Regulación de la expresión de ACSL4 por mecanismos post-traduccionales y su rol en el metabolismo mitocondrial

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2021-05-20

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ACSL4 - ACIDO ARAQUIDONICO - CANCER DE MAMA - MECANISMOS POST-TRADUCCIONALES-UBIQUITINACION - METABOLISMO MITOCONDRIAL - BIOENERGETICA - ACSL4 - ARACHIDONIC ACID - BREAST CANCER - POST-TRANSLATIONAL MECHANISMS-UBIQUITINATION - MITOCHONDRIAL METABOLISM - BIOENERGETICS

Descripción:

En la actualidad es sabido que los lípidos son biomoléculas que están involucradas en vías de transducción de señales, y que los desequilibrios en su metabolismo causan múltiples trastornos de alta prevalencia. Dentro de los lípidos más estudiados en la actualidad, se encuentra el ácido araquidónico (AA), debido a las funciones que cumple tanto esta molécula como sus metabolitos, los eicosanoides, en el control de la homeostasis celular. Previamente, en nuestro laboratorio se ha descripto el rol de la enzima Acil- CoA sintetasa 4 (ACSL4) en la regulación de los niveles del AA intracelular en la esteroidogénesis y en células tumorales. ACSL4 participa en la fisiopatología del cáncer de mama, y, la desregulación de los niveles de expresión de esta esta enzima se vincula con la agresividad tumoral. Recientemente, se demostró la existencia de una regulación diferencial en los mecanismos de transcripción de ACSL4, en líneas celulares de cáncer de mama humano de diferente agresividad. Sin embargo, se sabe que existen otros mecanismos regulatorios post-traduccionales, tales como la fosforilación y la ubiquitinación, que podrían estar involucrados en la regulación de la expresión de la ACSL4 y por ende, en la tumorigénesis. Por lo tanto, en esta tesis doctoral, se propone profundizar en el estudio de los mecanismos post-traduccionales que podrían afectar la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama de distinta agresividad. Utilizando líneas celulares de cáncer de mama de distinta agresividad, MCF7 (menos agresiva), y MDA-MB-231(más agresiva) se observó que la estabilidad de la proteína es menor en la línea menos agresiva. A través de ensayos con MG-132, reconocido inhibidor proteasomal, determinamos también que el proteasoma está involucrado en la degradación de ACSL4 y por lo tanto, en los niveles de expresión y estabilidad de la enzima. Mediante la búsqueda en bases de datos y ensayos de mutagénesis sitio dirigida, pudimos identificar a las lisinas 621 y 702 de ACSL4 como posibles blancos de ubiquitinación. Además, identificamos a la enzima E3- ligasa Parkina como una de las candidatas a realizar esta modificación post-traduccional y, demostramos que efectivamente, existe una interacción entre ACSL4 y Parkina. Por otro lado, a través de estudios in sílico, observamos que ACSL4 regula la expresión de genes relacionados con el metabolismo y la función mitocondrial, en células de cáncer de mama. Actualmente, se sabe que las mitocondrias juegan un papel clave en la oncogénesis, es por eso que, en este trabajo, decidimos profundizar sobre el rol de ACSL4 en el metabolismo mitocondrial en células tumorales mamarias de distinto nivel de agresividad. Utilizamos células MCF-7 que sobreexpresan ACSL4 de manera estable (MCF-7 tet-off/ACSL4) y células MDA-MB-231 silenciadas para la expresión de ACSL4 (shACSL4). Evaluamos si ACSL4 regula la expresión de distintos marcadores mitocondriales. Realizamos ensayos con el objetivo de medir la masa, la actividad y la bioenergética mitocondrial que nos permitieron determinar cómo la expresión y/o ausencia de ACSL4 afecta estos parámetros. Logramos determinar que ACSL4 regula positivamente la expresión de marcadores mitocondriales tales como NRF1, VDAC1 y el Complejo III de la cadena respiratoria. Además, en los estudios de bioenergética medimos la tasa de consumo de oxígeno, y en base a los resultados obtenidos, analizamos distintos parámetros respiratorios. Demostramos que la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama produce cambios significativos en la tasa de respiración máxima, la capacidad de reserva respiratoria y la fuga de protones. Estos resultados indican que las células que sobreexpresan ACSL4 poseen una mejor capacidad de respuesta frente a situaciones de demanda energética. Además, en células MCF-7 tet-off/ACSL4 observamos mayor actividad mitocondrial y una disminución en la masa mitocondrial con respecto al control, lo cual sugiere una compensación del genoma mitocondrial ante la disminución en su cantidad. Por otro lado, los resultados obtenidos con la línea MDA-MB- 231 shACSL4 son opuestos a lo observado en células MCF-7 tet-off/ACSL4, lo cual valida el rol de ACSL4 en células de cáncer de mama sobre diversos parámetros mitocondriales. Los resultados del siguiente trabajo contribuyen a ampliar los conocimientos sobre la regulación de ACSL4 y el rol que ejerce en el metabolismo mitocondrial, permitiendo profundizar en el conocimiento de la fisiopatología de la célula tumoral y los mecanismos moleculares involucrados.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6842_Benzo