El objetivo del presente trabajo de tesis fue estudiar comparativamente los efectos de la exposición cutánea a dosis altas de RUV (daUV) y dosis bajas y repetitivas de RUV (dbrUV) sobre la respuesta inmune innata y adaptativa. La exposición a daUV llevó a una marcada inflamación local, con disminución de la respuesta inmune adaptativa; mientras que la exposición a dbrUV promovió el efecto contrario, sin signos de inflamación local, con refuerzo de la barrera epitelial e inmunoestimulación sistémica. En contraste con estos resultados, al realizar un desafío infeccioso con Staphylococcus aureus en animales irradiados, se observó que la exposición a daUV no alteró la respuesta frente al patógeno, pero sí lo hizo la exposición a dbrUV, permitiendo una mayor diseminación de la infección. El presente trabajo demuestra que la exposición cutánea a RUV puede llevar a distintas modificaciones de la respuesta inmune, tanto nocivas como beneficiosas.

Descripción: La necesidad de contar con herramientas seguras y efectivas para el manejo de plagas, alternativas o complementarias a los insecticidas químicos, estimula el interés en usar entomopatógenos como agentes de biocontrol. Bacillus thuringiensis es entre ellos, el patógeno más exitoso en cumplir este objetivo, y el que además mantiene potencial para seguir desarrollándose. En este estudio se trabajó en la selección y caracterización de cepas de B. thuringiensis tóxicas para larvas de dos especies de coleópteros plagas que son de gran importancia en el Sector Agropecuario: el picudo del algodonero (Anthonomus grandis) y el escarabajo de la cama de pollos (Alphitobius diaperinus). Asimismo, se trabajó en el mejoramiento de un medio de cultivo para obtener una mayor biomasa activa de una cepa nativa de B. thuringiensis con vistas a la elaboración de un bioinsecticida. En una primera etapa, se realizaron bioensayos preliminares con cultivos completos de 124 cepas de B. thuringiensis con larvas neonatas de A. grandis. Se seleccionaron tres cepas exóticas y cuatro nativas por causar porcentajes de mortalidad superiores al 50%. Todas ellas eran productoras de ?-exotoxina. Las cepas nativas compartieron una morfología similar de cristales parasporales, un perfil de proteínas similar y los mismos genes insecticidas. Sus características hacen que se parezcan a cepas tóxicas para Lepidópteros. Además mostraron un perfil de REP-PCR idéntico al de la cepa lepidoptericida HD-1, sugiriendo que podrían pertenecer al serovar kurstaki. Sin embargo, se observaron diferencias en el perfil plasmídico y en la producción de ?-exotoxina. Para determinar en qué fracción del cultivo se encontraban los metabolitos responsables de la toxicidad, se realizaron bioensayos utilizando pellets resuspendidos y sobrenadantes filtrados, comparándolos con los cultivos completos. Ambas fracciones mostraron diferentes niveles de toxicidad. Los resultados sugieren que los principales factores de virulencia se encuentran en el sobrenadante y estarían directamente relacionados con la presencia de ?-exotoxina. De acuerdo con los bioensayos de los sobrenadantes filtrados y sobrenadantes filtrados y autoclavados, no se descartaría también la participación de factores de virulencia termolábiles como Cry1Ia en la toxicidad. En las cepas seleccionadas el principal factor de virulencia sería la ?-exotoxina, por lo que su uso no sería posible de acuerdo a la reglamentación vigente. No obstante, estas podrían ser fuente de genes (ej: cry1Ia) para la producción de plantas transgénicas resistentes a dicha plaga. En una segunda etapa, se realizaron bioensayos preliminares con cultivos completos de 42 cepas de B. thuringiensis con larvas de 2º estadio de A. diaperinus. Las cepas evaluadas no resultaron tóxicas o presentaron porcentajes de mortalidad menores al 10%, exceptuando la cepa nativa INTA Mo4-4 y B. thuringiensis svar. morrisoni cepa tenebrionis DSM2803. Ninguna de estas dos cepas demostró producir ?-exotoxina, sugiriendo que este metabolito no tendría un papel preponderante en la patogenicidad. Ambas cepas presentaron morfología similar de cristales, un perfil de proteínas similar y los mismos genes insecticidas. Sin embargo, alguna diferencia surgió cuando se compararon los perfiles electroforéticos de REP-PCR. Ambas cepas mostraron perfiles similares que difieren por la presencia de una banda polimórfica en INTA Mo4-4. Estas similitudes sugieren que esta cepa podría representar una variante dentro del serovar morrisoni. Al igual que para A. grandis, se analizó en qué fracción del cultivo se encontraban los metabolitos responsables de la toxicidad. Los resultados mostraron que los metabolitos tóxicos principales se encontrarían en el pellet y se asociarían a proteínas Cry3. Se cuantificó la virulencia del pellet seco y molido de ambas cepas para la estimación de la concentración letal media y de otros parámetros estadísticos empleando bioensayos ?finos?. La cepa INTA Mo4-4 resultó significativamente más tóxica que la cepa tenebrionis DSM2803. Se observó además que la solubilización y tripsinización in vitro de los cristales de INTA Mo4-4 no influyen significativamente sobre su virulencia. Por lo expuesto, la cepa nativa INTA Mo4-4 se constituyó como la mejor opción para ser utilizada como ingrediente activo de un formulado nuevo destinado al manejo de A. diaperinus. Teniendo en cuenta esta premisa, se seleccionó el caldo BM con almidón soluble como medio propicio para la producción de INTA Mo4-4, debido a que fue en él donde se logró una mayor producción de proteínas totales. Posteriormente, se empleó un diseño de Plackett-Burman para determinar cuáles de los ocho componentes del caldo mencionado afectaban significativamente la producción de proteínas de la biomasa activa. Se obtuvo de ese estudio que el extracto de levadura es un componente importante del caldo BM, que influyó significativamente y positivamente en la producción de proteínas. La glucosa y el almidón (fuentes de C) demostraron respectivamente, un efecto negativo y positivo, aunque no significativo, sobre la producción de proteínas. Sabiendo que las proporciones de C:N en los medios de cultivo son importantes para el crecimiento normal de B. thuringiensis y la producción de proteínas Cry, y considerando que el análisis de Plackett-Burman sólo detecta efectos principales sin tener en cuenta interacciones, resultó de interés avanzar en el estudio de la interacción entre el extracto de levadura y el almidón soluble. Los dos componentes seleccionados fueron optimizados utilizando un diseño central compuesto rotatorio. Se logró mejorar el caldo BM con la información generada. Se obtuvo una producción de proteínas insecticidas de INTA Mo4-4 significativamente mayor respecto al medio original, lo que se tradujo en un aumento significativo de la toxicidad para A. diaperinus.

Descripción: La exocitosis acrosomal (EA) es un proceso secretorio dependiente de Ca2+ fundamental para que el espermatozoide fecunde el ovocito. Durante este trabajo de tesis describimos la presencia y localización de MARCKS en espermatozoides humanos. En un modelo de espermatozoides permeabilizado, anticuerpos que reconocen diferentes dominios de MARCKS inhibieron la EA. A su vez se demostró que el dominio efector (ED) de MARCKS es capaz de inhibir la EA y que el estado de fosforilación del ED regula su participación durante la EA. Asimismo la adición de PIP2 o adenofostina, un potente agonista de los receptores de IP3 revirtió el efecto inhibitorio del ED de MARCKS sobre la EA, sugiriendo que MARCKS regula la disponibilidad de PIP2 durante la EA. Además se demostró que un péptido que posee la secuencia del ED de MARCKS es permeable a la membrana plasmática y es capaz de inhibir los movimientos de Ca2+ que ocurren durante la EA. En esta tesis demostramos que una vez que se estimula la EA se produce la fosforilación y translocación de MARCKS desde las membranas al citosol celular. Estos resultados nos permiten plantear que MARCKS es un componente importante en las vías de transducción de señales durante la exocitosis acrosomal.

Descripción: Si bien desde 1998 se conocieron los primeros marcadores de resistencia a quinolonas de codificación plasmídica (PMQR), y sumado a la elevada resistencia a quinolonas reportada, son escasos los estudios epidemiológicos acerca de los PMQR. Dentro de estos determinantes se describieron las proteínas tipo Qnr, la variante de la enzima acetiltransferasa (Aac(6´)-Ib-cr), y las bombas de eflujo (QepA y OqxAB). El objetivo de este estudio fue investigar la frecuencia de los determinantes de resistencia a quinolonas mediados por plásmidos (PMQR) en tres colecciones de Enterobacteriaceae resistentes a cefalosporinas de tercera generación (RCTG) aisladas de especímenes clínicos de Argentina (A), Perú (P) y Colombia (C). Se incluyó, además, otra colección de aislamientos de Colombia sensible a estos antibióticos. Los mecanismos más frecuentemente encontrados fueron aac(6´)-Ib-cr (A= 38,6 %, P= 55,5 %, C-resistente= 71,4 % y C-sensible= 18,7 %) y qnrB (A= 36,8 %, P= 25,9 %,C- resistente 52,4 % y C-sensible 3,1 %). Un aislamiento por país mostró el gen qepA, de los cuales dos fueron qepA1 y el tercero un nuevo alelo con 99 % de identidad con qepA1 y qepA2. Los genes oqxAB se encontraron en tres aislamientos de E. coli de Perú asociados a secuencias de inserción de la familia IS6 en plásmidos de 90 a 100 Kb. El trabajo muestra la importante asociación de la resistencia a fluoroquinolonas (y de las PMQR) en aislamientos RCTG, y su mayor prevalencia que en la colección sensible a oxiiminocefalosporinas. Este trabajo es la primera descripción de la prevalencia de genes de tipo PMQR en aislamiento RCTG en poblaciones de Argentina, Perú y Colombia, así como la primera descripción y caracterización de qepA y oqxAB en aislamientos clínicos de sus países de origen.

Descripción: Los hallazgos obtenidos a lo largo del presente trabajo de tesis muestran que el sistema del NO, participa como modulador de los parámetros hemodinámicos, de la funcionalidad cardíaca y del balance renal de agua ante un estado hipovolémico inducido por restricción controlada de agua a largo plazo, según avanza la edad. Las modificaciones en la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO) cardiaco y renal, y su interacción con las caveolinas, estarían compensando los cambios funcionales y estructurales asociados con la edad en estos órganos bajo estrés osmótico. En relación al impacto del NO renal sobre la reabsorción tubular de agua, se demuestra que se afecta la redistribución de los canales de agua tipo 2 (AQP2) en la médula renal. Esta respuesta es dependiente del avance de la edad, y al menos en parte, responsable de la menor capacidad de concentrar la orina durante la edad avanzada. Las presentes observaciones enfatizan el papel del sistema del NO cardíaco y renal durante un desequilibrio hidrosalino inducido por restricción de agua durante el proceso natural de envejecimiento.

Descripción: Numerosas evidencias sugieren que las acuaporinas (AQPs) intervendrían en el movimiento del agua a través de la membrana plasmática durante la apoptosis. Aunque la apoptosis de trofoblasto es un evento fisiológico, está exacerbada en procesos patológicos como la preeclampsia. La hipoxia intermitente seria un potente inductor de la apoptosis placentaria. Nuestro objetivo fue determinar el papel de AQPs placentarias en la apoptosis trofoblasto. Explantos de placentas normales se cultivaron en normoxia, hipoxia, e hipoxia/reoxigenación (H/R), y se evaluaron índices de apoptosis en presencia o ausencia de bloqueantes de AQPs. Se estudió la expresión de AQP3 y AQP4 en placentas preeclámpticas y en el modelo de explantos. Las expresiones AQP3 y AQP4 disminuyeron en placentas preeclámpticas y en explantos expuestos a H/R. El bloqueo de la actividad AQPs con HgCl2, redujo drásticamente la degradación del ADN, el número de núcleos apoptóticos, la expresión de Bax y la actividad de caspasa?3. Los mismos resultados se obtuvieron bloqueando la AQP3 con CuSO4 mientras que con TEA y floretina no se inhibió la apoptosis. Por lo tanto, las AQPs y, en particular, AQP3, participarían en la apoptosis de trofoblasto. Así, alteraciones en su expresión perturbarían el equilibrio de este proceso ordenado desencadenado la preeclampsia.

Descripción: El Virus de la Hepatitis B (HBV) es uno de los principales agentes etiológicos de enfermedades hepáticas agudas y crónicas en humanos. A nivel mundial, se estima que 2000 millones de personas han estado en contacto con el virus, de los cuales 240 millones presentan evidencias de infección crónica. El estudio del origen, emergencia y dispersión de los virus que infectan a las poblaciones humanas resulta de utilidad para evaluar la historia evolutiva, esclarecer la epidemiología de las enfermedades humanas y mejorar la comprensión del comportamiento biológico en relación a su interacción con el hospedador. En el caso particular del HBV, el conocimiento de las cepas que circulan en una población se ha vuelto uno de los principales focos de la epidemiología debido a la evidencia del impacto diferencial de los genotipos en el curso clínico de la infección, severidad de la enfermedad hepática y respuesta a la terapia antiviral. La evolución del HBV, en particular su origen y tiempo de interacción con las poblaciones humanas, es objeto de continuo debate. Diferentes líneas de evidencia sugieren una relación antigua entre el HBV y las poblaciones humanas. Sin embargo, una de las principales dificultades en el estudio de la evolución del HBV es la falta de consenso acerca de las tasas de sustitución. Se ha observado que las estimaciones de tasas de evolución muestran una correlación negativa con la escala temporal, disminuyendo a medida que se incrementa el intervalo de tiempo en el que dicha tasa fue medida. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo de Tesis fue analizar la historia evolutiva del HBV en dos escalas temporales y contextos epidemiológicos: la evolución a largo plazo del Genotipo F en América y la epidemiología reciente del virus en la Provincia de Misiones, Argentina. Se analizó en profundidad la estructura filogenética del Genotipo F y el proceso de dispersión geográfica a lo largo de tiempo, con foco en los tipos prevalentes en nuestro país. Los análisis de coalescencia por métodos Bayesianos calibrados con una tasa de evolución ?lenta? permitieron proponer un origen antiguo para las actuales cepas circulantes el Genotipo F. Además, se corroboró que este tipo de calibración temporal se ajusta a los datos epidemiológicos y demográficos, indicando que son apropiados para estudios de la evolución a largo plazo del Genotipo F. Si bien no existe un alto grado de certeza sobre los eventos de diversificación basales del Genotipo F, Centroamérica y norte de Sudamérica serían las localizaciones más probables de los ancestros de los linajes que circulan en la actualidad. El proceso de dispersión y el patrón geográfico sugieren una asociación entre la diversificación del HBV y el proceso de poblamiento prehistórico del continente. Por otro lado, se estudió la epidemiología reciente del HBV en la Provincia de Misiones, caracterizada por su reciente poblamiento, diversidad étnica y cocirculación de varios subgenotipos virales. La calibración de los análisis con muestras heterocronas, arrojó datos congruentes con el poblamiento de la región es los últimos 150 años, mostrando ser apropiados para el estudio de la epidemiología recientes en una región geográfica circunscripta. En conjunto, los análisis filogenéticos y de coalescencia sugieren que los Subgenotipos D2 y D3 de origen europeo fueron introducidos en varias ocasiones en la primera mitad del siglo XX y posteriormente se diversificaron en la región, resultando los principales responsables de las infecciones crónicas actuales. El Subgenotipo F4 podría estar relacionado con migraciones recientes desde el norte de Argentina y países limítrofes, o representar a las cepas autóctonas de la Provincia de Misiones. El Subgenotipo F1b fue introducido en los últimos 30 años y se relaciona con nuevos eventos de transmisión. En conjunto, el análisis de secuencias genómicas virales permitió describir la dinámica poblacional en diferentes escalas temporales. La información obtenida contribuye al conocimiento de la historia evolutiva del HBV y a establecer un escenario epidemiológico más detallado, al profundizar el conocimiento sobre el origen y dispersión de los genotipos que actualmente circulan en nuestra región.

Descripción: Los eritrocitos humanos (RBC) liberan ATP frente a diferentes estímulos. In vitro, la exposición a diferentes agentes farmacológicos desencadena eventos intracelulares que activan la liberación de ATP. En esta tesis se analizaron los factores que controlan la evolución temporal de la concentración de ATP extracelular (ATPe). Las células fueron expuestas a dos estímulos que inducen liberación de ATP: 3V y mastoparán 7 (MST7). Ambos estímulos inducen aumentos de la concentración de cAMP. La exposición a 3V produjo un aumento de cAMP, que se tradujo en una liberación aguda de ATP. Cuando las células fueron tratadas con CBX (bloqueante de panexina 1), la liberación de ATP fue completamente bloqueada concluyendo que la salida de ATP ocurriría sólo a través de la panexina 1. La exposición a MST7 indujo pequeños aumentos de cAMP que llevaron a una gran salida de ATP. El CBX bloqueó parcialmente la liberación de ATP, sugiriendo la existencia de dos vías para la liberación del mismo. Además se estudió el papel del volumen y la adhesión celular en la cinética de ATPe. En las células no adheridas, MST7 no indujo respuesta mientras que en células adheridas, las concentraciones ATPe aumentaron y se observó un aumento de volumen celular.

Descripción: La respuesta inmune celular, y en particular la mediada por linfocitos T, juega un rol fundamental en el control de la infección por Trypanosoma cruzi. En pacientes con infección crónica ha demostrado estar relacionada con la progresión desde el estadio asintomático a la cardiopatía chagásica. No obstante, la complejidad del parásito y de su interacción con el sistema inmune del hospedero dificultan el estudio de la memoria inmunológica mediada por linfocitos T. En este trabajo, abordamos el análisis de esta respuesta mediante dos aproximaciones. Mediante la primera, desarrollamos y optimizamos un protocolo para la generación de líneas celulares a partir de la expansión ex vivo de linfocitos T de memoria de pacientes con enfermedad de Chagas crónica, y la detección de cultivos específicos contra antígenos de T. cruzi. Como resultado, logramos aislar y amplificar poblaciones clonales de linfocitos T CD4+ específicos contra el parásito. Mediante la segunda, se utilizó una estrategia de predicción bioinformática y validación in vitro de epitopes peptídicos de T. cruzi, activadores de secreción de IFN-? en linfocitos T CD4+ y CD8+ de pacientes con enfermedad de Chagas crónica. Así, encontramos y caracterizamos 7 secuencias inmunogénicas, 4 de las cuales representan nuevos epitopes de T. cruzi.

Descripción: El ciliado Tetrahymena thermophila no sintetiza ni requiere esteroles para su crecimiento, aunque sintetiza tetrahymanol, a diferencia de otros ciliados que no lo hacen y son auxótrofos para esteroles. Algunos ciliados pueden incorporar esteroles y modificarlos. Se analizaron, a nivel bioinformático, las vías metabólicas de tetrahymanol y esteroles, revelando la presencia de la vía completa de síntesis de tetrahymanol en Tetrahymena, con enzimas provenientes de diferentes orígenes, pero incompleta en los otros ciliados analizados. Además, se investigó la respuesta, a nivel de la expresión génica, de T. thermophila a esteroles, mostrando una regulación de la vía metabólica de tetrahymanol y de esteroles. T. thermophila transforma a algunos esteroles a través de 4 actividades enzimáticas, C-5, C-7 y C-22 desaturaciones y C-24 des-etilación. C-5 esterol desaturasa (Des5Ap) es dependiente del sistema citocromo b5/ citocromo b5 reductasa, mientras que se desconoce el sistema dador de electrones de C-7 esterol desaturasa (Des7p). Se analizaron la funcionalidad y la conservación de los sistemas dadores de electrones de ambas, expresando Des5Ap en Saccharomyces cerevisiae y Des7p en células de Spodoptera frugiperda, revelando que ambas enzimas son funcionales a pesar de la distancia evolutiva y además que los sistemas dadores de electrones son conservados.

Descripción: ?98? y ?78? son dos variantes truncadas todo-ß de IFABP (proteína que une ácidos grasos de intestino de rata). Esta familia se constituye como un modelo estructural útil para estudiar los determinantes moleculares relacionados con la agregación de proteínas de la clase ß. Las variantes abreviadas revelan una plasticidad conformacional incrementada, una topología del tipo nativa y un plegado cooperativo. Este trabajo de tesis aborda el estudio de la conformación, estabilidad y la tendencia amiloidogénica de estas proteínas. Optamos por el 2,2,2 trifluoroetanol (TFE) como el agente disparador de la agregación, investigándose el mecanismo cinético y las características morfológicas de los agregados amiloides. Asimismo, evaluamos el impacto de bajas concentraciones de TFE (< 15 % v/v) -condición donde la proteína se mantiene soluble- sobre la conformación y la estabilidad de las proteínas mediante diversas técnicas biofísicas. Dichos estudios revelaron la coalescencia conformacional de las tres proteínas y permitieron refinar el modelo estructural planteado para las variantes abreviadas. Finalmente, con el fin de abordar los primeros eventos que conducen a la formación de núcleo de agregación, se estudiaron los cambios que ocurren inmediatamente después de la adición de 25 % v/v TFE. Se concluye que el cambio estructural alcanzado a 10 % v/v TFE mimetizaría aquel necesario para desencadenar la agregación.

Descripción: En el presente trabajo se determinó la implicancia del acido hialurónico (AH) en diversos mecanismos biológicos que favorecen la progresión tumoral. Para ello se utilizaron las líneas celulares humanas de leucemia mieloide crónica K562 y Kv562. Se demostró que el AH incrementó la proliferación de ambas células. En las células K562 su efecto estaría mediado por el receptor CD44 y la activación de las vías de PI3K/Akt y de MEK/ERK mientras que en las Kv562 dependería del receptor RHAMM y de PI3K/Akt. Los oligosacáridos del AH (oAH) inhibieron la proliferación de las células K562 a través de CD44 y la reducción de pAkt y pERK. El inhibidor de la síntesis de AH, 4MU, disminuyó la proliferación celular atenuando la señalización de PI3K/Akt e induciendo senescencia. Asimismo, en ambas líneas celulares el AH revirtió el efecto anti-proliferativo y senescente de Imatinib mientras que los oAH y la 4MU las sensibilizaron a la acción del inhibidor. Además, los oAH y la 4MU sensibilizaron a las células Kv562 al efecto senescente de la VCR mediante la inhibición de PI3K y de la Pgp. A partir de estos resultados puede concluirse que las células K562 y Kv562 sintetizan AH para impedir la inducción de senescencia y resistir a la quimioterapia. Además, los oAH y la 4MU sensibilizaron a las células al efecto de Imatinib y de VCR sugiriendo un posible uso como co-adjuvantes para el tratamiento de leucemias que resisten a la terapia convencional.

Descripción: Este trabajo propone que el estudio del cáncer de mama basándonos solamente en las células tumorales es insuficiente ya que su microambiente debe ser considerado. Fue así que demostramos que el microambiente hematopoyético de médula ósea, en particular las células madre mesenquimales, de pacientes con cáncer de mama avanzado favorece la formación de un nicho pre?metastásico propicio para la futura evolución de la cascada metastásica ósea. Creemos que nuestros resultados podrían ser útiles en el diseño de innovadoras terapias que intenten prevenir o retrasar la aparición de metástasis óseas, así como en la identificación de nuevos indicadores de metástasis óseas en estas pacientes. Por otro lado, estudiamos el valor pronóstico del microambiente tumoral y de las células tumorales del tumor primario de pacientes con cáncer de mama temprano. Fue así que encontramos que la expresión alta de CD105 en las células estromales fusiformes CD34 (?), no asociadas a la vasculatura, así como la expresión alta de TRAIL?R3 y de CCR?2 en las células tumorales son claros parámetros de pronóstico desfavorable para estas pacientes, en particular predictores del desarrollo metastásico; entre otros hallazgos. Estas herramientas podrían ser incorporadas en la rutina clínico?patológica ya que son altamente accesibles, sencillas y no invasivas.

Descripción: El síndrome metabólico(SM), definido según la ATP III, afecta a más del 20% de la población mundial. Se considera a la insulino resistencia (IR) el componente patogénico fundamental. Interviene un desbalance del Sistema Nervioso Autónomo, afectado por factores ambientales y cambios del estilo de vida. El páncreas, a través del eje endocrino-exocrino, actúa en el proceso digestivo de todos los nutrientes, y regula la homeostasis de la glucosa. Se estudió, en pacientes con SM, la importancia de la PTOG ampliada, como herramienta para su diagnostico y tratamiento. La alteración exocrina producida en la IR, a consecuencia de la interacción del eje endocrino-exocrino, se evaluó con la Prueba del Pancreolauryl. Se estudió en un modelo animal de SM, que la esplacnicectomia (interrupción del circuito vago-central-esplácnico) mejora la IR característica. Postulamos que la esplacnicectomia, corta un freno modulador del tono colinérgico hepático; incrementa la liberación del Hepatic Insulin Sensitizing Substance (HISS), potencial hormona que actúa sinergicamente con la insulina en músculo esquelético, corazón y riñones, aumentando la disponibilidad de glucosa en el tejido. Mejora la respuesta fisiopatológica del páncreas endocrino y exocrino. Puede llegar a ser una herramienta terapéutica útil para el tratamiento de estas patologías en humanos.

Descripción: Las proteínas de membrana son esenciales para la regulación de la composición del medio celular, el potencial de membrana, el metabolismo y las vías de señalización. Por su ubicación son consideradas la puerta de ingreso a la célula y el blanco de muchas drogas, ya que más de la mitad de las moléculas terapéuticas pequeñas están dirigidas contra proteínas asociadas a la membrana. Sin embargo, existen escasas estructuras tridimensionales de dichas proteínas debido a las dificultades inherentes a su expresión, extracción, purificación y a la obtención de muestras abundantes y homogéneas que permitan su estudio cristalográfico. Dada su relevancia fisiopatológica y farmacológica, ha sido de especial interés desarrollar diferentes estrategias con el fin de obtener la información necesaria para resolver los distintos aspectos del complejo entramado entorno-estructura-función. La bomba de calcio de la membrana plasmática (PMCA) pertenece a la superfamilia de las P-ATPasas; está presente en la membrana plasmática de todas las células eucariotas y es uno de los sistemas que participa en la remoción del Ca2+ citosólico transportándolo hacia el medio extracelular. A diferencia de los intercambiadores Na+/Ca2+ (NCX) y Na+/Ca2+-K+ (NCKX), que también remueven el Ca2+ citosólico, la PMCA es un sistema de alta afinidad y baja capacidad de transporte de Ca2+. La PMCA es regulada por calmodulina, fosfolípidos ácidos y ácidos grasos insaturados. Además, los fosfolípidos neutros como la fosfatidilcolina son esenciales para la actividad de la enzima. En el presente trabajo de Tesis, estudiamos la dependencia de la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA con la fracción molar de fosfolípidos. Para tal fin, reconstituimos a la PMCA en micelas mixtas con diferentes proporciones de detergente/fosfatidilcolina y a su vez, diferentes largos de cadenas carbonadas de fosfatidilcolina. Los sistemas micelares mixtos se han utilizado ampliamente para el estudio de la interacción de las proteínas integrales de membrana con su entorno hidrofóbico. En particular, se ha aceptado el uso de este tipo de sistemas para el estudio de la PMCA ya que la misma preserva las características bioquímicas presentes en su entorno nativo. Hemos caracterizado la transición micela-vesícula de los diferentes sistemas de reconstitución utilizando para tal fin dos técnicas diferentes, la dispersión de luz estática (SLS) y la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). Además determinamos los niveles de intermediarios fosforilados de la PMCA que permitieron describir funcionalmente los efectos ejercidos no sólo por la fracción molar presente en la micela mixta sino también la acción de diferentes largos de cadena carbonada. Finalmente, realizamos simulaciones de dinámica molecular de un modelo de la PMCA insertado en bicapas de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de manera de explorar el efecto del grosor hidrofóbico del dominio transmembrana de la PMCA sobre la actividad ATPasa. Mediante estas estrategias experimentales demostramos que los fosfolípidos neutros modulan la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA, modificando el número de recambio de la enzima en función de la composición de la micela mixta y de las características de las moléculas de fosfatidilcolina. Los cambios biofísicos asociados con la transición micela-vesícula incrementan el tiempo de permanencia de la enzima en el intermediario fosforilado, siendo este paso el responsable de la disminución de la actividad enzimática. Las simulaciones de dinámica molecular permitieron demostrar que cuando la PMCA se encuentra inserta en bicapas de DOPC, existen residuos cargados incluidos en el centro hidrofóbico de dichas bicapas. De manera complementaria, en las bicapas de DMPC los requerimientos de la superficie proteica se satisfacen evitando el costo termodinámico de exponer residuos cargados en zonas hidrofóbicas. De acuerdo a los datos experimentales, sugerimos que el grosor hidrofóbico óptimo para la PMCA es cercano a 24 Å, en concordancia con la máxima actividad hallada en presencia de este fosfolípido de 14 átomos de carbono de su cadena hidrofóbica. Para estudiar la modulación de la PMCA por ácidos grasos insaturados, se desarrolló un análogo fotoactivable de ácido oleico (AS86). Esta molécula se une covalentemente a la PMCA y es desplazable por ácido oleico. En la presente tesis hemos sintetizado, purificado y caracterizado dicho análogo y comprobamos que el AS86 se comporta de manera análoga al ácido oleico, cuando interactúa medianteunión no-covalente, incrementando la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA en el rango de concentraciones en las que actúa el ácido oleico. En este mismo sentido, pudimos demostrar que el AS86 es capaz de interaccionar directamente con PMCA e inducir un cambio conformacional tal que sus segmentos transmembrana se encuentran menos expuestos al entorno lipídico. Esta última característica es compartida por todos los activadores de la PMCA estudiados, incluyendo el ácido oleico. Estas evidencias demuestran la gran similitud entre la sonda fotoactivable AS86 y el ácido oleico. A partir de allí, desarrollamos una estrategia experimental que involucra la fotomarcación de la PMCA con AS86 y un posterior análisis por espectrometría de masa de los fragmentos para hallar los posibles sitios de interacción de la enzima con los ácidos grasos insaturados. La estrategia adoptada se basó en unir covalentemente el AS86 a la PMCA, realizar la digestión del aducto con V8 proteasa, separar por SDS-PAGE los fragmentos y posteriormente digerir in-gel con tripsina y luego analizar los péptidos resultantes por espectrometría de masa. Los resultados aquí mostrados constituyen la primera evidencia de un análisis mediante MALDI TOF-TOF de fragmentos trípticos de la PMCA purificada de eritrocitos humanos. Proponemos una región para la interacción del AS86 con la PMCA (E812ASDIILTDDNFTSIVKAVMW832) que podría ser parte de un dominio donde interactúan varias moléculas de ácidos grasos para el transporte de calcio. En conclusión, en el presente trabajo hemos estudiado la regulación del transporte de calcio por fosfolípidos neutros y por ácidos grasos insaturados mediante el desarrollo de diferentes estrategias experimentales. Además hemos modelado la acción de estos lípidos sobre la estructura y la función de la PMCA.

Descripción: Los microorganismos del suelo cumplen un rol preponderante en los procesos ecosistémicos, estando afectados por las diferentes estrategias de manejo de cultivos aplicadas en la producción agrícola. Los efectos de la aplicación de fertilizantes e inoculantes formulados con bacterias promotoras del crecimiento vegetal en condiciones de campo sobre las comunidades microbianas nativas no son completamente conocidos. El objetivo general de este trabajo fue generar conocimiento sobre la ecología microbiana rizosférica y sobre las variables agronómicas de los cultivos de trigo y maíz cuando se aplican fertilizaciones químicas e inoculantes experimentales de Azospirillum brasilense en condiciones de campo. Para ello se llevaron a cabo experimentos independientes entre sí, en diferentes establecimientos productivos de la provincia de Buenos Aires y campañas agrícolas. Se determinaron parámetros agronómicos y microbiológicos. Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen un aporte significativo al conocimiento científico, con el objetivo de mejorar la respuesta a la inoculación en interacción con la fertilización, y para la caracterización del riesgo ambiental de ambas prácticas agronómicas. La información obtenida en el marco del presente tiene implicancias tanto académicas como productivas y ambientales, y resulta directamente transferible a asesores y productores agropecuarios, bajo el actual paradigma de una producción agrícola más sustentable.

Descripción: Se abordó el estudio bioquímico y molecular de Inquilinus limosus con muestras del ámbito hospitalario. Se observó la presencia de un clon con dos variantes de expresión en un paciente con fibrosis quística, crónicamente colonizado (2006-2013), con distinto nivel de producción de biofilm in vitro. Altas concentraciones de colistín y tobramicina promovieron la formación de un biofilm in vitro con alta viabilidad remanente. La combinación antimicrobiana IMI+CIP (0,25 y 1 ?g/ml) presentó sinergia antimicrobiana a 6 h de iniciado el ensayo para determinar la velocidad de muerte de I. limosus planctónico, sin recrecimiento a las 48h. Se describieron dos serino-ß-lactamasas tipo AmpC cromosómicas, INQ-1 e INQ-2, con diferentes afinidades por ß-lactámicos, sin genes reguladores y poco afectados por los inactivadores clásicos de serino-ß-lactamasas. La secuenciación genómica del 99,8 % de I. limosus MP06 permitió detectar la presencia de determinantes génicos de bombas de eflujo de resistencia a múltiples drogas (familia RND y superfamilia ABC) e hipotetizar su rol patogénico al encontrar determinantes génicos vinculados a la evasión del sistema inmune adaptativo y a la sobrevida intracelular. Este trabajo permitió caracterizar a I. limosus como patógeno oportunista emergente con estrategias que le permiten colonizar/infectar de forma recalcitrante al tratamiento antimicrobiano.

Descripción: La hipertensión arterial (HTA) es una patología de muy elevada incidencia a nivel mundial que se relaciona con muertes por eventos cardiovasculares. Un modelo de estudio consiste es el DOCA-Sal, que presenta incrementos en las endotelinas plasmáticas y centrales, así como en la actividad del sistema simpático. Recientemente demostramos que las ETs actuarían como neuromoduladores de neuronas catecolaminérgicas a nivel de los bulbos olfatorios (BO), hipotálamo anterior (HA), importante centro simpatoinhibitorio, e hipotálamo posterior (HP), conocida área simpatoexcitatoria. Hipotetizamos entonces que el sistema endotelinérgico endógeno central está involucrado en la hipertensión arterial del modelo DOCA-sal modulando la actividad catecolaminérgica. Para esto administramos centralmente un antagonista del receptor ET-A o un agonista ET-B, en animales normotensos e hipertensos, durante una hora luego de la cual fueron sacrificados. Observamos que ambas drogas disminuyeron la presión arterial, principalmente en hipertensos. Por otra parte, ambas drogas en animales hipertensos mostraron disminuir la actividad de la Tirosina Hidroxilasa (TH), enzima limitante en la biosíntesis catecolaminérgica, a nivel de los BOs y del HP. Resultados acordes se hallaron en la fosforilación, expresión proteica y de mensajero de la misma. Así, evidenciamos principalmente la importancia del sistema endotelinérgico endógeno central en el mantenimiento de la PA de ratas DOCA-Sal.

Descripción: Las enfermedades asociadas a biopelículas bacterianas representan el 80% de las infecciones en humanos. Las infecciones sobre dispositivos médicos implantados resultan un problema clínico de suma importancia, debiéndose la mayoría de ellas, a la formación de biopelículas sobre la superficie de los mismos y la consecuente infección de los tejidos circundantes. La resistencia bacteriana a diferentes antibióticos y la formación de biopelículas dificultan la erradicación de la infección por lo que han emergido otras alternativas terapéuticas como la fotoinactivación bacteriana (FIB). La FIB es un tratamiento donde se emplea una molécula fotosensibilizante (FS), que luego de ser irradiada con luz visible genera especies reactivas del oxígeno con el consecuente daño sobre los microorganismos a eliminar. En la actualidad, la búsqueda de nuevos FS es una prioridad creciente. Hemos diseñado una nueva porfirina sintética, 5,10,15,20-tetrakis porfirina (TAPP), que puede adquirir cargas positivas a pH fisiológico, favoreciendo así la interacción con las biomembranas. La irradiación de cultivos planctónicos de Staphylococcus aureus incubados con TAPP 2,5 ?M e irradiados con una fuente de luz blanca con una potencia de 180 J/cm2 indujo la erradicación completa de las bacterias. En cambio, para el tratamiento de biopelículas de S. aureus se requirieron concentraciones más altas de TAPP y mayores dosis lumínicas (TAPP 20 ?M y 180 J/cm2 se obtuvo una reducción de alrededor de 3 órdenes de magnitud de UFC/ml). Con el fin de determinar la eficacia de la FIB empleando TAPP en bacterias Gram negativas, se trataron cultivos planctónicos y biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Fueron necesarias concentraciones más elevadas de TAPP para lograr la fotosensibilización de bacterias planctónicas (reducción de 3 órdenes de magnitud de las UFC/ml empleando TAPP 20 ?M y 180 J/cm2). Por otro lado, altas concentraciones de TAPP no fueron tóxicas per se en las biopelículas de P. aeruginosa (TAPP 30 ?M yn180 J/cm2 se obtuvo una reducción de 3 órdenes de magnitud de las UFC/ml en biopelículas). Luego de demostrar que TAPP es un FS prometedor y eficiente, se evaluó esta terapia en un modelo de crecimiento de biopelículas crecidas sobre superficies de titanio de uso odontológico para implantes. Se estudiaron biopelículas de S. aureus, Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis crecidas sobre placas de titanio con distintos tratamientos que promueven su osteointegración. Con el fin de potenciar los efectos de la FIB, pre-tratamos las biopelículas con tratamiento fototérmico mediado por láser infrarrojo cercano de 980 nm. La FIB realizada a partir de TAPP a concentraciones entre 0,5 y 5 ?M resultó efectiva en la reducción de la viabilidad de las biopelículas de las tres especies estudiadas, reduciendo 2 órdenes de magnitud las UFC/ml en relación a los controles no tratados. El tratamiento previo con el láser de 980 nm, incrementó en un orden de magnitud el efecto bactericida de la FIB sobre las biopelículas. Por otro lado, se evaluó la respuesta a la FIB del ácido 5-aminolevulínico (ALA), precursor de la síntesis de porfirinas fotosensibilizantes, en cultivos planctónicos y en biopelículas de S.aureus, S. epidermidis, Escherichia coli y P. aeruginosa. Además, se cuantificó la cantidad y el tipo de porfirinas sintetizadas en los diferentes tratamientos por determinaciones fluorimétricas y por HPLC. La FIB de S. aureus empleando concentraciones entre 1 y 2 mM de ALA, indujo una reducción de 6 órdenes de magnitud de las UFC/ml en cultivo planctónico y 7 órdenes de magnitud de las UFC/ml de biopelículas empleando una dosis lumínica de 213 J/cm2. En el caso de S. epidermidis, se logró una reducción de 5 órdenes con una incubación de 3 h con ALA 1 mM y una dosis lumínica de 71 J/cm2 y con ALA 2 mM y una dosis lumínica de 213 J/cm2, en cultivos planctónicos y en biopelículas, respectivamente.nEn el caso de P. aeruginosa, mostró sensibilidad a ALA-FIB en el cultivo planctónico, reduciendo su viabilidad en 4 órdenes de magnitud a concentraciones altas de ALA (40 mM). En cambio E. coli, a pesar de presentar acumulación de porfirinas, no pudo ser fotoinactivada, cuestionando así el paradigma de que la falta de respuesta a la FIB en bacterias Gram negativas se debería a la escasa incorporación de FS en estas células. El análisis por HPLC de las porfirinas sintetizadas a partir ALA demostró que las mismas son dependientes de la concentración, el tiempo de incubación y la bacteria empleada. Estos perfiles cambian drásticamente con las condiciones de tratamiento y en consecuencia, se observan diferencias en la respuesta a la FIB. Por lo cual, concluimos que es de suma importancia la optimización de las variables en cada tratamiento. En conclusión, los resultados obtenidos indican que la FIB a partir de TAPP resultaría un tratamiento efectivo en la eliminación de bacterias formadoras de biopelículas sobre superficies de titanio empleadas en implantes de uso clínico, odontológico especialmente. El pre tratamiento fototérmico sensibilizaría las biopeliculas a los efectos de la FIB. Además, se ha demostrado la eficacia que posee el tratamiento, empleando ALA en cultivos planctónicos y biopelículas de bacterias Gram positivas y negativas. Por último, se ha concluido que la sensibilidad a este tratamiento está directamente relacionada con el patrón y la cantidad de porfirinas sintetizadas. La FIB tanto a partir de porfirinas sintéticas como endógenas, es un tratamiento prometedor para el control de infecciones bacterianas, especialmente por bacterias Gram positivas, mientras que es necesario mejorar la eficiencia sobre las Gram negativas.

Descripción: Los camélidos sudamericanos son un grupo de especies de interés ganadera milenaria, que durante los últimos años 20 años han recobrado relevancia comercial. No obstante el interés creciente en su cría y comercialización, existe un notorio déficit en el conocimiento básico acerca de cuestiones sanitarias, y en la disponibilidad de herramientas para el diagnóstico, seguimiento y relevamiento sanitario. Para contribuir al desarrollo de estas herramientas y para avanzar sobre el conocimiento del estatus sanitario de los camélidos sudamericanos, durante el trabajo de esta tesis doctoral se estudió la presencia de anticuerpos reactivos en muestras de suero de camélidos de diferentes regiones de Argentina, frente a distintos agentes microbianos que pudieran eventualmente causar alguna patología, vinculando estos resultados con los estudios microbiológicos directos correspondientes. Para abordar esta problemática, se eligieron microorganismos de relevancia sanitaria comprobada, microorganismos reportados en camélidos de otras partes del mundo y patógenos no descriptos para estas especies animales. La presencia de anticuerpos reactivos contra antígenos derivados de estos microorganismos se estudió por las técnicas de ELISA, Western Blot y técnicas derivadas. A su vez se estudió la presencia de los microorganismos por métodos de detección directos, que variaron según el microorganismo de interés. También se estudió la respuesta inmunoserológica artificial frente a la vacunación antirrábica con tres generaciones de vacunas, y se compararon los resultados de los ensayos serológicos desarrollados en esta tesis, con aquellos de una prueba de seroneutralización de la capacidad infectiva del virus vivo en ratones, a los efectos de predecir el estado de protección de un modo indirecto. En el marco de esta serie de experimentos, se definió la mejor estrategia de vacunación para las llamas, y de esta manera se arribó a una estrategia definida y probada de inmunoprofilaxis antirrábica. De la combinación de los estudios de prevalencia de anticuerpos, y de los protocolos de vacunación experimental, se derivaron las virtudes y los eventuales límites que puede ofrecer el análisis serológico de anticuerpos cuando se lo quiere emplear para predecir la exposición microbiana, o la respuesta protectora luego de la vacunación. Considerando las particularidades del sistema inmune de CS y los requisitos de los reactivos utilizados en ensayos serológicos, fue necesario desarrollar tecnologías de inmunodetección de isotipos de Ig de CS, así como también fue necesaria la adaptación de distintos protocolos de trabajo originalmente descriptos para otras especies. Por su parte, las tecnologías desarrolladas permitieron caracterizar las respuestas inmunes en términos de los isotipos de Ig de respuesta, lo que permite hacer contribuciones sustantivas al conocimiento inmunobiológico básico de la especie.

Descripción: Esta tesis de doctorado titulada "La literatura farmacéutica siríaca y árabe. Comparación de El Libro de las medicinas (siríaco) con recetas en la literatura farmacéutica árabe", identifica los paralelos literarios existentes entre dieciséis medicamentos idénticos o similares (en cuanto al nombre propio, indicaciones clínicas, composición cuali-cuantitativa, posología y vía de administración, farmacotecnia, conservación y referencias citadas) de los textos árabes medievales, y los del texto siríaco-arameo de un manuscrito medieval editado por Budge (1913), llamado El Libro de las medicinas. Además, indaga su origen en la medicina clásica de lengua griega y latín, y en la medicina antigua de Egipto y Mesopotamia. Todos estos medicamentos, simples o compuestos, fueron identificados por su taxonomía constitutiva. Mediante el análisis filológico de los medicamentos simples, demostramos en varios casos los préstamos del siríaco al árabe, o al menos su nombre vulgar anterior al período árabe islámico; de modo que, sumado a los paralelos literarios mencionados anteriormente, nos permitió demostrar que los cristianos de lengua siríaca-aramea fueron, al menos en los casos considerados, traductores de la medicina clásica más tempranos que los árabes musulmanes, como sostienen los académicos en estudios siríacos, bizantinos y árabes; y los especialistas en Historia de la Ciencia.

Descripción: En el sistema nervioso central (SNC) la Transferrina (Tf) y las Hormonas Tiroideas (HTs) favorecen la maduración de los oligodendrocitos (OLGs) y la mielinización. Resultados de nuestro laboratorio sugirieron que la Tf y las HTs, regularían en forma conjunta dichos procesos debido a que las HTs modulan la expresión de la Tf mientras que esta última tendría efecto sobre la expresión del receptor ? de las HTs (TR?). Para dilucidar este potencial mecanismo de interacción realizamos experimentos in vivo en los que evaluamos la influencia combinada de la Tf y las HTs sobre la mielinización así como sobre los receptores de las HTs (TRs). Posteriormente utilizamos células progenitoras neurales (CPNs) y analizamos la acción de ambos factores en forma conjunta o individualmente sobre la maduración oligodendroglial. Nuestros resultados in vivo, sugirieron que tanto la apoTransferrina (aTf) como las HTs ejercían efectos positivos individuales sobre la mielinización. Asimismo, las HTs regularon la expresión de la Tf durante las primeras dos semanas de vida y existó una interacción entre ambos factores a nivel de los TRs debido a que las HTs regularon la expresión del TR? mientras que la Tf reguló la expresión del TR?. Los experimentos in vitro revelaron que el silenciamiento de la expresión de la Tf condujo a una disminución de la maduración oligodendroglial. Bajo estas condiciones se observó una pérdida parcial de la capacidad de las HTs de favorecer la maduración oligodendroglial conjuntamente con la disminución de la expresión del TR?, efecto que se revierte por la adición de apoTf. La inhibición farmacológica del TR? también condujo a la disminución de la maduración oligodendroglial y además bloqueó parcialmente la capacidad de la aTf de promover la diferenciación de los OLGs. El tratamiento de las CPNs con HTs indujo la expresión del TR? y el incremento prematuro de la expresión de la Tf el cual es abolido por la inhibición del TR?. Estos hallazgos indicaron que las acciones combinadas de la Tf y las HTs son necesarias para que ocurran una adecuada maduración oligodendroglial y mielinización. Estos efectos serían consecuencia de la interacción entre los efectos de la Tf y las HTs que asegurarían la progresión del plan de maduración de los OLGs. En concordancia con la anterior hipótesis, nuestros resultados demostraron que las HTs son capaces de regular la expresión de la Tf, la que a su vez ejerció efectos positivos sobre la maduración oligodendroglial y aumentó la expresión del TR? conformando un circuito de retroalimentación, que sumado a los efectos de las HTs mediados por el TR? aseguraron que ocurra una adecuada maduración oligodendroglial.

Descripción: El Stroke, ataque cerebral o accidente cerebrovascular (AC) es la tercera causa demuerteen el mundo y se considera la primera causa de discapacidaden adultos. Hay dos tipos de AC: isquémicos y hemorrágicos, siendo la mayor parte de los AC de tipo isquémicos. En este trabajo de tesis se estudió la participación de los receptores de la inmunidad innata tipo Toll (Toll-like receptor, TLR) en la gliosis reactiva y en la conversión astroglial hacia el fenotipo proinflamatorio que induce neurodegeneración. Utilizando paradigmas de ganancia y pérdida de función in vitro e in vivopudimos establecer queTLR4 aumenta su expresión en células gliales (astrocitos y microglía) luego de inducida la isquemia cerebralin vivo en modelos experimentales en roedores o bien luego de una exposición a deprivación de oxígeno y glucosa in vitro. La sobreexpresión de TLR4 facilita la conversión de los astrocitos al fenotipo proinflamatorio que induce neurodegeneración cuando están disponibles los ligandos de TLR, siendo NF-?B el efector final de la vía. Nuestros experimentos mostraron que tanto un PAMP como el LPS o DAMP como la molécula HMGB-1, liberada de células en necrosis, actúan como activadores de esta señalización, aunque HMGB-1 muestra capacidad de activar otros receptores de patrones moleculares como TLR2 y RAGE y muestra cierta capacidad sinaptogénica sobre neuronas in vitro. Finalmente, la aplicación in vivo de un inhibidor químico de la activación deNF-?B, sulfasalazina, modula la gliosis reactiva, disminuye la neurodegeneración y altera la formación de la cicatriz glial en animales sometidos a isquemia cerebral experimental. En función de nuestros resultados proponemos que TLR4 participa en la conversión glial al fenotipo proinflamatorio-neurodegenerativo activando NF-?B. Esta cascada ofrece varios puntos de control que podrían ser explorados para el desarrollo de estrategias de reducción de la neuroinflamación luego de la isquemia cerebral.

Descripción: Las infecciones invasivas por Staphylococcus aureus constituyen un gran problema para la salud pública dado el incremento en la incidencia de aislamientos resistentes a la meticilina aún en individuos de la comunidad. El desarrollo de reemplazos de articulaciones ha sido sin duda uno de los grandes éxitos de la medicina del siglo XX. Sin embargo, a pesar del desarrollo de nuevas técnicas quirúrgicas, el implante de prótesis se asocia indefectiblemente a un alto riesgo de infecciones bacterianas. Entre las diferentes especies que pueden ocasionar infecciones asociadas a prótesis, S. aureus es uno de los patógenos de mayor importancia siendo el responsable de entre el 50 y el 70% de las osteomielitis en individuos adultos. Las infecciones osteoarticulares por S. aureus son muy difíciles de erradicar ya que la bacteria se vuelve refractaria al tratamiento con antibióticos independientemente de su patrón de susceptibilidad in vitro. Este hecho, sumado a la aparición de cepas resistentes a vancomicina hacen al tratamiento de las infecciones estafilocóccicas un verdadero desafío. En este contexto, el esclarecimiento de los mecanismos involucrados durante la interacción de S. aureus con células críticas en el metabolismo óseo que conducen al desarrollo de osteomielitis es sumamente necesario a fin de establecer tratamientos alternativos y/o complementarios a los actuales. En el presente proyecto de investigación se propuso estudiar el rol de la proteína A, una proteína altamente conservada y potente inductora de mediadores inflamatorios, en la patogénesis de la osteomielitis por S. aureus. Se determinó que la proteína A contribuye significativamente al proceso de osteoclastogénesis a través de la señalización mediada por el receptor de TNF-? tipo 1 (TNFR1) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Mientras que ambos receptores participan del proceso de diferenciación de osteoclastos, la señalización por TNFR1 resultó determinante para la función resortiva de los mismos. Mediante la utilización de modelos experimentales de osteomielitis se demostró que la proteína A posee un rol crítico en la activación temprana de osteoclastos y en la inducción de mediadores inflamatorios durante la infección in vivo por S. aureus. Se estableció asimismo, la importancia de la señalización por TNFR1 en el primado de osteoclastos durante la osteomielitis experimental. Más aún se demostró la participación de la proteína A en el desarrollo de daño óseo, evidenciado por alteraciones histopatológicas del tejido y por la inducción de cambios en la densidad mineral ósea volumétrica durante la infección in vivo por S. aureus. Finalmente, se estableció la potencialidad del uso de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la proteína A para bloquear la diferenciación de osteoclastos inducida durante los estadios iniciales de la infección y modular la producción de mediadores inflamatorios durante la infección in vivo por S. aureus. Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen un avance en el entendimiento de las bases moleculares de los mecanismos que desencadenan el daño óseo y la persistencia bacteriana durante la osteomielitis por S. aureus. Considerando el impacto que dicha enfermedad posee en la salud pública es sumamente necesario contar con estrategias terapéuticas alternativas a las actuales. En este sentido, el presente trabajo demuestra que la proteína A podría ser considerada como un potencial nuevo blanco terapéutico en el diseño de terapias complementarias a las convencionales para la prevención y tratamiento de la osteomielitis por S. aureus.