Descripción: La extinción de especies animales es una de las consecuencias más alarmantes provocada por el deterioro ambiental y nos priva, de manera irreversible, de un material genético único e irremplazable. La Familia Felidae no escapa a esta problemática y es por este motivo que las biotecnologías reproductivas se convierten en herramientas muy poderosas para la conservación de estas especies. La hipótesis de la presente tesis doctoral radica en que es posible utilizar ovocitos u ovoplastos de gata doméstica (Gd) para desarrollar técnicas reproductivas aplicables a felinos silvestres. Por ende, nuestro principal objetivo fue adaptar las biotecnologías existentes, para reproducir y conservar felinos en peligro de extinción. Debido a la limitada disponibilidad de ovocitos de felinos silvestres, se utilizó como modelo experimental ovocitos de Gd para desarrollar las diferentes técnicas. En el Capítulo I, se estudiaron diferentes condiciones de maduración y cultivo embrionario para mejorar los resultados de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en el Gd. De esta manera, determinamos que utilizando el suplemento insulina-transferrina y selenio (ITS) durante la maduración de los ovocitos, y baja tensión de oxígeno (5%O2) durante el cultivo, se obtienen mayores tasas de formación de blastocistos, que realizando la maduración sin ITS o cultivando con 21%O2. Luego, se seleccionaron las mejores condiciones para generar embriones interespecíficos inyectando espermatozoides de chita (Ch, Acinonyx jubatus) y leopardo (Leo, Panthera pardus) en ovocitos de Gd. En este experimento, se obtuvieron tasas similares de formación de blastocisto tanto en el control de ICSI homoespecífica de Gd como en los embriones interespecíficos, sin necesidad de realizar activación química luego de la inyección del espermatozoide. Con este trabajo fue posible evaluar la capacidad de desarrollo de los espermatozoides de felinos silvestres por la técnica de ICSI interespecífica utilizando ovocitos de Gd. En el capítulo II, se estudió la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, del inglés somatic cell nuclear transfer) en felinos. El objetivo consistió en desarrollar nuevas estrategias de SCNT para mejorar la técnica en el Gd y en felinos silvestres. En primer lugar evaluamos tres técnicas diferentes de SCNT en el Gd, dos de las cuales no habían sido previamente reportadas en esta especie. Las tres técnicas fueron: fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos con zona pelúcida (ZP), inyección de la célula donante de núcleo en ovoplastos con ZP, y fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos libres de ZP. Esta última fue la que resultó más eficiente por lo que se decidió utilizar esta técnica para determinar la capacidad del ovoplasto de Gd de reprogramar células de felinos filogenéticamente distantes por SCNT interespecífica (SCNTi). Las células donantes utilizadas fueron de gato bengal (Be, híbrido entre gato doméstico y leopardo asiático), chita y tigre (Ti, Panthera tigris). Asimismo, se evaluó el efecto de la agregación embrionaria cultivando los embriones reconstituidos libres de ZP en micropozos de manera individual (1X) o de a 2 clones de la misma especie juntos (2X, embriones agregados), con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro y la calidad de los embriones, tal como se había reportado para otras especies. En este experimento, se obtuvieron embriones hasta el estadío de blastocisto de todas las especies. La agregación de embriones mejoró la tasa de desarrollo en todos los grupos y la calidad de los blastocistos de Gd y de Ti. Además, se estudiaron los niveles relativos de expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación temprana (OCT4, NANOG, SOX2 y CDX2) en blastocistos clones de Gd, Be y Ch. Este estudio reveló que los embriones de Gd1X tenían mayor nivel relativo de expresión de los cuatro genes comparado con embriones del grupo control de fecundación in vitro (FIV). Sin embargo, esta sobre-expresión se vio reducida en los blastocistos derivados del grupo Gd2X, en los que se determinó que los cuatro genes alcanzaron niveles relativos de expresión similares a los de FIV. Por otra parte, los niveles relativos de expresión de los cuatro genes en los embriones de chita fueron inferiores que los del control, observándose también este resultado para los niveles relativos de expresión del gen OCT4 en embriones de bengal. Como conclusión, podemos afirmar que la técnica de ICSI representa una metodología directamente aplicable a la reproducción de felinos silvestres, especialmente cuando las muestras seminales son de baja calidad. Con respeto a la SCNT y SCNTi, los ovocitos de gata doméstica fueron capaces de reprogramar células de otras especies silvestres y generar blastocistos. Además, la agregación de clones ha demostrado mejorar el desarrollo de los embriones en todos los grupos y normalizar la expresión relativa de genes en el gato doméstico, pero no en los embriones interespecíficos. La SCNT representa una alternativa para generar animales que no están en edad reproductiva o que han muerto y sus células fueron criopreservadas. La presente tesis aporta nuevas metodologías biotecnológicas y conocimiento para la reproducción en felinos.

Descripción: Con los objetivos de: 1) desarrollar un modelo de deficiencia subclíncia de zinc (Zn) en ovinos y 2) estimar la biodisponibilidad relativa (BDR) del Zn en un complejo Zn-aminoácidos con respecto al sulfato de Zn (ZnSO4) para ovinos en crecimiento, se llevaron a cabos dos ensayos. En el primer ensayo, 10 corderos de raza Corriedale, con un peso promedio de 10,09 kg de peso, fueron asignados aleatoriamente a dos grupos: Basal (B) y Suplementado con Zn (Z). La dieta B contenía 10 ppm de zinc (Zn), base materia seca (MS), y la dieta Z fue suplementada con ZnSO4, para aportar un nivel extra de 30 ppm de Zn. El ensayo se extendió por el término de 5 meses, período durante el cual los animales se pesaron mensualmente. También con esta periodicidad, fueron sangrados de vena yugular, para la posterior medición de parámetros hematológicos y de los niveles de Zn, Cu y fosfatasa alcalina (FA) en plasma. A los 45 días y hacia el final del período experimental, se realizaron ensayos de balance de Zn, Cu y nitrógeno (N). Posteriormente, se procedió al sacrificio de los animales y se recogieron muestras de músculo (longissimus dorsi, supraescapular y semimembranoso), hígado, páncreas, testículo, riñón, pulmón, hueso (metacarpo y metatarso) y lana para la determinación de los niveles de Zn y Cu. Por otro lado, también se tomaron muestras de piel (zonas del flanco y del vientre), hueso (metacarpo y metatarso, tercios distales), testículo, páncreas y del epitelio de lengua, esófago, rumen y vejiga para ser procesadas histológicamente. La ganancia de peso y la calidad de la lana fueron similares en ambos grupos, mientras que la producción de lana fue superior en el grupo Z. Los niveles de Zn plasmático fueron significativamente mayores en el grupo Z que en el grupo B, pero los niveles de FA plasmática, el hematocrito, la concentración de hemoglobina, y el número de glóbulos rojos, leucocitos y linfocitos en sangre no difirieron entre grupos. Las cupremias tendieron (p<0,10) a ser mayores en el grupo B. De acuerdo al primer ensayo de balance, las retenciones de Zn y de N fueron significativamente mayores en el grupo Z. La retención porcentual de Zn en grupo B fue mayor y mostró la puesta en marcha de los mecanismos homeostáticos. La retención de Cu tendió (p<0,10) a ser mayor en el grupo B. En el segundo ensayo de balance los resultados (Zn, Cu y N) fueron similares. En el segundo ensayo, 20 corderos Corriedale, con un peso de 15,3 kg fueron asignados en forma aleatoria a cinco grupos: Basal (dieta con 10 ppm de Zn), suplementados con ZnSO4 y con un complejo Zn-aminoácidos para proveer, en ambos casos, niveles adicionales de 10 y 20 ppm. Con los animales, se trabajó con una metodología similar al primer ensayo. Para la determinación de la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos en comparación con ZnSO4 fueron elegidas las cinco variables que respondieron, en las dos fuentes, con incrementos lineales al aumento de la dosis de Zn. Las mismas fueron: Zn aparentemente digerido (períodos 1 y 2), retención de Zn (períodos 1 y 2) y Zn hepático. Si bien, en los cinco casos la pendiente del complejo Zn aminoácidos fue numéricamente mayor que la de la fuente patrón (BDR entre 105 y 125), las diferencias no llegaron a ser estadísticamente significativas.Tomados en su conjunto, los resultados de ambos trabajos demuestran la validez del modelo de deficiencia de Zn, en el que varios indicadores pueden ser utilizados en ensayos de BDR. Bajo las condiciones de nuestro ensayo, la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos no parece ser mayor a la del ZnSO4.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un patógeno del ganado que causa inmunosupresión en los animales infectados, provocando la muerte de los linfocitos y monocitos-macrófagos. El VDVB no afectaría a las células dendríticas (DC), sin embargo, no existen estudios que describan la actividad del virus sobre estas células a las pocas horas post-infección. El control de esta enfermedad se ve afectado por la falta de vacunas eficaces. Las vacunas tradicionales (virus inactivado) no logran inducir protección y no se ha avanzado en el uso de vacunas de nueva generación. Uno de los problemas es la dificultad de contar con animales libres del virus para evaluar las vacunas. Estas evidencias apoyan la búsqueda de herramientas creativas para la selección de antígenos vacunales, reduciendo el número de pruebas realizadas en la especie destino. En el presente trabajo se investigó la posibilidad de seleccionar inmunógenos candidatos vacunales según su actividad sobre las DC. Estudiamos también la interacción entre el VDVB infectivo y las DC durante el primer día de infección, a fin de establecer la influencia de estas células en la inmunopatogenia del virus. Se estableció un protocolo de selección de antígenos vacunales de acuerdo a su capacidad de inducir la activación de DC in vitro, tanto en DC murinas como bovinas. Se evaluaron: el virus inactivado, la glicoproteína E2 (principal blanco de la respuesta neutralizante) truncada, expresada en el sistema Baculovirus recombinante-células de insecto (Bt-E2) y plásmidos que expresan t-E2. La activación de las DC se estableció midiendo la expresión de moléculas co-estimulatorias y la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos muestran que solamente los vectores plasmídicos lograron una completa activación de las DC, por lo que no requerirían de adyuvante, mientras que la Bt-E2 y el virus inactivado, no inducían una activación completa. Se obtuvieron resultados similares con DC murinas y bovinas. Los antígenos candidatos vacunales se evaluaron en ratones, cobayos y bovinos. Las vacunas génicas no fueron eficientes en activar la respuesta humoral, mientras que la Bt-E2 formulada con diferentes adyuvantes indujo altos niveles de anticuerpos (Ac) neutralizantes e inmunidad celular. El perfil de la respuesta inducida fue influenciado por el adyuvante. La aplicación de un adyuvante nanoparticulado diseñado especialmente para activar a las DC, permitió una mejor respuesta, humoral y celular, aún con baja masa antigénica. La inducción de altos niveles de Ac neutralizantes en bovinos guardó relación con la masa de E2 de la vacuna, ya sea recombinante o propia del virus inactivado. Verificamos que Bt-E2 puede ser utilizada como aditivo antigénico para alcanzar una masa adecuada de E2 en las vacunas. Demostramos que el VDVB es capaz de infectar y replicar rápidamente en las DC, y que a pesar de tratarse de un virus de biotipo citopático, no induce apoptosis en estas células. Las Mo-DC infectadas no pueden adquirir un fenotipo activado durante las primeras horas de infección. Proponemos que, al infectar y mantener la viabilidad de las DC, el virus ganaría acceso al tejido linfoide, causando la muerte masiva de linfocitos. La metodología desarrollada en este trabajo resultó ser especialmente útil para comparar antígenos de la misma naturaleza química. La selección de antígenos en base a su capacidad de inducir la activación de DC murinas in vitro, constituye una herramienta muy útil en el desarrollo de vacunas veterinarias porque permite reducir el número de candidatos vacunales para evaluar in vivo; apoyando los esfuerzos por reducir, refinar y finalmente reemplazar los ensayos con animales para la evaluación de productos biológicos.

Descripción: El dimorfismo sexual tanto morfológico como funcional del eje hipotalamo-hipofisario-adrenal ha sido descripto en diversas especies; así como también existen reportes acerca de la influencia de la estacionalidad sobre dicho eje. Sin embargo, no existen estudios que analicen estas caracteristicas en el perro. Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue determinar si en el perro existen variaciones en las hormonas del eje HHA (adrenocorticotrofina , melanotrofina-alfa y cortisol) de acuerdo al sexo, estatus gonadal (castrado o no) y al fotoperiodo (positivo o negativo) en condiciones basales (anestro) y durante el ciclo estral. Asimismo se propuso evaluar si en el perro existe dimorfismo sexual morfológico del área corticotropa de la hipófisis y de la zona fascicular de la corteza adrenal; y si el mismo se ve afectado por la estacionalidad. Además se evaluó si el receptor de estrógenos alfa (RE?) se expresa en los tejidos mencionados y si el receptor de progesterona (RP) se expresa en la zona fascicular adrenal. En el caso del análisis hormonal, la población de estudio consistió en perras no castradas (n=11), perros machos no castrados (n=6), machos castrados (n=5) y hembras castradas (n=6). El estudio morfológico se realizó mediante un análisis inmunohistoquímico en hipófisis y adrenales obtenidas en fotoperiodo negativo (hembras y machos ) y en fotoperiodo positivo (hembras y machos ), para ACTH en hipófisis, y para RE?, el RP y el receptor para ACTH (melanocortin-2-receptor, MC2R) en la glándula adrenal. Se realizó una doble inmunofluorescencia para poder co-localizar al RE? y a la ACTH (para poder identificar si las células corticotropas expresan dicho receptor). En hipófisis se analizó la proporción de células corticotropas por campo, su área celular, citoplasmática y nuclear, y la densidad óptica de su inmunomarcación. La expresión del RE? y RP se analizó mediante la proporción de células positivas por campo y la del MC2R mediante la densidad óptica. En condiciones basales (machos castrados y no castrados, hembras castradas y hembras en anestro) la ACTH, la ?-MSH y el cortisol no se vieron afectados por el sexo ni el estatus gonadal. Por el contrario, el cortisol se encontró más elevado en el fotoperiodo negativo que en el positivo en todos los grupos (P<0.05), excepto en las hembras en anestro. Durante el ciclo estral, todas las hormonas estudiadas presentaron variaciones (P<0.0001). Las mayores concentraciones de ACTH se observaron en el proestro, mientras que la ?-MSH y el cortisol presentaron las máximas concentraciones en el estro. Las tres hormonas disminuyeron en el diestro. La ACTH y el cortisol se encontraron más elevadas en el fotoperiodo negativo (P=0.04 and P<0.0001, respectivamente), mientras que la ?-MSH fue mayor en el fotoperiodo positivo (P=0.012). En el grupo de perras no castradas, el estradiol y la progesterona correlacionaron con la ACTH (r=0.75, P<0.0001; r=0.34, P<0.01, respectivamente), ?-MSH (r=0.49, P<0.0001; r=0.52, P<0.0001, respectivamente) y el cortisol (r=0.33, P<0.01; r=0.5, P<0.0001, respectivamente). A partir del análisis morfológico se encontró que las hembras presentaron mayor cantidad de células corticotropas/totales por campo en ambos fotoperiodos (p<0.01). El área celular y citoplasmática de las mismas fue mayor en hembras que en machos en ambos fotoperiodos (p<0.001). No se encontraron diferencias significativas en estos parámetros entre estaciones para ninguno de los sexos. La densidad óptica de las células corticotropas fue mayor en hembras que en machos en ambos fotoperiodos (p<0.001); así como también fue mayor en fotoperiodo negativo que en fotoperiodo positivo en ambos sexos (p<0.001). El RE? fue identificado en la zona fascicular adrenal, siendo su expresión mayor en hembras que en machos (p<0.001). La densidad óptica de la inmunomarcación para MC2R fue mayor en hembras que en machos (p<0.001). No se encontró inmunomarcación para RP. En ambos sexos la expresión de los dos receptores fue mayor en fotoperiodo negativo (p<0.001). El RE? fue identificado en algunas células corticotropas, pero dada su baja expresión no se realizó un análisis cuantitativo. Estos resultados evidencian que existe dimorfismo sexual tanto morfológico como funcional del eje HHA en el perro. Asimismo es la primera vez que se identifica la expresión del RE? en las corticotropas y corteza adrenal en dicha especie, postulándose un sitio de acción para el estradiol. De esta forma el estradiol podría tener un rol regulador sobre el eje HHA. Asimismo se obsevaron variaciones morfológicas y hormonales entre fotoperiodos, que podrían relacionarse con adaptaciones climáticas o metabólicas; las cuales quedan pendientes de estudio.

Descripción: El papel de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los procesos relacionados con la manipulación y el cultivo de gametas y embriones in vitro es controversial. Se ha propuesto que un adecuado nivel de (anión superóxido) O2 - sería beneficioso durante la maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos para aumentar su competencia de desarrollo. En concordancia, se observó un aumento gradual en los niveles de ROS desde el estadio de dos células al de mórula tardía, que podría depender de los cambios en el metabolismo del embrión bovino durante su desarrollo. Por otro lado, diversos estudios han demostrado la expresión de genes que codifican para enzimas antioxidantes a lo largo del cultivo in vitro de ovocitos y complejos ovocito-cumulus y sostienen que para que el embrión adquiera la competencia de desarrollo sería importante también que los antioxidantes sean almacenados en el ovocito (como ARNm o proteínas) durante el crecimiento y la maduración. Los reportes aparentemente contradictorios encontrados en la bibliografía y los resultados previos de nuestro grupo justifican la necesidad de profundizar la investigación para determinar si las ROS desempeñan un rol importante en el progreso meiótico y/o en la maduración citoplasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo fue determinar la posible fluctuación en la producción de ROS durante la maduración y activación in vitro de ovocitos bovinos en presencia de diferentes moduladores y su relación con los principales eventos de ambos procesos. En este trabajo la producción de ROS demostró ser fluctuante durante las 22 hs de la maduración. Se observó una significativa disminución en la generación de ROS entre las 2 y las 18 hs, que podría corresponder a un período que demanda una alta producción de energía por parte de la cadena respiratoria para la síntesis de proteínas requeridas durante las fases preparatorias para los eventos principales de la MIV. En cuanto al proceso de activación, observamos que existen patrones metabólicos diferentes entre ovocitos no activados, activados por espermatozoides y activados partenogenéticamente. El comportamiento contrastante observado en las fluctuaciones de los niveles ROS y de actividad oxidativa entre la activación mediada por espermatozoides y la partenogenética podría estar relacionado con la diferencia que presentan ambos tipos de activación con respecto a los picos de liberación de Ca+2. El pico único de liberación de Ca+2 desencadenado por la activación partenogenética no sería eficiente para estimular a la mitocondria en forma consistente, siendo así responsable de la menor competencia de desarrollo observada en este tipo de activación. Mediante la modulación de los niveles de glutatión reducido (GSH) pudimos observar que si bien el rol antioxidante del GSH podría ser suplido por otros componentes del sistema antioxidante del ovocito, su participación en el mantenimiento de la morfología del huso meiótico sería esencial para que se lleve a cabo la maduración. Al analizar el efecto de la modulación de los niveles de óxido nítrico (ON) exógeno y endógeno sobre la producción de ROS durante la MIV, la adición de un donante de ON demostró ser perjudicial para la maduración independientemente de las variaciones en los niveles de ROS. Por lo tanto, podemos concluir que un aumento en la concentración de ON en el ovocito impediría el progreso meiótico tanto por la formación de ONOO- como por la inhibición de la enzima Map quinasa y del factor promotor de la maduración, que intervienen en sistemas de señalización intracelular claves para la maduración. Mediante la adición de un inhibidor de la NADPH oxidasa al medio de MIV determinamos que la inhibición de la enzima no generaría cambios en los niveles de ROS del ovocito, pero la disminución del O2 - generado por esta enzima afectaría la tasa de clivaje embrionario, posiblemente por la participación de este compuesto en mecanismos de señalización intracelular necesarios para la ctivación. Al estudiar el efecto de la adición de sistemas enzimáticos moduladores de los niveles de H2O2 y O2 - observamos que si bien la adición de sistemas generadores de estos compuestos serían perjudiciales para la calidad del ovocito, el uso de scavengers alteraría el proceso de maduración por intervenir con diferentes mecanismos de señalización intracelular. Estos resultados estarían demostrando que determinados niveles de ROS son necesarios para que el ovocito bovino lleve a cabo la maduración posiblemente por participar en sistemas de señalización que intervienen en el proceso. Mediante la adición de moduladores de la actividad de la cadena respiratoria determinamos que el aporte de ATP de la respiración celular sería especialmente importante a las 12 hs, momento en el cual hay una elevada demanda de actividad metabólica con una activa síntesis proteica y que coincide con la transición entre las metafases I y II. En conclusión, se determinó una significativa fluctuación de los niveles de ROS a lo largo de la maduración y la activación de ovocitos bovinos in vitro. Las variaciones observadas tienen relación con eventos clave de ambos procesos y son relevantes para aumentar el conocimiento respecto de la competencia de desarrollo de los ovocitos y los embriones tempranos. Estos resultados justifican la importancia de realizar futuras experiencias para dilucidar si las fluctuaciones responden solamente a las variaciones en la actividad metabólica o si determinadas ROS intervienen además en sistemas regulatorios o de señalización celular. A su vez, estudios posteriores sobre el control metabólico de la activación partenogenética podrían contribuir a mejorar la performance de los embriones obtenidos mediante esta activación en diferentes aplicaciones biotecnológicas como transferencia nuclear, clonación y transgénesis.

Descripción: La paratuberculosis, causada por el Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), es una patología crónica intestinal que afecta a rumiantes. El diagnóstico es engorroso y permite identificar principalmente a los bovinos en estadios avanzados (clínico). El objetivo general del trabajo fue caracterizar los anticuerpos bovinos totales y específicos frente a Map y sus proteínas, e identificar su efecto en la viabilidad bacteriana. Los objetivos particulares fueron: Identificar el efecto de la infección con Map en los niveles de anticuerpos totales. Caracterizar la respuesta inmune humoral específica frente a Map y sus proteínas en sobre la viabilidad bacteriana intracelular. Los anticuerpos bovinos se estudiaron por la metodología de ELISA (niveles) y mediante un modelo de infección de macrófagos in vitro (funcionalidad). Se evaluaron un total de 120 animales. Los grupos de bovinos analizados difirieron según los experimentos, pero en general fueron: infectados naturalmente en estadio subclínico, clínico y terminal, infectados experimentalmente, expuestos, inmunizados con proteínas específicas de Map y controles sanos. Se demostró que: La paratuberculosis afecta los niveles de anticuerpos totales en muestras de suero y materia fecal, según el estadio. Los bovinos con paratuberculosis clínica presentan incrementos en los niveles de IgM sérica, así como de IgM, IgG e IgA a nivel local. El estudio del isotipo IgG2 específico frente a la bacteria entera o al antígeno protoplasmático de Map (PPA) mejora la identificación de bovinos infectados en estadio subclínico (sensibilidad de IgG2 e IgG/ELISA-PPA del 54% y del 23%, respectivamente). El isotipo IgG2 aparece de manera temprana en la infección experimental (p=0,013, a los 60 días postinfección). Los anticuerpos específicos frente a la proteína p34 inhiben la viabilidad intracelular de Map en el modelo de infección de macrófagos bovinos in vitro utilizado. Estos resultados impactan sobre las metodologías diagnósticas utilizadas en la actualidad y revalorizan el papel de los anticuerpos específicos frente a p34. Este hallazgo justifica la continuación de su análisis en modelos de infección y protección en la especie bovina.