Rol de la señalización mediada por AMPc en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi y en célula hospedadora durante la invasión

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2022-04-20

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

T.CRUZI - INVASION - AMPC - EPAC - RAP1B - CRATAEGUS - PLANTAS MEDICINALES - ERK - CARP - T. CRUZI - INVASION - CAMP - EPAC - RAP 1B - CRATAEGUS - MEDICINAL PLANTS - ERK - CARP

Descripción:

La Enfermedad de Chagas, causada por el protozoario flagelar Trypanosoma cruzi, es considerada por el Ministerio de Salud de la Nación Argentina como uno de los principales problemas de salud pública del país. Sin embargo, no existen vacunas contra el parásito y los fármacos de primera línea, nifurtimox (Nfx) y benznidazole (Bnz), presentan alta toxicidad y baja eficiencia, especialmente en la fase crónica de la enfermedad. El desarrollo de drogas tripanocidas más eficientes requiere de la identificación de nuevos blancos moleculares, siendo un buen blanco terapéutico aquel que tenga una función exclusiva y/o esencial en la biología del parásito. En este sentido, las vías de señalización mediadas por AMP cíclico (AMPc), que demostraron ser esenciales en la biología del parásito, podrían representar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de nuevos medicamentos en el tratamiento efectivo de la enfermedad de Chagas. En este trabajo se estudiaron dos aspectos fundamentales de la señalización mediada por AMPc. En primer lugar, se identificaron y caracterizaron los efectores del AMPc del hospedador mamífero que participan en la invasión de T. cruzi, y se evaluaron como potenciales blancos terapéuticos. En segunda instancia, se estudiaron in vivo e in vitro las recientemente descubiertas proteínas de respuesta al AMPc (CARP), una familia de proteínas esenciales implicadas en la señalización de este nucleótido en el parásito. En la primera parte se corroboró, en diferentes líneas celulares, que la activación de Epac era necesaria durante la invasión mediada por AMPc. Además, mediante experimentos de precipitación diferencial, se demostró la participación del efector activo de la vía AMPc/Epac, Rap1b-GTP. En línea con estos resultados, la invasión celular y el número de tripomastigotes liberados luego de la invasión aumentaron significativamente en células que expresaban la mutante constitutivamente activa de Rap1b (Rap1b-G12V). Asimismo, los datos obtenidos sugieren que la fosforilación de Rap1b en la S179 tendría un efecto antagonista dependiente de PKA sobre la invasión mediada por AMPc. Con el fin de dilucidar las vías activadas río abajo de AMPc/Epac/Rap1b, se observó que durante el proceso de invasión de la célula hospedadora ocurría la activación, de manera independiente de PKC, de la vía MEK, y la consecuente inducción de la fosforilación de ERK. Al final de este capítulo, se evaluó la inhibición de la vía AMPc/Epac/Rap1b como potencial tratamiento contra la enfermedad de Chagas utilizando un extracto hidroalcohólico de Crataegus oxyacantha (CO-EE), una planta utilizada en medicina alternativa. Nuestros resultados sugieren que CO-EE otorga protección frente a la invasión de T. cruzi a través de la inhibición de la vía de señalización Epac/Rap1b. En este contexto, al utilizar CO-EE en células tratadas o no con Nfx, se observó una adición de los efectos inhibitorios de ambos tratamientos, abriendo la posibilidad de utilizar este extracto en conjunto con las drogas administradas actualmente. En la segunda parte de este trabajo se realizó una validación funcional de CARP1 utilizando epimastigotes transgénicos que sobreexpresan esta proteína. Estos parásitos transgénicos no mostraron diferencias en el crecimiento en comparación con los parásitos de tipo salvaje, incluso en presencia de un análogo de AMPc (8-Br- AMPc). Curiosamente, presentaron una resistencia al estrés oxidativo alrededor de 2.6 veces menor respecto al control. Además, se observó que en los estadíos epimastigote existe una co-localización de la proteína CARP1 con vesículas ácidas, aunque su localización mayoritaria sería citoplasmática. Por último, se logró expresar y purificar los cuatro integrantes de la familia CARP en bacterias, con el fin de realizar una futura caracterización estructural de las mismas.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7068_Ferri