Descripción: GumK es una glucuronosiltransferasa de Xanthomonas campestris involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido xantano, siendo la enzima encargada de adicionar el cuarto residuo de azúcar en la síntesis de la unidad repetitiva pentasacarídica de este polímero. Específicamente, GumK transfiere un residuo de ácido glucurónico a partir de su sustrato dador UDP-GlcA a su sustrato glicolipídico aceptor, polisoprenil-pirofosfato-glucosa-β-1,4-glucosa-α-1,3-manosa. Se caracterizó funcional y estructuralmente a GumK. La caracterización funcional se dio mediante la sobrexpresión, purificado y ensayos de actividad in vitro e in vivo de la enzima. Mediante estos ensayos de actividad se estudió la especificidad por sus sustratos. Asimismo se estudió su localización subcelular mediante fraccionamiento y detección por western blots. Al determinarse que esta enzima esta asociada a membranas, se realizaron experimentos de disociación para determinar el modo de unión a la membrana. Encontramos que interacciones hidrofóbicas y electrostáticas están involucradas en esta interacción. La caracterización estructural involucró la cristalización, colección de datos de difracción de rayos-X y resolución de la estructura de la proteína. La estructura fue resuelta con la información de fases proveniente de un experimento de dispersión anómala múltiple sobre un derivado de GumK con átomos de platino. La proteína mostró una estructura consistente de 2 dominios globulares tipo Rossmann, con una hendidura central que es el sitio de unión de sus sustratos y donde ocurre la catálisis. Además, y mediante experimentos de inmersión de cristales, logramos observar y describir el sitio y las interacciones que median la unión de la porción nucleotídica (UDP) del sustrato dador en la enzima. Para confirmar el rol de los residuos involucrados en la unión del UDP, realizamos mutagénesis sitio-dirigida y análisis de la cinética enzimática de las proteínas mutadas. Además realizamos estudios de complementación in vivo con estas mutantes. Estos análisis nos permitieron confirmar el rol de al menos media docena de residuos involucrados en la unión del sustrato dador y postular al aspartato 157 como un posible aminoácido catalítico.

Descripción: Xanthomonas campestris es un patógeno de plantas causando la putrefacción negra en las hojas de las crucíferas. Además, produce un polisacárido extracelular (EPS), de gran importancia industrial, llamado xantano. La estructura de su unidad repetitiva es ( Jansson, P. E. et al., 1975. Carbohydr. Res. 45: 274): (ver figura en el pdf). La biosíntesis in vitro de xantano ha sido estudiada en detalle en nuestro laboratorio (Ielpi et al., 1993. Bacteriol., 175:2490). Se ha determinado que ésta ocurre en al menos dos etapas. En la primera etapa, la unidad repetitiva se ensamba secuencialmente sobre un poliprenol pirofosfato. En una segunda etapa, las unidades repetitivas son polimerizadas y el EPS formado liberado en el medio de crecimiento. Se conoce que los genes involucrados en la biosíntesis del xantano, 12 genes, están agrupados en un segmento de ADN de 16 Kb ( Barrre et al., 1986.Int. Biol. Macromol, 8: 372) y parte de los genes involucrados en la transferencia de azúcares estan identificados (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., EEUU), pero no se realizó un estudio detallado de la caracterización de mutantes no productoras de xantano, como asi también, aún se desconoce la ubicación de los genes responsable del proceso de polimerización y exportación. En este trabajo de tesis, presentamos la caracterización de algunas mutantes defectuosas en la producción de EPS, en la cual, en dos de ellas, se realizó un estudio más detallado: X. campestris 8004:: Tn525 y 8004:: Tn570. La primera mutante falló en producir el pentasacárido, unidad repetitiva del xantano, y solamente tres azúcares fueron transferidos al prenil pirofosfato intermediario, esta unidad repetitiva truncada no obstante pudo ser polimerisada. El polímero truncado formado tiene la estructura de una celulosa sustituida alternadamente por residuos de manosa y tiene un potencial interés industrial. El transposón, responsable de la mutación, fue localizado dentro del gen gumk. Por lo tanto, este gene codificaría la glicosil transferasa IV, que cataliza la transferencia de ácido glucurónico al trisacárido manosil-celobiosa. La segunda mutante estudiada resultó ser capaz de sintetizar in vitro el lípido pentasacárido, unidad de repetitiva, con cualquiera de los tres dadores de azúcares utilizados: UDP-Glc, GDP-Man y UDP-GlcA, pero incapaz de polimerizar estas unidades. El Tn5, en la cepa N °70, fue localizado 15 bp "upstream" del sitio de iniciación del gen gumB (primer gen del grupo). Esto suguiere que gumB está involucrado en el proceso de polimerización. Un segundo aspecto desarrollado en este trabajo de tesis fue el efecto de los grupos no glicosídicos en el proceso de polimerización. Se demostró que los niveles más altos de polimerización, en el EPS producido por la cepa mutante N° 25, fueron obtenidos cuando 30 % de las unidades repetitivas truncadas se encontraban acetiladas. Por otra parte, el fosfoenolpiruvato (dador de los grupos piruvatos) se comportó, sobre este polímero, como un regulador positivo en las reacciones de polimerización. En la cepa silvestre solo se observó cierta inhibición en la reacción de polimerización con ambos dadores de grupos no glicosídicos estudiados. Es importante destacar que la unidad truncada que sintetiza la cepa N° 25 no posee grupos piruvatos en su estructura. Finalmente, estudios preliminares mostraron la obtención in vitro de glucanos β -( 1,2 ) lineales y cíclicos utilizando diferentes preparaciones de X. campestris. Algunos resultados preliminares suguieren un posible rol de estos glucanos en el proceso de infección.

Descripción: Muchas bacterias producen polisacáridos extracelulares que pueden asociarse a lasuperficie celular o ser secretados al medio extracelular. Numerosos polisacáridosbacterianos se encuentran asociados al desarrollo de patogenicidad, convirtiéndose enun importante factor de virulencia. Por otro lado, existe un gran interés industrial sobremuchos polisacáridos bacterianos debido a sus amplias aplicaciones. En general, se ha descripto en detalle los primeros pasos de la síntesis depolisacáridos, pero aún no se han esclarecido los mecanismos involucrados en lapolimerización y transporte de los mismos hacia la superficie bacteriana o al medioextracelular. Se ha postulado que estos procesos serían llevados a cabo gracias a laformación de complejos proteicos que podrían atravesar la membrana plasmática, deforma similar a lo observado para los sistemas de secreción de proteínas. En esta tesis se presenta el estudio estructural y bioquímico de la proteína demembrana externa GumB, la cual se encontraría asociada a la síntesis/secreción delpolisacárido xantano en Xanthomonas campestris. Fue posible sobreexpresar ypurificar cantidades suficientes para ensayos estructurales de esta proteína demembrana, al expresarla en el citoplasma. Se obtuvieron cristales de la proteína nativay de su derivado de selenio-metionina, a partir de los cuales fue posible resolver laestructura a 2,54 Å. Se encontró que en el cristal GumB forma un tetrámero, estacaracterística también se ha observado en solución mediante ensayos de dispersiónde luz estática y entrecruzamiento químico. Por otro lado, ensayos de dispersión deneutrones a bajos ángulos mostraron que la forma de GumB en solución es similar a laobservada en el cristal. El tetrámero de GumB mostró una gran cavidad con cargaspositivas que podrían estar involucradas en la interacción con el xantano, el cualposee cargas negativas debido a sus residuos de ácido glucurónico y grupos cetalpiruvato. Asimismo, se presenta evidencia que sugiere la participación de GumB en un complejoproteico. Mediante ensayos de entrecruzamiento químico in vivo se observó que GumB forma complejos de alto peso molecular. Electroforesis azul nativa permitióidentificar potenciales interacciones entre GumB y otras proteínas de X. campestris.

Descripción: El género Xanthomonas incluye a más de 300 especies que atacan a una gran variedad de plantas, entre ellas muchas de interés comercial. En esta tesis se trabajó en la caracterización de la interacción entre dos patovariedades de Xanthomonas y sus hospedadores. En la primera parte de la tesis se describe la interacción entre Xanthomonas campestris pv. campestris, agente causal de la putrefacción negra de las crucíferas y su hospedador Arabidopsis thaliana, y Nicotiana benthamina, un nuevo modelo de interacción, focalizándonos en cual es el rol del glucano cíclico beta-(1,2) en el proceso infectivo. Este compuesto demostró ser un supresor de la respuesta de defensa de la planta, a través de un mecanismo que involucra su capacidad de diseminarse sistémicamente dentro de la misma. En la segunda parte de estas tesis se estudió la interacción entre Xanthomonas citri susp. citri, uno de los agentes causales de la Cancrosis Bacteriana de las Cítricos (CBC) y su hospedador Citrus limon. En particular se estudió el rol de exopolisacárido xantano producido por la bacteria en la formación de biofilms y en su virulencia. Encontramos que el xantano es fundamental para la formación de complejos multicelulares bacterianos, y que la formación de estos mismos tiene un rol central en la sobrevida de la bacteria en la planta y en la virulencia de la misma. En la tercera, y última sección de esta tesis, se propuso la aplicación de los conocimientos adquiridos sobre la CBC en el desarrollo de un método de diagnóstico para la enfermedad. El método desarrollado se basó en una amplificación de ADN isotérmica acoplada a tiras del tipo test de embarazo. Los resultados obtenidos muestran que el desarrollo es altamente específico, sensible, transportable y fácil de ser llevado a cabo.

Descripción: Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento delos organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyaspropiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs estánlocalizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En estetrabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesisdel polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis sepresenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividadglicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional,demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unidaa la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas yelectrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose losparámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en laclasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización seobtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI,es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión asus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta deunión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaronestudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudiosrealizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada,fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnéticanuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambiosconformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

Descripción: En esta tesis, estudiamos algunos de los mecanismos a través de los cuales Xanthomonas campestrispv. campestris (Xcc) suprime la respuesta inmune de Arabidopsis thaliana. Los microbios gatillan el cierre estomático en la planta a través de patrones moleculares asociadosa microbios (MAMPs), sin embargo Xcc es capaz de colonizar A. thaliana a través de estos poros medianteun factor de virulencia (Xcc FV) capaz de inhibir su cierre. En la primera parte de esta tesis estudiamos el mecanismo de acción del Xcc FV y de una toxinade efecto similar producida por la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae pv. tomato denominadacoronatina. Encontramos que ambos compuestos inhiben el cierre estomático inducido por MAMPs y porla hormona ácido abscísico a través de la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) mediada por NADPH oxidasas y de manera dependiente de la señalización de jasmonatos. En la segunda parte de la tesis, estudiamos el rol del glucano cíclico β-(1,2) de Xcc en el procesoinfectivo. Hallamos que este compuesto inhibe la producción de ERO, disminuye la expresión de genes dedefensa y suprime la deposición de calosa inducidas por flagelina. Asimismo, observamos que el efectodel glucano cíclico β-(1,2) requiere de dos receptores quinasa con dominios ricos en lisina, LYK3 y LYK4,y que se une específicamente a preparaciones de membranas de A. thaliana, lo cual sugiere que actúa através de la unión a un receptor de membrana. En la tercera parte de la tesis, estudiamos el mecanismo a través del cual el xantano, unexopolisacárido producido por Xcc, actúa como factor de virulencia. A través del uso mutantes de Xccafectadas en enzimas biosintéticas encargadas de modificar químicamente el xantano, descubrimos que lapiruvilación sobre la manosa externa de la unidad repetitiva de este polisacárido son esenciales para suactividad de supresión de la respuesta inmune de A. thaliana. Palabras clave: estomas, ABA, coronatina, NADPH oxidasas, especies reactivas de oxígeno, glucanocíclico β-(1,2), flg22, inmunidad vegetal, xantano, Xanthomonas, Arabidopsis thaliana.