Descripción: Durante la preñez, el eje hipotalámico-hipofisario-ovárico (HHO) de la mayoría de los mamíferos se ve inhibido por la retroalimentación negativa ejercida por las hormonas ováricas (E2, Pg, inhibinas) sobre el hipotálamo y la hipófisis. Sin embargo, la vizcacha de las llanuras (Lagostomus maximus) presenta reclutamiento y desarrollo de folículos preovulatorios en forma continua a lo largo de la gestación con recuperación de la actividad esteroidogénica de los cuerpos lúteos primarios (CLp) y formación de cuerpos lúteos accesorios (CLa) a mitad de la gestación, que resulta en una nueva oleada de Pg luteal permitiendo el mantenimiento y finalización con éxito de la gestación. La disminución de Pg sérica a partir de los 70 días de gestación resulta en un aumento en la síntesis y liberación de GnRH, seguido de un aumento en FSH y reclutamiento folicular que generan la síntesis E2. Como resultado ocurre un pico de LH y formación de los CLa entre los días 100-120 de gestación. Dada la función de GnRH y las hormonas ováricas sobre el eje reproductivo y las características atípicas de la vizcacha, el presente trabajo se propuso dilucidar el rol de la hipófisis en la reactivación del eje HHO durante la gestación. Para poner a prueba esta hipótesis se propuso investigar la dinámica hipofisaria de la vizcacha durante la gestación, estudiar el efecto de las hormonas ováricas sobre la actividad hipofisaria y su relación con la pseudo-ovulación y con la formación de cuerpos lúteos esteroideogénicamente activos que se observan en esta especie durante la preñez. Para esto, se utilizaron hembras adultas preñadas y hembras adultas no preñadas. Se pusieron a punto los ensayos de modulación fisiológica ex vivo e in vivo, como el desarrollo de un modelo de ovariectomía bilateral con reemplazo hormonal. Durante la gestación, antes de la reactivación del eje HHO, los bajos niveles de inhibina ováricos permitirían la liberación hipofisaria de FSH la cual, a su vez, induciría la formación de folículos maduros los cuales producen E2. Luego de la luteinización de los folículos maduros mediada por el pico de LH, los niveles de E2 y Pg se ven incrementados y retroalimentarían positivamente la liberación de LH, pero no la expresión de RGnRH hipofisario. Luego de este pico de LH, los RFSH luteal de las hembras P3 favorecería la actividad enzimática de aromatasa y, como consecuencia, el incremento de E2. A su vez, IGF1R también estaría favoreciendo la producción de E2 y Pg ováricos durante la preñez media. Los altos niveles de expresión de inhibina ovárica observados en las P3 podrían involucrar a este factor como posible regulador de la expresión del RGnRH hipofisario observado en este estadio. Por otra parte, en hembras no preñadas, los receptores de estrógenos hipofisarios presentarían efecto diferencial sobre los gonadotrofos, siendo RE? el que estimula la expresión de RGnRH y RE? actuando sobre la síntesis y liberación de LH. Sin embargo, E2 y Pg desensibilizarían a la hipófisis inhibiendo la síntesis y liberación de LH a través de la vía de señalización de GnRH mediada por los factores de transcripción Egr-1 y Sf-1. En conjunto, este trabajo muestra el efecto diferencial de las hormonas ováricas sobre la expresión del RGnRH y su vía de acción en la síntesis de LH en hembras no preñadas y hembras preñadas en una especie de roedor silvestre con reactivación del eje HHO durante la gestación

Descripción: El control estacional de la reproducción a través de la información fotoperiódica se basa en la melatonina como mensajero clave que actúa sobre los componentes del eje hipotalámicohipofisario- gonadal (H.H.G.). Esta hormona es producida en la glándula pineal por la enzima AANAT, y se une a los receptores MT1 y MT2 del hipotálamo, hipófisis y ovario, modulando la secreción de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), la hormona luteinizante (LH) y los esteroides sexuales estradiol y progesterona, respectivamente. La vizcacha de las llanuras de Sudamérica (Lagostomus maximus) posee caracteres reproductivos únicos, como poliovulación natural de hasta 800 oocitos por ciclo estral, inhibición de la atresia folicular, una preñez prolongada con reabsorción embrionaria selectiva y reclutamiento folicular, y una pseudo-ovulación con generación de cuerpos lúteos accesorios durante la gestación. Presenta dos períodos reproductivos al año, siendo el que va de abril a agosto más eficiente que el que abarca de octubre a febrero. El objetivo de este trabajo fue estudiar la in?uencia del fotoperíodo sobre el funcionamiento del eje H.H.G. de la vizcacha. En primer lugar se determinó la secuencia del ARNm de la prepro-GnRH hipotalámica. Se encontraron dos isoformas que difieren únicamente en el largo de la secuencia 5?-UTR. La variante de GnRH determinada fue mGnRH, y presentó un alto grado de conservación entre caviomorfos emparentados, mientras que la secuencia del péptido asociado a GnRH (GAP) mostró alta una variabilidad. El análisis de la expresión del sistema melatoninérgico a lo largo del ciclo reproductivo de la vizcacha arrojó como resultado la co-localización de GnRH con ambos receptores de melatonina en núcleos hipotalámicos que controlan la reproducción, el área preóptica y los núcleos supraóptico y supraquiasmático. Además, se determinó un incremento de la expresión de AANAT y de los niveles de melatonina conforme progresa la gestación, y los menores niveles de MT1 y MT2 hipotalámicos se registraron en la etapa media de la preñez. Esto indicaría que el sistema melatoninérgico contribuye al mantenimiento de la extensa gestación de la vizcacha. El efecto de la disponibilidad lumínica se determinó en vizcachas en fase folicular y en fase lútea inducida. En el primer caso, la exposición contínua a la luz redujo los niveles séricos de melatonina pero incrementó la expresión de AANAT y en el ovario aumentó el número de folículos antrales y de cuerpos lúteos, los niveles de progesterona y la expresión de MT2, mientras que la oscuridad constante incrementó los niveles de GnRH y MT1, los niveles séricos de estradiol y la expresión de MT1 en el ovario. En animales en fase lútea, la luz incrementó los niveles de melatonina y de LH, mientras que la oscuridad estimuló la expresión de AANAT y del MT1 hipotalámico. Estos resultados indicarían que los desajustes fotoperiódicos y hormonales alteran la respuesta del hipotálamo, de la hipófisis y del ovario de manera diferencial en función de la etapa del ciclo estral. La expresión hipotalámica de los receptores de estrógenos ? (RE?) y ? (RE?) también varió con la disponibilidad lumínica; en animales en fase folicular se observó un incremento de los niveles de RE? con la luz y un aumento de RE? con la oscuridad. Por otro lado, en animales en fase lútea, la luz constante aumentó la expresión hipotalámica del RE?. En ensayos de pulsatilidad, se observó que la melatonina estimula la secreción de GnRH y de LH en hembras con ovulación inducida. Asimismo, se determinó el efecto inhibitorio del neuroestradiol sobre la secreción de GnRH, mientras que la incubación con melatonina revirtió ese efecto. Por otro lado, la incubación conjunta de melatonina con estradiol o con un agonista del RE? incrementó la liberación de GnRH, sugiriendo que la interacción de melatonina y estradiol resulta necesaria para la actividad del eje H.H.G. En conclusión, este es el primer trabajo que demuestra que en la vizcacha, la regulación de cada órgano a través de la información fotoperódica, así como su respuesta a la melatonina y el contexto hormonal del ciclo estral, confluyen en la modulación del eje reproductivo de manera de ajustar el inicio de la actividad del eje H.H.G. con la estación más favorable para la reproducción. Esta regulación particular, dependiente de la etapa del ciclo estral y de la disponibilidad lumínica, demuestra la relevancia de la información ambiental para llevar a cabo una gestación exitosa y remarca la importancia de esta especie como un valioso modelo de regulación neuroendócrina de la reproducción en mamíferos.

Descripción: El Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) representa un importante desafío a nivel productivo debido a su carácter endémico a nivel mundial. La infección por el VDVB es altamente prevalente en la Argentina y provoca pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera, asociadas mayormente a problemas reproductivos. La enfermedad provocada por el VDVB se presenta con una variada signología que puede ir desde un curso subclínico a cuadros agudos hemorrágicos cuyo desenlace suele ser fatal. A esto se suma el efecto inmunosupresor del VDVB que predispone a infecciones bacterianas y parasitarias que pueden comprometer la vida del animal. El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, género Pestivirus y está representado por 3 genotipos: VDVB-1, VDVB-2 y VDVB-3 o ?Virus HoBi-like?. A su vez, este agente puede ser clasificado según su biotipo en citopático (CP) y no citopático (NCP). Una característica fundamental del VDVB es su capacidad de generar infecciones persistentes. El nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) tiene lugar cuando las hembras preñadas se infectan con una cepa NCP del VDVB entre los días 30 y 150 de gestación. Estos individuos no son capaces de montar una respuesta inmune y eliminan grandes cantidades de virus en todas las excreciones y secreciones. Actualmente se proponen dos medidas principales para el control de la enfermedad: la detección y eliminación de animales PI, y la posterior vacunación de todo el rodeo no PI. La primera medida es recibida con fuerte resistencia por parte de los productores. Por otro lado, la inmunidad que confieren las vacunas que se encuentran en el mercado requiere más de dos semanas para desarrollarse e incluso de más de una dosis, siendo dudosa su eficacia en presencia de inmunidad materna. A estos inconvenientes se suma que la mayoría de las formulaciones comerciales no brindan cobertura contra todas las cepas del virus que circulan en el campo. Para complementar el conjunto de herramientas para el control del VDVB se precisan antivirales que puedan prevenir la dispersión viral y evitar la inmunosupresión. Los antivirales podrían utilizarse en casos de brotes o como preventivo antes de ciertas maniobras como el transporte, encierro, inseminaciones, introducción de nuevos animales, etc. En este trabajo proponemos el uso de Interferones (IFNs) ya que son antivirales naturales, de sencilla producción y amplio espectro. En contraste con la respuesta inmune adaptativa, los mecanismos innatos de defensa inmune mediados por los IFNs son inmediatos, y resultan operativos incluso en las primeras etapas de desarrollo intrauterino. La administración de IFNs como agentes bioterapéuticos es una medida efectiva para el tratamiento de varias infecciones virales. Tradicionalmente, en terapias desarrolladas para humanos, se ha utilizado el IFN de tipo I (IFN-?). Este está siendo actualmente reemplazado, dada su toxicidad hematológica, por el IFN de tipo III (IFN-?). El efecto antiviral de esta última citoquina es idéntico al del IFN-? pero localizado en epitelios, principalmente en mucosas, sin efecto sobre las células sanguíneas. La familia del IFN-? se encuentra conservada en bovinos y el tratamiento con IFN-?3 ha mostrado ser eficaz en controlar la infección oronasal por el virus de la fiebre aftosa (VFA). No se ha estudiado la aplicación terapéutica ni la funcionalidad del IFN-?3 contra otros virus que afectan la producción ganadera. Este trabajo plantea las siguientes hipótesis: ?El IFN-?3 bovino posee actividad antiviral contra el VDVB?; y ?El IFN-?3 bovino recombinante es un candidato para ser utilizado como bioterapéutico en infecciones con el VDVB?. Para contrastar estas hipótesis, hemos clonado y expresado el IFN-?3 y el IFN-? bovinos en células de mamífero en cultivo y evaluamos su actividad antiviral frente a distintas cepas del VDVB tanto in vitro como in vivo para comprobar su potencial uso como bioterapéutico en bovinos. Los IFN recombinantes (IFNr) producidos en sobrenadantes de células HEK293T transfectadas fueron cuantificados en función a las unidades activas determinadas sobre un virus de referencia y utilizando un ensayo reportero de actividad basado en células de riñón bovino Madin-Darby T2 (MDBK-T2) transfectadas en forma estable con el promotor del gen Mx río arriba del ORF para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Para establecer la sensibilidad de cepas de campo y de referencia del VDVB a los IFNr, desarrollamos una técnica de alto rendimiento aplicable a cepas CP y NPC. Se trata de un ELISA en células que permite la medición directa de la infección detectando una proteína no estructural del virus en microplacas de cultivo celular, sin necesidad de cosechar las células. Utilizando este ensayo estimamos la concentración inhibitoria 50% para cada IFNr utilizando seis cepas de VDVB de diferente biotipo y genotipo, verificando que las cepas CP son más susceptibles a ambos IFNr que las NCP y, particularmente, las cepas NCP de tipo 2 resultaron más sensibles al IFN-?. La actividad de los IFNr fue evaluada luego in vivo, en un modelo murino de virulencia desarrollado en nuestro laboratorio, en el que ratones de la cepa BALB/c infectados con cepas del tipo 2 del VDVB desarrollan viremia a los 4 ó 7 días post infección (dpi), según la virulencia de la cepa. La cepa de alta virulencia suprimió además la respuesta proinflamatoria en estos animales. A juzgar por nuestros resultados, el tratamiento de los ratones infectados con la cepa 98-124 (de baja virulencia) con IFNr murinos comerciales mostró que el IFN-? fue más eficiente en prevenir la infección mientras que el IFN-? evitó la viremia. Experimentos de tratamiento combinado con dos dosis de IFN pre y post infección, combinando el uso de ambos IFNs, reveló que el tratamiento con IFN-? antes de la infección seguido luego por IFN-? fue efectivo en controlar la viremia en los ratones. Además, el tratamiento pre y post-infección con IFN-? resultaba igualmente protector. La limitación de la replicación del VDVB se verificó además por la ausencia de TNF-? sistémico. Estos resultados entonces indicaron que el IFN-? resultaba efectivo contra el VDVB in vivo, y que no era necesario combinarlo con IFN-?. Para evaluar el uso de nuestros IFNr en bovinos establecimos primero la inocuidad de los mismos sobre células sanguíneas bovinas (ex vivo) donde ambos IFNs mostraron ser seguros a las dosis de uso propuestas, a pesar de que el IFN-? causó apoptosis de células inmunes bovinas a dosis altas. La determinación de la inocuidad posológica se realizó directamente en los animales mediante el control de parámetros hematológicos durante 14 días post-inoculación, revelando la ausencia de toxicidad con las diferentes dosis de IFN?r evaluadas. A partir de estos resultados se realizó una prueba de concepto en terneros para evaluar la factibilidad de la utilización de IFN-?r frente a la infección con una cepa de baja virulencia aislada en la provincia de Buenos Aires, del genotipo 2 y biotipo NCP, ampliamente caracterizada en nuestro laboratorio. Se seleccionaron para el estudio 6 terneras libres del VDVB, que fueron infectadas con la cepa antedicha. Cuatro de ellas fueron inoculadas por vía sub-cutánea con dos dosis de IFN-?r dos días previos a la infección y dos días posteriores a la misma, mientras que las otras dos terneras recibieron tratamiento placebo (medio de dilución). Los animales infectados-no tratados desarrollaron enfermedad clínica con síntomas respiratorios entre los 2 a 4 días post-infección, detectándose también viremia y excreción viral a través de secreciones nasales. Los animales del grupo tratado con IFN-?r no desarrollaron enfermedad ni presentaron signos clínicos. En tres de ellos no de detectó viremia ni excreción viral nasal. Un individuo de este último grupo presentó viremia y excreción viral pero con valores menores a los del grupo no tratado. Hemos desarrollado un antiviral seguro y eficaz, IFN-?3 bovino recombinante, demostrando la factibilidad de su potencial utilización para la prevención y el tratamiento de las infecciones por el VDVB. Comprobamos el efecto antiviral del IFN-?r sobre cepas de campo y de referencia in vitro, como así también su inocuidad y eficacia en bovinos contra una cepa de campo Argentina del genotipo 2, biotipo NCP. Además, establecimos un modelo ratón de viremia por el VDVB, de gran utilidad para los estudios in vivo con este virus. Desarrollamos una técnica novedosa, que consiste en un ELISA en células que utiliza un anticuerpo detector contra una proteína conservada no estructural que puede ser potencialmente aplicable para medir con precisión la infectividad de cualquier cepa viral, independientemente de su capacidad de causar la muerte de células en cultivo. Este trabajo constituye la primera evidencia experimental del potencial bioterapéutico del IFN-? bovino contra el VDVB in vivo, abriendo una nueva perspectiva enfocada en el uso de antivirales biológicos económicos, biodegradables y seguros para reducir la incidencia de las infecciones virales en animales en ámbitos productivos. La aplicación de esta herramienta podría impactar indirectamente en la disminución del uso de antibióticos al decrecer la tasa de infecciones bacterianas que devienen de las infecciones virales inmunosupresoras.

Descripción: El exantema coital equino (ECE), causado por la infección conalfaherpesvirus equino 3 (Equid alphaherpesvirus 3, EHV-3), es una enfermedad venérea, altamente contagiosa y caracterizada por la formación de pápulas, vesículas, pústulas y úlceras en los genitales externos de yeguas y padrillos. La infección no resulta en enfermedad sistémica, ni tampoco produce infertilidad y/o aborto. El impacto negativo del ECE radica en la necesidad de interrumpir temporalmente la actividad reproductiva; el riesgo de diseminación iatrogénica de EHV-3, y la ocurrencia de brotes en centros de inseminación artificial (IA) y transferencia embrionaria (TE). Esto se ve reflejado en retrasos de las fechas de parto, disminuciones significativas del número de yeguas servidas y en las tasas de preñez en las yeguas afectadas, al reducirse las oportunidades de ser servidas. El diagnóstico se realiza en forma clínica, ya que las lesiones son muy características, pero como existen animales patentemente infectados en los que el virus se reactiva y reexcreta en forma subclínica y no predecible, la identificación de los mismos resulta crítica para prevenir la transmisión de la infección, principalmente de yeguas a padrillos durante el servicio. Existen técnicas de diagnóstico rápidas, como la PCR convencional y la PCR en tiempo real (qPCR), pero las mismas no son aplicables para determinar la excreción viral subclínica in situ, previo al servicio, IA y/o TE. Las medidas de control frente a brotes de ECE en centros de reproducción son, limitar la diseminación de la infección por medio del reposo sexual en animales clínicamente afectados, detectar tempranamente nuevos casos clínicos, e implementar estrictas medidas de higiene para evitar la transmisión mecánica. El tratamiento es paliativo y consiste en la utilización de antisépticos/astringentes, antiinflamatorios y antimicrobianos, que contribuyen a acortar el período de reposo sexual. El objetivo general de este trabajo fue disminuir el impacto negativo de las infecciones por EHV-3 mediante la evaluación de compuestos antivirales para su uso tópico, y la incorporación de un método rápido de diagnóstico rápido a campo. Inicialmente se realizó un análisis in vitro de cuatro compuestos antivirales sintéticos (aciclovir, cidofovir, ganciclovir y brivudin) y uno natural (lamda-carragenano). Con los resultados de concentración efectiva 50 (CE50) y CE100, se seleccionaron tres concentraciones de aciclovir, cidofovir y ganciclovir para continuar con el análisis de inhibición de la producción viral en cultivos celulares. Posteriormente, estos tres compuestos fueron evaluados contra seis cepas de campo de EHV-3 aisladas en nuestro laboratorio entre los años 2001 y 2009. Se demostró que 5 ug/ml de aciclovir, 2 ug/ml de cidofovir y 0,05 ug/ml de ganciclovir son efectivos para reducir la replicación de EHV-3 in vitro, siendo ganciclovir el compuesto más eficiente. Se continuó entonces, con el análisis de ganciclovir in vivo y el mismo fue preparado en crema base al 0,01% p/p (GCV 0,01% p/p) para su uso tópico, como tratamiento preventivo o terapéutico, en yeguas infectadas experimentalmente con EHV-3. Dos grupos de animales recibieron tratamiento preventivo, uno a las 4 h y el otro a las 4 y 24 h postinfección; mientras que un tercer grupo recibió tratamiento terapéutico con este compuesto una vez iniciado el cuadro clínico. Un grupo de yeguas, experimentalmente infectadas, que no recibió tratamiento antiviral y otro tratado con crema base sin antiviral (placebo) fueron los grupos controles. Como parámetros de la eficacia del compuesto in vivo, se evaluaron: signos clínicos y lesiones (mediante un score numérico); temperatura rectal; excreción viral por qPCR y por infectividad en cultivos celulares; y respuesta de anticuerpos séricos por seroneutralización. En los grupos tratados a las 4 y 4/24 h (animales clínicamente sanos, pero excretando virus), se redujo significativamente la severidad del cuadro clínico y en uno de ellos se observó una disminución significativa en el tiempo de excreción de virus infectivo (animales tratados a las 4 h post-infección). Con respecto a los animales tratados con GCV 0,01% p/p en forma terapéutica, se observó una reducción de la severidad clínica y una disminución significativa en la intensidad y en el tiempo de excreción de virus infectivo (ocho días menos). Este ensayo in vivo, representa un avance en el desarrollo de un tratamiento preventivo y/o terapéutico, basado en la aplicación tópica de ganciclovir para controlar la infección por EHV-3. Ajustes en la concentración, forma de presentación o frecuencia del tratamiento deberían considerarse para alcanzar una inhibición completa de la excreción viral. Por último, se adoptó la plataforma tecnológica conocida como PCR isotérmica aislada (iiPCR), para el diagnóstico rápido (1:30 h) de la infección por EHV-3, al pie del animal. Se realizó la validación de este método estableciendo la sensibilidad y especificidad (analítica y diagnóstica), comparado con la qPCR. Los resultados obtenidos con la iiPCR tiene una concordancia de 98,2% con la qPCR, metodología que si bien permitía el diagnóstico rápido de EHV-3 en el laboratorio, no era útil desde el punto de vista práctico para el diagnóstico rápido e in situ, previo a las maniobras reproductivas. Para concluir, tanto el uso de GCV en forma tópica como tratamiento de las lesiones producidas por la infección con EHV-3, así como también la incorporación de la tecnología de iiPCR para el diagnóstico rápido al pie del animal, podrían contribuir a disminuir el impacto negativo del ECE en la producción equina.

Descripción: El virus de la fiebre aftosa produce una de las enfermedades vesiculares más contagiosas en el ganado bovino y otros animales de pezuña hendida. Esta enfermedad, constituye una amenaza latente para los países que son libres, ya que incursiones virales se traducen en una significativa pérdida económica, no solo por merma productiva sino por el cierre de mercados comerciales. La República Argentina es un país reconocido por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) como libre de aftosa sin vacunación al sur del paralelo 42° y libre con vacunación al norte del mismo. El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA), por sus funciones como organismo nacional de control, sumado a su designación como ?Laboratorio de referencia de Fiebre Aftosa? por la OIE tiene entre sus funciones más relevantes realizar actividades que aporten al conocimiento profundo del comportamiento del virus. En este contexto, fueron de gran importancia los estudios de caracterización de las cepas responsables por las emergencias de tipo O ocurridas esporádicamente durante los años 2000-2011 en zonas del Cono Sur de Sudamérica ya reconocidas por la OIE como libres de fiebre aftosa con vacunación sistemática. El trabajo que aquí se presenta es el primer estudio de las variantes responsables de las emergencias mencionadas, que incluyó la caracterización genética, antigénica e inmunogénica, con particular énfasis en su relación con la cepa vacunal O1/Campos, en uso en la región. El impacto de los cambios genéticos y antigénicos en la protección por la vacuna en uso fue evaluado a partir de pruebas de protección heteróloga ?in vitro? e ?in vivo?. El análisis filogenético realizado a partir de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteína VP1; las variaciones a nivel aminoacídico registradas en el precursor proteico P1; así como el análisis antigénico realizado en base al perfil de reactividad con un panel de anticuerpos monoclonales muestran que estos aislamientos pertenecen a un único linaje genético, aunque se distinguen algunas variaciones a nivel antigénico. Cuando dichos aislamientos se comparan con la cepa vacunal O1/Campos es posible determinar diferencias considerables tanto a nivel genético como antigénico. A partir de los estudios de protección cruzada ?in vitro? con la cepa vacunal O1/Campos mediante valores de r1 y de expectativa de protección se infiere una respuesta protectiva satisfactoria a los 79 días post vacunación o luego de la revacunación, la cual también se alcanzó a los 30 días post vacunación en algunos de los virus estudiados. Los resultados de las pruebas ?in vitro? fueron confirmados mediante el desafío ?in vivo? a 79 días post vacunación y luego de la revacunación, utilizando como virus de descarga el último aislado viral del año 2011 en Paraguay. Se discute el valor de los estudios de protección heteróloga para cubrir los diferentes objetivos en que los resultados serán analizados: profilaxis, vacunación de emergencia y/o incorporación de un nuevo virus de campo en los bancos de antígeno/vacuna. En este contexto, y para cuando se requiere una respuesta inmune más rápida y específica, como es el caso ante una emergencia, se llevaron a cabo pruebas de comportamiento biológico con la cepa utilizada en el desafío, incluyendo el rendimiento de masa antigénica y la estabilidad de las suspensiones virales luego de su inactivación, para evaluar en forma preliminar su posible incorporación dentro del banco de antígenos del País.

Descripción: Las garrapatas son los principales vectores implicados en la transmisión de patógenos a los animales domésticos y de vida silvestre a nivel mundial. En Argentina, la especie Rhipicephalus microplus actúa como vector transmisor de dos enfermedades de relevancia en la actividad ganadera, la Babesiosis y la Anaplasmosis. Los patógenos responsables de estas enfermedades son los protozoarios Babesia bovis, Babesia bigemina y la bacteria Anaplasma marginale, siendo los tres agentes intracelulares obligados del eritrocito bovino. El estudio de la diversidad poblacional de estos patógenos a nivel genético constituye un enfoque fundamental tendiente a dilucidar el impacto de factores tales como transmisibilidad y estructura poblacional subyacente. En este trabajo, hemos desarrollado una herramienta destinada el estudio epidemiológico a nivel molecular basada en la secuenciación de múltiples loci (MLST) para cada uno de los tres patógenos. La aplicación de esta herramienta permitió la caracterización genotípica y la discriminación de distintos aislamientos. La implementación de estudios filogenéticos y programas estadísticos permitió estudiar aspectos vinculados a procesos evolutivos previos. Producto del análisis de aislamientos de campo se obtuvieron resultados sugerentes de una gran diversidad poblacional así como presencia de co-infecciones con variantes genotípicas distintas en un mismo hospedador bovino. En tal sentido se reprodujo experimentalmente la coinfección con dos genotipos distintos de B. bovis y de A. marginale a fin de comprender la dinámica de la interacción entre dos cepas en un mismo animal como un evento altamente probable en zonas enzoóticas y de alta carga de garrapatas. Este trabajo de tesis contribuye al estudio de la diversidad y estructura poblacional de los hemoparásitos B. bovis, B. bigemina y A. marginale a través del desarrollo de una herramienta de tipificación molecular de última generación.

Descripción: La trichinellosis es una enfermedad zoonótica transmitida por el consumo de alimentos infectados con Trichinella spp. En Argentina la enfermedad es endémica y principalmente transmitida por cerdos, reemergente en el período 1990/2005. El diagnóstico de esta parasitosis se puede realizar por medio de métodos directos e indirectos. Dentro de los métodos de observación directa del parásito están la técnica de digestión artificial y técnicas moleculares. Mientras que los indirectos detectan la respuesta del hospedador al parásito, particularmente en cerdos se utiliza la técnica de ELISA y la misma se confirma por medio de un Western Blot. Estas metodologías se realizan ya sea para realizar estudios de prevalencias como de métodos de detección directos de esta enfermedad. El objetivo de este trabajo fue estudiar la infección aguda y crónica de la enfermedad, la susceptibilidad de especie y la respuesta inmune de jabalíes infectados experimentalmente con T. patagoniensis y T. pseudospiralis. Como también evaluar la capacidad de detección de larvas recién nacidas durante el período ventana en sueros de jabalíes y cerdos infectados con T. patagoniensis, T. pseudospiralis y T. spiralis por medio de la técnica de PCR en tiempo real. Para este estudio se emplearon 17 jabalíes (Sus scrofa) y 6 cerdos (Sus scrofa domestica). Los animales fueron inoculados con 20000 larvas de T. patagoniensis (5 jabalíes y 1 cerdo), con 20000 larvas de T. pseudospiralis (5 jabalíes y 2 cerdos), y con 20000 larvas de T. spiralis (4 jabalíes y 2 cerdos), estos animales fueron divididos en grupos en función a su especie animal y a la especie de Trichinella inoculada. Se mantuvieron como control 3 jabalíes y 1 cerdo. Estos animales fueron revisados periódicamente y durante la fase aguda de la enfermedad fueron pesados semanalmente. Se realizaron extracciones de sangre cada 7 días durante todo el estudio. Estas muestras de sangre se utilizaron para varios estudios paralelos. Por un lado, esto se utilizó para evaluar el recuento relativo de eosinófilos en los jabalíes infectados con T. patagoniensis y T. pseudospiralis, por medio de frotis sanguíneos. Además, se utilizó el suero obtenido de las muestras de sangre de los jabalíes infectados con T. patagoniensis y T. pseudospiralis, para determinar el título de anticuerpos mediante la técnica de ELISA, utilizándose un kit comercial ¨PrioCHECK Trichinella Ab¨, esto se evaluó hasta el fin de la experiencia. Por otra parte, el suero de todos los animales infectados también fue utilizado para evaluar la presencia de larvas recién nacidas (LRN) a partir de la técnica de PCR en tiempo real. Esto se midió en los jabalíes a los 7 y 14 días post infección (d.p.i.), en los cerdos infectados con T. spiralis y T. pseudospiralis a los 2, 5, 9, 12 y 15 d.p.i, y en los cerdos infectados con T. patagoniensis a los 2, 6, 10, 12 y 15 d.p.i. Con el fin de evaluar el patrón de distribución de las larvas musculares se tomaron muestras de músculos de interés parasitológico y comercial durante la necropsia de los jabalíes infectados con T. patagoniensis y T. pseudospiralis. Los mismos fueron: lengua, diafragma, maseteros, intercostales, porción muscular del esófago, paletas, jamones, bondiola y solomillo. Estos se analizaron por medio de la técnica de digestión artificial. A su vez, también se tomaron muestras de bondiola, jamón y paleta de los jabalíes infectados con T. pseudospiralis para evaluar la tolerancia de las larvas musculares (LM) a la congelación. Estos músculos se sometieron a temperaturas de -18 ºC durante 14 días. Las fechas de muestreo fueron 2, 4, 7, 9, 11 y 14 días, y en cada fecha se digirió una muestra de cada músculo, por medio de la digestión artificial, con el fin de recuperar las larvas allí presentes y así luego inocularlas en ratones BALB/c para determinar el Índice de Capacidad Reproductiva (ICR). Ningún animal presentó signos clínicos relacionados con esta parasitosis. Durante la fase aguda de la enfermedad, no se evidenciaron diferencias en la ganancia de peso, entre los jabalíes infectados y los controles. Se evidenció un aumento en el recuento relativo de eosinófilos la primera semana p.i. en los jabalíes infectados con T. pseudospiralis y en la semana 2 p.i. en los jabalíes infectados con T. patagoniensis. Con respecto a la dinámica de anticuerpos, los jabalíes inoculados con T. patagoniensis seroconvirtieron entre las 2 4 semanas p.i., mientras que los jabalíes inoculados con T. pseudospiralis a las 2 semanas p.i. Todos los animales, excepto los controles, se mantuvieron por encima del valor de corte durante toda la experiencia (19 semanas). Diferencias estadísticamente significativas se observaron en los valores de densidad óptica (OD) entre los jabalíes inoculados con T. pseudospiralis y los inoculados con T. patagoniensis a las 2 semanas p.i. (P <0.050). La detección temprana de LRN mostró resultados variables en función a la especie animal y la especie de Trichinella bajo estudio. Las muestras tomadas a los 7 d.p.i. de los jabalíes infectados con T. spiralis fueron positivas al ser analizadas con el cebador Rep. Estas muestras positivas presentaron un rango de Ct de 29,26 ± 0,16 para una muestra y de hasta 33,37 ± 0,45 para otra, y el Ct promedio (de las muestras positivas) fue de 31,91 ± 1,70. A los 14 d.p.i. no se detectó ADN de LRN en los sueros analizados. Con respecto a los cerdos infectados con T. spiralis, el cebador Rep no logró detectar ADN circulante en suero en ninguna fecha muestreada. El cebador 18S, no logró detectar ADN de LRN en los jabalíes infectados con T. pseudospiralis, ni T. patagoniensis en las fechas muestreadas (7 y 14 d.p.i.). Con este cebador sólo se logró detectar ADN en una muestra a los 7 d.p.i. en un solo jabalí infectado con T. spiralis cuando se utilizó 1 l de ADN, al aumentar a 5 l de ADN se lograron detectar las otras 3 muestras también como positivas. La muestra realizada con 1 l de ADN presentó un valor de Ct promedio de 37,32 ± 0,45, mientras que las muestras analizadas con 5 l presentaron un rango de Ct de 35,13 ± 1,02 a 36,80 ± 0,29, con un Ct promedio de 36,21 ± 1,02. La distribución muscular de las larvas de T. pseudospiralis y T. patagoniensis arrojaron los siguientes resultados. T. patagoniensis presentó una densidad larvaria considerablemente inferior a T. pseudospiralis. Ambas especies de Trichinella mostraron predilección principalmente por la lengua y el diafragma. Seguidamente, los músculos más predilectos fueron para T. patagoniensis las paletas, mientras que para T. pseudospiralis los solomillos y bondiolas. Las cargas larvarias más altas fueron: para T. pseudospiralis 134,3 larvas por gramo (lpg) (en lengua y músculos intercostales) y para T. patagoniensis de 0,087 lpg (en la lengua). Las larvas de T. pseudospiralis recuperadas de los músculos sometidos al tratamiento de congelación (-18 ºC) se mantuvieron viables hasta las 48 h posteriores de ser colocadas en el medio propuesto. A partir del día 4 el valor del RCI fue igual a 0 en todos los grupos musculares estudiados. Este estudio nos permite comprender cómo se desarrollan estas especies cuando afectan a jabalíes, como también nos permitieron ahondar en sus capacidades biológicas. Utilizar diversos métodos diagnósticos no sólo nos permitió evaluar cómo se desarrolla esta enfermedad, sino también nos permitió comenzar a construir nuevas estrategias diagnósticas para tratar de prevenir esta parasitosis o incluso poder llegar a su diagnóstico y tratamiento precoz.

Descripción: La Bronquitis Infecciosa (BI) de las aves es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a todas las categorías productivas en la industria avícola. El agente etiológico es el virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), un miembro de la familia Coronaviridae. Es un virus pleomórfico, cuyo genoma de RNA de simple cadena (+ssRNA) codifica 4 proteínas estructurales. Entre ellas, la más importante es la proteína de la espícula (S) por su rol en la adherencia a la célula hospedadora, tropismo e inmunogenicidad. La respuesta inmune se basa en la producción de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra determinantes antigénicos de dominios ubicados en la subunidad S1 de la proteína S. Estos dominios presentan alta variabilidad, por lo que existen diversas variantes de IBV con escasa o nula protección cruzada. Las variantes pueden ser caracterizadas mediante ensayos de virus neutralización con sueros de referencia lo que permite establecer serotipos virales. En general, se considera que la infección o vacunación con un serotipo otorga protección baja o insignificante contra la infección de un virus heterólogo. La región genómica que codifica la subunidad S1 también ha sido empleada para la caracterización genética de IBV. En base a esta caracterización se ha determinado que en Argentina existen dos variantes de campo pertenecientes a los linajes GI-11 y GI-16, siendo este último el más prevalente en la actualidad. En nuestro país, durante décadas el control de la enfermedad estuvo basada en el uso de dos serotipos vacunales, Massachusetts (Mass) y Connecticut (Conn), hasta que en el 2013 se autorizó el uso del serotipo 793/B. Sin embargo, solo recientemente, y en nuestro laboratorio, se comenzó a trabajar en estudiar las similitudes antigénicas de las cepas de campo y los serotipos vacunales. En esta tesis se alcanzó el objetivo de caracterizar antigénicamente a la cepa de campo A13 (linaje GI-16) determinando su relación con las vacunas comerciales. Ello se logró mediante la técnica de virus neutralización cruzada empleando (en una primera instancia) embriones de pollo (EP). Posteriormente, se implementó un sistema de cultivo primario de riñón de embrión de pollo (ChEK) mucho menos laborioso y costoso que el de EP. De este modo, se estableció que las cepas A13 (GI-16), CHu8 (GI-11), Ma5 (GI-1) y CR88 (GI-13) pertenecen a serotipos diferentes. Este resultado sugiere la necesidad de replantear las actuales estrategias de prevención considerando el uso de una vacuna homóloga a la variante de campo (GI-16), que al día de la fecha no existe disponible comercialmente. De este modo, la posibilidad de contar con una vacuna perteneciente al linaje GI-16 contribuiría al control de BI en nuestro país. Para ello es necesario, en primer lugar, contar con una cepa perteneciente al linaje GI-16 con potencial para ser usada como vacuna atenuada. Es así como en este trabajo primero se obtuvo, mediante pasajes en serie en EP, una cepa (A13) atenuada, que posteriormente fue evaluada para ponderar su potencial como candidata vacunal. Esta evaluación se basó en la aplicación de las siguientes las pruebas: i) inocuidad, administrada en dosis elevada (109,624 DIE50/ml) a pollitos de un día no generó trastornos de salud), inmunogenicidad, adecuados títulos de anticuerpos en todos los pollos inoculados (a una dosis de 105 DIE50/ml), iii) estabilidad (no revirtió luego de 4 pasajes por contacto natural) y iv) mayor eficiencia ante el desafío con una cepa homóloga (comparada con vacunas comerciales de los serotipos Massachusetts y 793/B). Para la prueba de desafío se desarrollaron y/o adaptaron técnicas que fueron optimizadas para su empleo. Dos de ellas fueron críticas para la evaluación: i) la cuantificación de la carga viral en tráquea y riñón mediante una RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) y ii) la prueba de la ciliostasis en muestras de tráquea (mediante sistema de scores). Por otro lado, en este trabajo también se realizó un estudio de evolución viral empleando como insumo algunos pasajes en serie (en distintos soportes biológicos) de diferentes cepas de IBV. El objetivo fue obtener variantes que contengan cambios fenotípicos (virulencia) y evaluar si los mismos estaban relacionados a cambios del genoma. Además, algunos de esos pasajes sirvieron para otros ensayos de esta tesis (obtención del candidato vacunal y el virus de desafío para el ensayo de eficiencia). El estudio de evolución viral demostró que la mayoría de los cambios de nucleótidos (y aminoácidos codificados) se producen en el ORF1 y en el gen S (fundamentalmente en la subunidad S1). Lamentablemente, en este estudio no se ha logrado detectar un patrón de cambios en la secuencia de nucleótidos que permita asociarlos a la replicación en un hospedador en particular o a cambios en la virulencia. En síntesis, los resultados obtenidos en esta tesis permitieron caracterizar antigénicamente a la cepa de mayor circulación en la industria avícola argentina, determinar su falta de relación con las vacunas comerciales, y obtener un candidato vacunal que cumple con los estándares de seguridad y otorga una adecuada respuesta inmune ante un desafío homólogo

Descripción: L. maximus presenta características reproductivas inusuales en los mamíferos euterios como su elevada tasa de ovulación y un proceso de reabsorción embrionaria selectiva durante la primera mitad de la preñez. A pesar de tener una alta tasa ovulatoria, sólo 8 a 12 oocitos son fecundados e implantados y el embrión más cercano al cérvix en cada cuerno uterino presenta un desarrollo normal; el resto sufre reabsorción. Una gestación exitosa requiere un balance inmunológico Th1/Th2 inclinado hacia la actividad Th2; la prevalencia de Th1 se asocia con reabsorción fetal. En animales domésticos, el 80% de las pérdidas embrionarias ocurre durante el período de peri-implantación. La insuficiencia de progesterona (P4) en circulación uterina podría generar una considerable pérdida de embriones. El objetivo de este trabajo fue analizar las posibles causas y mecanismos del inusual proceso de reabsorción embrionaria selectiva que presenta L. maximus y su vinculación con la respuesta inmunológica. En L. maximus la decidualización y la reabsorción se presentan como dos procesos que suceden de manera diferida y en sentido inverso a lo largo del cuerno uterino. El sector uterino más cercano al cérvix presentó mayor concentración de P4. El único embrión que se gesta a término mostró mayores niveles de P4 y estrógeno (E2). La presencia de mayores niveles hormonales se debería a que la arteria uterina, rama de la arteria ilíaca, tiene un trayecto ascendente. Durante la preñez se encontraron niveles bajos de IL-10 con marcada presencia de IFN-?, indicando una respuesta Th1 activa. La reabsorción embrionaria estaría generada por apoptosis, seguida de necrosis. Los niveles de P4 podrían no ser suficientes para generar la inmunoprotección fetal. Ante el descenso de P4 durante la gestación, se daría la secreción de citocinas de Th1 perjudiciales para el feto; al producirse la pseudoovulación durante la preñez, los cuerpos luteos accesorios producen un nuevo aumento de P4 salvando el único feto más cercano al cérvix. En L. maximus las alteraciones hormonales durante la preñez darían cambios en el sistema inmunológico generando como resultado final la reabsorción embrionaria selectiva. Por último, el hallazgo de espículas peneanas en L. maximus permitió establecer el probable caracter de ovulador inducido

Descripción: La infección por Influenza A virus (IAV) es considerada una de las principales causas de enfermedad respiratoria en cerdos. Además, su carácter zoonótico representa un riesgo para la salud pública. En Argentina, si bien existían reportes de presencia de anticuerpos, el primer aislamiento de IAV en cerdos fue en el año 2008, de un subtipo H3N2 completamente humano. Luego, asociado a la pandemia humana del año 2009, se aisló un subtipo H1N1 pandémico (H1N1pdm09) y se reportaron múltiples cuadros clínicos relacionados a este virus. Es por ello que el objetivo general de este trabajo fue caracterizar las cepas de IAV circulantes en cerdos en Argentina y la forma de presentación de dicha infección. Se realizaron estudios clínicos, patológicos, serológicos y virológicos en nueve granjas intensivas porcinas. Los resultados demostraron una presentación clínico-epidemiológica endémica en 8 granjas en animales de entre 21 y 50 días. Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico más frecuente fue la bronconeumonía supurativa con bronquiolitis necrotizante. Los estudios serológicos evidenciaron dos patrones. En uno de ellos se observó una caída de los anticuerpos calostrales entre los 21 y 49 días y un posterior aumento marcado en el porcentaje de animales seropositivos (20 a 80%), lo cual se asoció con una circulación activa del virus. En cambio, en el otro patrón, observado en dos granjas, se detectó un bajo porcentaje de animales seropositivos en reproductores, menos del 50%, y en la línea de producción, el mayor porcentaje de cerdos positivos fue del 20%, lo cual es sugerente de una infección endémica con baja circulación del virus. Los resultados de los ensayos de Inhibición de la Hemoaglutinación detectaron anticuerpos contra H1pdm09, ?H1 y H3 en todas las granjas y en el 75% de los animales presencia de anticuerpos contra más de un subtipo. Se detectó, mediante rRT-PCR, IAV en 7 granjas, la mayoría entre los 21 y 50 días de vida, y se obtuvieron 5 aislamientos, 4 fueron caracterizados como subtipo H1N1pmd09 y uno como subtipo H3N2. Se realizaron además, estudios clínicos y virológicos en 12 granjas intensivas que reportaron cuadros compatibles con infección por IAV. La inspección clínica determinó, en 8 granjas, el cuadro clínico endémico y en 4 granjas se observó la forma epidémica. La edad de presentación de los signos clínicos fue variable, siendo los animales de postdestete los más afectados (30 a 40 días). Todas las granjas evaluadas fueron positivas por rRT-PCR y la edad de detección del virus coincidió con la edad de presentación de los signos clínicos. Se obtuvieron un total de 13 aislamientos de IAV, H1N1pdm09 (7), H1N2 ?2 (3) y H3N2 cluster II (3). Se evaluó la circulación de IAV en pequeños productores y productores familiares. Se tomaron muestras de 57 establecimientos de distintas regiones del país. Los estudios serológicos detectaron la presencia de anticuerpos contra H1pdm09 en más del 60% de los establecimientos y en el 40% de los animales, mientras que menos del 17% de los establecimientos y del 2% de los animales fueron positivos para el subtipo H3. Se realizó el diagnóstico y la caracterización de IAV a partir de muestras enviadas al Laboratorio de Aves y Porcinos, CICVyA, INTA. Se recibieron muestras de 51 establecimientos, de 10 provincias y se obtuvieron 27 aislamientos. El 70% de los subtipos aislados fueron caracterizados como H1N1pdm09. También se obtuvieron aislamientos de los subtipos ?2 H1N2; ?2 H1N1; ?1 H1N1 y H3N2. El análisis filogenético del total de los aislamientos (N=45), mostró un predominio en la circulación del subtipo H1N1pdm09. Solamente 5 aislamientos se caracterizaron como subtipo H3N2 cluster II, 8 aislamientos como ?2 H1N2, un único aislamiento como subtipo ?2 H1N1 y el restante como subtipo ?1 H1N2. Todos ellos poseen gen M pandémico y genes externos de IAV humanos estacionales. Se identificaron 9 introducciones de IAV de humanos a cerdos, 7 relacionadas con la pandemia H1N1 del año 2009 y 2 con IAV humanos estacionales H3 y H1, circulantes más de una década atrás. Los estudios de cartografía antigénica demostraron que, a pesar de la similitud a nivel genético en los virus detectados en el país, las diferencias antigénicas son marcadas. La infección por IAV se encuentra ampliamente diseminada en cerdos de nuestro país. En la mayoría de las granjas evaluadas se observó la presentación endémica (subclínica). Estos resultados alertan sobre la posible generación de virus reasortantes y la presencia de un porcentaje variable de animales sin anticuerpos contra IAV que permitirían la persistencia de la infección. La totalidad de los subtipos de IAV circulantes en cerdos en Argentina corresponde a introducciones de virus de origen humano, en algunos casos relacionados con cepas circulantes más de una década atrás. Esto resalta la importancia del hombre en la epidemiología de IAV en cerdos en nuestro país y supone un riesgo para la población humana por la posibilidad de reintroducciones. La información generada en este estudio muestra que los subtipos circulantes en el país no se corresponden con los reportados en Norteamérica y Eurasia. Este hecho, sumado a la alta variación antigénica observada y a la rápida evolución de IAV, alerta sobre la necesidad de desarrollo de inmunógenos locales y ensayos diagnósticos que permitan el correcto control de IAV en las explotaciones porcinas de nuestro país.

Descripción: El crecimiento demográfico y la creciente demanda de alimentos de origen animal han originado una intensificación de los sistemas de producción ganadera. La aplicación de excretas de feedlot como fertilizantes a suelos agrícolas es una fuente relevante de incorporación de metales al suelo, debido principalmente a la suplementación mineral en las raciones de los animales engordados en confinamiento. En los sistemas pastoriles de producción ganadera, los proveedores naturales de minerales son las pasturas y el agua de bebida. Por lo tanto, la fertilización de los forrajes que consumen los bovinos con enmiendas orgánicas ricas en elementos traza, se presenta como una alternativa a la suplementación animal de minerales usualmente realizada vía sistémica. El objetivo general del presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido evaluar el enriquecimiento de forrajes destinados a rumiantes con micronutrientes mediante la aplicación de enmiendas orgánicas y su absorción a nivel ruminal. Los contenidos del trabajo de tesis incluyen: a) Micronutrientes en excretas de sistemas intensivo de engorde bovino. En este Capítulo se evaluó en primer lugar, la evolución de la ganadería hacia la intensificación de sistemas ganaderos. Posteriormente se analizaron características generales de los sistemas intensivos de producción, producción de excretas y análisis de su composición, haciendo énfasis en el contenido total y biodisponibilidad de micronutrientes (Cu, Zn, Co y Mo). b) Carencia de micronutrientes en sistemas extensivos de ganadería bovina. En este Capítulo se realizó una revisión de los factores determinantes de carencias minerales y una descripción de los cuadros carenciales de presentación frecuente en nuestro país. Así mismo, se evaluó el contenido total y la biodisponibilidad de micronutrientes (Cu, Zn, Co, Mo y Se) en suelos de la provincia de Buenos Aires donde fue reportada la carencia. c) Enriquecimiento de forrajes con micronutrientes: prueba preliminar de fertilización en microcosmos y ensayo en parcelas. En estos capítulos, se presentan ensayos de fertilización, donde se utilizan excretas provenientes de sistemas intensivos de producción, ricas en micronutrientes (Cu y Zn), como enmiendas orgánicas. d) Metabolismo de micronutrientes en rumiantes. En este Capítulo se evalúa la liberación en rumen de elementos minerales (Cu y Zn), a partir de mezclas forrajeras con y sin tratamiento de fertilización con micronutrientes. Los resultados obtenidos a partir de los estudios realizados permiten concluir: - Las excretas provenientes de sistemas intensivos de producción bovina, presentan altos contenidos totales de Cu y Zn provenientes de la dieta. A partir del fraccionamiento secuencial de las mismas; se determinó un mayor porcentaje de fracción soluble o intercambiable de elementos traza respecto de excretas provenientes de sistemas extensivos de producción sin suplementación mineral. - Las muestras de suelos analizadas, presentaron valores de concentración total Cu, Zn y Se cercanos al límite inferior del rango considerado normal para suelos agrícolas, perteneciendo las mismas a zonas de la Región Pampeana donde se reportó la carencia de dichos minerales. Así mismo, a partir del fraccionamiento secuencial, se determinó que las muestras de suelo analizadas presentaron baja disponibilidad de Cu, Co y Mo; mientras que para Zn la biodisponibilidad vario considerablemente entre las distintas muestras.- A partir de la prueba preliminar de fertilización en macetas, se obtuvieron respuestas positivas al agregado de excretas como enmiendas orgánicas, habiéndose observado un incremento en el porcentaje de materia seca determinada por maceta, y una mejora en los parámetros de crecimientos de las especies forrajeras utilizadas (raigrás perenne y trébol blanco). - La incorporación de excretas provenientes de sistemas intensivo de producción, permite incrementar las concentraciones de Cu y Zn en la biomasa foliar de las especies forrajeras analizadas, 30 días post siembra de las mismas. Esta mayor asimilación de dichos metales traza, se ve favorecido por el mayor contenido total y mayor porcentaje de fracción soluble de dichos metales traza, aportado por las excretas a los suelos. - A partir de los resultados obtenidos del ensayo de fertilización en parcelas, se pudo corroborar el enriquecimiento de Cu y Zn en forrajes implantados a partir del agregado de excretas intensivas a los 30 días post aplicación de las mismas.- Así mismo, se obtuvieron mejores respuestas a la fertilización con enmiendas orgánicas respecto al uso de fertilizantes inorgánicos (CuSO4 ? ZnSO4), independientemente de la dosis utilizada. - La aplicación de excretas provenientes de sistemas intensivos a los suelos como fertilizantes, promueve un efecto sobre la movilidad y liberación gradual de elementos traza desde fracciones menos disponibles para las plantas (como las fracción unida a materia orgánica e fracción inorgánica) obtenidas por fraccionamiento secuencial. - La forma de aplicación, dosis y persistencias de sulfato de Cu y sulfato de Zn en los suelos luego de su aplicación, son factores que condicionan incorporación de dichos elementos trazas a los forrajes. - Las concentraciones determinadas de Cu y Zn en las muestras de forrajes obtenidas en las experiencias en parcelas 30 post aplicación de los diferentes tratamientos de fertilización, permitirían cubrir los requerimientos de dichos micronutrientes en bovinos de carne, debiendo también considerarse factores del animal y del alimento. - A tiempos de cosecha más tardíos (90 días pos aplicación de los tratamientos), se obtuvieron respuestas variables a la aplicación de enmiendas orgánicas y fuentes inorgánicas de fertilización. - La dinámica de crecimiento de las especies forrajeras, el envejecimiento de los tejidos de las plantas y la defoliación pueden explicar las menores concentraciones de Cu y Zn en la biomasa foliar a tiempos más tardíos de cosecha independientemente del tratamiento de fertilización aplicado. - La incubación ruminal de forrajes frescos (enriquecidos en Cu y Zn, y sin fertilización) mostró altos porcentajes de degradabilidad de la materia seca total acompañado por altos porcentajes de liberación de Cu y Zn al medio ruminal a tiempos cortos de incubación (3 ? 9 horas). El secado en estufa de las muestras de forraje disminuye la degradabilidad de la materia seca incubada afectando la disponibilidad posterior de nutrientes contenidos en el alimento. La aplicación de excretas provenientes de sistemas intensivos de producción bovina como fertilizantes, favorece la incorporación de Cu y Zn en especies forrajeras debido principalmente a los mayores contenidos y aporte de formas biodisponibles de dichos metales a los suelos. De esta forma, la reutilización de dichas enmiendas orgánicas disminuye el peligro potencial de contaminación ambiental a partir del excedente de micronutrientes eliminados en excretas; como así también permite compensar carencias de Cu y Zn en zonas de cría de ganado vacuno. El aporte de micronutrientes a partir de los forrajes, permite cubrir los requerimientos minerales del ganado vacuno; hecho favorecido por la alta tasa de liberación ruminal de elementos traza a partir de los mismos.

Descripción: La clindamicina es un antimicrobiano indicado en medicina veterinaria para el tratamiento de infecciones por estafilococos y microorganismos anaerobios en pequeños animales. Los objetivos de este trabajo fueron poner a punto un método cromatográfico para la determinación cualitativa y cuantitativa de la clindamicina en plasma canino y felino. Caracterizar el perfil farmacocinético plasmático de la clindamicina en caninos y felinos domésticos luego de su administración por vía endovenosa y oral. Comparar la farmacocinética de la clindamicina entre caninos y felinos. Establecer y comparar la influencia del alimento sobre el perfil farmacocinético de la clindamicina administrada vía oral en caninos y felinos. Relevar el perfil de sensibilidad bacteriana a la clindamicina a través de la prueba de susceptibilidad in vitro, CIM, para microorganismos causantes de infección en caninos y felinos. Establecer las interacciones farmacológicas in vitro entre la clindamicina y otros antibióticos de uso frecuente en medicina de pequeños animales sobre cepas bacterianas aisladas en infecciones en caninos y felinos. En base a las interacciones estudiadas, proponer o no la conveniencia del empleo de asociaciones antibióticas de clindamicina en caninos y felinos domésticos. Calcular los predictores de eficacia terapéutica para la clindamicina en las distintas situaciones planteadas (especie animal, vía de administración y alimento) a través de la integración de los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos apropiados para este antibiótico. En base a los resultados obtenidos, proponer regímenes posológicos racionales para la clindamicina administrada por vía endovenosa y oral, tanto en ayuno como con alimento, a caninos y felinos. Para el estudio farmacocinético de la clindamicina se empleó un diseño cruzado (2x2x2). El antimicrobiano se administró por vía endovenosa en ambas especies a una dosis de 10 mg/kg y por vía oral, en ayunas y luego de recibir alimento, a una dosis de 8,3 ± 1,1 mg/kg a perros y 15 mg/kg a gatos. Cuando la administración se realizó con comida todos los animales recibieron su ración correspondiente de alimento e inmediatamente luego se les administró el antibiótico con agua para favorecer su deglución. La cuantificación del antibiótico en plasma se realizó mediante el método HPLC con detección UV. El perfil de susceptibilidad al antibiótico de los microorganismos causantes de infección en pequeños animales, se estableció mediante la determinación de la CIM por el método de macrodilución en caldo. El estudio de interacción in vitro entre la clindamicina con otros antimicrobianos de uso frecuente en medicina de pequeños animales, gentamicina, ampicilina, enrofloxacina y doxiciclina se llevó a cabo mediante la técnica del Tablero de Damas. El análisis FC/FD para este fármaco se realizó a través del cálculo de los predictores de eficacia t>CIM y ABC0-24/CIM. Luego de la administración endovenosa la clindamicina se distribuyó ampliamente y de forma similar en caninos y felinos con un Vc de 0,96 l/kg y 0,94 l/kg, respectivamente. La eliminación fue significativamente (p<0,05) más lenta en caninos definida con un Cl de 0,28 l/h/kg y una vida media de eliminación de 3,36 h mientras que en los felinos estos parámetros tomaron valores de 0,45 l/h/kg y 2,56 h respectivamente. Tras la administración oral en ayunas la clindamicina se absorbió rápidamente en ambas especies, con un Tmax en perros de 1,12 h y en gatos de 0,57 h, siendo significativamente (p<0,05) más temprana en estos últimos. La biodisponibilidad oral en ayunas fue buena tanto en caninos como en felinos, pero con un mayor valor para los gatos, siendo 61,9% y 94,8%, respectivamente. La presencia de alimento en el tubo digestivo no modificó significativamente la biodisponibilidad oral del antimicrobiano, siendo de 50,4% en perros y 90,3% en gatos. Se observaron cambios significativos (p<0,05) en la velocidad de absorción, aumentando en los perros con un Tmax de 0,75 h y retrasándose en los gatos, cuyoTmax fue de 0,96 h. La CIM50 de los Staphylococcus pseudintermedius causantes de infección en caninos y felinos tuvo un valor de 0,12 µg/ml mientras que el valor de CIM90 tomó valores superiores a 4 µg/ml, concentración a partir de la cual los microorganismos se clasifican como resistentes a este antimicrobiano. El porcentaje de resistencia para estos microorganismos fue del 38%. La interacción de la clindamicina con la doxiciclina, la ampicilina, la enrofloxacina y la gentamicina, analizada mediante el Tablero de Damas sobre el S. pseudintermedius, resultó en indiferencia para todas las combinaciones, excepto para la doxiciclina, con la cual se detectó sinergismo en uno de sus puntos de combinación. El resultado del predictor de eficacia FC/FD t>CIM para la administración endovenosa de la clindamicina a caninos y felinos fue de 15 h y 13 h respectivamente, dando un intervalo posológico óptimo de 24 h. Luego de la administración oral del antibiótico a caninos, en ayunas y con alimento, el t>CIM fue de 9 h en ambas condiciones, y por ende el intervalo posológico apropiado en este caso sería de 12 h. En felinos este predictor tomó valores superiores, 12 h oral en ayunas y 13 h con alimento, dejando un intervalo posológico de 24 h. El segundo predictor de eficacia calculado fue el ABC0-24/CIM50, y sus valores para la vía endovenosa, oral en ayunas y con alimento en caninos fueron 329, 159 y 134 respectivamente, mientras que en felinos fueron 210, 257 y 286. Luego de la administración endovenosa de la clindamicina en caninos y felinos la misma se distribuyó rápidamente, en forma amplia y similar en ambas especies. Por otro lado, el proceso de eliminación ocurrió con mayor velocidad en gatos respecto a perros. La absorción oral de la clindamicina en ayunas fue rápida presentando una buena biodisponibilidad en ambas especies, aunque mayor en los gatos respecto a los perros. El alimento no modificó significativamente la biodisponibilidad oral del antimicrobiano en ninguna de las especies en estudio. Se encontró un comportamiento distinto en la velocidad de absorción en perros y gatos, mientras que en los primeros el antimicrobiano administrado con comida se absorbió más rápido, en los segundos ocurrió lo contrario, viéndose enlentecido el proceso de absorción en presencia de alimento en el tubo digestivo. La sensibilidad de las cepas de estafilococos estudiadas fue moderada, señalando un porcentaje considerable de microorganismos resistentes a este antibiótico. Al combinar in vitro la clindamicina con otros antimicrobianos de uso frecuente en pequeños animales el resultado obtenido fue de indiferencia para todas las combinaciones excepto para la doxiciclina con la que se detectó sinergismo. El predictor de eficacia t>CIM resultó prolongado en ambas especies permitiendo en felinos un intervalo posológico de 24 horas a las dosis empleadas, mientras que en caninos el intervalo para la vía oral debiera reducirse a 12 horas. Al no existir valores de referencia en medicina humana como veterinaria para el predictor de eficacia ABC0-24/CIM, pudieron establecerse valores en ambas especies con las dosis empleadas en este trabajo.

Descripción: La extinción de especies animales es una de las consecuencias más alarmantes provocada por el deterioro ambiental y nos priva, de manera irreversible, de un material genético único e irremplazable. La Familia Felidae no escapa a esta problemática y es por este motivo que las biotecnologías reproductivas se convierten en herramientas muy poderosas para la conservación de estas especies. La hipótesis de la presente tesis doctoral radica en que es posible utilizar ovocitos u ovoplastos de gata doméstica (Gd) para desarrollar técnicas reproductivas aplicables a felinos silvestres. Por ende, nuestro principal objetivo fue adaptar las biotecnologías existentes, para reproducir y conservar felinos en peligro de extinción. Debido a la limitada disponibilidad de ovocitos de felinos silvestres, se utilizó como modelo experimental ovocitos de Gd para desarrollar las diferentes técnicas. En el Capítulo I, se estudiaron diferentes condiciones de maduración y cultivo embrionario para mejorar los resultados de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en el Gd. De esta manera, determinamos que utilizando el suplemento insulina-transferrina y selenio (ITS) durante la maduración de los ovocitos, y baja tensión de oxígeno (5%O2) durante el cultivo, se obtienen mayores tasas de formación de blastocistos, que realizando la maduración sin ITS o cultivando con 21%O2. Luego, se seleccionaron las mejores condiciones para generar embriones interespecíficos inyectando espermatozoides de chita (Ch, Acinonyx jubatus) y leopardo (Leo, Panthera pardus) en ovocitos de Gd. En este experimento, se obtuvieron tasas similares de formación de blastocisto tanto en el control de ICSI homoespecífica de Gd como en los embriones interespecíficos, sin necesidad de realizar activación química luego de la inyección del espermatozoide. Con este trabajo fue posible evaluar la capacidad de desarrollo de los espermatozoides de felinos silvestres por la técnica de ICSI interespecífica utilizando ovocitos de Gd. En el capítulo II, se estudió la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, del inglés somatic cell nuclear transfer) en felinos. El objetivo consistió en desarrollar nuevas estrategias de SCNT para mejorar la técnica en el Gd y en felinos silvestres. En primer lugar evaluamos tres técnicas diferentes de SCNT en el Gd, dos de las cuales no habían sido previamente reportadas en esta especie. Las tres técnicas fueron: fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos con zona pelúcida (ZP), inyección de la célula donante de núcleo en ovoplastos con ZP, y fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos libres de ZP. Esta última fue la que resultó más eficiente por lo que se decidió utilizar esta técnica para determinar la capacidad del ovoplasto de Gd de reprogramar células de felinos filogenéticamente distantes por SCNT interespecífica (SCNTi). Las células donantes utilizadas fueron de gato bengal (Be, híbrido entre gato doméstico y leopardo asiático), chita y tigre (Ti, Panthera tigris). Asimismo, se evaluó el efecto de la agregación embrionaria cultivando los embriones reconstituidos libres de ZP en micropozos de manera individual (1X) o de a 2 clones de la misma especie juntos (2X, embriones agregados), con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro y la calidad de los embriones, tal como se había reportado para otras especies. En este experimento, se obtuvieron embriones hasta el estadío de blastocisto de todas las especies. La agregación de embriones mejoró la tasa de desarrollo en todos los grupos y la calidad de los blastocistos de Gd y de Ti. Además, se estudiaron los niveles relativos de expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación temprana (OCT4, NANOG, SOX2 y CDX2) en blastocistos clones de Gd, Be y Ch. Este estudio reveló que los embriones de Gd1X tenían mayor nivel relativo de expresión de los cuatro genes comparado con embriones del grupo control de fecundación in vitro (FIV). Sin embargo, esta sobre-expresión se vio reducida en los blastocistos derivados del grupo Gd2X, en los que se determinó que los cuatro genes alcanzaron niveles relativos de expresión similares a los de FIV. Por otra parte, los niveles relativos de expresión de los cuatro genes en los embriones de chita fueron inferiores que los del control, observándose también este resultado para los niveles relativos de expresión del gen OCT4 en embriones de bengal. Como conclusión, podemos afirmar que la técnica de ICSI representa una metodología directamente aplicable a la reproducción de felinos silvestres, especialmente cuando las muestras seminales son de baja calidad. Con respeto a la SCNT y SCNTi, los ovocitos de gata doméstica fueron capaces de reprogramar células de otras especies silvestres y generar blastocistos. Además, la agregación de clones ha demostrado mejorar el desarrollo de los embriones en todos los grupos y normalizar la expresión relativa de genes en el gato doméstico, pero no en los embriones interespecíficos. La SCNT representa una alternativa para generar animales que no están en edad reproductiva o que han muerto y sus células fueron criopreservadas. La presente tesis aporta nuevas metodologías biotecnológicas y conocimiento para la reproducción en felinos.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae que afecta al ganado bovino en Argentina y en el mundo, ocasionando importantes pérdidas productivas y reproductivas. Uno de los pilares fundamentales en el control de este virus es la identificación y eliminación de los animales persistentemente infectados. Para ello se requieren técnicas diagnósticas de alta sensibilidad/especificidad, rápidas, económicas y adaptadas a la situación epidemiológica local. En esta tesis se adaptó e implementó un método de reacción en cadena de la polimerasa convencional con transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del VDVB en sueros bovinos provenientes de programas de saneamiento del virus y en casos clínicos. Asimismo, se evaluó y comparó el desempeño del aislamiento viral, ELISA para detección de antígeno, RT-PCR convencional y en tiempo real para la detección del VDVB en muestras de sueros y en casos de abortos o mortalidad neonatal. La variabilidad y evolución genética de las cepas obtenidas en este y en otros estudios nacionales se evaluó mediante estudios de filogenia y filodinamia. La técnica RT-PCR presentó una elevada sensibilidad analítica para su uso en muestras de sueros individuales o en pools bajo las condiciones epidemiológicas del país. Mediante la propuesta sanitaria para el control del VDVB se detectó al virus en el 1% de los bovinos y en el 20% de los rodeos. Aunque este trabajo no fue realizado bajo un estricto diseño epidemiológico, los resultados obtenidos aportan datos valiosos a la limitada información de la prevalencia del VDVB en Argentina. Por otra parte, el método RT-PCR mostró un adecuado desempeño para la identificación del virus en muestras de fetos abortados y mortalidad neonatal, que comúnmente presentan alto grado de autolisis y/o contaminación ambiental. Al comparar las técnicas para la detección del VDVB en suero, se demostró que cualquiera de las técnicas evaluadas puede ser empleada para la identificación del virus en muestras individuales de suero. En cuanto a la aplicación de las técnicas diagnósticas para la identificación del VDVB en muestras fetales, se concluye que ambos métodos moleculares fueron más adecuados que el ELISA. Las técnicas moleculares adecuadamente estandarizadas deberían incorporarse de forma rutinaria en los protocolos de diagnóstico de pérdidas reproductivas asociadas al VDVB. El estudio filogenético confirmó la circulación de los subtipos 1a, 1b y 2b del VDVB, con predominio del VDVB-1b. Mediante filodinamia se profundizó la caracterización de los dos subtipos más prevalentes en el país, 1a y 1b. Ambos habrían iniciado su diversificación genética entre las décadas del 50 y 60, en coincidencia con las primeras descripciones clínicas de la enfermedad en el país. El fragmento 5´UTR del VDVB-1a presentó mayor variabilidad genética que el VDVB-1b, aunque las curvas demográficas mostraron largos períodos de diversidad genética constante en ambos subtipos, confirmando así su naturaleza endémica. Se concluye que en el país se disponen técnicas de diagnóstico sensibles y específicas para la detección del VDVB; dependiendo su elección de diversos factores como el tipo de muestra, cantidad de individuos a evaluar, presentación clínica, infraestructura del laboratorio, costos, entre otros. La información obtenida a partir de los estudios genéticos contribuye al conocimiento de la historia evolutiva del VDVB en Argentina, siendo estos datos útiles para el diseño y evaluación de estudios epidemiológicos, herramientas diagnósticas y programas de control de la enfermedad

Descripción: Con los objetivos de: 1) desarrollar un modelo de deficiencia subclíncia de zinc (Zn) en ovinos y 2) estimar la biodisponibilidad relativa (BDR) del Zn en un complejo Zn-aminoácidos con respecto al sulfato de Zn (ZnSO4) para ovinos en crecimiento, se llevaron a cabos dos ensayos. En el primer ensayo, 10 corderos de raza Corriedale, con un peso promedio de 10,09 kg de peso, fueron asignados aleatoriamente a dos grupos: Basal (B) y Suplementado con Zn (Z). La dieta B contenía 10 ppm de zinc (Zn), base materia seca (MS), y la dieta Z fue suplementada con ZnSO4, para aportar un nivel extra de 30 ppm de Zn. El ensayo se extendió por el término de 5 meses, período durante el cual los animales se pesaron mensualmente. También con esta periodicidad, fueron sangrados de vena yugular, para la posterior medición de parámetros hematológicos y de los niveles de Zn, Cu y fosfatasa alcalina (FA) en plasma. A los 45 días y hacia el final del período experimental, se realizaron ensayos de balance de Zn, Cu y nitrógeno (N). Posteriormente, se procedió al sacrificio de los animales y se recogieron muestras de músculo (longissimus dorsi, supraescapular y semimembranoso), hígado, páncreas, testículo, riñón, pulmón, hueso (metacarpo y metatarso) y lana para la determinación de los niveles de Zn y Cu. Por otro lado, también se tomaron muestras de piel (zonas del flanco y del vientre), hueso (metacarpo y metatarso, tercios distales), testículo, páncreas y del epitelio de lengua, esófago, rumen y vejiga para ser procesadas histológicamente. La ganancia de peso y la calidad de la lana fueron similares en ambos grupos, mientras que la producción de lana fue superior en el grupo Z. Los niveles de Zn plasmático fueron significativamente mayores en el grupo Z que en el grupo B, pero los niveles de FA plasmática, el hematocrito, la concentración de hemoglobina, y el número de glóbulos rojos, leucocitos y linfocitos en sangre no difirieron entre grupos. Las cupremias tendieron (p<0,10) a ser mayores en el grupo B. De acuerdo al primer ensayo de balance, las retenciones de Zn y de N fueron significativamente mayores en el grupo Z. La retención porcentual de Zn en grupo B fue mayor y mostró la puesta en marcha de los mecanismos homeostáticos. La retención de Cu tendió (p<0,10) a ser mayor en el grupo B. En el segundo ensayo de balance los resultados (Zn, Cu y N) fueron similares. En el segundo ensayo, 20 corderos Corriedale, con un peso de 15,3 kg fueron asignados en forma aleatoria a cinco grupos: Basal (dieta con 10 ppm de Zn), suplementados con ZnSO4 y con un complejo Zn-aminoácidos para proveer, en ambos casos, niveles adicionales de 10 y 20 ppm. Con los animales, se trabajó con una metodología similar al primer ensayo. Para la determinación de la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos en comparación con ZnSO4 fueron elegidas las cinco variables que respondieron, en las dos fuentes, con incrementos lineales al aumento de la dosis de Zn. Las mismas fueron: Zn aparentemente digerido (períodos 1 y 2), retención de Zn (períodos 1 y 2) y Zn hepático. Si bien, en los cinco casos la pendiente del complejo Zn aminoácidos fue numéricamente mayor que la de la fuente patrón (BDR entre 105 y 125), las diferencias no llegaron a ser estadísticamente significativas.Tomados en su conjunto, los resultados de ambos trabajos demuestran la validez del modelo de deficiencia de Zn, en el que varios indicadores pueden ser utilizados en ensayos de BDR. Bajo las condiciones de nuestro ensayo, la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos no parece ser mayor a la del ZnSO4.

Descripción: El objetivo general de esta tesis fue la modelación de curvas de lactancia para estimar los rasgos de producción de leche aplicados a la identificación de regiones cromosómicas y genes asociados a dichos rasgos, en ganado Holando y cruza HolandoxJersey de la cuenca lechera central de la provincia de Santa Fe, Argentina. En el capítulo 2 se generaron estadísticas descriptivas de fertilidad y sobrevivencia para garantizar que las estimaciones de parámetros productivos fueran confiables, congruentes y adecuados con el sistema productivo bajo estudio y evitar distorsiones en los resultados de los análisis posteriores. Se obtuvo que la edad al primer servicio promedio fue de 20+3 meses (promedio + desvío estándar), la edad a la primera concepción promedio fue de 21+4 meses y la edad al primer parto promedio fue de 30+4 meses. El intervalo parto-concepción tuvo una duración promedio de 139+92 días y el intervalo entre servicios fue de 44+32 días. El período de gestación tuvo una duración promedio de 265+49 días y el intervalo entre partos promedio fue de 398+108 días. La duración de la lactancia promedio fue de 301+129 días y la longevidad promedio de los animales bajo estudio fue de 5,6+2,0 años. En el capítulo 3 se comparó una serie de modelos matemáticos que describen la curva de lactancia para las cinco variables productivas: producción de leche (PL), porcentaje de proteína (PP), producción de proteína (ProdP), porcentaje de grasa (PG) y producción de grasa (ProdG) diarias. Los resultados mostraron que el modelo de regresión aleatoria utilizando un polinomio de Legendre de sexto grado fue el que presentó el mejor desempeño en el ajuste para las cinco variables evaluadas. En el capítulo 4, a partir del modelo de regresión aleatoria utilizando un polinomio de Legendre de sexto grado se proporcionaron las estimaciones para la producción de leche, grasa y proteína acumulada a 305 días y el contenido de grasa y proteína. En general, los rasgos de producción de leche se vieron afectados por la proporción de Holstein, el número de lactancia, y el año y la temporada de parto. Con estos fenotipos, en el capítulo 5, se realizó un estudio de asociación de genoma completo utilizando 50.000 SNPs distribuidos en el genoma bovino mediante modelos lineales mixtos considerando los factores que afectan a los rasgos estudiados, la estructura poblacional y las relaciones de parentesco. En este contexto estricto de corrección de modelos y utilizando el ajuste por comparaciones múltiples de Bonferroni a nivel de genoma, no se encontraron SNPs estadísticamente significativos asociados a ninguno de los caracteres productivos considerados. Sin embargo, utilizando un nivel de significancia menos conservativo e inspeccionando los gráficos Quantil-Quantil, se identificaron 15 SNPs asociados con los caracteres productivos evaluados. El análisis realizado permitió calcular la proporción de variancia fenotípica capturada por los SNPs, siendo de 0,16 para la PL305 y ProdP305, 0,11 para la ProdG305, de 0,03 para el PGm y 0,09 para el PPm. La búsqueda de genes cercanos se realizó según la anotación génica del genoma bovino correspondiente al ensamblado UMD3.1 y teniendo en cuenta el desequilibrio de ligamiento calculado para esta población (r2 = 0,22 ± 0,27 a una distancia inter-SNP de 25- 50Kb). Se encontró que 11 de los genes identificados fueron x asociados en estudios previos con, rasgos productivos lecheros (IRS2, VEGFA, TCF7L2, RF00100, DCDC2 y OCA2) y con rasgos relacionados de la glándula mamaria tales como procesos metabólicos (IRS2, LIN28A), desarrollo (VEGFA, TCF7L2), el tejido (LOC525599) y el ligamento central (PKHD1). Otros genes fueron asociados con el recuento de células somáticas (DCDC2), la mastitis (RF00100), parámetros reproductivos como la reanudación de la ovulación después del parto (OCA2), intervalo entre partos (MAPT), edad a la primera inseminación (PKHD1) y enfermedades bovinas tales como la paratuberculosis (ZDHHC14) y el virus de la leucosis bovina (PKHD1). La estimación de parámetros relacionados con la fertilidad, longevidad y producción y composición de la leche de animales de diferentes razas y cruzas, explotados en tambos comerciales de la Argentina son valiosos para estudios futuros enfocados a incorporar caracteristicas de fertilidad y sobrevivencia en un programa nacional de mejoramiento genético lechero de Argentina. El conocimiento de regiones genómicas y genes relacionados con la producción y composición de la leche en ganado de la Argentina, es un aporte inicial relevante y pertinente al mejoramiento genético animal en el cual se predice el mérito genético individual mediante la selección genómica y al mismo tiempo permiten una mejor entendimiento de los mecanismo moleculares subyacentes a las características evaluadas.