Descripción: Más del 90% de todas las enfermedades humanas son causadas por infecciones virales para la mayoría de las cuales no existen vacunas profilácticas. Para los Adenovirus (AdV), que producen infecciones agudas respiratorias y queratoconjuntivitis, entre otras, no existen antivirales específicos y la ribavirina se utiliza sólo en situaciones clínicas específicas. Otro virus de importancia clínica es el Herpes simplex tipo 1 (HSV-1), causante de infecciones oro-faciales, queratitis estromal y encefalitis. Si bien el tratamiento de elección para el HSV-1 es el aciclovir, presenta la limitación terapéutica de la aparición de cepas mutantes resistentes a dicho antiviral. Los azasteroides son análogos de esteroides para los que se han descripto interesantes propiedades biológicas, como anticancerígena, antifúngica y antibacteriana. Algunos análogos azasteroides evaluados en nuestro laboratorio presentan actividad antiviral de amplio espectro. Los objetivos del presente trabajo son evaluar la actividad antiviral de nuevos azasteroides frente a AdV y HSV-1, investigar la etapa del ciclo de multiplicación viral en la que actúan los compuestos activos y analizar su actividad inmunomoduladora/antiinflamatoria. Los azasteroides de la serie U-20 mostraron actividad antiviral frente a AdV y HSV-1. Dicha actividad inhibitoria no se debe a una acción virucida. Los compuestos no afectan la adsorción ni la internalización de las partículas virales, sino que estarían inhibiendo etapas tempranas y tardías de la multiplicación viral, incluyendo la síntesis de proteínas. Asimismo, el compuesto U20-1 es capaz de modular la secreción de citoquinas proinflamatorias. En conclusión, los nuevos azasteroides sintéticos analizados presentan una doble actividad como antivirales e inmunomoduladores, lo cual los hace candidatos ideales para tratar inmunopatologías de origen viral como la queartoconjuntivitis adenoviral y la queratitis estromal herpética.

Descripción: La rama celular de la inmunidad innata, compuesta por fagocitos mononucleares y células dendríticas, cumple un rol importante iniciando, orientando y modulando varios aspectos de la respuesta inmune adaptativa. Estas células, a pesar de su diversidad fenotípica, comparten funciones esenciales para el desarrollo de la respuesta inmune. El modelo de células expuestas a lipopolisacárido (LPS), macromolécula glicolipídica presente en la pared de bacterias Gram negativas, permite hacer inferencias sobre diferentes tipos de infermedades en las que la inflamación juega un rol fundamental. En este trabajo se analizaron datos provenientes de experimentos de microarreglos de ADN de monocitos, macrófagos y células dendríticas expuestas a LPS. Mediante análisis de clusterización y de enriquecimiento funcional se logró identificar un grupo de genes sobreexpresados en los tres tipos celulares, que contiene genes que pueden modular la inflamación a traves de la inhibición de la vía de NFkB y que a su vez pueden ser estimulados por calcitriol. Esto permitió esbozar un modelo de red de regulación génica que puede ayudar a entender la acción antiinflamatoria, una de las acciones no clásicas de este compuesto. Esto también abre la búsqueda de moléculas que puedan actuar como blancos terapéuticos para un gran expectro de enfermedades en las que la inflamación juega un rol importante en la fisiopatogenia.

Descripción: La inactivación del cromosoma X (XCI) es un proceso normal por el cual uno de los dos cromosomas X de las mujeres es inactivado, para compensar la dosis génica con los varones XY. Este proceso de XCI ocurre temprano en el desarrollo y la elección del cromosoma X a inactivar se produce al azar, generando hembras mosaico con un 50% de células con el cromosoma X paterno activo y el otro 50% con el X materno activo. La inactivación del cromosoma X sesgada es una marcada desviación del 50% y entre otras causas puede asociarse a mutaciones sobre el gen XIST (X-inactive specific transcript) responsable de la iniciación y el mantenimiento de la inactivación. En el centro de inactivación del cromosoma X (XIC), en Xq13, se han descripto genes asociados a ARNs no codificantes (ARNnc) involucrados en el proceso de XCI: XIST, JPX (just proximal to XIST) y FTX (five prime to XIST). La presencia de variantes tipo SNP (single nucleotide polymorphism) en los genes del XIC podrían modificar su nivel de expresión, su función e impactar el balance alélico conduciendo a la XCI sesgada. Se realizó un estudio molecular exploratorio de tipo Caso/Control (n=22) sobre la eventual asociación de variantes genéticas en los genes del XIC con el patrón de XCI, con 11 Casos con XCI sesgada extrema (XIP>90%) y 11 Controles con inactivación al azar (50%>XIP<55%). En el primer grupo, se incluyeron mujeres portadoras y no-portadoras, sintomáticas y no-sintomáticas de Hemofilia A (HA) y Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Se realizó un screening genético del XIST, JPX y FTX mediante la estrategia de CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) y secuenciación de Sanger, incluyendo las regiones con SNPs de frecuencias alélicas relevantes. El estudio de un total de 990 amplímeros analizados no mostró deleciones ni mutaciones nuevas, sino sólo 18 variantes alélicas en los 161 SNPs anotados en las bases de datos para los tres genes. Once de los 18 muestran ORs de riesgo (e.g., OR>2,0) indicativos de asociación con XCI sesgada aunque no significativa (p>0,05). En XIST, rs6527, rs16992443, rs16992436 y rs16992442 mostraron ORs en el rango 3-4; en FTX, rs174138, rs68124822, rs146632102 y rs187332478, ORs de 2-6 y en JPX, rs68178357, rs55824328 y rs67649459, ORs de 2-3. Los datos estadísticos junto a los estudios bio-informáticos asociados a modificación de los sitios exónicos enhancer de splicing (ESE) y predictores de sitios de splicing sobre los SNPs informativos no mostraron claros indicios de causalidad del fenotipo aunque la mayoría de ellos mapeaban en regiones conservadas filogenéticamente. Nuestros resultados, aunque no concluyentes, nos estimulan a ampliar las series de Casos y más aún de Controles para aumentar la consistencia estadística del estudio confirmando o desestimando las tendencias observadas. Asimismo, la ausencia de SNPs heterocigotas en algunas regiones del XIC en ciertos Casos nos sugiere la posible asociación con deleciones que podrían asociarse a la abolición de la función de la XCI en cis del X afectado.

Descripción: La Enfermedad de Atesoramiento del Glucógeno tipo IX (EAG-IX) es causada por un defecto genético en una de las subunidades de la fosforilasa-b-quinasa (PHK) codificadas por los genes PHKA2, PHKB y PHKG2. La deficiencia de PHK ligada al cromosoma X (EAG-IXa), gen involucrado PHKA2, presenta dos variantes enzimáticas XLG1 (disminuida en hígado y eritrocitos) y XLG2 (sólo disminuida en hígado). Las deficiencias de PHK y fosforilasa hepáticas, conforman los Defectos del Sistema de la Fosforilasa (DSF), conduciendo a las denominadas EAG-IX y EAG-VI, respectivamente. La fosforilasa hepática es codificada por el gen PYGL. En el presente trabajo, inicialmente, se planteó la estandarización del diagnóstico molecular de la EAG-IX ligada al cromosoma X (gen PHKA2), sin embargo teniendo en cuenta los aspectos clínicos y bioquímicos de las EAG-IXa y EAG-VI, indistinguibles en la primera infancia, se extendió nuestro estudio al gen PYGL. Este trabajo propone definir nosológicamente los DSF mediante la consideración del sexo del paciente, actividad PHK en eritrocitos y análisis molecular del gen PHKA2 y gen PYGL. Se estudiaron 2 varones y 3 mujeres de 4 familias no emparentadas. La actividad PHK en eritrocitos de los individuos disponibles, resultó deficiente en 1 de los 2 pacientes varones, valores normales en 2 de las 3 probandos de sexo femenino y no se efectuó el ensayo enzimático en los 2 pacientes restantes (hermanos mellizos de diferente género). Se diseñó un algoritmo para el estudio de los genes involucrados en los DSF teniendo en cuenta genero de los pacientes y actividad PHK eritrocitaria. El estudio del gen PHKA2 en 1 de los pacientes de sexo masculino definió su condición de hemicigota mutado encontrándose un cambio en el sitio aceptor de ?splicing? en posición -1 del intrón 10 (c.1042-1G>A) llegando al diagnóstico definitivo EAG-IX ligada al cromosoma X con variante XLG1. El análisis del gen PYGL, identificó cuatro sustituciones y un polimorfismo: p.Gly233Ser, p.Gly686Arg, p.Met1Lys, p.Glu673Lys y IVS15-2delA, respectivamente. La frecuencia alélica de todas las variaciones génicas detectadas en el gen PYGL resultó del 50% para p.Gly686Arg que estuvo presente en 3 de los 6 alelos estudiados y del 16,6% para los restantes cambios encontrados en este gen en los pacientes investigados en nuestro centro. Se estima que esta investigación es el inicio en un área del conocimiento previamente no abordado en nuestro país que permitió definir pacientes con EAG IX y EAG VI demostrando que el análisis genético representa un procedimiento útil para establecer un diagnóstico certero.

Descripción: Se realizó un análisis de datos de sobre-expresión diferencial genómica del organismo Mycobacterium Tuberculosis (Mt), cepa H37Rv, en ensayos in-vitro en condiciones de estrés simulando el estado de latencia del bacilo en el huésped. Este análisis se combinó con información de diferentes bases de datos bioinformáticas de dominio público a través de una nueva herramienta en desarrollo denominada Tuberquery. Esta herramienta permitió identificar una serie de Open Reading Frames (ORFs) con una determinada homología de secuencia de Protein Families (PFAM) que tienen al menos una estructura molecular detallada en el Protein Data Bank (PDB). Posteriormente se consideró información metabólica y de esencialidad para clasificar los candidatos líderes obtenidos. Finalmente, se propone la continuación de este trabajo con investigaciones de drogabilidad, off-targeting, y virtual screening necesarios para estimar la potencialidad farmacológica de los candidatos líderes obtenidos. Se plantea el beneficio de utilizar herramientas bioinformáticas para la búsqueda de nuevos objetivos moleculares como una alternativa para optimizar recursos en el comienzo del proceso racional de descubrimiento de drogas.

Descripción: Caracterización de la evolución del virus de la Hepatitis C en la recurrencia postrasplante Introducción Se estima que en el mundo hay 170 millones de individuos infectados crónicamente por el virus de la hepatitis C (HCV). El trasplante hepático constituye la opción terapéutica de elección para aquellos pacientes que han llegado a estadios terminales de cirrosis o que han desarrollado hepatocarcinoma. En la actualidad la infección por HCV constituye la causa más frecuente para la indicación de trasplante. La recurrencia postrasplante de la infección viral es prácticamente universal; ocurre en forma inmediata tras la cirugía y se asocia con incrementos significativos de la viremia. Sin embargo, la severidad de la recurrencia es variable. Han sido descriptos diferentes factores virales y del hospedador que pueden influir en la severidad de la recurrencia; sin embargo, no existe evidencia concluyente sobre la importancia de cada uno de ellos. Objjettiivo Caracterizar la implicancia del trasplante hepático en la evolución viral de diferentes regiones del HCV y correlacionar la evolución viral con la severidad de la recurrencia. Paciienttes y méttodos Se caracterizó, mediante técnica de secuenciación y análisis filogenético, la evolución de las regiones NS5B, E2 y Core en nueve pacientes infectados crónicamente con HCV (5 de ellos coinfectados con HIV) sometidos a trasplante hepático. Se analizaron 31 muestras de plasma (1 a 2 muestras previas al trasplante y 1 a 3 muestras posteriores al trasplante). Las muestras analizadas abarcaron un periodo de tiempo de 19,4?10,5 meses. La recurrencia de la infección fue severa en 5 casos, moderada en los restantes 4 pacientes y ocurrió a los 4,74?4,87 meses postrasplante. En dos casos se analizó, mediante técnica de clonado y secuenciación, las poblaciones presentes previas y posteriores al trasplante. Resullttados La distribución de subgenotipos en la cohorte analizada fue: sg1a 33.3% (n=3), sg1b 44.4% (n=4), sg3a 22.2% (n=2). El número de sustituciones en las regiones NS5b, E2 y Core durante el seguimiento de los pacientes fue 2,56±3,05, 15,67±17,25 y 3,71±2,21 sustituciones/paciente respectivamente. Asimismo, la relación entre sustituciones sinónimas y no sinónimas en las regiones NS5B, E2 y Core fue 0,09±0,25, 0,92±0,83 y 1,17±1,47 respectivamente. En la región E2 se observó una correlación entre el número de sustituciones y el periodo de tiempos entre las muestras analizadas, coherente con un patrón de sustituciones secuencial y acumulativo. 2 Las poblaciones virales pre y postrasplante, caracterizadas en dos pacientes, mostraron un patrón evolutivo diferente. En un caso, no se observaron diferencias significativas en la diversidad y complejidad, lo cual sugiere que el trasplante no afectaría la evolución viral. Mientras que, en el otro caso se verificó un efecto de ?cuello de botella?, en el cual las poblaciones postrasplante presentaron una diversidad y complejidad menor que la observada en la muestra pretrasplante. Diiscusiión La distribución de subgenotipos en la cohorte estudiada fue análoga a la descripta en la población general, lo cual sugiere que no habría una implicancia determinante del subgenotipo que conlleve a la necesidad de someterse a un trasplante. La caracterización de la evolución viral en el contexto del trasplante hepático proporciona un paradigma fascinante para explorar las complejas presiones de selección que subyacen a la interacción virus-hospedador. Las regiones caracterizadas presentaron diferentes grados de variabilidad nucleotídica (E2>Core~NS5B), lo cual se correlaciona con el papel biológico que cada una de las proteínas desempeña en la biología del virus. La región NS5B presentó un elevado grado de conservación probablemente asociado a la restricción funcional de la actividad enzimática de la proteína. La evolución de la región E2 presentó un patrón de sustituciones secuencial y acumulativo en función del tiempo, compatible con la selección y el escape de la respuesta inmune, lo que refleja un constante mecanismo de adaptación del virus a la presión ejercida por el hospedador. Finalmente, el patrón de evolución de la región Core sugiere una compleja interacción finamente equilibrada entre la selección negativa debida a sus características funcionales y la selección positiva debida a sus propiedades antigénicas. Las secuencias nucleotídicas de las diferentes regiones de cada paciente, excepto en un caso, formaron clados con alto valor de soporte estadístico, sugiriendo que el trasplante no significó en la mayoría de los casos, un evento de presión selectiva positiva que implicara un cambio en la cuasiespecie predominante previo al trasplante, de modo tal de modificar significativamente la secuencia consenso. Sin embargo, en el análisis filogenético de la región E2, en tres de los siete pacientes en los cuales se analizaron más de 2 muestras, se observaron agrupamiento internos con valores significativos de soporte de la topología en los cuales se hallaban separadas las secuencias pretrasplante de las postrasplante. Este 3 resultado sugiere que el trasplante podría implicar la selección de una población minoritaria con mayor adaptación al escenario postrasplante. La caracterización de las poblaciones virales pre y postrasplante, realizada en dos pacientes, mostró diferentes patrones de evolución. En un caso, no se observaron diferencias significativas en la diversidad y complejidad, lo cual sugiere que el trasplante no afectó la evolución viral. Mientras que en el otro caso se verificó un efecto de ?cuello de botella?, en el cual las poblaciones postrasplante presentaron una diversidad y complejidad menor que la observada en la muestra pretrasplante. La implicancia del trasplante hepático en la evolución del HCV es motivo de controversia. Algunos estudios sugieren que luego del trasplante, en ausencia de la presión inmune efectiva debido a la inmunosupresión, la población viral se vuelve más homogénea. Señalando que la diversidad viral pretrasplante se reduce como consecuencia del "cuello de botella" que implica el trasplante, resultando en una presión selectiva de la variante viral que mejor se adapta al escenario postrasplante. Contrariamente al escenario de "cuello de botella", otros estudios han descripto que múltiples linajes del HCV se transmiten en el momento del trasplante, sin una disminución importante en la diversidad genética viral. La recurrencia postrasplante de la infección por HCV es prácticamente universal ya que sucede en la amplia mayoría de los pacientes. Sin embargo, en este estudio no se observó que la severidad de la recurrencia de la infección se asociara en forma particular a un subgenotipo viral y/o a la coinfección con HIV. Este resultado sugiere que la recurrencia de la infección es un evento multifactorial en el cual además de los factores virales, probablemente participan factores del hospedador como la edad, la etnia y el estado inmunológico del paciente.

Descripción: El presente estudio consistió en la detección y caracterización de genes de resistencia a ?-lactámicos y a quinolonas de codificación plasmídica en un total de 101 enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación aisladas de muestras clínicas en centros de salud de la ciudad de Cochabamba-Bolivia, en el periodo de Diciembre 2012 a Marzo 2013. Las ?-lactamasas de espectro extendido detectadas fueron en su totalidad de tipo CTX-M, de las cuales 89 correspondieron a CTX-M-grupo-1, 10 a CTX-M-grupo-9, 1 a CTX-M-grupo-2 y 1 aislamiento mostró la presencia simultánea de CTX-M-grupo-1 y CTX-M-grupo-9. Además, un 71% de los aislamientos mostró la presencia de blaoxa-1. Resultó frecuente la presencia simultánea de mecanismos que confieren resistencia a ambas familias de antibióticos siendo el 93% de las enterobacterias estudiadas resistentes a quinolonas. Se realizó la identificación de genes de resistencia plasmídica a quinolonas (PMQR). La variante enzimática aac(6?)-Ib-cr fue detectada en un 83% de los aislamientos siendo el mecanismo PMQR más prevalente. También se encontraron 6 aislamientos portadores de genes qnr que correspondieron a los alelos qnrB1 (5) y qnrB19 (1). El gen que codifica para la bomba de eflujo qepA1 fue identificado en 6 E. coli. Los genes que codifican OqxAB, otra bomba de eflujo, se detectó en un aislamiento de E. coli. Este trabajo constituye el primer reporte de marcadores de resistencia a ?-lactámicos y quinolonas en la ciudad de Cochabamba-Bolivia. Este estudio representa el primer reporte de qepA1, qnrB1, qnrB19 y aac(6?)-Ib-cr en esta 4 ciudad de Bolivia, mientras que la detección de oqxAB corresponde al primer reporte en dicho país y a uno de los primeros reportes en Latinoamérica .

Descripción: Según datos publicados por el C.D.C. ocurren en EEUU 90.0000 muertes por año debidas a infecciones intrahospitalarias. En los últimos años se habla de evolución moderna, donde no sólo entran en juego las mutaciones como importante mecanismo genético para evolucionar y hacer a las bacterias resistentes a los antimicrobianos, sino que además se han puesto en evidencia otros mecanismos como la Transferencia Horizontal Genética (THG), el cual es un mecanismo complejo, multifactorial, e importante en la evolución de distintos organismos. La resistencia a los antimicrobianos es el mejor ejemplo del proceso de presión-selección y adaptación genómica y fenotípica basada en la THG, ya que aproximadamente el 80% de las resistencias son debidas a este mecanismo. Hacia 1980, se observaron elementos genéticos asociados a la adquisición y pérdida de genes, los que fueron identificados como integrones. La definición actual de integrón define al integrón como un elemento que contiene los determinantes genéticos para mediar la recombinación sitio-específica, siendo capaz de reconocer y capturar genes cassettes móviles, muchos de los cuales codifican determinantes de resistencia a antibióticos. Nuestro objetivo es conocer la frecuencia de integrones de clase 1 y los arreglos de genes cassettes en P. mirabilis así como también la evolución, a lo largo de 15 años en una colección de cepas no relacionadas epidemiológicamente que presentan al menos resistencia a dos familias de antimicrobianos. Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 3 Se realizó el estudio en 35 aislamientos no relacionados epidemiológicamente de P. mirabilis provenientes de cinco nosocomios de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de la Provincia de Buenos Aires, aislados entre los años 1993-2008. El criterio de selección utilizado fue que los aislamientos debían ser resistentes al menos a dos familias de antimicrobianos. Se determinó la susceptibilidad de los aislamientos en estudio a once antimicrobianos de relevancia clínica por el método de difusión en agar de acuerdo a las guías del National Committee for Clinical Laboratory Standars (CLSI, 2013). Para realizar la caracterización de los integrones de clase 1 se llevó a cabo cartografía por PCR, utilizando distintas combinaciones de cebadores a fin de caracterizar la estructura y el contenido de genes cassettes en la zona variable. El 91,43% de los aislamientos fue resistente a ampicilina. La resistencia a ceftazidima, cefotaxima y cefepime se evidenció en el 48,57% del total de los aislamientos, los cuales todos presentaban fenotipo de ?-lactamasa de espectro extendido (BLEE) tipo CTX-M-2. El 100% de los aislamientos fueron sensibles a carbapenemes. El 31,43% de los aislamientos fue resistente a gentamicina, mientras que el 17,14% presentó sensibilidad intermedia. La resistencia a amikacina se manifestó en el 91,43% de los aislamientos, el 2,86% presentó sensibilidad intermedia. La resistencia a ciprofloxacina y ácido nalidíxico en los aislamientos estudiados fue de 54,29% y 62,86%, respectivamente. El porcentaje de resistencia a trimetoprima/sulfametoxazol de los mismos fue de 91,43%. Se encontró integrones de clase 1 en 35/35 (100%) de los aislamientos, y se detectó a ISCR1 en 17/35 (48,57%) de los mismos. Se encontraron en total 64 integrones de clase 1 en los 35 aislamientos, entre los que se distinguieron 12 arreglos de genes cassettes diferentes en su zona variable, que incluyen la combinación de 9 genes cassettes, 8 de los Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 4 cuales corresponden a genes de resistencia a antimicrobianos. El arreglo de genes cassettes más frecuente en los 35 aislamientos evaluados fue aac(6?)-Ib- blaOXA-2-orfD, tanto en los integrones clase 1 complejos y no complejos, correspondiente a In35. Al relacionar los arreglos de genes cassettes de los integrones de clase 1 con los resultados de sensibilidad a los antimicrobianos ensayados, se observa que todos los aislamientos resistentes a ceftazidima, cefotaxima y cefepime 17/35 (48,57%), tienen integrones de clase 1 complejos que albergan a ISCR1 con el gen blaCTX?M-2 en la VR-2. Al realizar un estudio bioinformático, observamos que en un período de 20 años (1993-2013) se publicaron 30 aislamientos de P. mirabilis con integrones de clase 1 en la base de datos INTEGRALL, dentro de los cuales 3 son integrones de clase 1 complejos. Estos integrones se encuentran formando parte de otras estructuras como islas genómicas, plásmidos y transposones. En ellos se encontraron 34 integrones de clase 1, con 27 arreglos de genes cassettes diferentes en su zona variable, que incluyen la combinación de 29 genes cassettes, de los cuales 25 corresponden a genes de resistencia a antimicrobianos. Se encontró en esta colección de P mirabilis provenientes de aislamientos clínicos una elevada frecuencia de integrones de clase 1 35/35 (100%) y se detectó a ISCR1, en 17/35 (48,57%) de los mismos. Dentro de los integrones de clase 1 complejos, In35::ISCR1:: blaCTX?M-2 fue el más frecuente. En los aislamientos estudiados correspondientes al período 1993-2008 aunque la cantidad de integrones por cepa no aumenta a lo largo del tiempo con respecto a los primeros aislamientos, se observa una tendencia a aumentar el número de familias de antimicrobianos a los que estos aislamientos presentan resistencia. Además, el número de Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 5 familias de antimicrobianos a los que cada cepa es resistente depende de los genes cassettes que conforman la estructura del integrón más que del número de integrones contenidos en la cepa. Nuestros resultados muestran una vez más que la THG, y junto a ella, la resistencia a múltiples familias de antimicrobianos ya no es patrimonio de ciertas cepas en particular

Descripción: El melanoma cutáneo (MC) es el cáncer de piel con mayor incremento en su incidencia. Presenta alta tasa de mutaciones, siendo la más relevante la mutación nucleotídica T1799A, sustitución aminoacídica (V600E) en el oncogén BRAF. La proteína serina-treonina quinasa BRAFV600E es una variante constitutivamente activa asociada a la proliferación celular por la vía MAPK. Entre las líneas celulares de MC establecidas en nuestro laboratorio hay variantes BRAFV600E (8/16), BRAFV600K (4/16) y BRAFWT (4/16); presentando las líneas BRAFV600E mayor índice proliferativo y clonogénico in vitro. Trabajos recientes en pacientes con metástasis regionales de MC (estadio III AJCC) reportaron una correlación entre la presencia de BRAFV600 mutado y un peor pronóstico. Este trabajo de investigación tiene el objetivo de determinar la prevalencia del status mutacional del oncogén BRAFV600 en biopsias tumorales en una población de pacientes con MC en diferentes estadios clínico (II, III, IV), procedentes del Instituto Alexander Fleming (n=44), y su posible relación con otros parámetros clínico-patológicos. Para ello, se estableció una metodología de trabajo; desde la extracción de ADN tumoral a partir de biopsias fijadas en formol y embebidas en parafina; hasta la amplificación de la región de interés y posterior análisis de su secuencia por el método de Sanger. Luego se determinó el status mutacional de BRAF en cada biopsia, y su relación con las características clínico-patológicas del tumor. La población de pacientes con MC analizada presentó una frecuencia del oncogén BRAFV600 mutado del 77%, mayor a lo reportado en bibliografía que oscila en un rango de 17-72%. De los pacientes con tumores BRAFV600 mutado, se observó una prevalencia de la mutación BRAFV600E (98%), seguida de BRAFV600K (2%). Los resultados obtenidos en la población del estudio, indican que el status mutacional del oncogén BRAF presenta una asociación con parámetros clínico-patológicos relacionados a la progresión tumoral, como el índice de Breslow mayor a 2mm en tumores primarios (p=0,012), la presencia de metástasis en ganglios linfáticos (p = 0,0036) y el índice proliferativo de los tumores metastásicos (p = 0,0353). No se encontraron asociaciones significativas con otras características clínico-patológicas ni con la evolución clínica en la población de estudio. Los resultados obtenidos abren la posibilidad de considerar el status mutacional del oncogén BRAF como factor pronóstico, con el fin de mejorar la estadificación del MC.

Descripción: Durante el proceso de N-glicosilación de proteínas el complejo oligosacariltransferasa (OST) en la membrana del retículo endoplasmático (RE) transfiere Glc3Man9GlcNAc2 desde el dolicol-PP al residuo Asn de la secuencia Asn-X-Ser/Thr de las proteínas que se están translocando al interior del RE. La adición de un glicano hidrofílico voluminoso mejora la eficiencia del plegamiento de proteínas, ya que reduce la agregación de intermediarios de plegamiento. Los defectos en la reacción de transferencia de glicanos debidos a mutaciones en la OST o a la formación de estructuras de glicanos truncadas sobre el Dol-PP pueden resultar en la hipoglicosilación de proteínas (sitios de N-glicosilación que normalmente están ocupadas con un glicano están vacíos). Esto provoca defectos generales en el plegamiento de glicoproteínas y las enfermedades humanas conocidas como trastornos congénitos de la glicosilación tipo I (CDG I). Se ha demostrado recientemente que una variante de GFP en la que se introdujo un sitio de N-glicosilación (GlyGFP) pierde su fluorescencia cuando dicho sitio está ocupado por un glicano. Hemos expresado GFP y la variante GlyGFP fusionadas en el N-terminal a un de Péptido Señal de S. pombe y en el C-terminal a una señal de retención RE tanto en una cepa de S. pombe salvaje como en una mutante ?alg6, en la que se produce hipoglicosilación de glicoproteínas. Nuestros resultados mostraron que mientras que la ER-GFP emite fluorescencia de en el ER de ambas cepas, ER-GlyGFP sólo emite fluorescencia en el ER de la mutante ?alg6, lo que indica que la intensidad de fluorescencia de esta construcción se puede utilizar para probar la hipoglicosilación de proteínas in vivo en S. pombe.

Descripción: Histoplasma capsulatum var. capsulatum, es el agente etiológico de la histoplasmosis (HP), una enfermedad subaguda o crónica, endémica en Argentina. Los objetivos de este trabajo fueron: (i) desarrollar una PCR en tiempo real para amplificar un fragmento del ITS1 (internal transcribed spacer) específico de H. capsulatum, (ii) evaluar su utilidad para el diagnóstico de HP en muestras de sangre, y (iii) comparar los parámetros de valoración de la PCR en tiempo real con los de una PCR anidada (gen HcP100 específico de H. capsulatum), utilizada en nuestro laboratorio para diagnóstico de HP. Se definió como caso de HP al paciente que tuvo un cultivo positivo y/o una serología positiva para H. capsulatum, o hallazgos histopatológicos (levaduras intracelulares y granuloma) consistentes con la presencia del hongo. La técnica de PCR en tiempo real se estandarizó con un sistema TaqMan? utilizando como blanco un fragmento del ITS1 específico de H. capsulatum. Se calculó el límite de detección utilizando diferentes concentraciones de muestras de ADN de H. capsultum y la especificidad frente a ADNs de especies fúngicas diferentes de H. capsulatum y de varias micobacterias. El límite de detección de la prueba fue 50 fg y la especificidad analítica 98,11%. Se analizaron muestras clínicas (sangre y otros materiales) obtenidas de 176 pacientes entre enero de 2010 y diciembre de 2013: 85 pacientes tenían HP y 91 tenían enfermedades que por sus características clínicas requerían un diagnóstico diferencial de HP. En 151 de estos pacientes (77 casos de HP y 74 sin HP) se analizó al menos una muestra de sangre, y en 25 pacientes se contó con otros materiales clínicos pero no con sangre (8 con HP y 17 sin HP). Para evaluar la sangre como muestra de elección en el diagnóstico de HP, se compararon los parámetros: sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN), en muestras de sangre versus todos los materiales clínicos disponibles del paciente (incluido sangre). Esta comparación mostró que la S diagnóstica de la PCR en tiempo real aumentó significativamente (de 71% a 84% p<0,05), así como el VPN (de 76% a 86% p<0,05), cuando se consideraron los resultados de todos los materiales clínicos disponibles. Por su parte la E y el VPP no mostraron diferencias significativas al analizar solamente sangre versus todos los materiales clínicos disponibles. La PCR en tiempo real resultó menos sensible (71% y 84% en sangre y todos los materiales clínicos disponibles, respectivamente) que la PCR anidada (84% y 94% en sangre y todos los materiales clínicos disponibles, respectivamente). Ambas PCRs fueron específicas (>91%) y presentaron VPP elevado (> 90%) independientemente de si se analizó solamente sangre o todos los materiales clínicos disponibles. Las técnicas de PCR son sensibles y específicas para detectar ADN de H. capsulatum en muestras clínicas con muy buenos valores predictivos para el diagnóstico de HP. Siempre que sea posible, se recomienda analizar, además de muestras de sangre, todas las muestras clínicas disponibles del paciente para aumentar la eficiencia del diagnóstico. Hasta el momento los resultados de PCR deben ser confirmados por técnicas microbiológicas que siguen siendo las definitivas para el diagnóstico de HP.

Descripción: Bacteroides fragilis es la especie del grupo Bacteroides fragilis que se asila con mayor frecuencia de especímenes clínicos, debido, en parte, a que es la especie más virulenta del grupo. La mayoría de los aislamientos de B. fragilis resultan resistentes a los antibióticos ?-lactámicos, excepto a los carbapenems, siendo el principal mecanismo de resistencia la producción de ?-lactamasas. En B. fragilis se han descripto 3 ?-lactamasas diferentes: - CepA, una cefalosporinasa endógena que le confiere resistencia a la mayoría de los antibióticos ?-lactámicos con excepción de las cefamicinas y carbapenems, y es inhibida por los inhibidores de ?-lactamasas. - CfxA la cual confiere resistencia a cefaloridina, cefoxitina y otros antibióticos ?-lactámicos excepto imipenem. Y una metalo-?-lactamasa CfiA con actividad frente a penicilinas, cefalosporinas, incluyendo las cefamicinas, y carbapenems. CfiA no es inhibida por el ácido clavulánico ni el sulbactam pero sí por EDTA y su actividad se recupera por el agregado de Zn2+. En nuestro país, la actividad de los antimicrobianos frente a los aislamientos del grupo Bacteroides fragilis se ha mantenido inalterable a lo largo de diferentes relevamientos efectuados. Sin embargo en un estudio de vigilancia llevado a cabo entre los años 2006 y el 2009, en 363 aislamientos clínicos de bacilos gram negativos anaerobios pertenecientes a este grupo, se detectaron 3 aislamientos con alto nivel de resistencia (CIM?32 ?g/ml) a los carbapenems. Este hallazgo constituyó el primer reporte en nuestro país en aislamientos de B. fragilis procedentes de materiales clínicos. En dichos aislamientos la presencia de una metalo-?-lactamasa fue sospechada a partir de ensayos de inhibición con EDTA El objetivo general de este trabajo fue analizar la presencia del marcador de resistencia cfiA en aislamientos de B. fragilis recuperados durante el estudio de vigilancia mencionado previamente, así como analizar el entorno genético de dicho marcador. Este es el primer estudio en Argentina donde se informan 7 aislamientos de B. fragilis portadores de cfiA. Tres de ellos correspondieron a los aislamientos que presentaban resistencia a carbapenemes (CIM?32 ?g/ml). En 2/3 se identificó al gen codificante de CfiA13 asociado a IS pertenecientes a la familia IS1380, grupo IS942. En el restante aislamiento resistente se identificó al gen codificante de CfiA4 asociado a una IS perteneciente a la familia IS21. En los 4 aislamientos sensibles a imipenem se identificaron las variantes CfiA 4, CfiA 2 y dos nuevas variantes, de CfiA4 y CfiA13. No se hallaron IS en la región upstream a los genes codificantes. Solo en el aislamiento que resultó intermedio para doripenem se identificaron las secuencias promotoras -10 y -35 en la región adyacente a cfiA2.

Descripción: Introducción: Las mutaciones de NPM1, CEBPA y FLT3 se encuentran en 25-n35% de las LMA de adultos. Estas mutaciones se correlacionan con el pronósticonde la enfermedad, especialmente en LMA con cariotipo normal (CN). Hay pocosninformes sobre la incidencia e importancia de estas mutaciones en LMA pediátricany no hay datos de Argentina.nObjetivo: Describir la incidencia de estas mutaciones y analizar el impacto clínicony pronóstico de las mutaciones en nuestra institución.nPacientes y Métodos: Se analizaron retrospectivamente muestras de 216 niñosncon LMA. La mediana de edad fue de 7,0 años, incluyendo 44 pacientesnmenores a un año. El 15% de los pacientes presentaron CN. La detección denmutaciones NPM1 y CEBPA fueron realizadas por Gene-Scanning; las mutacionesnFLT3-ITD y FLT3-TKD fueron estudiadas por RT-PCR y RFLP, respectivamente.nLos casos positivos se caracterizaron además por secuenciación.nResultados: La incidencia de las mutaciones estudiadas fueron: NPM1mut:4,2%,nCEBPAmut:1,9%, FLT3-ITD:10,2% y FLT3-TKD:7,9%. En LMA con CN fueron:nNPM1mut:24,2%,CEBPAmut:12,1%, FLT3-ITD:15,2% y FLT3-TKD:6,1%. La mediande edad fue:NPM1mut:13,4 años, CEBPAmut:11,6 años,FLT3-ITD:13,8 años y FLT3-nTKD: 8,0 años. NPM1 y CEBPA mostraron asociación significativa con CNn(p<0,00001, p=0,001, respectivamente), mientras que FLT3-ITDse asociónconPML/RARA (p<0,0001). Los subtipos FAB observados con mayor frecuencianfueron: NPM1mut:M2 (p=0,1322), CEBPAmut:M2 (p=0,0281), FLT3-ITD:M3n(p=0,0002) y FLT3-TKD:M5 (p=0,3258). Las edades de los pacientes connResumennPágina 2nNPM1mut, CEBPAmut y FLT3-ITD fueron significativamente mayores (p=0,0001,np=0,0368 y p<0,00001 respectivamente). FLT3-TKD fue la única mutaciónndetectada en 11,4% de los pacientes menores de 1 año.nLas probabilidades de sobrevida libre de eventos (pSLE) y error estándar (EE)nfueron: LMA Total:48,9(3,8)%, NPM1mut:75,0(15,3)%, CEBPAmut:75,0(21,7)%,nFLT3-ITD: 59,6(11,1)%, FLT3-TKD: 46,0(16,2)%y NPM1mut/CEBPAmut/FLT3-nITDneg:80,8(12,2)%(p=0,2002). Las pSLE (SE) de los pacientesnNPM1mut/CEBPAmut/FLT3-ITDneg con CN fue de 78,8(13,4)%(p=0,0593) y en elngrupo de riesgo alto fue de 80,8(12,3)% (p=0,0104).nConclusiones: Este es el primer reporte de las frecuencias de mutacionesnenNPM1, CEBPA y FLT3en LMA pediátrica en nuestro país. Las incidencias denNPM1mut y CEBPAmut fueron significativamente más altas en la LMA con cariotiponnormal. Nuestros datos confirman el pronóstico favorable de LMA con genotiposnNPM1mut/FLT3-ITDneg y/o CEBPAmut/FLT3-ITDneg, apoyando la postulación de estengrupo como un nuevo subtipo de LMA con mejor pronóstico.

Descripción: El trasplante renal es un procedimiento terapéutico que ha logrado prolongar la vida de los individuos con insuficiencia renal crónica. Sin embargo, aún hoy no es posible la sobrevida del injerto sin que el paciente deba ser sometido a un tratamiento inmunosupresor que altera la homeostasis del sistema inmune, poniendo en riesgo la vida del paciente. Es por esto que se requieren estrategias tendientes a evaluar el estado inmunológico del paciente. El objetivo de este trabajo fue estudiar la función de un inhibidor de serino proteasas denominado SLPI en los pacientes trasplantados renales, con la intención de determinar si este parámetro podría ser útil como indicador del estado inmunológico del paciente inmunosuprimido. Los resultados indicaron que los pacientes trasplantados renales presentan niveles elevados de SLPI sérico comparados con los individuos sanos. Sin embargo, estos niveles fueron menores comparados con los que se observan en los pacientes en el pre-trasplante. Por otro lado, el tratamiento inmunosupresor influye sobre los niveles de SLPI, ya que los pacientes tratados con micofenolato mofetil + esteroides + rapamicina presentan niveles superiores a los pacientes tratados con micofenolato mofetil + esteroides + tacrolimus. Como era de esperar, la capacidad proliferativa de los leucocitos mononucleraes en respuesta a mitógenos fue menor en los pacientes inmunosuprimidos con respecto a los individuos sanos. Sin embargo, el tratamiento de las células in vitro con SLPI, produjo una disminución de la proliferación celular inducida por un mitógeno, en ambos grupos de individuos (inmunosuprimidos y sanos). Llamativamente, aquellos individuos con mayores niveles de SLPI plasmático presentaron menores índices de proliferación celular, pero se correlacionaron con una menor función renal. En general estos resultados indican que el SLPI es un marcador de daño renal con capacidad inmunomoduladora. Su posible utilización como marcador del estado inmunosupresor deberá ser validado con un número mayor de individuos y probablemente dependerá del tratamiento inmunosupresor instaurado.

Descripción: Este trabajo se centró en la generación y caracterización de recubrimientos ultrafinos con capacidad autolimpiante. El objetivo general fue inmovilizar una enzima detergente típica en superficies modelo a través de un procedimiento que permitiera conservar la actividad enzimática. El sistema específico bajo investigación fue un recubrimiento de hidrogel capaz de unirse químicamente a la superficie y simultáneamente servir como vehículo para la enzima. El recubrimiento de hidrogel se preparó a partir de polímeros solubles en agua con un pequeño porcentaje de grupos fotorreactivos adecuados para reacciones de entrecruzamiento entre cadenas vecinas. Grupos similares en el recubrimiento proporcionan un anclaje para el establecimiento de enlaces covalentes con la enzima. La enzima amilasa fue elegida por su amplia disponibilidad y su capacidad de degradar hidratos de carbono. Los hidratos de carbono son moléculas típicamente presentes en muchas manchas de superficie y como resultado de la acción de la amilasa se producen moléculas más pequeñas y generalmente más solubles, de manera que una mancha que contiene estos componentes se elimina más fácilmente. La enzima fue incorporada en el recubrimiento de hidrogel por co-deposición mediante inmersión. Posteriormente, a través de la exposición a radiación UV se generó un entrecruzamiento que condujo al anclaje, no solo de la película a la superficie, sino también de la enzima a la película, a través de atrapamiento físico o anclaje químico. Estudios previos indicaron un anclaje insuficiente de las enzimas cuando el proceso se realizaba a través de esta técnica de co-deposición con inmersión, dado que la enzima era depositada a partir de soluciones buffer con altas cantidades de sal, que también se depositaba sobre la superficie. Este fenómeno impedía la incorporación de gran parte de la enzima al recubrimiento de hidrogel. Por esta razón la enzima se modificó con otro polímero hidrófilo, el polietilenglicol (PEG). Se unieron químicamente cadenas de PEG a la amilasa a través de un éster activo. Utilizando este procedimiento, la amilasa se solubilizó en etanol sin perder actividad. Se investigaron diversas técnicas de recubrimiento y se demostró que la utilización de la amilasa conjugada con PEG y la deposición a partir de etanol en ausencia de cualquier sal produjo recubrimientos con una distribución homogénea de la enzima y de características muy lisas, mientras que los recubrimientos generados con amilasa nativa depositada a partir de solución buffer salina dieron origen a recubrimientos muy ásperos y cubiertos con cristales de sal. Un análisis comparativo de la actividad enzimática, a través de mediciones colorimétricas, demostró que los recubrimientos tenían actividad enzimática, cualquiera fuera el procedimiento utilizado para su generación. Los recubrimientos preparados a partir de amilasa conjugada con PEG mostraron siempre mayor actividad que los preparados a partir de amilasa nativa y retuvieron mejor la actividad enzimática después de la exposición a radiación UV o calor. A través de una prueba de autolimpieza sencilla se demostró que los recubrimientos preparados a partir de amilasa nativa perdieron su propiedad autolimpiante, inicialmente buena, después de un primer enjuague. El uso repetido de dichos recubrimientos no fue posible. Los recubrimientos producidos con la amilasa conjugada con PEG también perdieron gran parte de su actividad autolimpiante inicial después del primer enjuague, pero fueron reutilizables. Se utilizó un ensayo de degradación del almidón en una muestra de mayonesa para estos estudios. El objetivo general del recubrimiento de hidrogel con enzimas unidas a superficie se cumplió exitosamente en este trabajo. Investigaciones futuras se deberán enfocar en el análisis de la influencia de las condiciones de deposición sobre la actividad de la enzima. Esas investigaciones deberían incluir una caracterización más profunda de la estructura del recubrimiento resultante. Este tipo de investigación podría conducir eventualmente a desarrollar superficies autolimpiantes estables en escalas de tiempo adecuadas para aplicaciones específicas, por ejemplo, en el entorno biomédico.

Descripción: Introducción. El embarazo es uno de los factores de riesgo para el desarrollo de una Candidiasis vulvovaginal (CVV) y su diagnostico y tratamiento permite prevenir posibles complicaciones gineco-obstetricas. La especie Candida albicans es la principal agente etiológico, sin embargo, las CVV debidas a Candida no- albicans se encuentran en paulatino ascenso y presentan una mayor resistencia a los antifúngicos. Por ello, es necesaria la identificación de los aislamientos de Candida y los métodos convencionales de diagnóstico microbiológico en algunas especies no son concluyentes. Objetivo. Informar sobre la frecuencia de las CVV y de la portación por especies de Candida en pacientes gestantes inmunocompetentes. Determinar la distribución y prevalencia de las distintas especies de levaduras aisladas en las pacientes con CVV y en la portación asintomática de estos microorganismos. Diferenciar mediante técnicas moleculares a las especies de los complejos C. albicans (C. albicans, C. dubliniensis y C. africana), C. parapsilosis y C. glabrata. Comparar las técnicas microbiológicas convencionales con las moleculares para su detección. Determinar la frecuencia de otros patógenos de riesgo obstétrico o causantes de vulovaginitis y conocer la posible asociación con las diferentes especies de Candida. Materiales y Métodos. Se analizaron 210 exudados vaginales obtenidos de gestantes inmunocompetentes y 64 secreciones vaginales de embarazadas que se encontraban entre las semanas 35 y 37 de gestación para la investigación de Streptococcus agalactiae y su asociación con especies de Candida. Para la identificación de levaduras se realizaron estudios microbiológicos convencionales ( estudio microscópico de la muestra, cultivos en medio CHROMagar Candida, producción de clamidoconidios en agar leche Tween 80 al 1 % y en medio de Staib, asimilación de azúcares, y método API ID 32C) y métodos moleculares (PCR a partir de las suspensiones de levaduras con primers específicos para: i) diferenciar entre C. albicans, C. dubliniensis y C. africana (gen actina y HWP1); ii) C. parapsilosis, C. orthopsilosis y C. metapsilosis (regiones ITS1-ITS2 del rDNA); y iii) C. glabrata, C. bracarensis y C. nivariensis (gen RLP31 que codifica para una proteína ribosomal de 60S). Se realizaron además estudios microbiológicos por métodos convencionales para la identificación de S. agalactiae, Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis. Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Trichomonas vaginalis, Se realizó el análisis estadístico de los resultados mediante estadísticas descriptivas y el test de Chi cuadrado. Programa GraphPad Prism (versión 6.0). Resultados: La prevalencia de CVV en las gestantes estudiadas fue del 25% (52/210). Se observó un incremento de los síntomas a medida que aumentaron las semanas de gestación, siendo mayor en el 2do y 3er trimestre del embarazo, probablemente secundario a la mayor colonización por Candida spp. La colonización por Candida spp alcanzó en las pacientes asintomáticas el 13,8 %. En las pacientes con CVV se aisló C. albicans en el 80,7% y el 19,3% restante fueron otras especies de levaduras, en tanto que en las pacientes asintomáticas en el 50% se aislaron S. cerevisiae, Rhodotorula spp y Candida no- albicans (p <0,005). Ello sugiere que la colonización de levaduras en la vagina se asocia con Candida no- albicans u otras levaduras y que el desarrollo de la CVV dependería entre otros factores del reemplazo de estas especies por C. albicans. En las CVV, los aislamientos de especies de Candida no- albicans dominantes fueron C. glabrata (7,68%) y C. dubliniensis (3,84%). Estas dos últimas especies, se hallaron en las gestantes tanto como biota colonizante como en las VVC, en ambos casos con una diferencia no significativa. Los métodos moleculares empleados en el presente trabajo permitieron diferenciar las especies de Candida no distinguidas mediante métodos fenotípicos convencionales, como a C. parapsilosis sensu stricto. La amplificación por PCR para el intrón del gen de actina en C. dubliniensis corroboró la identificación microbiológica convencional. No se registró mediante la PCR con los cebadores específicos la presencia de C. africana, C. bracarensis y C. nivariensis. La amplificación por PCR del gen HWP1 permitió detectar aislamientos de C albicans heterocigotos y homocigotas para este gen, no encontrándose diferencias significativas en las pacientes con CVV y en aquellas con portación asintomática de este patógeno. Al considerar otros patógenos en la población estudiada (n=210) observamos que la VB afectó al 18,09 %, C. trachomatis al 1,43%, N. gonorrhoeae al 0,48%, Ureaplasma spp. y Mycoplasmas hominis al 17,62% y 2,85%, respectivamente. En las pacientes que cursaban el embarazo entre las semanas 35 y 37 (n= 64) se halló S. agalactiae en el 12,5 % de las pacientes, y en un 4,7% se asoció con C. albicans. Algunas especies de Candida se asociaron con vaginosis bacteriana (VB), Streptococcus agalactiae, Ureaplasma spp. y Mycoplasma hominis. Conclusiones: La prevalencia de CVV en embarazadas fue del 25% y C. albicans la especie más frecuente. Los métodos fenotípicos no resultaron concluyentes en la identificación de las distintas especies de Candida, mientras que el empleo de técnicas moleculares, permitió un conocimiento más certero de la epidemiología en mujeres gestantes en Argentina, particularmente por la importancia en especies C. albicans y no albicans.

Descripción: Antecedentes: Lurbinectedin, un alcaloide capaz de unirse al surco menor del ADN, presenta actividad antitumoral contra diferentes tumores sólidos, pero no ha sido evaluado aún en neoplasias hematológicas. La leucemia linfática crónica (LLC) es la leucemia más frecuente del adulto y pese a los avances terapeúticos logrados en los últimos años sigue siendo una enfermedad incurable. La supervivencia y multiplicación de las células B malignas en LLC dependen de señales del microambiente tumoral que están dadas por leucocitos no malignos, células estromales y endoteliales. Objetivos: Investigar la actividad citotóxica de Lurbinectedin sobre poblaciones leucocitarias humanas, evaluando la sensibilidad de los linfocitos B, T, células NK y monocitos de donantes sanos y pacientes con LLC. Investigar además el mecanismo de muerte celular inducido por Lurbinectedin. Materiales y Métodos: Separación de leucocitos de sangre periférica humana e incubación con Lurbinectedin. Evaluación de la muerte celular con la sonda fluorescente 7-AAD y análisis por citometría de flujo. Identificación de las poblaciones leucocitarias con anticuerpos específicos. Detección de la ruptura del ADN por evaluación de la expresión de ?H2AX por citometría de flujo. Detección de la fragmentación de PARP por Western blot. Resultados: Lurbinectedin induce muerte celular de manera dosis-dependiente sobre todas las poblaciones leucocitarias evaluadas, siendo los linfocitos B normales y leucémicos y las células de estirpe mieloide más sensibles que los linfocitos T y las células NK. En muestras de pacientes LLC, Lurbinectedin afecta la viabilidad de las células B leucémicas a través de la eliminación de las células de tipo nodriza diferenciadas de monocitos. El mecanismo citotóxico en células LLC involucra la fosforilación de la histona H2AX y la fragmentación de PARP. Conclusiones: Lurbinectedin es un agente citotóxico eficaz contra células B leucémicas de pacientes LLC ejerciendo no sólo un efecto directo si no también indirecto a través de la eliminación de las células de estirpe nodriza que colaboran con la supervivencia de las células leucémicas. La menor sensibilidad de los linfocitos T y células NK supondría una ventaja para el tratamiento de estos pacientes que presentan una inmunosupresión característica.

Descripción: La micosis fungoide (MF) es un tipo de desorden linfoproliferativo clonal que preferentemente involucra la piel, cuya etiología y patogénesis son inciertas. Las características clínicas y morfológicas no siempre resultan suficientes para predecir el pronóstico de esta enfermedad. Las técnicas de hibridación genómica comparada y microarrays han mostrado desbalances de los genes CDKN2A (9p21) y C-MYC (8q24), con un probable valor pronóstico en esta patología. Además la sobreexpresión de miR-155 fue observada en diferentes tumores sólidos y hematológicos, promoviendo la inestabilidad genómica, proliferación y supervivencia de las células malignas. En el presente estudio, evaluamos los desbalances genómicos de CDKN2A y C-MYC, así como su asociación con la expresión de miR-155 en pacientes con diagnóstico de MF. Los resultados fueron correlacionados con las características clínico-patológicas de los pacientes. El estudio fue realizado en biopsias fijadas en formol y embebidas en parafina de 36 pacientes con MF (26 varones; edad media 62,5 años, rango: 31-82 años): 16 casos correspondieron a MF estadio tumoral (MF-T), 13 a MF con transformación histológica a un linfoma T de células grandes (MF-TR), y 7 casos a la variante MF foliculotrópica (MF-F). El análisis de FISH se realizó usando las sondas OTS9P21.3 (CDKN2A) y OTS8Q24 (C-MYC) (LiVE-Lexel, Argentina). Se cuantificó la expresión de miR-155 mediante PCR en tiempo real usando metodología TaqMan. Se evaluaron además diez muestras de enfermedades inflamatorias cutáneas, usadas como controles. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética local. Todos los individuos proveyeron consentimiento informado para su participación. El estudio de FISH fue realizado en 34 pacientes, 20 (59%) mostraron alteraciones genómicas (AG): 8 (40%) casos tuvieron deleción de CDKN2A, 7 (35%) mostraron ganancias de CMYC y 5 (25%) exhibieron ambos desbalances. La deleción de CDKN2A fue observada en 7/13 (54%) MF-TR, 4/7 (57%) MF-F y 2/16 (12,5%) MF-T (p=0,03); mientras que la ganancia de C-MYC fue detectada en 7/13 (54%) MF-TR y en 5/7 (71,4%) MF-F. De esta forma, la frecuencia de AG fue de 14,3% MF-T frente a 92,3% MF-TR y 85,7% MF-F (p=0,001 y p=0,004, respectivamente). Estas aberraciones fueron más frecuentes en las lesiones ubicadas en cabeza, cuello y extremidades inferiores (77,8%) en contraste con las halladas en el tronco y miembros superiores (40%) (p=0,03). Por inmunohistoquímica, la mayoría de los casos con < 25% células CD30+ no presentaban AG (91% vs 9%) (p=0,01), mientras que los pacientes con alteraciones mostraron una mayor media del índice de proliferación (Ki-67) (49,5%) que los casos sin alteraciones (SA) (5%) (p=0,003). Adicionalmente, las MF-TR de origen foliculotropo tenían más frecuentemente deleción 9p21 (80%) que ganancia de 8q24 (40%) respecto a las de origen clásico (42,8% y 71,4%, respectivamente). La respuesta clínica al tratamiento fue ausente en 11/20 (55%) de los casos con AG respecto a 2/14 (14,3%) pacientes SA (p=0,02). Aunque no se alcanzaron diferencias significativas, los niveles de LDH y Beta 2 microglobulina, y la recaída extracutánea fueron mayores en relación al grupo SA. Además, el grupo con AG mostró la sobrevida más corta (92 meses) comparado con los casos SA, que no alcanzaron la media de supervivencia (Log-rank p=0,04), indicando su asociación con un pronóstico desfavorable. El análisis de la expresión génica (n=36) mostró sobreexpresión de miR-155 en el 25% de las MF-TR y en el 28,6% de las MF-F, mientras que sólo se observó en el 7,7% 7,7% de las MF-T. No se detectó sobreexpresión de miR-155 en los controles. La correlación con los resultados de FISH mostró incremento de la expresión de miR-155 en el 26,3% de los pacientes con AG respecto de 8,3% de los casos SA. Nuestros resultados muestran una alta proporción de pérdidas de 9p21 y 8q24 en pacientes con MF. La MF-TR exhibió la mayor frecuencia de AG, apoyando un rol de éstas alteraciones en el proceso de transformación neoplásica. Aún cuando el número de MF-F es reducido en nuestra serie, esta variante morfológica podría estar asociada a una mayor frecuencia de AG. Finalmente, nuestros hallazgos en la expresión de miR-155 apoyan su relación con la inestabilidad genómica y el desarrollo tumoral, pudiendo constituir un aporte para la profundización de la caracterización biológica de esta patología.

Descripción: Las neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1 negativas (NMPs BCR-ABL1-) integran un grupo heterogéneo de patologías mieloides, siendo las más frecuentes la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MF). La mayoría de estas patologías se asocian con mutaciones en el gen JAK2 (V617F). Luego de adquirida la mutación JAK2V617F, puede producirse un fenómeno denominado pérdida de heterocigosidad (LOH). Estos eventos llevan a la homocigosidad de la mutación, introduciéndose el concepto de carga alélica (CAL). En este trabajo se estudiaron 41 pacientes incluyendo: 21 PV, 11 TE y 9 MF, se cuantificó la carga alélica y expresión de la mutación JAK2V617F mediante PCR cuantitativa (QPCR). Lo cual permitió la comparación de los niveles de JAK2V617F en muestras pareadas de ADN y ARN del mismo paciente. Los resultados promedio obtenidos de ambas mediciones fueron en MF (media ± ES) (62,01 ± 8,00), (80,89 ± 10,26), en PV (59,51 ± 6,01), (75,02 ± 5,48) y en TE (43,08 ± 6,49), (43,42 ± 5,95) respectivamente, mostrando una correlación estadísticamente significativa (Spearman r=0,7, p<0,0001). Se observó que sólo 3 casos con diagnóstico de PV presentaban valores muy incrementados de transcriptos JAK2V617F, considerados outliers, lo cual podría asociarse a una expresión aumentada o sobreexpresión del alelo mutado. La frecuencia de LOH de la mutación JAK2V617F en MF, PV y TE fue 66,6%, 57% y 27% respectivamente, mostrando que la TE posee menor incidencia de homocigosis de dicha mutación. Se analizaron parámetros hematológicos: recuento de glóbulos blancos (WBC), plaquetas y hematocrito, en pacientes homocigotas y heterocigotas para la mutación JAK2V617F en las diferentes patologías, el análisis estadístico mostró un incremento significativo en el recuento de plaquetas y una tendencia al aumento de WBC en pacientes con PV con homocigosis de la mutación JAK2V617F. En MF y TE no se observaron diferencias. En este estudio preliminar se pudo observar que el análisis de la carga alélica de la mutación JAK2V617F podría explicar parte de las diferencias fenotípicas de las patologías incluidas en las NMPs BCR-ABL1 (-).

Descripción: Introducción. La epilepsia es una enfermedad neurológica frecuente que afecta a más de 50 millones de personas en todo el mundo. Cuando las crisis epilépticas permanecen por dos años refractarias al tratamiento farmacológico se plantea la intervención quirúrgica. Las entidades clínico-patológicas más frecuentemente observadas en los especímenes quirúrgicos por farmacorresistencia son la Esclerosis del hipocampo (HS), los Tumores asociados a epilepsia de larga data y las Malformaciones del desarrollo cortical dentro de las cuales se encuentran las Displasias corticales focales (DCF). Tanto para la HS como para la DCF existe una clasificación principalmente histopatológica publicada por la Liga internacional contra la epilepsia que las divide en distintos tipos. A su vez, cuando la HS se asocia a DCF tipo II se define como Patología dual (PD). Se ha descripto, en algunas de estas patologías y en entidades histopatológicas no definidas asociadas a epilepsia farmacorresistente, un incremento de células oligo-like en sustancia blanca y en capas corticales profundas. En algunos de estos estudios han identificado que parte de esas células correspondían a células precursoras oligodendrogliales (OPCs). Objetivos. Evaluar las OPCs en las DCF, HS y PD con el fin de determinar su implicancia en estas patologías. Materiales y métodos. Se han evaluado las OPCs utilizando doble inmunotinción con los anticuerpos PDGF?R y Olig2 y por medio de la técnica de PCR en tiempo real para evaluar la expresión relativa de los transcriptos de PDGF?R y de NG2 (marcadores putativos de las OPCs) a nivel de sustancia gris de neocorteza en 8 casos con DCF, 5 casos con HS y 3 con PD. La edad media de los pacientes fue de 33 ±15 años, siendo 10 mujeres y 6 varones. Resultados. Al evaluar el nivel de expresión relativa de los transcriptos de PDGF?R y NG2 no se observaron diferencias significativas entre las tres patologías estudiadas. Tampoco se detectaron diferencias significativas en la mediana de células doble positivas. Al dividir los casos en base a la edad al inicio de las crisis se evidenció un incremento significativo en el número de OPCs totales en los pacientes con un inicio de crisis a edades mayores de 16 años comparados con los que iniciaron sus crisis a edades menores a 5 años (p=0,022, Test de Kruskal Wallis), mostrando a su vez correlación positiva significativa entre la edad de inicio y el número de OPCs totales (r=0,706, p=0,0029; correlación de Spearman) y en posición de satelitosis perineuronal (r=0,695, p=0,003). El análisis en base al tiempo de evolución de las crisis no mostró diferencias significativas ni en el nivel de transcriptos ni en el número de células dobles positivas. Al agrupar los casos en base a la edad en el momento de la cirugía se observó incremento significativo del número de OPCs en posición de satelitosis perineuronal entre el grupo de pacientes mayores a 36 años y el de menores a 20 años (p=0,049), detectándose a su vez correlación positiva significativa entre ambas variables (r=0,694, p=0,003). Posteriormente, identificamos que los casos de pacientes mayores al momento de la cirugía se correspondían en parte con aquellos que presentaban edades tardías de inicio de las crisis. Conclusiones. La población de células precursoras oligodendrogliales a nivel de sustancia gris de neocorteza no mostró diferencias significativas entre casos con displasia cortical focal, esclerosis del hipocampo y patología dual, interpretando que estas células no se verían afectadas en forma diferente entre estas patologías y especulando así mismo, en asociación con hallazgos en trabajos previos, que no intervendrían en forma significativa con el incremento de células oligo-like descripto en estas patologías. A su vez, hemos identificado que la afectación de crisis convulsivas desde edades tempranas de la vida generaría una reducción del número de estas células con respecto a pacientes con debut más tardío de inicio de las crisis. Consideramos que este hallazgo podría deberse a una mayor susceptibilidad de estas células ante el daño producido por las crisis en pacientes pediátricos menores a 5 años.

Descripción: Existen numerosas evidencias que la criopreservación de espermatozoides en humanos altera parámetros básicos de su fisiología natural, además de esto puede existir un daño que compromete su integridad nuclear. Esto implica una disminución de la viabilidad y a la vez de su capacidad para fecundar pudiendo limitar su uso en técnicas reproductivas. El presente estudio busca evaluar si ocurre daño en el núcleo espermático luego de la criopreservación de las células sexuales provenientes de hombres que no consultan por infertilidad. Se utilizaron 44 muestras provenientes de hombres sanos y menores de 40 años, candidatos al programa de donación de esperma de un banco de semen en la República Argentina. Se realizó un espermograma básico inicial para cada muestra y se midió la compactación nuclear mediante AA y CMA3. Posteriormente se someten las muestras a congelación lenta en nitrógeno líquido y luego son descongeladas para su posterior evaluación. El impacto en la integridad nuclear fue medido mediante TUNEL para evidenciar fragmentación del ADN en tres momentos distintos: antes de la congelación, posterior a la descongelación y posterior a la descongelación sometiendo la muestra a un gradiente de selección. Los datos evidenciaron una distribución normal y se evaluaron mediante el programa estadístico SPSS. Los resultados obtenidos evidencian que la criopreservación tiene un efecto deletéreo y significativo en la integridad nuclear de espermatozoides de hombres jóvenes y sanos, destacando a su vez la importancia de una selección espermática posterior a la técnica para disminuir el porcentaje de espermatozoides que han sufrido el impacto a nivel estructural y molecular.

Descripción: Cryptosporidium, Blastocystis y Enterocytozoon son parásitos cosmopolitas que pueden causar cuadros clínicos gastrointestinales en humanos y animales y en algunos casos puede ser letal en personas inmunocomprometidas. El ganado vacuno puede llegar a ser una fuente importante de infección de estos agentes zoonóticos si el desarrollo de la industria ganadera no se acompaña de medidas preventivas adecuadas para el manejo de los desechos provenientes de estos animales. Durante el período 2011-2013 se realizó un relevamiento de Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi y Blastocystis en establecimientos lecheros distribuidos en 12 municipios de la Cuenca Mar y Sierras, Provincia de Buenos Aires. Se obtuvieron muestras fecales de 209 terneros de menos de 2 meses de edad las cuales se analizaron por métodos moleculares para identificar y caracterizar molecularmente a dichos microorganismos. Para la detección de Cryptosporidium se efectuó un protocolo de PCR anidada para la identificación del gen 18S rRNA. La detección de subtipos de C. parvum, se realizó una PCR anidada que identifica al gen de la glicoproteína de superficie GP60. En el caso de E. bieneusi, se amplificó mediante PCR anidada un fragmento de 400 pb correspondiente a toda la region ITS y las porciones flanqueantes tanto de la subunidad menor como mayor del rADN. Para identificar Blastocystis, se efectuó una PCR para detectar un fragmento del gen SSU rDNA. Un total de 87 muestras resultaron positivas para Cryptosporidium (41,62%). Cryptosporidium bovis se detectó en una sola muestra, mientras que el resto fueron positivas para C. parvum. La subtipificación de las muestras positivas para C. parvum reveló una amplia variedad de subtipos zoonóticos: IIaA16G1R1, IIaA18G1R1, IIaA19G1R1, IIaA20G1R1, IIaA21G1R1, IIaA22G1R1, IIaA23G1R1. Se detectaron coinfecciones en dos muestras con los subtipos IIaA21G1R1 y IIaA22G1R1. E. bieneusi se detectó en 10 muestras (4,8%). Seis genotipos fueron encontrados de los cuales cinco de ellos fueron detectados con anterioridad en humanos. Los genotipos D, I, J y BEB4, descrito previamente en terneros los seres humanos fueron identificados. EbpC, que ha sido descrito previamente en los seres humanos, se encontró por primera vez en los terneros. Un nuevo genotipo, BEB10, fue identificado en un ternero. El genotipo más frecuente fue el J, seguido por I. No se detectaron infecciones mixtas. Un total de 6 muestras de heces mostraron coinfección por Cryptosporidium y E. bieneusi. Se encontraron las siguientes asociaciones: C. bovis con genotipo J, C. parvum subtipo IIaA18G1R1 con genotipo I, IIaA20G1R1 con el genotipo D, IIaA20G1R1 con el genotipo J, IIaA21G1R1 con genotipo BEB4 y IIaA22G1R1 con el genotipo J. Blastocystis no fue detectado en ninguna muestra. Estos resultados indican una amplia diversidad genética de subtipos y genotipos zoonóticos de C. parvum y E. bieneusi respectivamente, en terneros en la provincia de Buenos Aires. La presencia de estos microorganismos en terneros sugiere que estos animales podrían representar un riesgo para la salud pública a través de la contaminación del agua potable y productos frescos. Para una mejor comprensión de la transmisión zoonótica de estos agentes es esencial llevar a cabo estudios moleculares de muestras provenientes de seres humanos que viven o están en contacto con estos animales.

Descripción: Se analizaron las historias clínicas de 36 pacientes quemados con infección fúngica documentada, internados durante el período comprendido entre enero 2011 y diciembre del 2014 en el área de internación de Terapia Intensiva del Hospital Municipal de Quemados del Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Se identificaron por microbiología convencional y molecular a 52 especies de Candida provenientes de la colección de cultivo que el Laboratorio del Hospital de Quemados conserva a -20 ºC, correspondiente a los pacientes estudiados. La internación de los pacientes fue promedio 46,7 días, con un rango entre 9 y 218 días. Pertenecieron al sexo femenino el 63,9 % (n=23) y al masculino 36,1 % (n=13). Se observó un predominio de una extensión de la superficie corporal quemada entre 31 y 50 % en el 33,3 % de los pacientes (p=0,03). Esta se presentó en el grupo etario de mayor edad (59 años), en tanto entre el 71 y 100%, la edad promedio fue de 19 años. Al considerar la profundidad de la quemadura específicamente la de grado 4, se observó en el 69,4 % de pacientes, esto marca la severa gravedad de las lesiones en los pacientes estudiados. El 75 % de los pacientes presentaron una combinación de sitios quemados (tronco, cara, miembros inferiores y miembros superiores) y solo el 25 % exhibieron lesiones en miembros inferiores, superiores o en tronco. Los agentes causantes de la quemadura fueron: combustible (alcohol, nafta, explosión) 41,7 %, fuego directo 25,0 %, estufa 13,9 %, agua 16,7 % y por último electricidad 2,8 %. Debemos destacar que cuando el agente causal de la quemadura resultó el combustible, el alcohol fue el agente de mayor prevalencia. Al relacionar a los agentes causales y la edad observamos que cuando la fuente fue la estufa y el fuego las quemaduras se presentaron a una mayor edad promedio, en tanto que cuando lo fue el alcohol, combustible y electricidad se presentaron a menor edad. Al analizar los agentes causales y el género, podemos apreciar que el elemento alcohol, fue prevalente en el sexo femenino. Esta superioridad femenina, se relaciona con el agente causante alcohol y fuego directo como causa de la quemadura, según figura historia clínica por lesiones de un tercero con vínculo afectivo. Son, en parte las causas actuales de femicidios, que se informan en nuestro país y que se presentan en menores de 40 años. La quemadura por electricidad y nafta furon exclusivas del sexo masculino.Al relacionar la superficie quemada y la causa (combustible vs. otros agentes), se encontró que causas no combustibles ocasionan una menor superficie quemada (p= 0,01), en tanto el grado 2 se presenta cuando el agente fue combustible (alcohol, nafta, explosión) (p=0,03), como resultado de una mayor profundidad de la quemadura. El 50 % de los pacientes quemados presentaron LIH, implicados el combustible y el fuego como agente de la quemadura. Se requirió de vías centrales en el de 88,9 % de los quemados. La vía femoral se usó en el 90,6 % y el 9,4 % las vías superiores (subclavia y/o yugular). El promedio de vías utilizadas en cada paciente fue de 5,8. La intubación orotraqueal y la traqueotomía se practicaron en el 72,2 % y 41,7 %, respectivamente. Se practicó tratamiento quirúrgico en el 91,7 % de los pacientes (escarectomías 100%, escarotomías 42,4%, fasciotomías 54,5% y amputación de miembros 6,1%) y sin tratamiento quirúrgico (sólo curación con lavados) se encontraron 8,3 % de los quemados. Luego del tratamiento quirúrgico y de obtener un lecho de tejido viable, se procedió a cubrir la herida con injertos de piel. Se les aplicó autoinjerto a 97,2%. El mismo exhibió buena adherencia al tejido subyacente en un 75%. En el 25% que no fue exitoso, el porcentaje de mortalidad fue de 100 % (p< 0,01), cuya causa principal es el shock séptico. El requerimiento de inotrópicos fue del 72,2 % y de antifúngico del 91,7%. Se inició la terapia con fluconazol en el 58,8% y el resto anfotericina B liposomal. La mortalidad ocurrió en el 38,8 % pacientes y se observó que fue mayor entre los mayores de 65 años (p= 0,018), con el uso de inotrópico (noradrenalina) (p < 0,001), con LIH (p= 0,04), en pacientes que se les practicó una fasciotomía (p=0.04) y en el grupo con antecedentes o factores de riegos (p = 0,002). Las infecciones bacterianas estuvieron presentes en el 100 % de los pacientes quemados y los microorganismos fueron: bacterias Gram negativas multirresistentes como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa (KPC). Entre los Gram positivos, S. aureus meticilinoresistente (SMR) fue el más prevalente. El momento de aparición de las infecciones bacterianas en promedio fue 4 días post ingreso a la unidad de cuidados intensivos. El 38,9 % de los pacientes presentaron un APACHE II entre 31-40 y el 8,3 % entre 41?46. El Candida score fue de 3 en el 77,7 %. Las infecciones fúngicas son una causa importante de morbimortalidad en pacientes quemados, ya que constituyen un huésped ideal para las infecciones oportunistas. La incidencia de infección fúngica representó en 39,3 por cada 1000 quemados y las candidiasis se produjeron en promedio a los 21,4 días de ingreso a la unidad de cuidados intensivos (rango 1-3 semanas). La levadura de más frecuente aislamiento fue C. albicans en todos los materiales clínicos analizados (biopsia de la lesión, urocultivo, hemocultivo, aspirado traqueal, punta de catéter). Asi, C. albican estuvo representada con el 53,8 %, C. tropicalis con el 23,1 %, C. parapsilosis sensu stricto 13,5 %, C. kruse 5,8 %, C. glabrata y C. krusei 1,9 % cada una. En los hemocultivos, C. albicans fue la especie prevalente, seguida por C. parapsilosis. En el urocultivo las especies Candida no-C. albicans sobrepasaron a C. albicans. Los pacientes con hemocultivos positivos (candidemias), presentaron mayor mortalidad que aquellos con candidemias negativas aunque sin diferencia estadísticamente significativa (p= 0,091). La identificación molecular (la amplificación por PCR del gen HWP1 coincidió con la microbiológica en C. albicans y C. dubliniensis. Existieron aislamientos de C. albicans que la amplificación produjo dos fragmentos de ADN. El fragmento de menor (941 pb) tamaño es producto del gen HWP1 y el fragmento de mayor tamaño se debió a la amplificación parcial del gen RBT1 por un pegado inespecífico de los cebadores, pero se confirmó por secuenciación de ambos clones a C. albicans.Para la identificación de C. parapsilosis y de C. glabrata como C. parapsilosis sensu stricto y C. glabrata dentro del complejo de esta última especie, se requirió de la identificación molecular a los aislamientos. En el complejo de C. glabrata a través de la reacción de PCR para el gen RLP31 que codifica para una proteína ribosomal de 60S determinó la ausencia de C. bracarensis y C. nivariensis; y confirmó la presencia de C. glabrata. La identificación molecular de las especies del complejo de C. parapsilosis con cebadores específicos para cada una de las especies de este complejo derivados de secuencias dentro de la región de ITS1 y ITS2 del rDNA permitió la identificación C. parasilopsi sensu stricto. No se detectó la presencia de C. orthosilopsis y C. metapsilosis.

Descripción: Ectodominio desdoblamiento de proteínas de la superficie celular por una disintegrina y metaloproteinasas (Adams) es altamente regulado, y su desregulación se ha vinculado a muchas enfermedades. ADAM17- dependiente Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) pro-ligando unidades clivaje carcinogénesis mamaria, proliferación, migración e invasión de Cáncer de Mama Triple Negativo (TNBC) células tanto in vitro como in vivo. ADAM 17 de expresión de forma negativa en los pacientes TNBC predice los resultados adversos en pacientes con cáncer de mama y recientemente se ha propuesto como una nueva herramienta de diagnóstico y objetivos terapéuticos. Esta tesis explora el potencial para entender empaparlo anterior reglamento de ADAM17 En el caso de ADAM17/EGFR ligando en eje TNBC. El objetivo general es el de investigar la etnización de ADAM17 sustratos por examinar el efecto de los inhibidores de la enzima diferentes moléculas de señal ización (kinasas, fosfatasas y del citoesqueleto componentes) en basal y éster de forbol inducidos por ADAM17-mediada por clivaje sustrato EGFR y la fosforilación en MDA-MB-231células. ADAM17 escote los reguladores han sido identificadas como nuevas dianas farmacológicas en TNBC. En línea con este objetivo, el papel de los dos identificados recientemente ADAM17 depende de clivaje de los reguladores del laboratorio, la proteína quinasa C (PKC alfa-?) y proteína fosfatasa 1 reguladores (inhibidor) subunidad 14 (PPP1R14D), TNBC pertinentes en las respuestas celulares han sido evaluados. En primer lugar, el tumbador inducible (KD) de estos objetivos se ha logrado en la línea celular epi telial TNBC MDA-MB-231 lentivíricos IPTG a través de sistema de vectores shRNA inducible (pLKO-904) y sus efectos sobre la migración, la invasión y prol iferación celular fue probado in vitro. Estos resultados in vitro se correlacionaron con los resultados obtenidos in vivo mediante el trasplante las mismas células mamarias orthoptopic través adiposa de trasplante en ratones. Para ambos enfoques, anál isis de Western blot de extractos de proteínas totales aislados de l isados celulares todo fue uti l izado para determinar el nivel total y fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) así como de sus objetivos posteriores reguladas por señales extracelulares (llamada Erks cuya), proteína quinasa B (AKT) y transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3). qPCR fue uti l izado para estudiar los niveles de expresión de EGFR y de otros receptores tirosina quinasas (RTKs). Las pruebas ELISA con sobrenadantes de cultivos celulares se real izaron para medir escinde ADAM17 sustratos tales como soluble transformar-crecimiento-factor-alfa (TGF-?), de heparina EGF (HB-EGF), la anfiregul ina, tumor necrosis factor receptor-1 de (TNFR1) junto con el sustrato ADAM10 R/c. Encontramos que el derramamiento reglamento se produce sobre el sustrato y que la proteína quinasa C (PKC) es esencial en la regulación de clivaje ligando EGF. PKC? y PPP1R14D el tumbador produjo una significativa disminución migración, invasión y prol iferación celular de las células, lo que sugiere que la selección de PKC? y PPP1R14D podría proporcionar un beneficio terapéutico en TNBC. Dirigido a los reguladores que escote sustratos dirección en lugar de la proteasa podría impedir que el observado efectos secundarios negativos de amplio espectro inhibidores de metaloproteasas en pacientes, que se debieron a la no inhibición selectiva clivaje sustrato. Desde solo terapias dirigidas, en particular las terapias dirigidas contra el EGFR, suelen provocar resistencia, l igando EGF cl ivaje selección regulador podrían uti l izarse en combinación con los beneficiarios directos de EGFR mejor beneficio terapéutico.

Descripción: El cáncer de mama triple negativo (TNCB) es aquel que no expresa el receptor de estrógenos (ER), ni el de progesterona (PR) o el HER2. Esta patología representa el 15% de los tumores de mama invasivos y tiene una alta incidencia en mujeres jóvenes Afro-Americanas. Es responsable de una alta tasa de mortalidad por cáncer de mama ya que generalmente el TNCB causa metástasis; además, responde pobremente a las terapias con quimioterápicos a largo plazo y generalmente desarrolla resistencia a las terapias dirigidas, incluyendo las que implican al EGFR. Por todo ello, es fundamental el desarrollo de terapias alternativas, dado que solo el 30% de las mujeres con cáncer de mama metastásico sobrevive pero ninguna de las que presentan TNBC metastásico. Actualmente, no existe una terapia adecuada y efectiva para el TNBC. En parte, esto se debe a la alta heterogeneidad genética que presentan estos tumores, lo cual redunda en la inefectividad de terapias basadas en una única droga. Terapias basadas en blancos terapéuticos específicos están en investigación y desarrollo, como aquellas basadas en la inhibición de quinasas implicadas en señalización (ejemplo: /Akt, MEK, VEGFR, PDGFR), reparación del DNA, supervivencia celular o acciones androgénicas. Mayormente, estas terapias específicas son combinadas con quimioterapia sistémica. Sin embargo, hasta el momento, los beneficios de tales propuestas terapéuticas no son claros. Aproximadamente el 60% de los TNBC de tipo basal sobreexpresan EGFR; sin embargo, las terapias que implican la inhibición del receptor son mayormente inefectivas debido al desarrollo de resistencia. Distintos mecanismos están involucrados en el desarrollo de resistencia a las terapias dirigidas, como ser mutaciones en la proteína blanco o la redundancia y sobreactivación de vías de señalización compartidas con otros factores de crecimiento. Por lo tanto, es fundamental diseñar terapias combinadas para TNBC que contemplen el posible desarrollo de resistencia. El trabajo de investigación propuesto intenta identificar alteraciones de vías de señalización intracelular ocasionadas por las terapias dirigidas, particularmente en lo que respecta al eje ADAM17/EGFR, con el fin de establecer su posible implicancia en el desarrollo de resistencia. Dado que se desconoce como es regulada la actividad y selectividad de ADAM17, se realizó un amplio estudio mediante shRNA para dilucidar como se regula el clivaje de and PPP1R14D regulan el clivaje de TGFa, AREG y HB-EGF sin afectar la actividad proteasa de ADAM17. La inhibición del eje ADAM17/EGFR sería beneficioso para el tratamiento del TNBC. Nuestros estudios in vitro revelaron que células MDA MB 231 knockout para PKC? and PPP1R14D no presentan sobreactivación de RTKs, sugiriendo que en estos modelos podría verse potenciada la eficacia terapéutica de la inhibición del eje ADAM17/EGFR. Sin embargo, cuando las mismas células fueron inyectadas a ratones, produjeron un fenotipo de tumor agresivo y metastásico, asociado a la reactivación de vías de señalización intracelular como las mediadas por ERK y PI3K/Akt. Ello se asoció a un aumento de la expresión y activación de distintas RTKs, incluido el EGFR como así también de Akt. Estos resultados sugieren la activación alternativa de vías de señalización que permiten que las células tumorales proliferen y produzcan metástasis.

Descripción: La Atrofia Muscular Espinal (AME) es una de las enfermedades autosómicas recesivas más frecuentes, y es causada por mutaciones en el gen SMN1. Esta enfermedad neuromuscular se caracteriza por degeneración de las motoneuronas del asta anterior de la medula espinal resultando en atrofia y debilidad muscular progresiva. Existen 4 formas clínicas de presentación desde la manifestación neonatal severa a la forma del adulto con mínima debilidad. La severidad de la enfermedad se ha correlacionado con el número de copias del gen SMN2, altamente homólogo y cercano a SMN1. El gen SMN2, a diferencia de SMN1, produce sólo un 10%-15% de proteína SMN activa. Actualmente se están desarrollando estudios de investigación clínicos con medicamentos que estimulan una mayor síntesis de proteína activa a partir de SMN2, entre ellos ácido valproico (VPA) y 4-fenilbutirato. Otro gen cercano a SMN1, denominado NAIP, se encuentra delecionado en la mayoría de los pacientes con AME severa. Objetivos El objetivo principal de este trabajo fue evaluar la influencia del número de copias del gen SMN2 y la ausencia del gen NAIP, en el fenotipo AME en niños diagnosticados en el Hospital de Pediatría J. P. Garrahan. Para ello: - Se determinó el número de copias del gen SMN2 mediante dos metodologías semicuantitativas de biología molecular - Se estableció la presencia o ausencia del gen NAIP - Se realizó un estudio de correlación Genotipo-Fenotipo en los niños con AME de nuestra población Pacientes y Métodos Se estudiaron 144 niños con diagnóstico de AME; los mismos fueron categorizados de acuerdo a los criterios establecidos por el Consenso Internacional de AME ?Consensus Statement for Standard of Care in Spinal Muscular Atrophy, 2007?. El número de copias del gen SMN2 se determinó mediante MLPA (Multiplex Ligation-dependet Probe Amplification) y PCR a tiempo real. La ausencia del gen NAIP se determinó mediante la metodología de MLPA. Resultados El número de copias del gen SMN2 pudo ser determinado mediante MLPA en la totalidad de los pacientes. Con la PCR a tiempo real se pudo establecer en 119/144 pacientes. Los resultados obtenidos por ambas técnicas fueron equivalentes en el 95% de los casos. Todos los niños con AME tipo I presentaron 2 copias, mientras que más del 98% de los pacientes con AME tipo II y III mostraron entre 3 y 4 copias de SMN2. Sólo en el grupo AME tipo III se observaron 4 copias de SMN2, siendo éstas más frecuente en los pacientes con el subtipo IIIb. El gen NAIP estuvo ausente en el 73,2% de los niños con AME tipo I y presente en más del 85% de los pacientes con AME tipo II y III. Conclusiones La metodología de MLPA resultó ser más robusta que la PCR a tiempo real y brinda mayor información acerca de la región AME. El número de copias del gen SMN2 y la ausencia del gen NAIP mostraron ser modificadores del fenotipo clínico de AME en la población estudiada. Estos biomarcadores no alcanzan a explicar la totalidad de los casos, sugiriendo la existencia de otros factores modificadores que aún no se conocen y deberán ser revelados en futuras investigaciones. El presente proyecto contribuyó a la incorporación de una nueva metodología que aumenta la sensibilidad diagnóstica (superando el 95%) y que permite la detección de portadores en el grupo familiar.

Descripción: El Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida ha sido descripto hace 30 años y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) identificado como su agente causal. La infección por HIV-1 involucra la interacción entre las glicoproteínas de la cubierta viral gp120/41 y las moléculas del grupo de diferenciación 4 (CD4) expresadas en la superficie de las células hospedadoras: linfocitos T, macrófagos y células dendríticas. Este evento es seguido de la unión a un receptor celular de quimioquinas (CCR): CCR5 y /o CXCR4, que permite la fijación y el subsecuente ingreso del virus según su tropismo. Para relacionar la presencia de mutaciones en los genes que codifican estos correceptores con la susceptibilidad o protección frente a la infección, se reclutaron parejas heterosexuales de población argentina en las que una persona es HIV positiva y la otra HIV negativa, aun manteniendo condiciones de sexo no protegido. Se las conoce como parejas ?discordantes?, ?serodiscordantes? o ?con estado serológico mixto?. Se sometió a ambos miembros de estas parejas a tamizaje serológico para la detección de antígenos y anticuerpos presentes en infecciones por HIV, HBV (Virus de la Hepatitis B), HCV (Virus de la Hepatitis C) y HTLV (Virus Linfotrópico T del Humano) al ingresar y finalizar el protocolo. Nuestro objetivo principal fue analizar la influencia de los haplotipos en los correceptores del HIV-1: CCR5-CCR2 en población de parejas discordantes que viven en Argentina y secundariamente detectar infección y coinfección por otros patógenos virales (HBV, HCV y HTLV) en ambas cohortes, comparar las frecuencias alélicas, haplotípicas y de combinaciones de haplotipos de los correceptores obtenidas en la cohorte de infectados (seropositivos) , no infectados (expuestos seronegativos) y las del grupo control; y finalmente comparar los resultados obtenidos en estas parejas con los datos de estos marcadores para transmisión perinatal en nuestra población. Desarrollamos un estudio observacional, descriptivo, de cohortes, a doble ciego; para el cual se reclutaron individuos expuestos seronegativos (ESN) e individuos seropositivos (SP) miembros de parejas heterosexuales discordantes, adultos, que pertenecen a población argentina y mantenían sexo no protegido. La caracterización de los haplotipos se realizó mediante PCR y PCR-RFLP (Reacción en Cadena de la Polimerasa ? Longitud del polimorfismo de los fragmentos de restricción). Incluimos ambos integrantes de 63 parejas heterosexuales discordantes. Siete mujeres y un hombre seropositivo y una mujer seronegativa no concurrieron con su compañero, pero acreditaron su condición de discordante, por lo tanto fueron incluidos en este protocolo. Todos son adultos que viven en la República Argentina, firmaron el consentimiento informado y recibieron información exhaustiva sobre los objetivos de esta investigación. El período de desarrollo de este estudio fue: mínimo de un año y máximo de cinco años (?=2,53 años ± SD=1,22). La cohorte de seropositivos (SP) está compuesta por 40 mujeres y 31 hombres y la de expuestos seronegativos (ESN) por 31 mujeres y 33 hombres. No hallamos diferencias significativas entre ambas cohortes con respecto al sexo. Como ?grupo control? (GP) se incluyeron 99 donantes de sangre de población argentina que concurrieron al Banco de Sangre del Hospital J. P. Garrahan. El análisis de las coinfecciones evidenció que las frecuencias fueron: significativamente mayores en SP (23,9%) con respecto a ESN (3,1%) (p=0,0005, RR= 7,66 IC 95% = 1,84-31,88) entre los miembros de ambas cohortes. No se encontraron diferencias significativas comparando los resultados de ESN con las prevalencias de estas patologías en población general argentina ni entre las frecuencias de coinfección de SP con las de la población general de pacientes HIV reactivos. El único haplotipo que evidenció diferencia significativa entre ESN y GC fue HHG2 (??32) (OR = 5,92 IC 95%: 1,59-21,99, p=0,0045). Comparando SP vs. GC y SP vs. ESN no se evidencian diferencias significativas. El genotipo HHE/HHE se asocia en forma significativa con mayor riesgo de infección mientras que HHE/HHF2 con un efecto protector (HHE/HHE: OR=5,09 IC (95%) 1,05-24,63, p=0,0428; HHE/HHF2: OR=0,13 IC (95%) 0,03-0,50, p=0,0039. Estos resultados coinciden con los reportados para transmisión perinatal en población argentina. En este estudio hemos demostrado mediante la genotipificación de los haplotipos CCR5-CCR2 y sus posibles combinaciones, que existe asociación significativa con un factor predisponente HHE/HHE y otro protector HHE/HHF2 frente a la infección por el virus HIV en parejas discordantes de población argentina. El valor de este análisis radica en el hecho que hasta el momento no hay publicaciones sobre este tema en nuestra población y que el reclutamiento de estas parejas de difícil acceso nos permite estudiar posibles factores que condicionan la susceptibilidad a la infección por HIV. La infección es el resultado de la intercurrencia de características tanto del hospedador como del virus, por lo tanto no podemos dejar de mencionar que el análisis de la variabilidad de estos correceptores es sólo un aspecto dentro del universo de posibilidades condicionantes de la transmisión viral.

Descripción: Frente a las posibilidades inmediatas de aplicación de la secuenciación genómica en la investigación en salud humana, determinar el alcance ético apropiado del asesoramiento genético (?counselling?) de participantes se convierte en una cuestión de la mayor importancia. En esta tesis, se presentará un modelo de consentimiento informado para la divulgación de los hallazgos incidentales en la investigación que utiliza procedimientos de secuenciación del genoma completo o secuenciación de exoma completo. El diseño de un modelo de consentimiento informado se basa en la teoría general del proceso de consentimiento informado. Por lo tanto, los modelos de consentimiento informado pueden definirse como una aplicación de la teoría de consentimiento informado ideal, que incorpora principios éticos generales, en un contexto particular. El objetivo de la tesis es diseñar y defender un modelo de informe que determina el alcance ético apropiado del proceso de asesoramiento genético para la comunicación de hallazgos incidentales al cual llamo ?modelo iterativo? para resaltar la continuidad del proceso de consentimiento informado entre el consejero y el participante de la investigación. Para ello, las teorías de consentimiento in-formado serán analizadas y adaptadas al caso de la investigación en salud humana con procedi-mientos de secuenciación de genoma/exoma completo. Además, valores relevantes a la ética de la investigación y características de los datos genómicos serán tomados en consideración. El modelo iterativo de consentimiento informado se basa en los modelos de consentimiento informado tradi-cional y dinámico, para asegurar la comprensión y la elección autónoma por parte de los sujetos de la investigación.

Descripción: La regulación hormonal de la esteroidogénesis involucra al ácido araquidónico, precursor de los productos lipoxigenados necesarios para la activación de la esteroidogénesis, independientemente del estímulo que desencadene la respuesta. En otros sistemas, está postulado que los productos lipoxigenados son secretados y que funcionarían en forma autócrina estimulando un receptor de membrana denominado OXER1 perteneciente a los receptores acoplados a proteína G y con alta afinidad por 5-oxo-ETE, 5-HpETE y 5-HETE, productos de la 5-lipoxigenasa. En base a estos antecedentes, hipotetizamos que los metabolitos del ácido araquidónico vía la 5-LOX podrían señalizar a través de su propio receptor en la regulación de la esteroidogénesis. con una aproximación farmacológica, demostramos que el OXER1 estaría involucrado, al menos en parte, en la vía de transducción que involucra al AMPc/PKA. Con el fin de identificar al OXER1 como mediador de la activación de la esteroidogénesis, inicialmente demostramos la presencia del receptor OXER1 en células esteroidogénicas humanas de la línea H295R productoras de esteroides a través de varias vías de señalización. Luego, abordamos la modificación de la actividad y de los niveles de expresión del OXER1 en células esteroidogénicas. La actividad se modificó con herramientas farmacológicas, usando un agonista y un antagonista del receptor. Estos compuestos fueron capaces de modificar la producción de esteroides por células H295R. Para los cambios en la expresión, fue necesario primero obtener herramientas de biología molecular para realizar el silenciamiento y la sobreexpresión, parte fundamental del trabajo que se presenta. Entonces, se obtuvo un plásmido pSUPER.retro.puro-OXER1 para el silenciamiento y se clonó el ADNc humano generando plásmidos de expresión transitoria y estable: pRc/CMVi-OXER1 y pBABE-OXER1, respectivamente. Con estas construcciones se transfectaron células de las líneas MA-10 de Leydig de testículo de ratón y/o células H295R adrenocorticales humanas. Solo los dos plásmidos recombinantes obtenidos para la sobreexpresión fueron aptos para el uso ya que únicamente con ellos se logró el cambio esperado de la expresión del OXER1 (ARNm y/o proteína). Para analizar la funcionalidad del OXER1 sobreexpresado, determinamos el efecto de la transfección de ambos plásmidos sobre la producción de esteroides tanto en células MA- 10 como H295R. La estimulación de estas células por agonistas que activan vías de señalización que involucran tanto AMPc/PKA como PLC/PKC resultó en un aumento en la esteroidogénesis cuando se sobreexpresa el OXER1. Este trabajo entonces aporta evidencia de la participación del receptor de membrana OXER1 en la activación de la producción de esteroides. Otro aporte relevante de este trabajo es que la transfección de células H295R adrenocorticales humanas generó células que expresan en forma estable al OXER1. Esta nueva línea celular, H295R-OXER1, es un sistema de estudio de gran utilidad en el futuro análisis de la transducción de señales iniciada por la activación del receptor.

Descripción: La asfixia perinatal (AP) (incidencia 1-5000 nacidos vivos) es una complicación obstétrica asociada a una alta tasa de morbimortalidad. El conocimiento de los mecanismos involucrados en las alteraciones causadas por la AP permitirá diseñar terapias preventivas o paliativas de esta condición. El cerebelo es vulnerable a la hipoxia en recién nacidos por su rápido crecimiento en este período y puede dar lugar a alteraciones de sus funciones, incluyendo el control del motor y cognitivo y procesos afectivos. Previamente, utilizando un modelo de AP murino en nuestro laboratorio caracterizamos las alteraciones hipocampales a largo plazo; sin embargo, las modificaciones en cerebelo no han sido completamente dilucidadas. Por tal motivo estudiamos las alteraciones morfológicas de los cerebelos (10-12 por grupo) de ratas adultas (120 días) que sufrieron AP y el efecto de un tratamiento tardío con Estradiol (E2) como posible terapia neuroprotectora. Se analizaron los lóbulos cerebelares de secciones sagitales por inmunohistoquímica. Observamos que el número de células de Purkinje no se alteró en los animales AP, pero que presentaban mayor porcentaje de células con tinción anormal para Calbindina así como por tinción con Azul de Toluidina. Se observa además una configuración espacial desorganizada de la capa de células de Purkinje con aglomerado de las mismas en diversas regiones. A nivel de la capa molecular, se detectó un aumento del espesor de la misma en los animales asfícticos así como una edematización de las dendritas de las PC, reflejadas en el incremento del porcentaje del área MAP2 reactiva. Con respecto a la capa granular se observó un aumento en el espesor de la misma en los animales AP. Tanto en esta capa como en la molecular se observó un incremento de gliosis reactiva (astrocitos y glia de Bergmann respectivamente) en cerebelos de animales AP determinada por un aumento del porcentaje del área GFAP+. Dicho aumento fue corroborado por Western blot. El tratamiento con E2 no produjo cambios significativos entre los animales AP y los controles. En conclusión, este trabajo muestra los efectos a largo plazo de la AP en la estructura del cerebelo, que podrían estar involucrados en la patogénesis de los déficits cognitivos, como se observa en los animales y los seres humanos. El E2 no fue un tratamiento efectivo para revertir los cambios producidos por la AP en las ratas probablemente por el tipo de receptor de E2 expresado en el cerebelo y al tiempo analizado.

Descripción: La tiroides es la primera glándula endócrina en aparecer en el desarrollo embrionario. Alrededor de la semana 11 de gestación, la glándula tiroides fetal ya tiene la capacidad de concentrar yoduro y aproximadamente en la semana 18, comienza a liberar hormonas tiroideas. Este aporte de hormonas endógenas es esencial para la maduración del cerebro y del esqueleto del feto. La deficiencia de hormonas tiroideas, aún durante cortos períodos podría conducir a daños cerebrales irreversibles cuyas consecuencias dependerán del momento de inicio y duración de dicha deficiencia. La prevalencia del hipotiroidismo neonatal es de 1/3.000-1/4000 recién nacidos según fue determinado a partir de programas de screening a nivel mundial. Dentro del hipotiroidismo varias entidades poseen características propias, el hipotiroidismo congénito sin bocio (disembriogénesis) debido a agenesias, ectopias o hipoplasias, correspondiendo al 80-85 % de los casos del hipotiroidismo neonatal. Se identificaron algunos casos donde la causa es una mutación en los genes TTF-1, TTF-2, Pax 8, NKH2-5 y Receptor de TSH. Un segundo grupo del hipotiroidismo neonatal lo constituyen los hipotiroidismos congénitos con bocio o bocios congénitos debido a alteraciones de unos de los componentes de la biosíntesis de hormonas tiroideas (dishormonogénesis): tiroperoxidasa (TPO), tiroglobulina (TG), DUOX2, NIS, Pendrina y dehalogenasa I. Dicho grupo corresponde al 15-20 % de los hipotiroidismos neonatales y se caracteriza por bajos niveles de hormonas tiroideas y como consecuencia aumento de TSH y mayor proliferación celular tiroidea. El bocio se presenta generalmente cuando la glándula tiroides es incapaz de producir suficiente cantidad de la hormona tiroidea para satisfacer las demandas del individuo. La glándula tiroides se agranda para compensar esta situación, con lo cual generalmente se corrigen las deficiencias leves de la hormona tiroidea pero no las severas. La biosíntesis de hormonas tiroideas se realiza en la interfase célula-coloide, en la membrana apical de la célula tiroidea, sobre una glicoproteína estructural de elevado tamaño que es la tiroglobulina. Esta es la proteína con mayor eficiencia de formación de hormonas tiroideas en presencia de concentraciones fisiológicas de yoduro. Además de intervenir en la biosíntesis de hormonas tiroideas sirve también para el almacenamiento del yoduro. El yoduro ingresa en forma activa en la glándula tiroides y debe ser oxidado antes de actuar como agente efectivo de yodinación. Ingresa al citoplasma celular a través del transportador NIS, ubicado en la membrana basolateral del tirocito. Un segundo transportador localizado en la membrana apical, la pendrina, lleva al yoduro hacia la interfase célula/coloide. Las tres etapas de la organificación del yoduro: oxidación, incorporación del mismo a los residuos tirosílicos de la tiroglobulina y finalmente el acoplamiento de las monoyodotirosinas y diyodotirosinas para formar las hormonas tiroideas triyodotironina (T3) y tetrayodotironina (T4) son catalizadas por una misma enzima microsomal, de membrana, la TPO y en presencia de una fuente de H202. Dos enzimas están relacionadas a la síntesis de H2O2, se trata de dos NADPH oxidasas unidas a la membrana apical denominadas Duox1 y Duox2, y dos factores de maduración de las mismas DuoxA1 y DuoxA2. La biosíntesis de las hormonas tiroideas está regulada por la TSH quien ejerce su acción estimuladora de la transcripción de los genes específicos tiroideos por interacción con su receptor. El efecto de las hormonas tiroideas, es ejercido a nivel transcripcional a través de la interacción de éstas con su receptor nuclear. Mutaciones dispersas a lo largo del gen de TPO constituyen la causa más común de dishormonogénesis con hipotiroidismo congénito permanente con un patrón de herencia autosómico recesivo. El gen que codifica a la TPO humana, de 17 exones está localizado en el cromosoma 2 en el intervalo 2p24-p25. Los aminoácidos entre 149 y 711 que corresponden a los exones 5 a 12 en el gen de la TPO humana muestran una significativa similitud con el consenso denominado ?animal haem peroxidase? (An peroxidase). Los exones 13 y 14 tienen homología con la familia de genes denominados ?complement control protein (CCP)-like? (residuos 742-795) y ?calcium-binding epidermal growth factor (EGF)-like? (residuos 796-839), respectivamente. El exón 15 codifica para el dominio de transmembrana y los exones 16 y 17 para la región intracitoplasmática4. El conocimiento de la organización estructural del gen de la TPO humana permitió desarrollar las herramientas necesarias para identificar mutaciones que originan bocios congénitos por deficiencia de dicha proteína. Estos estudios permitieron diseñar primers intrónicos para amplificar por PCR cada uno de los 17 exones de la tiroperoxidasa y en consecuencia estudiar, a partir del ADN genómico, pacientes con bloqueo de la organificación del yoduro por defecto de la TPO. Hasta el momento, más de 80 mutaciones se han descripto en el gen de TPO las cuales se heredan de un modo autosómico recesivo12. En alrededor del 20% de los casos de hipotiroidismo congénito permanente se han identificado defectos monoalélicos en dicho gen, presumiblemente debido a mutaciones crípticas no halladas en regiones intrónicas o regulatorias del gen. De esta manera, se ha reportado solamente la expresión monoalélica del alelo mutante. La necesidad actual es analizar cómo estas diferentes mutaciones ubicadas en diferentes dominios del gen de TPO alteran la funcionalidad de la respectiva proteína y originan el bocio congénito. Esto permitirá un gran adelanto en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y de la correlación clínica con la variabilidad fenotípica. Una segunda entidad es la Resistencia a Hormonas Tiroideas (RTH) que se caracteriza por una disminución de la respuesta a la T3 por parte de los tejidos. La incidencia de RTH es de 1 caso cada 50.000 nacidos vivos, con más de 600 casos conocidos. Existen dos genes que codifican a los receptores de hormonas tiroideas, el gen THRalfa se encuentra en el cromosoma 17 y el gen THRbeta, de 10 exones en el cromosoma 3. El 90% de las mutaciones se localizan en el dominio LBD (Ligand Binding Domain) del gen THRbeta y se heredan de modo autosómico dominante. Han sido descriptas alrededor de 200 mutaciones dentro de las cuales predominan aquellas que originan cambio de aminoácido. Solo dos mutaciones han sido descriptas recientemente en el gen THRalfa. Con respecto a los polimorfismos en dicho gen, no se conoce mucho aun respecto del rol de los mismos. Estudios recientes han demostrado la asociación de los mismos con los niveles de TSH, éste es el caso del polimorfismo THR?-in9-G/A el cual explica una concentración aumentada de TSH de manera alelo, dosis dependiente. Con respecto al hipotiroidismo congénito con bocio, uno de nuestros objetivos consistió en la identificación de mutaciones en el gen de TPO siendo las que se presentan con mayor frecuencia en esta patología. A tal fin, se analizaron 5 pacientes con diagnóstico clínicobioquímico de hipotiroidismo congénito con bocio por defectos en la organificación del yodo. En primer lugar se utilizó la técnica PCR-RFLP para identificar la posible presencia de la mutación p.R396fsX472 generada por la inserción duplicación de GGCC en la posición 1277 de la secuencia de referencia del ARNm en el octavo exón del gen TPO la cual genera, un cambio en el marco de lectura dando como resultado un codón prematuro en el exón 9, con la producción de una proteína truncada sin actividad biológica. A continuación, luego de la puesta a punto de las condiciones para la amplificación por PCR del promotor y de cada uno de los 17 exones del gen se llevó a cabo la secueciación de los mismos. Se identificaron en nuestros pacientes una mutación descripta en bibliografía, p.E799K y dos variantes raras de secuencia: p.V748M y la deleción c.2007-11_2007-9del (-CTT). Se empleó el sistema de clonado pGEM-T Easy Vector para la caracterización de la deleción heterocigota identificada. Se analizó la segregación alélica en las familias correspondientes a los pacientes portadores de las mutaciones. Por otra parte en los pacientes se identificaron y caracterizaron polimorfismos ya sea descriptos como no descriptos previamente. Con respecto a la RTH, se estudiaron 11 pacientes con sospecha de estar afectados con dicha patología y sus grupos familiares. Para la Identificación y caracterización de nuevas mutaciones en el gen del THRbeta se amplificaron los exones que presentan habitualmente mutaciones. Se realizó PCR a partir de ADN genómico empleando primers intrónicos para los exones 7, 8, 9 y 10 del gen THRbeta. Se secuenciaron los productos de PCR y posteriormente fueron analizados los resultados. Se identificó asi una mutación no descripta previamente, lo cual fue confirmado por estudios poblacionales para descartar un posible polimorfismo: p.P452L y dos mutaciones reportadas: p.A268G y p.G345R. Las alteraciones identificadas ya sean en el gen de TPO como en el de THRbeta fueron caracterizadas mediante estudios bioinformáticos de actualidad. Se realizaron análisis evolutivos de homología proteica, de predicción de la estructura proteica secundaria, de predicción del impacto funcional de las sustituciones aminoacídicas identificadas y el efecto que las posibles mutaciones halladas en regiones consenso de splicing pudieran ocasionar sobre dicho proceso. Por otra parte se incluyeron estudios ?in silico? 3D siendo un gran aporte el modelado por homología llevado a cabo para la TPO humana. Las técnicas de biología molecular empleadas constituyen una herramienta útil para la comprensión de la fisiopatología molecular del hipotiroidismo neonatal y de la RTH. Por otra parte contribuirán al diagnóstico temprano y la elección del tratamiento más conveniente haciendo posible también el adecuado asesoramiento genético a las familias afectadas.

Descripción: Los procesos sépticos constituyen una de las mayores causas de muerte en las unidades de cuidados intensivos. Aunque en las sepsis se observa una secreción simultánea de agentes inflamatorios y antiinflamatorios (TNF-?, IL-1, IL-6, IL-8, IFN-?, IL-10, TGF-? y GC), en la fase temprana predomina un estado clínico característico de una respuesta hiper-inflamatoria, mientras que durante la fase tardía prevalece, clínicamente, la respuesta anti-inflamatoria. Durante este último estadio ocurren más del 70% de las muertes por sepsis, debido a que, habitualmente, los pacientes entran en un estado de inmunosupresión y son susceptibles a infecciones por microorganismos oportunistas. En las sepsis causadas por bacterias Gram negativas, las endotoxinas, constituyentes normales de la membrana, también conocidas como lipopolisacáridos (LPS), han sido consideradas como uno de los agentes principales causantes de esa inmunosupresión. Debido a que en nuestro laboratorio se demostró la participación de los glucocorticoides (GC) en la inmunosupresión, el objetivo de este trabajo fue evaluar la contribución de la IL-10 a la misma y su potencial relación con los GC. Por eso, ratones BALB/c wild type (WT) y deficientes en la producción de IL-10 (IL-10 KO) fueron inmunosuprimidos con LPS. Los resultados mostraron una alta sensibilidad de los ratones IL-10 KO al LPS probablemente debido a los niveles elevados y sostenidos en el tiempo de las principales citoquinas pro-inflamatorias asociadas a cuadros sépticos (TNF-?, IL-12 e IFN-?) así como a un mayor número de receptores para TNF-? observado en esos ratones con respecto a los WT. Los niveles de corticosterona también fueron más altos en los ratones IL-10 KO, aunque la dexametasona no tuvo un efecto protector ante un desafío letal con LPS (2LD50=200ug). Además, el estatus basal de la respuesta inmune humoral primaria -aunque no la secundaria- como así también el nivel de inmunosupresión fue similar en ambas cepas. Sin embargo, la IL-10 es crítica para el control de la producción temprana de TNF-? después del LPS y la refractariedad inducida por los GC. Por otra parte, nuestros resultados apoyan la tesis de la existencia de una regulación bidireccional entre los GC y la IL-10. Así, por un lado, los GC ejercen sobre la IL-10 una regulación positiva, mientras que la IL-10 sobre los GC accionaría en sentido contrario. Finalmente, este trabajo fue un intento de ampliar el conocimiento acerca de los mecanismos responsables de la inmunosupresión que, eventualmente, pueda ayudar a incorporar la implementación de procedimientos terapéuticos en sepsis sobre bases más racionales.

Descripción: Las S-layers (surface layer) o capa S cumplen un rol en las propiedades probióticas de las cepas que la poseen siendo capaz de influir en la respuesta inmune y en muchos casos favoreciendo la adhesión a células. La proteína S-layer pura de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 tiene propiedades antimicrobianas y antivirales que podrían ser explotadas. Con un objetivo similar se buscará verificarlo en las cepas de Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus y Lactobacillus kefiri, frente a diferentes patógenos. Se buscó determinar cómo puede influir esta estructura de la superficie bacteriana en las características probióticas como son capacidad de adhesión a células epiteliales, y el efecto barrera contra patógenos (bacterianos y virales). A través de construcciones de cepas de Pseudomonas aeruginosa con genes reporteros fluorescentes se verificó la capacidad de la proteína S-layer pura de proteger a cultivos de células eucariotas frente a agentes patógenos bacterianos y virales y su efecto sobre la formación de biofilm en superficies bióticas y abióticas. Hemos obtenido una disminución considerable en la formación de biofilm de P. aeruginosa al tratarla con S-layer de L. acidophilus, L. brevis y L. helveticus. Además se encontró una disminución en la adhesión del patógeno a células A549 en células pretratadas con las proteínas. También se observó disminución de la infección viral de HSV-1 al tratar previamente células A549 con las proteínas S- layer estudiadas a excepción de la S-layer de L. acidophilus.

Descripción: En la actualidad, grandes avances se han realizado en el campo de la terapia génica para el tratamiento del cáncer, y dentro de este campo, el uso de virus oncolíticos se presenta con adelantos prometedores, ya que no solo presentan un tropismo preferencial por células transformadas, sino que también median procesos citotóxicos en las células infectadas, sin dañar a las células normales. Dentro de los virus oncolíticos encontramos los adenovirus de replicación condicional basados en adenovirus que infectan a humanos (?CRAds? en sus siglas en inglés). En nuestro laboratorio se construyó un CRAd cuya replicación es dirigida por un promotor quimera con: un fragmento del promotor de SPARC, elementos respondedores a hipoxia y a inflamación; además posee una fibra quimera 5/3. Este virus se denominó Adenovirus 5/3 NHS. En la búsqueda de nuevas estrategias para el ?delivery? de CRAds al tumor, se utilizaron células mesenquimales (?MSCs? en sus siglas en inglés) pre infectadas con el Ad 5/3 NHS como medio de transporte para el mismo. Se observó que al infectar estas células tanto en presencia de medio condicionado de células tumorales que expresan la proteína SPARC, como en presencia de la proteína purificada SPARC, la infección fue más eficiente, evidenciándose en un aumento en la lisis a menor multiplicidad de infección (?MOI? en sus siglas en inglés). Partiendo de esta premisa, en este trabajo se planteó evaluar si el efecto observado en MSC se reproducía en células tumorales. Para ello se utilizaron 3 estrategias: infecciones en presencia de medio condicionado proveniente de células que secretan SPARC, infección en presencia de la proteína purificada SPARC e infecciones en células que expresan o no SPARC, empleando 3 virus: Ad5/3 Luciferasa como control no replicativo, Ad5/3 WT como control positivo y el Ad5/3 NHS generado en nuestro laboratorio. La estrategia en la que infectamos en presencia del medio condicionado no represento un ensayo eficiente para la evaluación del efecto de SPARC, ya que el mismo inhibió el crecimiento celular. La expresión de SPARC y el agregado exógeno de la proteína favorece la lisis mediada por los adenovirus utilizados. Sin embargo, estudios de expresión de los receptores adenovirales CAR, CD46 y Desmogleína-2, y de entrada de virus por cuantificación de copias del gen E4, nos sugieren que el mecanismo utilizado por SPARC no está relacionado con las etapas del ciclo adenoviral que abarcan la unión a receptores y la entrada del virus.

Descripción: El sistema colinérgico no neuronal (SCnN) está conformado por la acetilcolina, la enzima que la sintetiza, la colina acetil transferasa, la enzima que la degrada, la acetilcolinesterasa y los receptores nicotínicos y muscarínicos (M) presentes en células de origen no nervioso. Este sistema participa en la regulación de funciones celulares fisiológicas y patológicas. En este sentido se ha reportado la participación del SCnN en la progresión tumoral. En particular, la sobreexpresión de los receptores M se ha descripto en un gran número de tumores. Hemos demostrado la expresión de estos receptores en células de la línea MCF-7, derivadas de un adenocarcinoma mamario humano, así como también en células tumorales mamarias murinas y la ausencia de expresión en células no tumorigénicas mamarias humanas como las de la línea MCF-10A. Además observamos que la activación de los receptores M aumenta la proliferación, la migración celular y la angiogénesis in vivo. Sobre la base de estos antecedentes nos propusimos evaluar si la expresión de los subtipos 3 y 4 de los receptores M en las células MCF-10A promueve la transformación celular hacia un fenotipo tumoral. Para esto generamos por transfección tres líneas celulares que expresan los subtipos 3 y/o 4 de los receptores M, que denominamos: MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4. En estas tres líneas estudiamos el efecto de la activación colinérgica sobre el ciclo celular, la migración celular, la respuesta angiogénica y el crecimiento tumoral in vivo, utilizando a las células MCF-7 como control positivo. Demostramos que las tres líneas celulares generadas expresan el transcripto y las proteínas para los subtipos 3 y 4 de receptores M. Observamos que el tratamiento con el agonista carbacol incrementó el porcentaje de células en fase S/G2/M en las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 con respecto al control y que el efecto estimulante del carbacol se revierte en presencia del antagonista no selectivo atropina. También estudiamos el efecto del agonista en la migración celular y en la expresión de la metaloproteinasa-9 (MMP-9), como parámetros fundamentales en la invasión tumoral. Demostramos que el tratamiento con carbacol incrementó la capacidad migratoria y la expresión de MMP-9 en las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 de manera comparable a lo observado en las células tumorales MCF-7, mientras que no tuvo efecto sobre estos parámetros en las células MCF-10A. Estos efectos se redujeron en presencia de atropina así como de los antagonistas selectivos de los subtipos M3 y M4, 4-DAMP y tropicamida respectivamente. La angiogénesis es un paso central en la progresión tumoral. Estudiamos la capacidad de las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 para generar nuevos vasos sanguíneos in vivo. Encontramos que estas células aumentan la neovascularización de manera semejante a las células MCF-7. Además, las células transfectadas adquirieron la capacidad de sintetizar el principal promotor de la angiogénesis que es el factor de crecimiento del endotelio vascular-A (VEGF-A), una propiedad constitutiva en las células MCF-7. Por ultimo evaluamos la capacidad tumorigénica in vivo y encontramos que las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4, forman tumores en ratones NUDE mientras que las células MCF-10A carecen de esta capacidad. Concluimos que la expresión de uno o más subtipos de los receptores M en células de mama humana no tumorigénicas es suficiente para aumentar la proliferación, la migración e indujo la producción de MMP-9 in vitro y adquirir de novo la capacidad de inducir neovascularización, sintetizar VEGF-A y formar tumores in vivo.

Descripción: Las infecciones respiratorias agudas (IRA), cuyas patologías más frecuentes son la neumonía, la bronquiolitis y la enfermedad tipo influenza, afectan a toda la población, pero principalmente a los menores de 5 años y mayores de 65 años, encontrándose entre las primeras causas de mortalidad a nivel mundial. En Argentina, son la principal causa de consulta e internación en todas las edades, y en Santa Fe, representaron casi el 20% de las internaciones registradas en el hospital pediátrico de referencia de la ciudad durante el año 2010. Los patógenos virales más frecuentes causantes de IRA son el virus sincicial respiratorio (VSR), influenza, parainfluenza, adenovirus, metapneumovirus, coronavirus y rinovirus. Los rinovirus humanos (HRV) pertenecen a la familia Picornaviridae. Son virus esféricos no envueltos y su genoma es una única molécula lineal de ARN de sentido positivo, que se encuentra recubierta por una cápside de simetría icosaédrica. Aislados por primera vez en 1956, en la actualidad se conocen más de 100 serotipos diferentes que se encuentran agrupados en tres especies, HRVA, HRVB y HRVC. Son termoestables y se diseminan a través de las secreciones respiratorias contaminadas mediante el contacto directo entre personas. Es posible hallarlos en personas de todas las edades, su diseminación es a nivel mundial y, aunque la frecuencia de circulación suele ser mayor en los meses de otoño y primavera, pueden detectarse en todos los meses del año. Si bien históricamente los HRV fueron considerados patógenos de las vías aéreas superiores, en la actualidad se ha demostrado que también ocasionan infecciones en el tracto respiratorio inferior, causando hospitalizaciones de niños con neumonía, bronquiolitis y obstrucciones pulmonares crónicas. También se encuentran asociados a pacientes que presentan episodios de sibilancias recurrentes, exacerbaciones de asma, bronquitis, sinusitis y otitis media aguda. El diagnóstico virológico es necesario para determinar la etiología de las IRAs, ya que los cuadros clínicos producidos por los distintos virus suelen ser similares. Además, permite restringir el uso innecesario de antibióticos. El aislamiento viral en cultivo de tejido seguido por el test de labilidad ácida representa el método estándar en el laboratorio para la confirmación de una infección por HRV, pero el tiempo requerido es superior a dos semanas, lo que es de valor limitado para una decisión terapéutica. Las técnicas basadas en la detección de ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido incrementar la identificación de este virus. El hecho de que en Santa Fe no se hayan efectuado hasta el momento estudios relacionados a los HRV motivó la realización de este trabajo, que se propuso seleccionar y optimizar una técnica de PCR que permitiera la detección del virus en pacientes pediátricos hospitalizados con IRA durante el período marzo 2010-febrero 2011, para luego estudiar su frecuencia, estacionalidad y epidemiología, como así también aspectos clínicos-epidemiológicos de los pacientes infectados. Para el desarrollo del estudio, se seleccionó una RT-PCR anidada, altamente sensible y específica, que fue testeada por Steininger et al. (2001) para la mayoría de los serotipos de HRV conocidos y que amplifica un fragmento altamente conservado del genoma viral. Se optimizó la técnica con controles de positivos del virus, variando parámetros críticos del ensayo, y se corroboró la especificidad de la misma al ensayar controles positivos de otros virus respiratorios. Se obtuvieron un total de 2020 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes durante el período estudiado, a los cuales se les realizó la detección de antígenos VSR, adenovirus, parainfluenza e influenza A y B por inmunofluorescencia (IF). La detección de influenza A y B se realizó además por RT-PCR real time. A un porcentaje representativo de ANF que resultaron negativos por IF (452 muestras) se les realizó la determinación de HRV mediante RT-PCR, detectando el genoma del virus en 172, lo que representó una positividad del 38,1% y un segundo lugar (8,5%) en la frecuencia de circulación de virus respiratorios. Se encontró en todos los meses del año, predominando durante marzo de 2010 y desde agosto hasta febrero de 2011. El 60% de los niños hospitalizados con IRA atribuibles a HRV fueron menores de 6 meses, siendo la mediana de la edad de 4 meses. Se comprobó que la edad no fue un factor de riesgo para desarrollar enfermedad grave. La proporción de infectados fue similar para ambos géneros. Se analizaron aspectos clínicos y epidemiológicos de 145 pacientes. El 31% presentó antecedentes clínicos, entre los que se destacaron la prematurez (55,6%) y las sibilancias recurrentes (51,1%). Los diagnósticos de egreso más frecuentes fueron la neumonía (35,2%), la bronquiolitis (32,4%) y la bronquitis (12,4%). Como hallazgos radiológicos se observó atrapamiento aéreo (75,2%), infiltrado instersticial (67,9%) e infiltrado alveolar (35,8%). El 72,7% de los pacientes presentó leucocitosis. Se utilizaron antibióticos en el 66,4% de los tratamientos y el 85,5% de los niños requirió suministro de oxígeno durante la internación. La mediana de la duración de la estadía hospitalaria fue de 6 días y el 15,9% de los pacientes requirió internación en unidad de terapia intensiva (UTI). No se observaron diferencias significativas entre las edades de los pacientes internados en UTI y las de aquellos que no presentaron un cuadro clínico de gravedad, como así tampoco el presentar un antecedente clínico fue un factor de riesgo para desarrollar enfermedad severa. El presente estudio evidenció que los HRV están asociados a hospitalizaciones de niños por IRA. La implementación de una técnica de RT-PCR de punto final logró detectar con rapidez, sensibilidad y especificidad un virus que se ubicó en el segundo lugar de circulación (luego del VSR), y permitirá, en forma rutinaria, disminuir los casos de IRA de origen desconocido, estableciendo el papel que desempeñan estos virus en nuestro medio y facilitando la elección de conductas terapéuticas apropiadas.

Descripción: Los murciélagos del género Artibeus, pertenecientes a la familia Phyllostomidae, presentan una excepción al patrón típico de determinación sexual XX/XY de los mamíferos euterios: se establece un sistema de cromosomas sexuales múltiples con la consecuente formación de un cuerpo XY1Y2, que incluye dos regiones de sinapsis entre cromosomas X-Y1 y X-Y2. Combinando las técnicas de microscopía electrónica e inmunolocalización fluorescente de proteínas meióticas específicas, se confirma la presencia de la variante histónica ?-H2AX y de BRCA1 en la región diferencial del cuerpo XY1Y2, indicando que dichas regiones asinápticas están silenciadas transcripcionalmente. Por otra parte, se confirma lo reportado en la literatura respecto al número diploide, morfología cromosómica, ultraestructura secuencial, determinación del trivalente sexual XY1Y2 en A. lituratus y A. planirostris, y se establece que el mecanismo básico de la meiosis que impide la extensión de la inactivación de la cromatina de tipo sexual hacia los segmentos autosómicos del cuerpo XY1Y2 no es la presencia de NORs, pues estos se alojan en los cromosomas autosómicos y no en los que componen el trivalente sexual XY1Y2. Los resultados de esta tesina permiten avanzar en la comprensión de las características típicas de la meiosis en mamíferos, sea normal o patológica, incluyendo a los humanos portadores de reordenamientos cromosómicos estructurales.

Descripción: El sistema kalikreina kinina (SKK) es un sistema multienzimático complejo involucrado en la regulación de la presión arterial a través de la acción del óxido nítrico y las prostaglandinas. Trabajos previos de nuestro laboratorio han demostrado que el incremento en la ingesta de K+ disminuye la presión arterial con una activación del SKK y aumento la aldosterona plasmática concomitantes. Efecto similar fue observado tras la remoción de gónadas, evidenciando un rol de las hormonas sexuales sobre el sistema. Estos resultados llevaron a estudiar diferentes puntos de la vía de la acción de aldosterona en el riñón, como lo es su receptor, el canal epitelial de sodio y el canal rectificador de K+ de la médula externa renal (ROMK). El ROMK es necesario para el transporte epitelial de NaCl a nivel del asa ascendente de Henle y túbulo contorneado distal (TCD), ya que genera un gradiente electroquímico que permite la reabsorción de Na+ luminal impulsada por la ATPasa Na+/K+ en la membrana basolateral. Con el objetivo de dilucidar el rol del potasio y de las hormonas sexuales en la regulación del SKK, se inhibió el canal ROMK por glibenclamida y gonadectomía prepuberal, respectivamente. Se utilizaron ratas espontáneamente hipertensas de ambos sexos a las 12 semanas de vida, a la mitad de los animales se les suministró glibenclamida con glucosa 4 % como vehículo por vía oral y la otra mitad recibió vehículo durante los últimos tres días del experimento. Se realizó la gonadectomía (Gx) al destete (4° semana) en la mitad de los animales de cada grupo. Se midió la presión arterial, filtrado glomerular, aldosteronemia, diuresis, excreción urinaria de Na+ y K+ y actividad de kalikreina urinaria (KU). Los niveles de ARNm se midieron por PCR en tiempo real para Kcjn1 y Atp1a1 en médula y corteza renal y para Klk1 en corteza. La inhibición del canal ROMK aumentó la relación Na+/K+ urinaria (0.55 ± 0.03 vs 1.34 ± 0.30, p < 0,05). Esta respuesta mostró diferencias según sexo y presencia de gónadas: en ratas macho y ovariectomizadas la excreción de K+ disminuyó mientras que en hembras enteras aumento la de Na+. Las excreciones de Na+ y K+ fueron directamente proporcionales (r= 0,99; p < 0,05) y el tratamiento con glibenclamida disminuyó su pendiente en un 54.8 % (p < 0,001). Estos resultados muestran que la inhibición del canal ROMK impide el reciclado de K+ generando un aumento neto de la concentración de Na+ en la orina final. El filtrado glomerular aumentó post tratamiento con glibenclamida en todos los grupos experimentales (0,51 ± 0,06 vs 0,76 ± 0,06 ml/min/100gPC p < 0.01), sin cambios en presión arterial (121 ± 11 vs 127 ± 10 mmHg), ni aldosterona plasmática (55 ± 12 vs 49 ± 10 pg/ml). El tratamiento con glibenclamida no modificó los niveles de KU (24.37 ± 3.96 vs 28.37 ± 4.25 nkat/día/100gPC), ni de ARNm de Klk1 en corteza renal (1.10 ± 0.31 vs 1.75 ± 0.42). La inhibición del ROMK indujo un descenso abrupto en la expresión génica de Kcjn1 (1.29 ± 0.28 vs 0.32 ± 0.11 p < 0.01) y Atp1a1 (0.94 ± 0.23 vs 0.20 ± 0.02 p < 0.01) en médula renal y esta respuesta fue modulada por la presencia de gónadas. El conjunto de resultados muestra que el bloqueo del canal ROMK modificó la excreción urinaria de iones acorde a su participación en el manejo de los mismos a lo largo del nefrón. Los cambios drásticos encontrados en los niveles de ARNm de Kcjn1 y Atp1a1 en médula renal sugieren que dicho bloqueo modula la expresión génica de los mismos. A su vez, el consistente aumento en el filtrado glomerular, sin mostrar variaciones en la presión arterial, muestra una participación del canal en la modulación del feedback tubuloglomerular. La diferencia en la respuesta luego de la gonadectomía, sugiere que, al menos en parte las hormonas sexuales jueguen un rol en el balance electrolítico. Los niveles de KU y ARNm de Klk1 sugieren que el ROMK no intervendría en la regulación del SKK y nuevos experimentos serán necesarios para dilucidar los mecanismos por los que la aldosterona y las hormonas sexuales modulan dicho sistema.

Descripción: Staphylococcus aureus, forma parte de la microbiota colonizante de piel y mucosas en humanos y animales. Sin embargo, este patógeno oportunista es uno de los patógenos más frecuentes e importantes, aislado tanto en el ámbito nosocomial como en la comunidad, responsable de una gran variedad de infecciones tales como endocarditis, osteomielitis y sepsis. En el presente trabajo se caracterizaron cuatro aislamientos clínicos de S. aureus recuperados de un paciente que padeció cuatro episodios sucesivos de bacteriemia. Los primeros 3 aislamientos fueron sensibles a cefoxitina (FOX) y oxacilina (OXA), mientras que el último resultó resistente a OXA. Se determinó la isogenicidad de los cuatro aislamientos recuperados del paciente por la técnica de PFGE. La genotipificación indicó que estos aislamientos pertenecen al ST8, y spa tipo t024, linaje que no se encuentra dentro de los más frecuentes en Argentina. Se profundizó el estudio del primer aislamiento, SAMS1, y del último, SA2 dado su fenotipo poco frecuente en nuestro medio (sensibilidad a FOX y resistencia a OXA) La detección molecular del gen mecA que codifica la PBP2a, mecanismo más frecuente asociado a resistencia a oxacilina, dio resultado negativo. Se descartó también la presencia del gen mecC y de las diferentes recombinasas descriptas en los SCCmec. En consecuencia, se evaluaron mecanismos alternativos que pudiesen explicar este fenotipo. No se detectaron mutaciones en el gen pbp4 entre los aislamientos. El aislamiento SA2 presentó mayor actividad de ?-lactamasas que el aislamiento SAMS1. Sin embargo, no se encontraron mutaciones en el operón bla, que pudieran justificar esta hiperproducción. Se pudo evidenciar también, la presencia de una mutación en la posición 1350 del gen pbp2 de la cepa SA2 respecto de la SAMS1, que resultó en una sustitución Ala450Asp. Este cambio no se evidenció en la cepa SAMS3 (aislada en el tercer episodio de bacteriemia), lo que sugiere que esta mutación se podría vincular con la emergencia de resistencia a oxacilina en SA2. El análisis del efecto de esta mutación con modelos tridimensionales muestra el reemplazo de un aminoácido hidrofóbico como la alanina, por uno ácido como el aspártico, en un entorno hidrofóbico y cercano a la cavidad del sitio activo del dominio transpeptidasa de la PBP2 de SA2. La carga introducida en ese entorno hidrofóbico produciría una distorsión del ?-hélice y del cercano bolsillo de reacción, dificultando así el ingreso de la molécula de OXA. Posiblemente, tanto la hiperproducción de ?-lactamasa como la mutación que resulta en la sustitución Ala450Asp en PBP2, descriptas en la cepa SA2, contribuyan al fenotipo de resistencia observado. No se descarta la posible coexistencia de otros mecanismos moleculares que contribuyan a la resistencia a este antibiótico. La detección de aislamientos resistentes a oxacilina pero carentes del gen mec, representa un gran desafío para los laboratorios clínicos, dado que no se detectan utilizando el disco de FOX. Si bien el CLSI recomienda, dentro de las pruebas cualitativas, el uso del disco de FOX para informar la sensibilidad a antibióticos ?-lactámicos, este trabajo demuestra la emergencia en Argentina de aislamientos de S. aureus resistentes a OXA que no se detectan con ese método y serían reportados como SAMS.

Descripción: Se estima que de 15 a 20 millones de personas están infectadas con el HTLV-1 y de 3 a 5 millones con el HTLV- 2 en el mundo. Para ambos virus existen áreas endémicas con comunidades de originarios naturalmente infectados por uno de los tipos virales. La mayoría de ellos permanecen asintomáticos durante toda la vida y solo entre el 3 y 5% desarrolla una de las dos patologías asociadas al HTLV-1, la Leucemia a Células T del Adulto o la Mielopatía asociada al HTLV-1/ Paraparesia Espástica Tropical. Es por ello, que el riesgo de desarrollar o no la enfermedad estaría influenciado por otros factores, ya sea virales, del medioabiente o del huésped. El objetivo principal de esta tesis fue aportar mayores conocimientos sobre el HTLV 1 y 2 en Argentina, a través de un análisis descriptivo de los casos estudiados por el Grupo HTLV de Medicina Traslacional del Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), de las cepas circulantes y mediante la identificación de polimorfismos específicos de HLA relacionados con el desarrollo o ausencia de patologías asociadas al HTLV-1. Si bien nuestro país es endémico para el HTLV-1 en el Noroeste (Jujuy y Salta) y para el HTLV-2 en la Región Chaqueña (Chaco y Formosa), este trabajo de tesis confirma que ambos virus circulan en todas las provincias del país y que ambos son detectados en poblaciones no vulnerables como puede ser la de donantes de sangre. Deja establecido que una confirmación molecular y la necesidad de contar con laboratorios de referencia a nivel nacional es muchas veces necesaria para llegar a un diagnóstico definitivo. Los estudios filogenéticos identificaron únicamente al subtipo Cosmopolita subgrupo Transcontinental (Aa) del HTLV-1 en casos con patología y confirmaron nuevamente a este subtipo como mayoritario en el país. En base a los antecedentes epidemiológicos, se infiere que estas cepas podrían haber sido introducidas en la población caucásica de áreas no endémicas tiempo atrás a partir de ascendientes originarios, o bien por contacto con individuos infectados o de áreas endémicas, como Perú, para estos retrovirus. Se describen las características epidemiológicas de casos de ATLL y HAM/TSP, los niveles de carga proviral asociados a ellas y por primera vez se identifican alelos reportados como susceptibles para las patologías asociadas, como el HLA-A*33, previamente descrito como protector en Jamaica. Los datos de esta tesis brindan datos concretos sobre la necesidad de incluir a estos retrovirus en un programa nacional del ámbito de la Salud Pública, con el fin de implementar medidas de vigilancia que considere la capacitación de profesionales para realizar su diagnóstico y brindar la información necesaria en relación a la atención primaria y seguimiento de pacientes.