Estudio de la capacidad de antígenos del virus de la diarrea viral bovina (VDVB) de iniciar la respuesta inmune : interacción con las células dendríticas

El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un patógeno del ganado que causa inmunosupresión en los animales infectados, provocando la muerte de los linfocitos y monocitos-macrófagos. El VDVB no afectaría a las células dendríticas (DC), sin embargo, no existen estudios que describan la actividad del virus sobre estas células a las pocas horas post-infección. El control de esta enfermedad se ve afectado por la falta de vacunas eficaces. Las vacunas tradicionales (virus inactivado) no logran inducir protección y no se ha avanzado en el uso de vacunas de nueva generación. Uno de los problemas es la dificultad de contar con animales libres del virus para evaluar las vacunas. Estas evidencias apoyan la búsqueda de herramientas creativas para la selección de antígenos vacunales, reduciendo el número de pruebas realizadas en la especie destino. En el presente trabajo se investigó la posibilidad de seleccionar inmunógenos candidatos vacunales según su actividad sobre las DC. Estudiamos también la interacción entre el VDVB infectivo y las DC durante el primer día de infección, a fin de establecer la influencia de estas células en la inmunopatogenia del virus. Se estableció un protocolo de selección de antígenos vacunales de acuerdo a su capacidad de inducir la activación de DC in vitro, tanto en DC murinas como bovinas. Se evaluaron: el virus inactivado, la glicoproteína E2 (principal blanco de la respuesta neutralizante) truncada, expresada en el sistema Baculovirus recombinante-células de insecto (Bt-E2) y plásmidos que expresan t-E2. La activación de las DC se estableció midiendo la expresión de moléculas co-estimulatorias y la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos muestran que solamente los vectores plasmídicos lograron una completa activación de las DC, por lo que no requerirían de adyuvante, mientras que la Bt-E2 y el virus inactivado, no inducían una activación completa. Se obtuvieron resultados similares con DC murinas y bovinas. Los antígenos candidatos vacunales se evaluaron en ratones, cobayos y bovinos. Las vacunas génicas no fueron eficientes en activar la respuesta humoral, mientras que la Bt-E2 formulada con diferentes adyuvantes indujo altos niveles de anticuerpos (Ac) neutralizantes e inmunidad celular. El perfil de la respuesta inducida fue influenciado por el adyuvante. La aplicación de un adyuvante nanoparticulado diseñado especialmente para activar a las DC, permitió una mejor respuesta, humoral y celular, aún con baja masa antigénica. La inducción de altos niveles de Ac neutralizantes en bovinos guardó relación con la masa de E2 de la vacuna, ya sea recombinante o propia del virus inactivado. Verificamos que Bt-E2 puede ser utilizada como aditivo antigénico para alcanzar una masa adecuada de E2 en las vacunas. Demostramos que el VDVB es capaz de infectar y replicar rápidamente en las DC, y que a pesar de tratarse de un virus de biotipo citopático, no induce apoptosis en estas células. Las Mo-DC infectadas no pueden adquirir un fenotipo activado durante las primeras horas de infección. Proponemos que, al infectar y mantener la viabilidad de las DC, el virus ganaría acceso al tejido linfoide, causando la muerte masiva de linfocitos. La metodología desarrollada en este trabajo resultó ser especialmente útil para comparar antígenos de la misma naturaleza química. La selección de antígenos en base a su capacidad de inducir la activación de DC murinas in vitro, constituye una herramienta muy útil en el desarrollo de vacunas veterinarias porque permite reducir el número de candidatos vacunales para evaluar in vivo; apoyando los esfuerzos por reducir, refinar y finalmente reemplazar los ensayos con animales para la evaluación de productos biológicos.

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a pathogen that affects cattle causing immune-suppression by killing lymphocytes and monocytes-macrophages. BVDV does not seem to interfere with dendritic cells (DC). However, the effects of the virus on DC during the first day of infection have not been studied. There is a need of new vaccines to control this disease. Currently used inactivated vaccines are not protective, and there are not recombinant vaccines available. One of the main issues in the evaluation of vaccine efficacy or even sero-conversion, is the difficulty of getting BVDV-free animals, especially in endemic areas. These facts support the development of new-creative strategies to select vaccine antigens, reducing the number of animal trials needed. In this study we investigated the possibility of selecting vaccine antigens based on their activity on DC. We also studied the interaction between BVDV and DC shortly after infection, to bring information on the influence of these cells in the viral immunopathogenesis. We developed a protocol to select antigens based on their capacity to activate DC in vitro, using both murine and bovine DC. We evaluated several antigens: inactivated virus, the truncated form of the E2 glycoprotein of the viral envelope (main target of the neutralizing response) expressed by a recombinant Baculovirus in insect cells ?Bt-E2?, and plasmids expressing t-E2. Activation of DC was measured by determining the up-regulation of co-stimulatory molecules and expression of pro-inflammatory cytokines. Only the plasmids were able to induce a complete activation of the DC, indicating they might not require adjuvants; while Bt-E2 and the inactivated virus were unable to induce a complete activation of the DC. Similar results were obtained when using murine or bovine DC. Candidate antigens were then tested for immunogenicity in mice, guinea-pigs and bovines. DNA vaccines were no efficient inducing antibodies (Abs), while Bt-E2 formulated with adjuvants induced high levels of neutralizing Abs and, depending on the adjuvant, also cell-mediated immunity. The use of a nanoparticulated adjuvant, designed to activate DC, induced high levels of Abs with low antigen payload. Levels of neutralizing Abs were related to the amount of E2 in the vaccine, either recombinant or viral. In fact, Bt-E2 could be used an additive for the inactivated vaccine to achieve a protective E2-payload. BVDV was able to infect and replicate rapidly in the DC, and even though a cytopathic biotype was used, no effect on DC viability was observed. Infected DC could not get an activated phenotype during the first hours post-infection. We propose that by infecting DC and rescuing them from apoptosis, BVDV gets access to the lymph-nodes were it can rapidly kill large numbers of T-cells present in the follicles. The methodology developed in this study is particularly useful to compare different antigens of similar chemical composition. Selecting antigen candidates based on their capacity to activate DC is a useful tool to be applied in vaccine development, reducing the number of formulations that are finally taken to in vivo testing. This technology supports the efforts focused in reducing, refining and finally replacing the use of animals for the evaluation of the biological products.