Clonación e ICSI interespecífica en felinos y reprogramación nuclear

La extinción de especies animales es una de las consecuencias más alarmantes provocada por el deterioro ambiental y nos priva, de manera irreversible, de un material genético único e irremplazable. La Familia Felidae no escapa a esta problemática y es por este motivo que las biotecnologías reproductivas se convierten en herramientas muy poderosas para la conservación de estas especies. La hipótesis de la presente tesis doctoral radica en que es posible utilizar ovocitos u ovoplastos de gata doméstica (Gd) para desarrollar técnicas reproductivas aplicables a felinos silvestres. Por ende, nuestro principal objetivo fue adaptar las biotecnologías existentes, para reproducir y conservar felinos en peligro de extinción. Debido a la limitada disponibilidad de ovocitos de felinos silvestres, se utilizó como modelo experimental ovocitos de Gd para desarrollar las diferentes técnicas. En el Capítulo I, se estudiaron diferentes condiciones de maduración y cultivo embrionario para mejorar los resultados de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en el Gd. De esta manera, determinamos que utilizando el suplemento insulina-transferrina y selenio (ITS) durante la maduración de los ovocitos, y baja tensión de oxígeno (5%O2) durante el cultivo, se obtienen mayores tasas de formación de blastocistos, que realizando la maduración sin ITS o cultivando con 21%O2. Luego, se seleccionaron las mejores condiciones para generar embriones interespecíficos inyectando espermatozoides de chita (Ch, Acinonyx jubatus) y leopardo (Leo, Panthera pardus) en ovocitos de Gd. En este experimento, se obtuvieron tasas similares de formación de blastocisto tanto en el control de ICSI homoespecífica de Gd como en los embriones interespecíficos, sin necesidad de realizar activación química luego de la inyección del espermatozoide. Con este trabajo fue posible evaluar la capacidad de desarrollo de los espermatozoides de felinos silvestres por la técnica de ICSI interespecífica utilizando ovocitos de Gd. En el capítulo II, se estudió la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, del inglés somatic cell nuclear transfer) en felinos. El objetivo consistió en desarrollar nuevas estrategias de SCNT para mejorar la técnica en el Gd y en felinos silvestres. En primer lugar evaluamos tres técnicas diferentes de SCNT en el Gd, dos de las cuales no habían sido previamente reportadas en esta especie. Las tres técnicas fueron: fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos con zona pelúcida (ZP), inyección de la célula donante de núcleo en ovoplastos con ZP, y fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos libres de ZP. Esta última fue la que resultó más eficiente por lo que se decidió utilizar esta técnica para determinar la capacidad del ovoplasto de Gd de reprogramar células de felinos filogenéticamente distantes por SCNT interespecífica (SCNTi). Las células donantes utilizadas fueron de gato bengal (Be, híbrido entre gato doméstico y leopardo asiático), chita y tigre (Ti, Panthera tigris). Asimismo, se evaluó el efecto de la agregación embrionaria cultivando los embriones reconstituidos libres de ZP en micropozos de manera individual (1X) o de a 2 clones de la misma especie juntos (2X, embriones agregados), con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro y la calidad de los embriones, tal como se había reportado para otras especies. En este experimento, se obtuvieron embriones hasta el estadío de blastocisto de todas las especies. La agregación de embriones mejoró la tasa de desarrollo en todos los grupos y la calidad de los blastocistos de Gd y de Ti. Además, se estudiaron los niveles relativos de expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación temprana (OCT4, NANOG, SOX2 y CDX2) en blastocistos clones de Gd, Be y Ch. Este estudio reveló que los embriones de Gd1X tenían mayor nivel relativo de expresión de los cuatro genes comparado con embriones del grupo control de fecundación in vitro (FIV). Sin embargo, esta sobre-expresión se vio reducida en los blastocistos derivados del grupo Gd2X, en los que se determinó que los cuatro genes alcanzaron niveles relativos de expresión similares a los de FIV. Por otra parte, los niveles relativos de expresión de los cuatro genes en los embriones de chita fueron inferiores que los del control, observándose también este resultado para los niveles relativos de expresión del gen OCT4 en embriones de bengal. Como conclusión, podemos afirmar que la técnica de ICSI representa una metodología directamente aplicable a la reproducción de felinos silvestres, especialmente cuando las muestras seminales son de baja calidad. Con respeto a la SCNT y SCNTi, los ovocitos de gata doméstica fueron capaces de reprogramar células de otras especies silvestres y generar blastocistos. Además, la agregación de clones ha demostrado mejorar el desarrollo de los embriones en todos los grupos y normalizar la expresión relativa de genes en el gato doméstico, pero no en los embriones interespecíficos. La SCNT representa una alternativa para generar animales que no están en edad reproductiva o que han muerto y sus células fueron criopreservadas. La presente tesis aporta nuevas metodologías biotecnológicas y conocimiento para la reproducción en felinos.

The extinction of animals is one of the most alarming consequences caused by environmental degradation, and deprives us of unique genetic materials. The Felidae family does not scape to this problem and it is for this reason that reproductive biotechnologies become very usefull tools for the conservation of these species. The hypothesis of this doctoral thesis suggests that it is possible to use domestic cat oocytes or ooplasts to develop reproductive techniques applicable to wild felids. Thus, our principal objective was to adapt the existing biotechnologies to reproduce and preserve endangered felid species. Due to the limited availability of oocytes from wild cats, domestic cat oocytes (Dc) were used as an experimental model to develop different reproductive techniques. In Chapter I, different conditions of maturation and embryo culture were studied to improve the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in the Dc. Thus, we determined that by using the insulin-transferrin and selenium supplement (ITS) during maturation of the oocytes and low oxygen tension (5%O2) during embryo culture, higher rates of blastocyst formation were obtained. These conditions were chosen to generate interspecific embryos by injecting cheetah (Ch, Acinonyx jubatus) and leopard (Leo, Panthera pardus) spermatozoa in Dc oocytes. In this experiment, we obtained similar blastocyst rates in both the Dc homoespecífic ICSI and the interspecific ICSI, without the need of chemical activation after sperm injection. This work was useful to evaluate the developmental ability of wild cat sperm by the interspecific ICSI technique, using Dc oocytes. In Chapter II, the somatic cell nuclear transfer (SCNT) was studied in felids. The aim was to develop new strategies to improve this technique in the Dc and wild felids. Firstly, we evaluated three different SCNT techniques in the Dc, two of which had not been previously reported in this species. The three techniques were: fusion of the donor cell to an ooplast with zona pellucida (ZP), injection of the donor cell in an ooplast with ZP, and fusion of the donor cell to an ooplasts ZP free. The latter one was the most efficient, so we decided to use this technique to determine the ability of Dc ooplasts to reprogram phylogenetically distant feline cells by interspecific SCNT (iSCNT). The donor cells used were from bengal cat (Be, an hybrid between Dc and asian leopard), cheetah or tiger (Ti, Panthera tigris). The effect of embryo aggregation was also assessed by culturing ZP free reconstructed embryos in microwells, individually (1X), or 2 clones of the same species toghether (2X, aggregated embryos), in order to improve the in vitro development and the quality of the embryos, as had been previously reported for other species. In this experiment, we obtained embryos until the blastocyst stage of all the groups. Aggregation improved embryonic development in all the species and the quality of Ti2X and Gd2X blastocysts. Furthermore, the relative expression of genes related to pluripotency and early differentiation (OCT4, NANOG, SOX2 and CDX2) was studied in Dc, Be and Ch clone blastocysts. This analysis found that cat embryos had higher relative expression level of the four genes compared to the in vitro fertilized embryos (IVF, control group). However, this overexpression was reduced in Dc2X blastocysts reaching similar relative levels of gene expression as those of the IVF control. Moreover, the relative expression level of the four genes in cheetah embryos were lower tan the control, obtaining the same result for the relative expression level of OCT4 in bengal embryos. In conclusion, the ICSI technique represents a method directly applicable to wild felids reproduction, especially when semen samples are of poor quality. With respect to SCNT and iSCNT, cat oocytes were able to reprogram wild felid cells and to generate blastocysts. Furthermore, clone aggregation has shown to improve embryo development in all the groups and to normalize the relative gene expression only in the Dc but not in interspecific embryos. The SCNT is an alternative technique to generate animals that are not in good reproductive conditions or that have died and their cells were cryopreserved. This thesis provides new knowledge to biotechnological methodologies and reproduction in felids.