Desarrollo y evaluación de una técnica de PCR en tiempo real para detectar ADN de Histoplasma capsulatum en muestras clínicas

Histoplasma capsulatum var. capsulatum, es el agente etiológico de la histoplasmosis (HP), una enfermedad subaguda o crónica, endémica en Argentina. Los objetivos de este trabajo fueron: (i) desarrollar una PCR en tiempo real para amplificar un fragmento del ITS1 (internal transcribed spacer) específico de H. capsulatum, (ii) evaluar su utilidad para el diagnóstico de HP en muestras de sangre, y (iii) comparar los parámetros de valoración de la PCR en tiempo real con los de una PCR anidada (gen HcP100 específico de H. capsulatum), utilizada en nuestro laboratorio para diagnóstico de HP. Se definió como caso de HP al paciente que tuvo un cultivo positivo y/o una serología positiva para H. capsulatum, o hallazgos histopatológicos (levaduras intracelulares y granuloma) consistentes con la presencia del hongo. La técnica de PCR en tiempo real se estandarizó con un sistema TaqMan? utilizando como blanco un fragmento del ITS1 específico de H. capsulatum. Se calculó el límite de detección utilizando diferentes concentraciones de muestras de ADN de H. capsultum y la especificidad frente a ADNs de especies fúngicas diferentes de H. capsulatum y de varias micobacterias. El límite de detección de la prueba fue 50 fg y la especificidad analítica 98,11%. Se analizaron muestras clínicas (sangre y otros materiales) obtenidas de 176 pacientes entre enero de 2010 y diciembre de 2013: 85 pacientes tenían HP y 91 tenían enfermedades que por sus características clínicas requerían un diagnóstico diferencial de HP. En 151 de estos pacientes (77 casos de HP y 74 sin HP) se analizó al menos una muestra de sangre, y en 25 pacientes se contó con otros materiales clínicos pero no con sangre (8 con HP y 17 sin HP). Para evaluar la sangre como muestra de elección en el diagnóstico de HP, se compararon los parámetros: sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN), en muestras de sangre versus todos los materiales clínicos disponibles del paciente (incluido sangre). Esta comparación mostró que la S diagnóstica de la PCR en tiempo real aumentó significativamente (de 71% a 84% p<0,05), así como el VPN (de 76% a 86% p<0,05), cuando se consideraron los resultados de todos los materiales clínicos disponibles. Por su parte la E y el VPP no mostraron diferencias significativas al analizar solamente sangre versus todos los materiales clínicos disponibles. La PCR en tiempo real resultó menos sensible (71% y 84% en sangre y todos los materiales clínicos disponibles, respectivamente) que la PCR anidada (84% y 94% en sangre y todos los materiales clínicos disponibles, respectivamente). Ambas PCRs fueron específicas (>91%) y presentaron VPP elevado (> 90%) independientemente de si se analizó solamente sangre o todos los materiales clínicos disponibles. Las técnicas de PCR son sensibles y específicas para detectar ADN de H. capsulatum en muestras clínicas con muy buenos valores predictivos para el diagnóstico de HP. Siempre que sea posible, se recomienda analizar, además de muestras de sangre, todas las muestras clínicas disponibles del paciente para aumentar la eficiencia del diagnóstico. Hasta el momento los resultados de PCR deben ser confirmados por técnicas microbiológicas que siguen siendo las definitivas para el diagnóstico de HP.

Histoplasma capsulatum var. capsulatum is the etiologic agent of histoplasmosis (HP), a subacute or chronic mycosis which is endemic in Argentina. The aims of this work were: (i) to develop a real-time PCR assay to amplify a H. capsulatum specific ITS1 (internal transcribed spacer) fragment, (ii) to evaluate the utility of this real time PCR assay for the diagnosis of HP in blood samples, and (iii) to compare the efficiency of real time PCR with that of a nested PCR (H. capsulatum specific gene HcP 100) previously implemented, and currently in use in our laboratory for diagnostic purposes. A HP case was defined by positive results of culture and /or serum test positive for H. capsulatum, or histopathological findings (intracellular yeast and granulome) consistent for H. capsulatum. The real time PCR assay was standardized with the TaqMan? system addressing the ITS1 region of H. capsulatum as specific target. The limit of detection was determined using serial dilutions of H. capsulatum DNA samples. The specificity was calculated using DNAs of fungal species different from H. capsulatum and DNA from several mycobacteria. The lower limit of detection was 50 fg and the analytical specificity was 98.11%. We analyzed clinical specimen obtained from 176 patients between January 2010 and December 2013. Of these, 85 were HP cases and 91 presented any of several clinical conditions requiring a HP differential diagnosis. At least one blood sample was available from 151 of these patients (77 HP cases, 74 without HP). Clinical specimens other than blood were available from the remaining 25 patients (8 HP cases, 17 without HP). Diagnostic accuracy was measured using the following parameters: diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV). The performance of the real time PCR assay when applied to blood specimens alone was compared with performance when applied to any specimen (including blood). The real time PCR showed significantly higher diagnostic sensitivity (84% versus 71%, p <0.05), and NPV (86% versus 76%, p <0.05) when tested on blood plus other clinical specimen than when tested on blood specimens alone. The diagnostic specificity and the PPV showed no significant variation when adding specimens other than blood. The real time PCR assay was less sensitive (71% and 84% for blood and blood plus other specimen type, respectively) than the nested PCR (84% and 94% for blood and blood plus other specimen type, respectively). Both PCRs were fairly specific (> 91%) and the PPV was high (> 90%) regardless of clinical specimen type. PCR assays are sensitive and specific for the detection of H. capsulatum in clinical specimens and have good predictive values for the diagnosis of HP. Whenever possible, we suggest to analyze all the clinical specimens available from every patient, in addition to blood samples, to maximize the diagnostic efficiency. However, molecular techniques must be confirmed by conventional microbiology, which remains the gold standard for HP diagnosis.