Descripción: Más del 90% de todas las enfermedades humanas son causadas por infecciones virales para la mayoría de las cuales no existen vacunas profilácticas. Para los Adenovirus (AdV), que producen infecciones agudas respiratorias y queratoconjuntivitis, entre otras, no existen antivirales específicos y la ribavirina se utiliza sólo en situaciones clínicas específicas. Otro virus de importancia clínica es el Herpes simplex tipo 1 (HSV-1), causante de infecciones oro-faciales, queratitis estromal y encefalitis. Si bien el tratamiento de elección para el HSV-1 es el aciclovir, presenta la limitación terapéutica de la aparición de cepas mutantes resistentes a dicho antiviral. Los azasteroides son análogos de esteroides para los que se han descripto interesantes propiedades biológicas, como anticancerígena, antifúngica y antibacteriana. Algunos análogos azasteroides evaluados en nuestro laboratorio presentan actividad antiviral de amplio espectro. Los objetivos del presente trabajo son evaluar la actividad antiviral de nuevos azasteroides frente a AdV y HSV-1, investigar la etapa del ciclo de multiplicación viral en la que actúan los compuestos activos y analizar su actividad inmunomoduladora/antiinflamatoria. Los azasteroides de la serie U-20 mostraron actividad antiviral frente a AdV y HSV-1. Dicha actividad inhibitoria no se debe a una acción virucida. Los compuestos no afectan la adsorción ni la internalización de las partículas virales, sino que estarían inhibiendo etapas tempranas y tardías de la multiplicación viral, incluyendo la síntesis de proteínas. Asimismo, el compuesto U20-1 es capaz de modular la secreción de citoquinas proinflamatorias. En conclusión, los nuevos azasteroides sintéticos analizados presentan una doble actividad como antivirales e inmunomoduladores, lo cual los hace candidatos ideales para tratar inmunopatologías de origen viral como la queartoconjuntivitis adenoviral y la queratitis estromal herpética.

Descripción: El Receptor de la Hormona de Crecimiento (GHR) media la acción de la Hormona de Crecimiento (GH) sobre el crecimiento y metabolismo. En humanos, la GH es secretada por la glándula pituitaria y actúa directamente sobre el GHR en diversos tipos celulares, generando un aumento en la expresión del Factor de Crecimiento Insulino-Simil-1 (IGF1) así como de otros genes dependientes de GH. En la actualidad el gen GHR se encuentra ampliamente estudiado y caracterizado. Se localiza en el brazo corto del cromosoma 5 y consiste en 9 exones codificantes (exones 2 al 10) y 1 exón no codificante. Dicho receptor presenta un dominio extracelular involucrado en la dimerización y unión de la GH (exones 3 al 7), un dominio transmembrana que ancla el receptor a la superficie celular (exón 8) y un dominio intracelular involucrado en la señalización mediante la activación de la vía JAK-STAT (exones 9 y 10). Dicho gen codifica para el GHR, una proteína que consta de 638 aminoácidos. A través de la activación del receptor, la hormona de crecimiento está involucrada en un gran número de procesos fisiológicos en distintos tipos celulares. Las acciones biológicas de la GH pueden englobar dos grupos: Aquellas de tipo directo (que no requieren mediadores) como sus acciones sobre el cartílago de crecimiento, metabolismo hidrocarbonado y lipídico; y aquellas de tipo indirecto (mediadas por factores de crecimiento símil insulina o IGFs) como gran parte de la acción sobre el crecimiento y el metabolismo proteico e hidrocarbonado. Se han descripto varios polimorfismos asociados al gen GHR, siendo uno de los más frecuentes la deleción del exón 3 completo del gen (GHRd3), el cual genera la pérdida de 22 aminoácidos y la sustitución A24D en el extremo N-terminal del dominio extracelular del receptor. La frecuencia genotípica de este polimorfismo fue analizada en diversos estudios y en diversas poblaciones humanas. Encontrándose frecuencias de 2 a 27% en homocigosis y de 15-60% en heterocigosis dependiendo de la población en estudio. Si bien existen variaciones significativas entre las distintas poblaciones, en todos los casos se trata de una variante frecuente. Desde su descubrimiento al día de hoy este polimorfismo ha sido ampliamente estudiado, ya que se encuentra en un sitio altamente conservado en distintas especies de mamíferos y consiste en la deleción de un exón completo sin afectar la función de la proteína ni su afinidad por la hormona decrecimiento. Estas características sugieren que podría jugar un rol importante en mecanismos adaptativos, en el crecimiento y en la respuesta al tratamiento farmacológico con hormona de crecimiento. Existe amplia evidencia que apoya la teoría de que este polimorfismo está implicado en varios aspectos clínicos relacionados con el crecimiento, el metabolismo hidrocarbonado y el desarrollo puberal. OBJETIVOS: - Puesta a punto de una técnica anteriormente descripta para detectar ambos alelos del gen GHR (GHRfl y GHRd3). - Estudiar la frecuencia alélica del polimorfismo GHRd3 en nuestra población. - Analizar las variantes genotípicas del gen GHR (GHRd3/d3, GHRd3/fl, GHRfl/fl) y su relación con el crecimiento en niños nacidos PEG, así como con el inicio precoz de la adrenarca, la activación del eje HHG en dichos pacientes y el metabolismo hidrocarbonado. - Estudiar la presencia del exón 3 del gen GHR en ARN mensajero de diferentes pacientes y correlacionar los resultados con los genotipos de dichos pacientes. MATERIALES Y METODOS: En el presente estudio se analizaron 65 pacientes PEG y 94 pacientes con peso y talla adecuados para edad gestacional (AEG). En todos los casos se obtuvieron datos al nacimiento y a la edad de evaluación. Los pacientes AEG fueron utilizados para obtener las frecuencias genotípicas en la población. Todas las muestras fueron analizadas mediante PCR duplex, utilizando una técnica previamente descripta para la identificación de los transcriptos del gen GHR con la retención (GHRfl) ó la exclusión (GHRd3) del exón 3. Se evaluó en conjunto el genotipo de todos los pacientes junto con datos auxológicos obtenidos al nacimiento, a la edad de estudio y en edad puberal en los casos en los que fue posible. Se consideró PEG a todos los niños con antecedentes de retardo de crecimiento intrauterino constatado durante el control del embarazo o nacido con un peso por debajo de -2SDS para su edad gestacional y género. Cuando la edad gestacional no estaba disponible, se consideró PEG a aquel recién nacido con un peso de nacimiento menor a 2.5kg. La presencia del exón 3 del gen GHR en ARN mensajero fue analizada en muestras de placenta mediante una técnica de RT-PCR, seguida de PCR, ambas previamente descriptas. RESULTADOS: La frecuencia en nuestra población fue de 48% para el genotipo homocigota GHRfl, 38% para el genotipo heterocigota y 14% para el genotipo homocigota GHRd3. Las mismas cumplen con la Ley de Hardy-Weinberg. No se encontraron diferencias en los datos antropométricos al nacimiento entre los grupos homocigota para el alelo GHRfl (GHRfl/GHRfl) y portadores del alelo GHRd3 (GHRd3/-). La proporción de pacientes PEG portadores del alelo d3 que experimentaron crecimiento compensador espontaneo (catch-up) fue mayor que los homocigota GHRfl. La diferencia de estatura entre el momento de valoración y la longitud corporal al nacimiento (? talla) fue mayor para los portadores de la variante GHRd3. Otros parámetros auxológicos no fueron diferentes entre los portadores de los diferentes genotipos. Los valores de IGF1 e IGFBP3 en pacientes pre-puberales previos al inicio del tratamiento con rhGH no presentaron diferencias significativas entre genotipos. La edad de inicio puberal en ambos sexos fue similar entre los portadores de la variante GHRd3 y los GHRfl. Tampoco se observaron diferencias en la prevalencia de pubertad temprana en ambos grupos. Los valores de SDHEA en prepubertad no mostraron diferencias significativas entre los subgrupos de variantes de GHR. Los valores de glucemia, insulina e índice HOMA en pacientes PEG sin tratamiento con rhGH en prepubertad no mostraron diferencias significativas en función de la variante alélica del GHR. Tampoco se encontraron diferencias en otros parámetros clínicos como peso e índice de masa corporal. Con respecto a la expresión del GHR, a la fecha de finalización del estudio no se genotipificó ninguna placenta homocigota para el alelo GHRd3. En todos los casos los transcriptos evidenciados condicen perfectamente con el genotipo obtenido, indicando que en el tejido evaluado se expresarían todas las isoformas presentes en el genoma del paciente. CONCLUSIONES: La frecuencia genotípica del polimorfismo GHRd3 en la población en estudio se asemeja a los resultados obtenidos por diferentes grupos en otras poblaciones a nivel mundial. Con respecto al crecimiento, si bien no se observaron diferencias en el crecimiento prenatal ni en los niveles séricos de IGF1, si se observó una variación significativa en el crecimiento posnatal espontaneo entre ambos grupos estudiados. En nuestro estudio, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la edad de inicio puberal en mujeres ni en varones en función del polimorfismo de GHR. Son muy pocos los estudios que trataron este tema previamente, por lo que la evidencia es escasa y no se pueden hacer grandes comparaciones, pero nuestros datos son de utilidad como punto de partida en el tema. Los resultados en cuanto al metabolismo hidrocarbonado indican que no hubo diferencias en base al polimorfismo GHRd3. Pero los resultados publicados previamente por diversos autores muestran una gran controversia con respecto a este tema y nuestro estudio aporta un resultado más para tratar de elucidar este asunto. Con respecto a los ensayos de expresión del GHR en placentas sanas, los resultados muestran que para cada genotipo, se encontraron todas las isoformas esperadas, lo que indica que en ese tejido no ocurriría ningún mecanismo de splicing que dé origen a una isoforma no presente en el genoma del paciente. Es la primera vez que se realiza este estudio en placenta y esto podría explicar las diferencias que se observan en los resultados publicados hace años por los distintos investigadores. Es conveniente continuar estudiando este fenómeno con el objetivo de obtener pacientes con genotipo homocigota para el alelo GHRd3. Sería importante aumentar el tamaño de la población en estudio de manera de obtener una población más representativa. Esto permitirá hacer un análisis más completo del efecto que podría tener el polimorfismo sobre las diferentes variables estudiadas.

Descripción: La rama celular de la inmunidad innata, compuesta por fagocitos mononucleares y células dendríticas, cumple un rol importante iniciando, orientando y modulando varios aspectos de la respuesta inmune adaptativa. Estas células, a pesar de su diversidad fenotípica, comparten funciones esenciales para el desarrollo de la respuesta inmune. El modelo de células expuestas a lipopolisacárido (LPS), macromolécula glicolipídica presente en la pared de bacterias Gram negativas, permite hacer inferencias sobre diferentes tipos de infermedades en las que la inflamación juega un rol fundamental. En este trabajo se analizaron datos provenientes de experimentos de microarreglos de ADN de monocitos, macrófagos y células dendríticas expuestas a LPS. Mediante análisis de clusterización y de enriquecimiento funcional se logró identificar un grupo de genes sobreexpresados en los tres tipos celulares, que contiene genes que pueden modular la inflamación a traves de la inhibición de la vía de NFkB y que a su vez pueden ser estimulados por calcitriol. Esto permitió esbozar un modelo de red de regulación génica que puede ayudar a entender la acción antiinflamatoria, una de las acciones no clásicas de este compuesto. Esto también abre la búsqueda de moléculas que puedan actuar como blancos terapéuticos para un gran expectro de enfermedades en las que la inflamación juega un rol importante en la fisiopatogenia.

Descripción: La inactivación del cromosoma X (XCI) es un proceso normal por el cual uno de los dos cromosomas X de las mujeres es inactivado, para compensar la dosis génica con los varones XY. Este proceso de XCI ocurre temprano en el desarrollo y la elección del cromosoma X a inactivar se produce al azar, generando hembras mosaico con un 50% de células con el cromosoma X paterno activo y el otro 50% con el X materno activo. La inactivación del cromosoma X sesgada es una marcada desviación del 50% y entre otras causas puede asociarse a mutaciones sobre el gen XIST (X-inactive specific transcript) responsable de la iniciación y el mantenimiento de la inactivación. En el centro de inactivación del cromosoma X (XIC), en Xq13, se han descripto genes asociados a ARNs no codificantes (ARNnc) involucrados en el proceso de XCI: XIST, JPX (just proximal to XIST) y FTX (five prime to XIST). La presencia de variantes tipo SNP (single nucleotide polymorphism) en los genes del XIC podrían modificar su nivel de expresión, su función e impactar el balance alélico conduciendo a la XCI sesgada. Se realizó un estudio molecular exploratorio de tipo Caso/Control (n=22) sobre la eventual asociación de variantes genéticas en los genes del XIC con el patrón de XCI, con 11 Casos con XCI sesgada extrema (XIP>90%) y 11 Controles con inactivación al azar (50%>XIP<55%). En el primer grupo, se incluyeron mujeres portadoras y no-portadoras, sintomáticas y no-sintomáticas de Hemofilia A (HA) y Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Se realizó un screening genético del XIST, JPX y FTX mediante la estrategia de CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) y secuenciación de Sanger, incluyendo las regiones con SNPs de frecuencias alélicas relevantes. El estudio de un total de 990 amplímeros analizados no mostró deleciones ni mutaciones nuevas, sino sólo 18 variantes alélicas en los 161 SNPs anotados en las bases de datos para los tres genes. Once de los 18 muestran ORs de riesgo (e.g., OR>2,0) indicativos de asociación con XCI sesgada aunque no significativa (p>0,05). En XIST, rs6527, rs16992443, rs16992436 y rs16992442 mostraron ORs en el rango 3-4; en FTX, rs174138, rs68124822, rs146632102 y rs187332478, ORs de 2-6 y en JPX, rs68178357, rs55824328 y rs67649459, ORs de 2-3. Los datos estadísticos junto a los estudios bio-informáticos asociados a modificación de los sitios exónicos enhancer de splicing (ESE) y predictores de sitios de splicing sobre los SNPs informativos no mostraron claros indicios de causalidad del fenotipo aunque la mayoría de ellos mapeaban en regiones conservadas filogenéticamente. Nuestros resultados, aunque no concluyentes, nos estimulan a ampliar las series de Casos y más aún de Controles para aumentar la consistencia estadística del estudio confirmando o desestimando las tendencias observadas. Asimismo, la ausencia de SNPs heterocigotas en algunas regiones del XIC en ciertos Casos nos sugiere la posible asociación con deleciones que podrían asociarse a la abolición de la función de la XCI en cis del X afectado.

Descripción: La leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia de adultos más frecuente en occidente, caracterizada por la acumulación de linfocitos B maduros en sangre periférica, médula ósea, órganos linfoides y bazo, y por presentar un curso clínico variable, siendo de gran interés el estudio de factores genéticos como los polimorfismos en la vía de p53 ya que pueden cumplir un rol importante en la etiología y la evolución clínica de la LLC. El gen TP53 desempeña un papel central en la supresión del cáncer, el mantenimiento de la estabilidad del genoma, el control de la respuesta al daño del ADN, la proliferación y la apoptosis. La pérdida de la función de este gen en la LLC debido a la deleción del cromosoma 17p o a mutaciones genéticas, se asocia a un pronóstico adverso. La frecuencia de las mutaciones de TP53 es relativamente baja en pacientes con LLC recién diagnosticados, pero aumenta considerablemente con la progresión de la enfermedad. Se ha reportado que los polimorfismos en el gen TP53 o en sus reguladores MDM2 o NQO1 llevan a la inactivación de la vía de señalización p53. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación de los polimorfismos en genes de la vía p53 con la susceptibilidad y los factores pronóstico en pacientes argentinos con LLC. Se analizaron 89 pacientes y 122 controles sanos. En todos los pacientes se realizó de rutina el estudio citogenético y de FISH (hibridación de fluorescencia in situ), así como el estado mutacional de IGHV. Se estudiaron 3 polimorfismos en TP53: SNP213 G>C (rs1042522), IVS3 16 bp indel (rs17878362) y IVS6+62A>G (rs1625895); 2 en MDM2: SNP309T>G (rs2279744), MDM2 indel1518 (rs3730485) y el SNP NQO1 609C>T (rs1800566) por diferentes técnicas de PCR. En el grupo control se confirmó que las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo estaban en EHW (p>0,05). El análisis de los modelos genéticos por regresión logística demostró que los polimorfismos estudiados no se asocian con el riesgo a desarrollar LLC. Teniendo en cuenta el modelo recesivo, se encontró que los genotipos TP53 213-CC (OR=6,98; IC: 1,25-38,9; p=0,016) y MDM2 309-GG (OR=8,97; IC: 11,55-52,0; p=0,007) se asociaron con mayor riesgo de cariotipos anormales. Además, los pacientes con los genotipos TP53 213-CC, TP53 IVS3-ins/ins, MDM2 309-GG y NQO1 609-TT presentaron mayor riesgo para la del17p13. No se observaron asociaciones significativas con el estado mutacional de IGHV y los factores de pronóstico clínico. Nuestros datos indican que la variabilidad genética en la vía p53 no modula el riesgo a desarrollar LLC pero está relacionada con la adquisición de alteraciones cromosómicas específicas de la patología. La atenuación de la vía p53 debida a genotipos variantes probablemente conduce a una reparación deficiente del daño en el ADN que resulta en inestabilidad genómica, lo que a su vez contribuiría a la aparición de alteraciones cromosómicas específicas de la CLL.

Descripción: La generación del complejo craneofacial es un proceso que requiere una considerable organización. La cabeza de los vertebrados es una estructura compuesta cuya formación comienza temprano en el desarrollo, cuándo el cerebro empieza a formarse. Las células de la cresta neural tienen fundamental importancia en este proceso. La cresta neural constituye una población de células multipotentes que da lugar a una amplia gama de derivados, incluyendo las células pigmentarias, el esqueleto craneofacial, tejido conectivo, neuronas y células gliales del sistema nervioso periférico. En Xenopus, se originan tres poblaciones principales de migración de células de la cresta neural craneal a diferentes niveles axiales entre el cerebro medio y el posterior cuyos destinos son: el primer arco mandibular, segundo arco hioides y tercero y cuarto arcos branquiales. La sobrexpresión de Sonic hedgehog (Shh) lleva a una expansión de los arcos viscerales y branquiales. Por otro lado, la pérdida de la función de Shh produce una completa desorganización de los arcos branquiales y como consecuencia con alteraciones faciales. Estos resultados indican que Shh contribuye con la formación de los diferentes arcos y en consecuencia en el desarrollo de los cartílagos y huesos de la cara durante el desarrollo en Xenopus laevis.

Descripción: La Enfermedad de Atesoramiento del Glucógeno tipo IX (EAG-IX) es causada por un defecto genético en una de las subunidades de la fosforilasa-b-quinasa (PHK) codificadas por los genes PHKA2, PHKB y PHKG2. La deficiencia de PHK ligada al cromosoma X (EAG-IXa), gen involucrado PHKA2, presenta dos variantes enzimáticas XLG1 (disminuida en hígado y eritrocitos) y XLG2 (sólo disminuida en hígado). Las deficiencias de PHK y fosforilasa hepáticas, conforman los Defectos del Sistema de la Fosforilasa (DSF), conduciendo a las denominadas EAG-IX y EAG-VI, respectivamente. La fosforilasa hepática es codificada por el gen PYGL. En el presente trabajo, inicialmente, se planteó la estandarización del diagnóstico molecular de la EAG-IX ligada al cromosoma X (gen PHKA2), sin embargo teniendo en cuenta los aspectos clínicos y bioquímicos de las EAG-IXa y EAG-VI, indistinguibles en la primera infancia, se extendió nuestro estudio al gen PYGL. Este trabajo propone definir nosológicamente los DSF mediante la consideración del sexo del paciente, actividad PHK en eritrocitos y análisis molecular del gen PHKA2 y gen PYGL. Se estudiaron 2 varones y 3 mujeres de 4 familias no emparentadas. La actividad PHK en eritrocitos de los individuos disponibles, resultó deficiente en 1 de los 2 pacientes varones, valores normales en 2 de las 3 probandos de sexo femenino y no se efectuó el ensayo enzimático en los 2 pacientes restantes (hermanos mellizos de diferente género). Se diseñó un algoritmo para el estudio de los genes involucrados en los DSF teniendo en cuenta genero de los pacientes y actividad PHK eritrocitaria. El estudio del gen PHKA2 en 1 de los pacientes de sexo masculino definió su condición de hemicigota mutado encontrándose un cambio en el sitio aceptor de ?splicing? en posición -1 del intrón 10 (c.1042-1G>A) llegando al diagnóstico definitivo EAG-IX ligada al cromosoma X con variante XLG1. El análisis del gen PYGL, identificó cuatro sustituciones y un polimorfismo: p.Gly233Ser, p.Gly686Arg, p.Met1Lys, p.Glu673Lys y IVS15-2delA, respectivamente. La frecuencia alélica de todas las variaciones génicas detectadas en el gen PYGL resultó del 50% para p.Gly686Arg que estuvo presente en 3 de los 6 alelos estudiados y del 16,6% para los restantes cambios encontrados en este gen en los pacientes investigados en nuestro centro. Se estima que esta investigación es el inicio en un área del conocimiento previamente no abordado en nuestro país que permitió definir pacientes con EAG IX y EAG VI demostrando que el análisis genético representa un procedimiento útil para establecer un diagnóstico certero.

Descripción: Uno de los problemas más importantes que deben enfrentar las sociedades modernas es la contaminación ambiental producida por la liberación, accidental o deliberada desde fuentes industriales y/o agrícolas, de una gran variedad de compuestos químicos orgánicos. Los ácidos clorobenzoicos son contaminantes de gran interés ya que se encuentran en el ambiente mayormente como resultado de la degradación parcial de bifenilos policlorados (PCBs) y como derivados de la manufactura de colorantes, herbicidas, funguicidas y conservantes de pinturas. El presente trabajo tuvo por finalidad estudiar la cinética de degradación del ácido 3-clorobenzoico por una cepa de Pseudomonas putida aislada de sedimentos del Riachuelo (Buenos Aires, Argentina). Se evaluó la influencia de distintos factores como la concentración del compuesto en estudio, pH, tamaño del inóculo, presencia de co-sustratos metabólicos como glucosa y acetato de sodio, y de compuestos análogos estructurales como el ácido 4-clorobenzoico. Por otro lado, se determinó, mediante ensayos realizados a escala laboratorio, la capacidad de la cepa bacteriana para degradar el ácido 3-clorobenzoico en muestras de aguas superficiales contaminadas con el compuesto. Se realizaron ensayos estandarizados de toxicidad utilizando bacterias bioluminiscentes (Vibrio fischeri) y semillas de lechuga (Lactuca sativa) para evaluar la toxicidad del compuesto al inicio y final del proceso de biodegradación. Los ensayos de biodegradación se llevaron a cabo en un fermentador de 2 L de capacidad a 28 oC con agitación (200 rpm). La biodegradación fue evaluada por espectrofotometría, cromatografía gaseosa, demanda química de oxígeno (DQO) y crecimiento microbiano. Pseudomonas putida degradó 100 mg/L de ácido 3-clorobenzoico en 14 horas con una eficiencia expresada en remoción del compuesto de 92%. La máxima concentración degradada por la cepa bacteriana fue de 1000 mg/L y el tiempo requerido para ello fue de 7 días. La influencia del pH del medio en un rango de 6 a 9 no afectó la cinética de degradación, mientras que a pH 5 se observó una inhibición del crecimiento bacteriano. El tiempo requerido para degradar el compuesto disminuyó con el incremento del tamaño del inóculo. Pseudomonas putida mantuvo la capacidad de degradar el ácido 3-clorobenzoico sin haber sido sometida al proceso de adaptación. La presencia de glucosa aceleró la degradación del ácido 3-clorobenzoico. Por otro lado, se comprobo? que la cepa bacteriana fue capaz de metabolizar el ácido 3-clorobenzoico aún en presencia de concentraciones elevadas (100 mg/L) de compuestos análogos estructurales como el ácido 4-clorobenzoico. Los ensayos realizados en agua superficial a escala laboratorio demostraron que la presencia de otros microorganismos y componentes del medio no afectaron la capacidad degradativa de Pseudomonas putida. Los bioensayos de toxicidad realizados demostraron la detoxificación del ácido 3-clorobenzoico como consecuencia del proceso de biodegradación.

Descripción: El cáncer de mama (CM) es una enfermedad multifactorial que resulta de una combinación compleja de factores genéticos y medioambientales. La historia familiar de Cáncer de Mama y/u Ovario Hereditario (HBOC), es el principal factor de riesgo para este padecimiento. A nivel mundial, en el modelo poligénico de susceptibilidad al CM, se encuentra en estudio la prevalencia de mutaciones en la línea germinal del gen TP53 en familias con HBOC, no asociado a mutación en BRCA1 o BRCA2. En el presente trabajo buscamos determinar la presencia de variantes genéticas (VG´s) patogénicas en los exones ?hot spot? en la línea germinal del gen TP53 en pacientes con criterio de HBOC no asociados a mutación en BRCA1/2 ni Síndrome de Li Fraumeni (SLF). Para ello se estudiaron 74 sujetos con CM y/o CO, con/sin historia familiar de la enfermedad. Los análisis genéticos incluyeron secuenciación por Sanger en los exones 5, 6, 7 y 8 del gen TP53. En esta población fueron encontradas 4 VG´s de las cuales 2 resultaron patogénicas (2/74, 2.7%). Tras un análisis bioinformático, estas mutaciones deletéreas fueron asociadas con características patogénicas agresivas. Estos resultados generan conocimientos que permitirán a futuro identificar la distribución y frecuencia de las VG´s como factores de susceptibilidad o riesgo para el desarrollo de HBOC, proporcionando las bases para estudios posteriores que permitan determinar su distribución en todo el país y aportar el conocimiento del perfil epidemiológico genético local. Dada la gran heterogeneidad del cáncer a nivel mundial, la identificación y registro de los casos encontrados localmente en cada área, permiten dirigir las estrategias de manejo de las patologías, adecuándose a la población estudiada.

Descripción: Se realizó un análisis de datos de sobre-expresión diferencial genómica del organismo Mycobacterium Tuberculosis (Mt), cepa H37Rv, en ensayos in-vitro en condiciones de estrés simulando el estado de latencia del bacilo en el huésped. Este análisis se combinó con información de diferentes bases de datos bioinformáticas de dominio público a través de una nueva herramienta en desarrollo denominada Tuberquery. Esta herramienta permitió identificar una serie de Open Reading Frames (ORFs) con una determinada homología de secuencia de Protein Families (PFAM) que tienen al menos una estructura molecular detallada en el Protein Data Bank (PDB). Posteriormente se consideró información metabólica y de esencialidad para clasificar los candidatos líderes obtenidos. Finalmente, se propone la continuación de este trabajo con investigaciones de drogabilidad, off-targeting, y virtual screening necesarios para estimar la potencialidad farmacológica de los candidatos líderes obtenidos. Se plantea el beneficio de utilizar herramientas bioinformáticas para la búsqueda de nuevos objetivos moleculares como una alternativa para optimizar recursos en el comienzo del proceso racional de descubrimiento de drogas.

Descripción: El modelo de rata transgénica para la enfermedad de Alzheimer (EA) McGill-R-Thy1 contiene insertado el gen de la proteína precursora de péptidos amiloides (APP) humana, con las mutaciones Swedish e Indiana, causantes de esos tipos de EA. Este modelo presenta acumulación intracelular temprana de especies de péptidos A? en la corteza cerebral y en neuronas piramidales del hipocampo. Los animales homocigotas exhiben oligómeros A? intracelulares desde la primera semana de vida y depósitos de placas de amiloide extracelular desde los 6 meses de edad. Las ratas homocigotas de 3 meses presentaron alteración en la prueba del tanque de agua de Morris, prueba de condicionamiento al miedo y prueba de reconocimiento de nuevo objeto (NOR), mientras que las ratas de 13 meses demostraron déficits en la prueba de nueva localización de objeto (NOL). En cambio, los animales hemicigotas presentan características histológicas correspondientes a las primeras fases de la EA, cuando aún no hay placas de amiloide. En tareas como tanque de agua de Morris, los hemicigotas de 3 meses presentaron déficits, mientras que a los 13 meses presentaron déficits en la tarea de NOR y prueba de condicionamiento al miedo. Además, varias investigaciones mostraron que la inflamación está involucrada en la fisiopatología de la EA. Estudios clínicos prospectivos y retrospectivos sugirieron que las drogas antiinflamatorias disminuirían el riesgo de sufrir EA. En algunos modelos animales de EA se observó que la inflamación se correlaciona positivamente con la generación de especies de A? y con los déficits cognitivos. Caracterizamos las funciones cognitivas de los animales transgénicos hemicigotas (TG) así como de controles de genotipo salvaje (WT) descendientes de las mismas generaciones parentales, de manera de diferenciar los déficits posiblemente debidos al envejecimiento de aquellos atribuibles a la acumulación de A?. Evaluamos animales de 13 meses tanto TG como WT, en la habituación a un campo abierto (CA), la evitación inhibitoria de un choque eléctrico suave por el pasaje de un compartimiento a otro, en un paso (ST-IA), NOL y NOR. Para estudiar la posible contribución de la inflamación en este modelo de EA realizamos inmunomarcado contra Iba-1 y GFAP, analizando en la región CA1 del hipocampo el porcentaje de superficie cubierta por células de la microglía y por astrocitos. Para estimar si las neuronas hipocampales presentaban signos de degeneración usamos anticuerpos dirigidos contra NeuN, proteína que normalmente se halla en el núcleo, pero que se redistribuye al citoplasma en caso de estrés celular. No hubo diferencias entre los animales WT y TG en cuanto a los parámetros de exploración del CA: ambos grupos de animales presentaron habituación al ambiente en el corto plazo y expresaron la memoria correspondiente en el largo plazo. Los animales TG parecen incapaces de aprender la tarea de ST-IA, mientras que los animales WT presentan un rendimiento adecuado. Ni los animales WT añosos ni los TG tuvieron un adecuado rendimiento en la tarea de NOL, a diferencia de animales WT jóvenes que logran aprender y formar una memoria de esa tarea. En la tarea de NOR, los animales WT tuvieron un desempeño adecuado, tanto en el corto como en el largo plazo, mientras que los animales TG solo mostraron buen rendimiento en la memoria de corto plazo, no evidenciando haber formado memoria de largo pazo. Observamos atrofia astroglial en los animales TG, 5 mientras que la superficie del área cubierta por células de la microglía fue similar para las ratas TG y WT. Los animales TG presentaron redistribución citoplasmática de la proteína NeuN, lo que indica neurodegeneración. En conclusión: Estos cambios degenerativos podrían ser consecuencia de diferentes etiologías, como el ataque por A?-oligómeros sobre sinapsis y neuronas y/o la posible atrofia de la astroglia, afectando la función de neuronas y sinapsis. Podría tratarse también de una inflamación inespecífica por la secreción de moléculas inflamatorias inducidas por especies de A?, incluyendo A?-oligómeros. Estos resultados sugieren que la patología observada a nivel histológico en el hipocampo, puede estar directamente relacionada con los déficits de memoria, particularmente de largo plazo, tanto la de discriminación de objetos, como la de asociación con componentes espaciales y aversivos.

Descripción: El crecimiento de plantas en altas densidades de siembra genera cambios en la cantidad y calidad de la luz generando una disminución en la irradiancia percibida. Algunas plantas han desarrollado la capacidad para evitar el sombreado a través de cambios morfológicos, como son el alargamiento de tallos, entrenudos y peciolos, entre otros. Estas respuestas en su conjunto son conocidas como ?Síndrome de escape al sombreado? (SES). A nivel molecular, la regulación transcripcional de estas respuestas esta mediada por los Phytochrome Interacting Factors (PIFs), factores de transcripción de tipo bHLH (basic Helix Loop Helix). Si bien el SES es un carácter ventajoso en ambientes naturales, representa un problema en cultivos extensivos como el de soja debido a que el crecimiento de tallos y pecíolos ocurre a expensas de recursos que serían destinados a los órganos de cosecha. En el laboratorio de Genómica Comparativa del Desarrollo Vegetal, se ha descubierto un bHLH/HLH de Glycine max (Soja), que podría estar involucrado en la modulación de las respuestas del escape al sombreado en dicha planta, es por ello que este gen es un candidato para programas de mejoramiento. El objetivo del presente es caracterizar el rol en la modulación del SES del ortólogo de dicho bHLH en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Para ello se decidió realizar una aproximación de genética reversa empleando plantas mutantes de expresión nula para dicho gen, inicialmente se genotiparon plantas mutantes detectándose la presencia de una inserción de T-DNA que disrrumpe el gen de interés. Luego, se estudió la presencia del ARNm en las mutantes que poseían el T-DNA en el bHLH candidato, verificando que no hay expresión de mensajero funcional. Finalmente a partir de una caracterización fenotípica del SES se descubrió que las mutantes tienen mayor respuesta que el genotipo silvestre, lo que sería una evidencia que el bHLH en estudio actuaría como un modulador negativo del SES. De esta forma, el presente trabajo constituye una caracterización de un nuevo factor de transcripción de tipo bHLH que actúa modulador negativo de las respuestas al SES.

Descripción: Caracterización de la evolución del virus de la Hepatitis C en la recurrencia postrasplante Introducción Se estima que en el mundo hay 170 millones de individuos infectados crónicamente por el virus de la hepatitis C (HCV). El trasplante hepático constituye la opción terapéutica de elección para aquellos pacientes que han llegado a estadios terminales de cirrosis o que han desarrollado hepatocarcinoma. En la actualidad la infección por HCV constituye la causa más frecuente para la indicación de trasplante. La recurrencia postrasplante de la infección viral es prácticamente universal; ocurre en forma inmediata tras la cirugía y se asocia con incrementos significativos de la viremia. Sin embargo, la severidad de la recurrencia es variable. Han sido descriptos diferentes factores virales y del hospedador que pueden influir en la severidad de la recurrencia; sin embargo, no existe evidencia concluyente sobre la importancia de cada uno de ellos. Objjettiivo Caracterizar la implicancia del trasplante hepático en la evolución viral de diferentes regiones del HCV y correlacionar la evolución viral con la severidad de la recurrencia. Paciienttes y méttodos Se caracterizó, mediante técnica de secuenciación y análisis filogenético, la evolución de las regiones NS5B, E2 y Core en nueve pacientes infectados crónicamente con HCV (5 de ellos coinfectados con HIV) sometidos a trasplante hepático. Se analizaron 31 muestras de plasma (1 a 2 muestras previas al trasplante y 1 a 3 muestras posteriores al trasplante). Las muestras analizadas abarcaron un periodo de tiempo de 19,4?10,5 meses. La recurrencia de la infección fue severa en 5 casos, moderada en los restantes 4 pacientes y ocurrió a los 4,74?4,87 meses postrasplante. En dos casos se analizó, mediante técnica de clonado y secuenciación, las poblaciones presentes previas y posteriores al trasplante. Resullttados La distribución de subgenotipos en la cohorte analizada fue: sg1a 33.3% (n=3), sg1b 44.4% (n=4), sg3a 22.2% (n=2). El número de sustituciones en las regiones NS5b, E2 y Core durante el seguimiento de los pacientes fue 2,56±3,05, 15,67±17,25 y 3,71±2,21 sustituciones/paciente respectivamente. Asimismo, la relación entre sustituciones sinónimas y no sinónimas en las regiones NS5B, E2 y Core fue 0,09±0,25, 0,92±0,83 y 1,17±1,47 respectivamente. En la región E2 se observó una correlación entre el número de sustituciones y el periodo de tiempos entre las muestras analizadas, coherente con un patrón de sustituciones secuencial y acumulativo. 2 Las poblaciones virales pre y postrasplante, caracterizadas en dos pacientes, mostraron un patrón evolutivo diferente. En un caso, no se observaron diferencias significativas en la diversidad y complejidad, lo cual sugiere que el trasplante no afectaría la evolución viral. Mientras que, en el otro caso se verificó un efecto de ?cuello de botella?, en el cual las poblaciones postrasplante presentaron una diversidad y complejidad menor que la observada en la muestra pretrasplante. Diiscusiión La distribución de subgenotipos en la cohorte estudiada fue análoga a la descripta en la población general, lo cual sugiere que no habría una implicancia determinante del subgenotipo que conlleve a la necesidad de someterse a un trasplante. La caracterización de la evolución viral en el contexto del trasplante hepático proporciona un paradigma fascinante para explorar las complejas presiones de selección que subyacen a la interacción virus-hospedador. Las regiones caracterizadas presentaron diferentes grados de variabilidad nucleotídica (E2>Core~NS5B), lo cual se correlaciona con el papel biológico que cada una de las proteínas desempeña en la biología del virus. La región NS5B presentó un elevado grado de conservación probablemente asociado a la restricción funcional de la actividad enzimática de la proteína. La evolución de la región E2 presentó un patrón de sustituciones secuencial y acumulativo en función del tiempo, compatible con la selección y el escape de la respuesta inmune, lo que refleja un constante mecanismo de adaptación del virus a la presión ejercida por el hospedador. Finalmente, el patrón de evolución de la región Core sugiere una compleja interacción finamente equilibrada entre la selección negativa debida a sus características funcionales y la selección positiva debida a sus propiedades antigénicas. Las secuencias nucleotídicas de las diferentes regiones de cada paciente, excepto en un caso, formaron clados con alto valor de soporte estadístico, sugiriendo que el trasplante no significó en la mayoría de los casos, un evento de presión selectiva positiva que implicara un cambio en la cuasiespecie predominante previo al trasplante, de modo tal de modificar significativamente la secuencia consenso. Sin embargo, en el análisis filogenético de la región E2, en tres de los siete pacientes en los cuales se analizaron más de 2 muestras, se observaron agrupamiento internos con valores significativos de soporte de la topología en los cuales se hallaban separadas las secuencias pretrasplante de las postrasplante. Este 3 resultado sugiere que el trasplante podría implicar la selección de una población minoritaria con mayor adaptación al escenario postrasplante. La caracterización de las poblaciones virales pre y postrasplante, realizada en dos pacientes, mostró diferentes patrones de evolución. En un caso, no se observaron diferencias significativas en la diversidad y complejidad, lo cual sugiere que el trasplante no afectó la evolución viral. Mientras que en el otro caso se verificó un efecto de ?cuello de botella?, en el cual las poblaciones postrasplante presentaron una diversidad y complejidad menor que la observada en la muestra pretrasplante. La implicancia del trasplante hepático en la evolución del HCV es motivo de controversia. Algunos estudios sugieren que luego del trasplante, en ausencia de la presión inmune efectiva debido a la inmunosupresión, la población viral se vuelve más homogénea. Señalando que la diversidad viral pretrasplante se reduce como consecuencia del "cuello de botella" que implica el trasplante, resultando en una presión selectiva de la variante viral que mejor se adapta al escenario postrasplante. Contrariamente al escenario de "cuello de botella", otros estudios han descripto que múltiples linajes del HCV se transmiten en el momento del trasplante, sin una disminución importante en la diversidad genética viral. La recurrencia postrasplante de la infección por HCV es prácticamente universal ya que sucede en la amplia mayoría de los pacientes. Sin embargo, en este estudio no se observó que la severidad de la recurrencia de la infección se asociara en forma particular a un subgenotipo viral y/o a la coinfección con HIV. Este resultado sugiere que la recurrencia de la infección es un evento multifactorial en el cual además de los factores virales, probablemente participan factores del hospedador como la edad, la etnia y el estado inmunológico del paciente.

Descripción: El presente estudio consistió en la detección y caracterización de genes de resistencia a ?-lactámicos y a quinolonas de codificación plasmídica en un total de 101 enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación aisladas de muestras clínicas en centros de salud de la ciudad de Cochabamba-Bolivia, en el periodo de Diciembre 2012 a Marzo 2013. Las ?-lactamasas de espectro extendido detectadas fueron en su totalidad de tipo CTX-M, de las cuales 89 correspondieron a CTX-M-grupo-1, 10 a CTX-M-grupo-9, 1 a CTX-M-grupo-2 y 1 aislamiento mostró la presencia simultánea de CTX-M-grupo-1 y CTX-M-grupo-9. Además, un 71% de los aislamientos mostró la presencia de blaoxa-1. Resultó frecuente la presencia simultánea de mecanismos que confieren resistencia a ambas familias de antibióticos siendo el 93% de las enterobacterias estudiadas resistentes a quinolonas. Se realizó la identificación de genes de resistencia plasmídica a quinolonas (PMQR). La variante enzimática aac(6?)-Ib-cr fue detectada en un 83% de los aislamientos siendo el mecanismo PMQR más prevalente. También se encontraron 6 aislamientos portadores de genes qnr que correspondieron a los alelos qnrB1 (5) y qnrB19 (1). El gen que codifica para la bomba de eflujo qepA1 fue identificado en 6 E. coli. Los genes que codifican OqxAB, otra bomba de eflujo, se detectó en un aislamiento de E. coli. Este trabajo constituye el primer reporte de marcadores de resistencia a ?-lactámicos y quinolonas en la ciudad de Cochabamba-Bolivia. Este estudio representa el primer reporte de qepA1, qnrB1, qnrB19 y aac(6?)-Ib-cr en esta 4 ciudad de Bolivia, mientras que la detección de oqxAB corresponde al primer reporte en dicho país y a uno de los primeros reportes en Latinoamérica .

Descripción: La proteína GRP78 es un marcador clave del estrés de retículo endoplásmico (RE) y su inducción temprana se evidencia con diferentes inductores de estrés de RE. En este trabajo se analizó el rol de las MAP quinasas (MAPK) y las MAP quinasas fosfatasas (MKP) en la inducción de GRP78 por cisplatino (CPT), en células de riñón humano de la línea HK-2. Se demostró un incremento significativo de los niveles del ARNm de GRP78 a partir de las 3 h de exposición al CPT. El análisis de los niveles del ARNm de GRP78 en células incubadas con CPT en ausencia y presencia de inhibidores de la activación de las MAPK ERK1/2, JNK y p38 reveló que sólo el inhibidor de la activación de ERK1/2 (PD98059) reduce significativamente la inducción de GRP78 provocada por CPT. En concordancia con estos resultados se detectó un aumento significativo y transitorio de los niveles de las formas fosforiladas de ERK1/2 en células incubadas con CPT durante diferentes tiempos. Más aun, se demostró que el CPT también promueve la expresión transitoria de MKP-1, fosfatasa capaz de desfosforilar a ERK1/2, JNK y p38, con una cinética compatible con la desfosforilación de ERK1/2. Para determinar si MKP-1 contribuye a atenuar la inducción de GRP78 por su acción sobre ERK1/2, se analizó el efecto de la sobreexpresión de MKP-1 sobre la inducción de GRP78 por CPT en células transfectadas transitoriamente con un plásmido diseñado para la expresión bajo el control de un promotor constitutivo de la proteína MKP-1 ligada a un péptido de reconocimiento (flag-MKP-1) o con el correspondiente plásmido vacío como control. Estos estudios mostraron que la sobreexpresión de MKP-1 abate la inducción mediada por CPT de GRP78. Por otra parte, se demostró que la sobreexpresión de MKP-1 disminuye la viabilidad de las células expuestas al CPT. Se concluye que la exposición de las células HK-2 a CPT por periodos cortos (hasta 6 h) cursa con la inducción de GRP-78 mediante un mecanismo dependiente de la actividad de ERK1/2. El CPT también induce fosfatasas específicas, al menos MKP-1, que contribuyen a modular la actividad de ERK1/2 y, por ende, los eventos que integran la respuesta al estrés de RE y que son dependientes de estas quinasas.

Descripción: Rac1 es una Rho GTPasa ampliamente implicada en motilidad, mitogénesis, transformación y metástasis. P-Rex1 es un activador de Rac1 que se encuentra sobre expresado en cáncer de mama y su silenciamiento inhibe la migración celular. La sobreexpresión de P-Rex1 está asociada a tumores de tipo luminal. En este trabajo nos propusimos analizar la presencia de P-Rex1 en muestras de pacientes provenientes del Hospital Marie Curie de la Ciudad de Buenos Aires, y determinar su relación con parámetros clínicos e histopatológicos. Para tal fin, se determinaron los niveles de P-Rex1 en biopsias, tumores y tejido adyacente provenientes de cirugía primaria de pacientes no sometidas a terapia neoadyuvante. Nuestro análisis reveló altos niveles de P-Rex1, no solo en muestras de tipo luminal sino también en los tumores de tipo basal. Estos resultados confirman el potencial de P-Rex1 como target terapéutico tanto para el tratamiento de tumores luminales como para cierta población de pacientes triple negativos. La heregulina (HRG) es un ligando de los receptores tirosina quinasa ErbB que gatilla la activación de Rac1 a través de P-Rex1 en células de cáncer de mama. Dicha activación conduce a un aumento en la expresión de TGF?2. De hecho, la familia TGF? está involucrada en migración celular y metástasis. Basados en estos antecedentes nos propusimos estudiar las dinámicas de activación de Rac1 por HRG y determinar la capacidad de TGF?2 de inducir migración y de interactuar con los receptores ErbB en líneas celulares de cáncer de mama. Se realizaron mediciones de Rac1 activado por ensayos de pull down, mediciones de ARNm por PCR cuantitativa y ensayos de migración por cicatrización de herida. Concluimos que la HRG es necesaria para la activación inicial de Rac. Posteriormente, las células comienzan a producir factores autócrinos que son necesarios para el mantenimiento de la activación de Rac1 iniciada por HRG. Además, mostramos que HRG induce un aumento de ARNm de TGF?2 de forma dependiente del tiempo. Es más, los ensayos de cicatrización de heridas revelaron que TGF?2 en sí mismo induce la migración de las células de cáncer de mama de una manera dependiente de la dosis y que la adición combinada de HRG y TGF?2 produce el mismo aumento en la migración celular que HRG solo. Estos resultados sugieren que existe una relación secuencial entre el pico de activación de Rac1 y el aumento máximo de TGF?2. Proponemos que esta citoquina es necesaria para el mantenimiento del fenotipo desencadenado por HRG de las células de cáncer de mama. Los resultados obtenidos en su conjunto contribuirán a establecer el valor pronostico y terapéutico de P-Rex1 y a la dilucidación de vías de señalización relevantes para la progresión tumoral. La determinación de una señalización cruzada entre TGF?2 y HRG podría contribuir a la búsqueda de terapias alternativas para pacientes con cáncer de mama.

Descripción: Según datos publicados por el C.D.C. ocurren en EEUU 90.0000 muertes por año debidas a infecciones intrahospitalarias. En los últimos años se habla de evolución moderna, donde no sólo entran en juego las mutaciones como importante mecanismo genético para evolucionar y hacer a las bacterias resistentes a los antimicrobianos, sino que además se han puesto en evidencia otros mecanismos como la Transferencia Horizontal Genética (THG), el cual es un mecanismo complejo, multifactorial, e importante en la evolución de distintos organismos. La resistencia a los antimicrobianos es el mejor ejemplo del proceso de presión-selección y adaptación genómica y fenotípica basada en la THG, ya que aproximadamente el 80% de las resistencias son debidas a este mecanismo. Hacia 1980, se observaron elementos genéticos asociados a la adquisición y pérdida de genes, los que fueron identificados como integrones. La definición actual de integrón define al integrón como un elemento que contiene los determinantes genéticos para mediar la recombinación sitio-específica, siendo capaz de reconocer y capturar genes cassettes móviles, muchos de los cuales codifican determinantes de resistencia a antibióticos. Nuestro objetivo es conocer la frecuencia de integrones de clase 1 y los arreglos de genes cassettes en P. mirabilis así como también la evolución, a lo largo de 15 años en una colección de cepas no relacionadas epidemiológicamente que presentan al menos resistencia a dos familias de antimicrobianos. Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 3 Se realizó el estudio en 35 aislamientos no relacionados epidemiológicamente de P. mirabilis provenientes de cinco nosocomios de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de la Provincia de Buenos Aires, aislados entre los años 1993-2008. El criterio de selección utilizado fue que los aislamientos debían ser resistentes al menos a dos familias de antimicrobianos. Se determinó la susceptibilidad de los aislamientos en estudio a once antimicrobianos de relevancia clínica por el método de difusión en agar de acuerdo a las guías del National Committee for Clinical Laboratory Standars (CLSI, 2013). Para realizar la caracterización de los integrones de clase 1 se llevó a cabo cartografía por PCR, utilizando distintas combinaciones de cebadores a fin de caracterizar la estructura y el contenido de genes cassettes en la zona variable. El 91,43% de los aislamientos fue resistente a ampicilina. La resistencia a ceftazidima, cefotaxima y cefepime se evidenció en el 48,57% del total de los aislamientos, los cuales todos presentaban fenotipo de ?-lactamasa de espectro extendido (BLEE) tipo CTX-M-2. El 100% de los aislamientos fueron sensibles a carbapenemes. El 31,43% de los aislamientos fue resistente a gentamicina, mientras que el 17,14% presentó sensibilidad intermedia. La resistencia a amikacina se manifestó en el 91,43% de los aislamientos, el 2,86% presentó sensibilidad intermedia. La resistencia a ciprofloxacina y ácido nalidíxico en los aislamientos estudiados fue de 54,29% y 62,86%, respectivamente. El porcentaje de resistencia a trimetoprima/sulfametoxazol de los mismos fue de 91,43%. Se encontró integrones de clase 1 en 35/35 (100%) de los aislamientos, y se detectó a ISCR1 en 17/35 (48,57%) de los mismos. Se encontraron en total 64 integrones de clase 1 en los 35 aislamientos, entre los que se distinguieron 12 arreglos de genes cassettes diferentes en su zona variable, que incluyen la combinación de 9 genes cassettes, 8 de los Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 4 cuales corresponden a genes de resistencia a antimicrobianos. El arreglo de genes cassettes más frecuente en los 35 aislamientos evaluados fue aac(6?)-Ib- blaOXA-2-orfD, tanto en los integrones clase 1 complejos y no complejos, correspondiente a In35. Al relacionar los arreglos de genes cassettes de los integrones de clase 1 con los resultados de sensibilidad a los antimicrobianos ensayados, se observa que todos los aislamientos resistentes a ceftazidima, cefotaxima y cefepime 17/35 (48,57%), tienen integrones de clase 1 complejos que albergan a ISCR1 con el gen blaCTX?M-2 en la VR-2. Al realizar un estudio bioinformático, observamos que en un período de 20 años (1993-2013) se publicaron 30 aislamientos de P. mirabilis con integrones de clase 1 en la base de datos INTEGRALL, dentro de los cuales 3 son integrones de clase 1 complejos. Estos integrones se encuentran formando parte de otras estructuras como islas genómicas, plásmidos y transposones. En ellos se encontraron 34 integrones de clase 1, con 27 arreglos de genes cassettes diferentes en su zona variable, que incluyen la combinación de 29 genes cassettes, de los cuales 25 corresponden a genes de resistencia a antimicrobianos. Se encontró en esta colección de P mirabilis provenientes de aislamientos clínicos una elevada frecuencia de integrones de clase 1 35/35 (100%) y se detectó a ISCR1, en 17/35 (48,57%) de los mismos. Dentro de los integrones de clase 1 complejos, In35::ISCR1:: blaCTX?M-2 fue el más frecuente. En los aislamientos estudiados correspondientes al período 1993-2008 aunque la cantidad de integrones por cepa no aumenta a lo largo del tiempo con respecto a los primeros aislamientos, se observa una tendencia a aumentar el número de familias de antimicrobianos a los que estos aislamientos presentan resistencia. Además, el número de Caracterización Molecular del los Integrones de clase 1 en Proteus mirabilis Bioq. M.A TURINA | 5 familias de antimicrobianos a los que cada cepa es resistente depende de los genes cassettes que conforman la estructura del integrón más que del número de integrones contenidos en la cepa. Nuestros resultados muestran una vez más que la THG, y junto a ella, la resistencia a múltiples familias de antimicrobianos ya no es patrimonio de ciertas cepas en particular

Descripción: La identificación de colonias transformadas que expresan altos niveles de proteína de membrana es Pichia pastoris es un cuello de botella en los estudios de estructura y función de transportadores NSTs en nuestro laboratorio, dada la baja concentración obtenida en otros sistemas de expresión como Sacaromices cervisae, y, el alto consumo de tiempo que implica el análisis de SDS-PAGE, western blot, y los ensayos de actividad biológica. Nosotros describimos un método de screening rápido en células enteras; para esto fusionamos el transportador implicado en desordenes de la glicosilación como la malformación vertebral compleja (CMV), SLC35A3 a la GFP y 8 histidinas en la región C terminal mediante PCR; el producto lo digerimos y linealizamos con pmeI en un vector pPICZb que puede insertar múltiples copias de la construcción SLC35A3.GFP.His8 en el genoma de Pichia pastoris, dicho vector contiene un gen de resistencia a la zeocina que permite seleccionar las colonias transformantes. Los transformantes fueron obtenidos por transformación química en células competentes. La construcción pPICZB.SLC35A3.GFP.HIS8 fue introducida en el genoma de Pichia pastoris por recombinación homóloga bajo el promotor AOX1 altamente regulado e inducible con metanol. En este trabajo utilizamos la luminiscencia de GFP para monitorear la expresión del transportador SLC35A3 en células enteras transformadas. Posteriormente se realizó el screening de 96 transformantes de 122 obtenidos. Se seleccionaron los mejores transformantes y se sembraron cultivos de 1ml para optimizar variables de cultivo como la densidad óptica (UOD/ml) óptima para iniciar el cultivo, pH, temperatura, concentración del inductor metanol y concentración de glicerol y mezclas de glicerol/metanol. Se tomaron muestras para medir densidad óptica (UOD/ml) y Fluorescencia (Ua/ml). Finalmente se seleccionaron las mejores condiciones de cultivo para probar la cantidad y calidad de proteína producida en 25ml de cultivo y 1 litro comparando la mejor condición de cultivo encontrada con la recomendada por el fabricante del kit EasySelect (Invitrogen). Los resultados muestran que colonias con altos niveles de fluorescencia de GFP pueden ser utilizados para identificar células enteras que expresan altos niveles del transportador SLC35A3 en estadio temprano de crecimiento exponencial no superior a 48 horas post inducción. La correlación entre la fluorescencia de GFP y la expresión del transportador A3 se utilizó para monitorear las condiciones de cultivo óptimas para la expresión produciendo más de 22mg/L y disminuyendo el tiempo empleado en el laboratorio para poner a punto un sistema de expresión del transportador A3 integro para iniciar estudios de estructura y función.

Descripción: La radioterapia, una importante herramienta terapéutica en oncología, es efectiva pero no específica. Puede dar lugar a reacciones agudas locales, aumentar el riesgo de desarrollo de nuevos tumores primarios y paradójicamente, incrementar la capacidad proliferativa e invasiva de las células tumorales que sobreviven, con el consiguiente incremento del riesgo de recurrencias y metástasis. Durante muchos años se aceptó que los efectos biológicos de la radiación ionizante ocurren como resultado directo del daño en el ADN de las células irradiadas. Sin embargo, en los últimos años la evidencia científica indica que la comunicación intercelular puedeafectar la respuesta en las células irradiadas y aún producir daño en células no irradiadas. La transición epitelial-mesenquimática (TEM) es un proceso biológico que permite a las células epiteliales adquirir características mesenquimáticas cuya inapropiada activación en carcinomas epiteliales contribuye a la invasión y metástasis. La interacción célula tumoral/célula normal/estroma juega un papel importante en este proceso. En cáncer de mama cuando la radioterapia se utilizaen forma posterior a una cirugía conservadora el campo de irradiación comprende una porción extensa de tejido mamario sano, ya que aproximadamente el 50% de las pacientes presentan células malignas diseminadas en la mama. El objetivo de este trabajo fue estudiar dos aspectos de la comunicación entre las células epiteliales mamarias benignas irradiadas (MCF-10A) y las células tumorales irradiadas (MCF-7 y MDA-MB-231): 1) Investigar el efecto de los factores secretados por las células epiteliales mamarias benignas irradiadas sobre respuestas biológicas relacionadas con el daño al ADN de células tumorales mamarias irradiadas. 2) Investigar el efecto de los factores secretados por las células epiteliales mamarias benignas irradiadas sobre el proceso de TEM en células tumorales mamarias irradiadas. Para llevar a cabo los objetivos las células tumorales irradiadas se incubaron con los medios condicionados de las células MCF-10A irradiadas. Como controles se utilizaron los medios condicionados de células MCF-10A no irradiadas, medios no condicionados y células tumorales sin irradiar. Se estudió en las células tumorales el daño de doble cadenaal ADN mediante detección de focos de histona ?-H2AX y la inestabilidad cromosómica a través del ensayo citoma. Los resultados indicaron que la radiación ionizante induce en ambas líneas neoplásicas mamarias la aparición inmediata de focos de histona ?-H2AX que desaparecen a las 48 horas. Los medios condicionados de MCF-10A provocaron ciclos de daño en el ADN, quedando las células tumorales mamarias no irradiadas e irradiadas con un daño residual.En cuanto a la inestabilidad cromosómica, los resultados obtenidos manifestaron en la línea tumoral MDA-MB-231 una frecuencia basal de micronúcleos, puentes internucleares y brotes nucleares superior a la de lalínea neoplásica MCF-7. En ambas líneas celulares tumorales irradiadas observamos un incremento en la frecuencia de los marcadores estudiados. La incubación con los medios condicionados también produjo un aumento de los marcadores de inestabilidad cromosómica tanto en las celulares tumorales irradiadas como en las no irradiadas. En muchos casos el efecto de los medios condicionados de las MCF-10A irradiadas fuemayor que el de los medios condicionados de las no irradiadas. Demostramos también que los factores secretados por las células mamarias benignas (irradiadas o no) afectan la proliferación de las células tumorales (irradiadas y no irradiadas) y favorecen el proceso de TEM. Se registraron cambios en la morfología celular (células de aspecto más irregular, fusiforme y con gran dispersión entre ellas), cambios en la localización subcelular del E-cadherina (de membrana a citoplasma) y ?-catenina (de membrana a citoplasma y núcleo), aumento de la expresión del marcador mesenquimático vimentinay de la localización nuclear del factor de transcripción Slug, incremento de la actividad gelatinolítica y de la migración celular. La adquisición o el aumento de características mesenquimáticas en las células tumorales están mediados al menos en parte por la activación del receptor tipo I de TGF-? (a través del TGF-?1 secretado por las células benignas o proveniente de un circuito autocrino tumoral) y por una vía de señalización que incluye la activación/fosforilación de Src. Nuestros resultados ponen de manifiesto la relevancia de la interacción tumor-huésped en el comportamiento tumoral y en la respuesta a la radioterapia.

Descripción: El melanoma cutáneo (MC) es el cáncer de piel con mayor incremento en su incidencia. Presenta alta tasa de mutaciones, siendo la más relevante la mutación nucleotídica T1799A, sustitución aminoacídica (V600E) en el oncogén BRAF. La proteína serina-treonina quinasa BRAFV600E es una variante constitutivamente activa asociada a la proliferación celular por la vía MAPK. Entre las líneas celulares de MC establecidas en nuestro laboratorio hay variantes BRAFV600E (8/16), BRAFV600K (4/16) y BRAFWT (4/16); presentando las líneas BRAFV600E mayor índice proliferativo y clonogénico in vitro. Trabajos recientes en pacientes con metástasis regionales de MC (estadio III AJCC) reportaron una correlación entre la presencia de BRAFV600 mutado y un peor pronóstico. Este trabajo de investigación tiene el objetivo de determinar la prevalencia del status mutacional del oncogén BRAFV600 en biopsias tumorales en una población de pacientes con MC en diferentes estadios clínico (II, III, IV), procedentes del Instituto Alexander Fleming (n=44), y su posible relación con otros parámetros clínico-patológicos. Para ello, se estableció una metodología de trabajo; desde la extracción de ADN tumoral a partir de biopsias fijadas en formol y embebidas en parafina; hasta la amplificación de la región de interés y posterior análisis de su secuencia por el método de Sanger. Luego se determinó el status mutacional de BRAF en cada biopsia, y su relación con las características clínico-patológicas del tumor. La población de pacientes con MC analizada presentó una frecuencia del oncogén BRAFV600 mutado del 77%, mayor a lo reportado en bibliografía que oscila en un rango de 17-72%. De los pacientes con tumores BRAFV600 mutado, se observó una prevalencia de la mutación BRAFV600E (98%), seguida de BRAFV600K (2%). Los resultados obtenidos en la población del estudio, indican que el status mutacional del oncogén BRAF presenta una asociación con parámetros clínico-patológicos relacionados a la progresión tumoral, como el índice de Breslow mayor a 2mm en tumores primarios (p=0,012), la presencia de metástasis en ganglios linfáticos (p = 0,0036) y el índice proliferativo de los tumores metastásicos (p = 0,0353). No se encontraron asociaciones significativas con otras características clínico-patológicas ni con la evolución clínica en la población de estudio. Los resultados obtenidos abren la posibilidad de considerar el status mutacional del oncogén BRAF como factor pronóstico, con el fin de mejorar la estadificación del MC.

Descripción: Para evaluar los niveles de expresión del reordenamiento BCR-ABL1 en la Leucemia Mieloide Crónica, se realiza la cuantificación de dichos transcriptos respecto del gen control ABL1. Debido a que este gen está involucrado en la translocación, se sugirieron otros, entre ellos, beta-glucuronidasa (GUSB) el cual se localiza en el brazo largo del cromosoma 7 y no está implicado en el rearreglo molecular BCR-ABL1. En el presente estudio se evaluaron tres parámetros de respuesta molecular temprana: 1.- Nivel de transcriptos en escala internacional a los tres meses de tratamiento; 2.- Reducción de los transcriptos a la mitad (Halving time) con ambos genes control; 3.- Reducción logarítmica a tres meses de tratamiento (utilizando al gen control GUSB). A través de la PCR en tiempo real se cuantificaron los transcriptos: BCR-ABL1, ABL1 y GUSB y se calculó el factor de conversión para este último utilizando los calibradores de la WHO para validar los resultados a la escala internacional. Se estudiaron 44 muestras de pacientes al diagnóstico, 18 a los tres meses y 11 a los seis meses de seguimiento de la enfermedad bajo tratamiento con inhibidores de tirosina kinasa (ITK). Analizando las medias poblacionales de transcriptos-BCR-ABL1 al diagnóstico, a los 3 y 6 meses se observó que al diagnóstico la relación BCR-ABL1/GUSB presentaba valores menores respecto de BCR-ABL1/ABL1, mientras que a los 3 y 6 meses los valores eran coincidentes. Se observó una correlación positiva entre el nivel de transcriptos GUSB y BCR-ABL1 lo cual podría explicar los resultados con GUSB al diagnóstico. La disminución de los transcriptos BCR-ABL1 a los 3 y 6 meses respecto del momento del diagnóstico fue mayor utilizando el gen control ABL1 que con el gen control GUSB. Se analizó la velocidad de reducción de los transcriptos BCR-ABL1 a la mitad (Halving time) con ambos genes control. Para ello se realizaron las curvas ROC obteniéndose valores de corte ? 26 días para GUSB y ? 23 días para ABL1. Con este análisis, además, se observó que ABL1 tiene mayor poder de discriminación que GUSB entre respondedores y no respondedores. Mediante el test de Fisher aplicado a los 6 datos obtenidos con el gen control ABL1, observamos que la variable Halving time ? a 23 días se asoció con una Respuesta Molecular Mayor a los 12 meses de tratamiento (p=0.013). Nuestros datos indican que el ABL1 permite discriminar con mayor sensibilidad la respuesta al tratamiento con ITKs comparado con GUSB.