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Palabras contadas: aftosa: 1, fiebre: 1, virus: 10, la: 342, de: 435
Lotufo, Cecilia Maricel (Dir. Mattion, Nora Marta)
2017-03-10
Descripción: La Fiebre Aftosa es una enfermedad vesicular aguda de rápida propagación y
amplio rango de huéspedes. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA),
un virus no envuelto con genoma ARN de simple cadena y polaridad positiva,
perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para una
poliproteína que es escindida por proteasas virales para generar 4 proteínas capsidales y
8 no capsidales (PNC). Se ha reportado que la proteína NC 3A juega un papel relevante
en la síntesis del ARN, en el anclaje a membranas intracelulares del complejo
replicativo, así como en la virulencia y rango de huésped del VFA. El propósito de este
trabajo fue estudiar el rol de la región N-terminal y la propuesta como transmembrana
de la proteína NC 3A en la replicación del ARN y en su ubicación intracelular.
La metodología utilizada fue la evaluación de mutantes puntuales y de deleción
realizadas sobre un replicón del VFA (pRep), basado en la cepa O1/Campos, transcripto
desde el promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Este replicón codifica la región
completa de proteínas NC, y los extremos no traducibles, pero las proteínas capsidales
fueron reemplazadas por el gen reportero de la Luciferasa de Luciérnaga.
Se realizaron deleciones sobre pRep en la región N-terminal de 3A (pRep?6-11,
pRep?6-17 y pRep?6-23) y posteriormente mutaciones puntuales (pQ18A/H19A/E20A
y pE20A). Por otra parte, se mutó la zona predicha como transmembrana (aa 57-76),
reemplazándola por una secuencia de 8 alaninas (pRep?TM). La evaluación de
replicación/transcripción se realizó por medición de luminiscencia, luego de
transfección de células BHK-21 con los plásmidos mutantes o controles, junto con los
plásmidos que expresan T7pol y Luciferasa Renilla, este último para normalizar la
medición. Las mutantes pRep?6-23, pQ18A/H19A/E20A, pE20A y pRep?TM
presentaron una marcada disminución de actividad Luciferasa con respecto a pRep con
3A wt.
La ubicación intracelular se evaluó mediante Inmunofluorescencia Indirecta, por
microscopia de fluorescencia y confocal, utilizando el anticuerpo monoclonal 3H7 y un
anticuerpo comercial contra la etiqueta Flag. Se construyeron plásmidos de expresión
de 3Awt (p3AF) y de las mutantes analizadas anteriormente, unidas a la etiqueta Flag
(p?6-11F, p?6-17F, p?6-23F y p?TMF). Con la mutante p?TMF, se demostró que la
secuencia comprendida entre los aa 56 y 76 de la proteína 3A del VFA, estaría
involucrada en la asociación a membranas citoplasmáticas, ya que luego de su deleción
la proteína se localiza en el núcleo celular.
Se concluye que la región comprendida entre los aa 18 a 23 de la proteína 3A, en
especial el ácido glutámico en la posición 20, serian críticos para la replicación viral,
mientras que los aa 56 a 76 están involucrados en la ubicación subcelular de la misma.
Complementariamente, se mapeó el anticuerpo monoclonal 3H7 y se encontró
que su epitope se ubica en la zona N-terminal de 3A y se desarrolló un ensayo de
ELISA indirecto utilizando la proteína 3A unida a un péptido carrier (3AGFP-ELISA)
para screening de circulación viral en bovinos.
El 3AGFP-ELISA resulto rápido y específico, en la distinción de sueros de
animales vacunados, de sueros de animales infectados o convalecientes. Se evaluó su
performance en comparación con el ensayo 3ABC-ELISA actualmente en uso,
(desarrollado también por nuestro Instituto), mediante el análisisde un grupo de 5 sueros
positivos de referencia fuertes y débiles (cercanos al valor de corte del ensayo) y
posteriormente el análisis de 363 sueros de animales vacunados/no infectados. Los
resultados obtenidos con ambos ELISAs 3AGFP y 3ABC mostraron una muy buena
correlación, por lo que 3AGFP-ELISA, se podría proponer como una técnica simple y
rápida, para el screening inicial de sueros de campo.
...ver más Tipo de documento: tesis doctoral | Formato: PDF (tamaño kb) Pag. 158 p.
Aporte: Biblioteca de la Facultad de Farmacia y Bioquímica