Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente con potencial aplicación en terapia génica

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2002

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ANALOGOS DE ARN - ESTRATEGIA ANTISENTIDO - RIBOZIMA CABEZA DE MARTILLO - 2'-C-METILNUCLEOTIDOS - RESISTENCIA A NUCLEASAS - RNA ANALOGUES - ANTISENSE STRATEGY - HAMMERHEAD RIBOZYME - 2'-C-METHYLNUCLEOTIDES - RESISTANCE TO NUCLEASES

Descripción:

Dentro del campo de la Terapia Génica, el concepto de oligonucleótidos comopotenciales agentes terapéuticos ha ganado credibilidad y atención. El fundamento de laestrategia antisentido consiste en inhibir selectivamente la expresión de un determinado gen,impidiendo asi la producción de una dada proteína mediante la acción de un oligonucleótido desecuencia complementaria al ARN mensajero que codifica para esa proteina. Dentro de esteenfoque, las ribozimas, moléculas de ARN con una secuencia de bases y una estructuratridimensional definidas y que presentan actividad enzimática, aparecen como una alternativainteresante, ya que permiten incorporar a la acción antisentido de los oligonucleótidos suactividad catalitica. Debido a que los oligonucleótidos son degradados rápidamente por nucleasaspresentes tanto en suero como intracelularmente, surge la necesidad de modificadosquímicamente, lo cual permite obtener drogas con tiempos de vida medio adecuados. En el caso particular de las ribozimas y otros análogos de ARN, es importante que lasmodificaciones introducidas no afecten los requerimientos estructurales para la actividad ofunción particular de estas moléculas. Entre las diversas modificaciones desarrolladas, lasmodificaciones en la posición 2’ demostraron ser de utilidad. La presencia del hidroxilo-2’ probóser de suma importancia en determinadas posiciones para el correcto plegamiento de lasmoléculas de ARN. Debido a que ninguna de las modificaciones desarrolladas en la posición 2'mantiene esta función, la utilización de una nueva generación de oligonucleótidos modificadosen la posición 2' del azúcar que conserven esta función resulta atractiva y prometedora para eldiseño de ribozimas estables en medios biológicos. Aquí se propone, por lo tanto, una nuevaclase de nucleótidos modificados, los 2'—C-metilnucleótidos, potencialmente útiles para serincorporados en determinadas posiciones de análogos de ARN resistentes a la degradación pornucleasas. Se espera que cuando un 2'—C-metilnucleótido sustituya un ribonucleótido particularproveerá un hidroxilo-2' disponible para reproducir las interacciones terciarias del ARN; mientrasque la presencia del metilo, brindará resistencia a la degradación mediada por nucleasas. En este trabajo, se sintetizó la 2'—C-metiluridina siguiendo una ruta estereoselectiva, asícomo también, la fosforamidita adecuada para la sintesis automatizada de oligonucleótidos,incluyendo la protección regioselectiva del grupo hidroxilo-2'. Asimismo, se realizó un estudioconfonnacional de la 2'-C-metiluridina en solución por RMN y se comparó con resultadosobtenidos por cálculos computacionales. Los resultados mostrarón que la conformaciónpreferida de este nucleósido es la misma que la de la uridina natural, con lo cual ambasmoléculas posicionarían el hidroxilo-2' con la misma orientación. Con el fin de ensayar lahipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación, se eligió como modelo biológico laribozima cabeza de martillo. Un estudio preliminar usando modelado molecular sugirió que laintroducción de estos monómeros en las posiciones de esta ribozima para las cuales se habíadetectado que sus hidroxilos-2' tenían interacciones de orden terciario no parecía afectar laconformación global de la ribozima, excepto en una posición particular. La 2'-C—metiluridina fue,entonces, introducida en ribozimas cabeza de martillo dirigidas contra la región 5'-lider/gag delvirus HIV-1 en las posiciones de la uridina del core catalítico cuyos hidroxilos-2' demostraron serimportantes. Las ribozimas resultaron ser activas y tener una incrementada estabilidad frente anucleasas. Tambien se midió la afinidad por hebras complementarias de DNA y de RNA deoligodesoxinucleótidos conteniendo uridina, la nueva modificación o la (2’S)-2'-desoxi-2’-C-metiluridina.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3470_Gallo