Descripción: El virus Vaccinia Ankara modificado (MVA, del inglés Modified Vaccinia Ankara) es un vector viralatenuado que aún conserva numerosos genes inmunomoduladores en su genoma. Nuestro gruporeportó anteriormente la optimización de este vector luego de eliminar el gen viral C12L, el cualcodifica para la proteína de unión a IL-18. En este trabajo se analizó la inmunogenicidad del vector MVA al cual se le delecionaron de manera simultánea los genes A44L, relacionado con la síntesis deesteroides, y A46R, un inhibidor de la señalización mediada por receptores Toll (MVAΔA44L-A46R); otambién incluyendo la deleción del gen C12L, previamente descripto (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R). Paraello, se evaluó la respuesta celular T contra epítopes de Vaccinia tanto en bazo como en gangliosinguinales, drenantes al sitio de inoculación, en ratones de la cepa C57BL/6. Se observó que lamagnitud de la respuesta adaptativa, tanto en la etapa aguda como de memoria, fue mayor en losanimales inmunizados con los vectores delecionados en relación a aquellos que recibieron el vectorde la cepa salvaje (MVAwt). Asimismo, el vector MVAΔC12L/ΔA44L-A46R indujo una respuestacelular T específica de memoria de mayor calidad, caracterizada tanto por la bifuncionalidad de lascélulas T-CD8+ (expresión simultánea de CD107a/b e IFN-γ) como por la capacidad de proliferaciónespecífica de las células T-CD4+ y CD8+. Al estudiar la respuesta innata generada por el MVAΔC12L/ΔA44L-A46R, se observó que este vector indujo una mayor producción de citoquinasrelacionadas con la generación de una respuesta celular T, tales como IL-12 e IFN-γ, así comomediadores pro inflamatorios y antivirales como IL-1β e IFN-β. En conclusión, este estudio describepor primera vez que la deleción simultánea de los genes inmunomoduladores del genoma de MVA,cuyas funciones se encuentran inter-relacionadas, tales como A44L, A46R y C12L constituye unametodología adecuada para incrementar la inmunogenicidad del vector generando de esta manerauna mayor respuesta inmune tanto innata como adaptativa. Esto convierte al vector MVA en unaherramienta útil y versátil para ser utilizada en el campo del desarrollo de vacunas.

Descripción: En nuestro laboratorio nos encontramos investigando la utilidad de la porción proteicade la lipoproteína de membrana externa de 19 kiloDalton de Brucella abortus (U-Omp19) comoadyuvante vacunal. Resultados previos proponían a U-Omp19 como un inhibidor de serinproteasas de estómago e intestino. En esta tesis hemos comprobado que U-Omp19 poseeactividad de inhibidor de cisteín proteasas lisosomales y que la co-administración de U-Omp19inhibe parcialmente la degradación del antígeno (Ag) dentro de las células presentadoras de Agincrementando su vida media y promoviendo su presentación cruzada a las células T CD8+. UOmp19también es capaz de activar células dendríticas (DCs) induciendo un aumento en laexpresión de moléculas co-estimulatorias y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Porúltimo, estudiamos la respuesta inmune inducida en ratones luego de la co-administración de OVA y U-Omp19 por vía subcutánea. Observamos que U-Omp19 como adyuvante de OVAinduce una eficiente respuesta inmune celular de tipo T CD8+ y citotóxica con producción de IFN-γ. Los resultados obtenidos indican que la actividad adyuvante de U-Omp19 está dada, porun lado, por su capacidad de activar DCs y por otro lado, por promover la estabilidad y lapresentación de Ags a través de su acción como inhibidor de proteasas, éste último representaun novedoso mecanismo aún no descripto para un adyuvante vacunal.

Descripción: Durante este trabajo se obtuvieron distintas líneas de plantas de tabaco transplantómicas para el antígeno viral E7 del virus del papiloma humano (VPH). La capacidad del sistema plastídico para producir el antígeno viral fue verificada. Asimismo se comprobó que la proteólisis del péptido es el factor determinante de la expresión y principal limitante de los niveles de acumulación de la proteína recombinante. La modificación de las características intrínsecas del polipéptido mediante la fusión traduccional a otras proteínas como la cápside viral de PVX o la enzima β-glucuronidasa mostró ser una estrategia válida para reducir la tasa de degradación de E7. De esta forma se alcanzó un incremento de la expresión entre 5 y 10 veces superior a lo observado con E7 por masa de tejido. Sin embargo los mejores resultados se obtuvieron al reorientar la acumulación del antígeno viral hacia un entorno con características bioquímicas diferentes como es el lumen tilacoide. Por primera vez se logró translocar una proteína codificada por el plastoma a través de la membrana tilacoide utilizando una secuencia específica de la misma especie, la señal bipartita amino-terminal del gen OEC23 de tabaco. Los niveles de acumulación del antígeno en el tilacoide resultaron ser dos órdenes de magnitud superiores a los observados en el estroma. Los resultados de este trabajo muestran distintos abordajes basados en la utilización de plantas de tabaco transplastómicas como biorreactores para la producción de proteínas de interés inestables como E7 del VPH.

Descripción: Se caracterizaron de forma fenotípica y funcional las células dendríticas (CD)derivadas del cultivo de precursores de médula ósea, y se estudió el mecanismomediante el cual la vacuna CD/Apo-Nec, constituida por CD co-cultivadas con célulasapoptóticas y necróticas del melanoma murino B16F1 (Apo-Nec), genera protecciónanti-tumoral. Las CD se separaron empleando microesferas magnéticas anti-CD11c, y lasdos poblaciones resultantes en términos de positividad para CD11c (CD+ y CD-),se estudiaron junto a las CD. Se demostró que la población de CD obtenida luego de 7 días de cultivo con elfactor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos murino (mGM-CSF), esheterogénea y presenta aproximadamente un 60% de CD CD11c+. El 26,6% de lascélulas presentes en la fracción CD+ co-expresó los antígenos de superficie CD11c y F4/80, y el 75,4% resultó ser doble positiva para CD11c y CD11b. La fracción CD+también expresó Ly6-G. La fracción CD- quedó enriquecida en macrófagos CD11c-/F4/80+ (44,7%), algunos de los cuales co-expresaron Ly6G (41,8%); y en neutrófilos F4/80-/Ly6-G+(34,6%). Las fracciones CD+ y CD- mostraron una capacidad similar para fagocitar yendocitar antígenos, y expresaron niveles similares de moléculas del complejo mayorde histocompatibilidad de tipo II y moléculas co-estimulatorias CD80, CD83 y CD86,respecto a la población de CD. Sin embargo, sólo la vacuna CD/Apo-Nec fue capaz deconferir una protección significativa. Luego del co-cultivo no se detectó interleuquina-12,ni intracelularmente ni en el sobrenadante de la vacuna CD/Apo-Nec. Por lo cual,la protección obtenida sería independiente de su habilidad para secretar esta citoquinaen el momento de ser administrada. No detectamos una polarización de los macrófagos y neutrófilos derivados delcultivo de CD hacia un fenotipo M1/N1 o M2/N2, antes o después del co-cultivo, lo cualpodría relacionarse con la falta de expresión de interferón-γ, y de secreción deinterleuquina-10 e interleuquina-12 por parte de las células. Las vacunas constituidas por las fracciones CD+ y CD-(CD+/Apo-Nec y CD-/Apo-Nec),indujeron en los sitios de inmunización, la expresión de interleuquina-10 y una elevada producción de óxido nítrico, lo cual podría explicar en parte suincapacidad para conferir protección anti-tumoral. Los resultados obtenidos indicarían que existe una interacción entre laspoblaciones celulares que conforman el cultivo de CD. Variaciones en el número dedichas poblaciones resultarían en la falta de protección; por lo cual todas las célulaspresentes en la vacuna CD/Apo-Nec serían necesarias para inducir protección contrael melanoma murino B16-F1.

Descripción: El siguiente trabajo se desarrolló en el contexto del ensayo clínico de Fase II CASVAC-0401 cuyos objetivos principales fueron la evaluación de la eficacia clínica y seguridad del tratamiento con la vacuna de células de melanoma irradiadas CSF-470 y adyuvantes BCG (Bacillus Calmette-Guerin) y GM-CSF (Granulocyte-Macrophage colony-stimulating factor), en comparación con el tratamiento con dosis medias de IFN-α2b, en pacientes con melanoma cutáneo estadio IIB-IIC-III, luego de la cirugía. Con un total de 30 pacientes con un seguimiento promedio de 41 meses y un máximo de 102, aquellos tratados con CSF-470 tuvieron una mayor tasa de sobrevida libre de metástasis a distancia y mejor calidad de vida que pacientes tratados con IFN-α2b. Además, el inmunomonitoreo de muestras de sangre periférica obtenidas a los largo de los 2 años de tratamiento demostró que CSF-470 produjo un aumento de células Natural Killer y estimuló la respuesta inmune adaptativa tanto celular como humoral, contra las células tumorales presentes en la vacuna y contra células tumorales autólogas. Para entender los primeros efectos inmunes de la vacunación en el sitio de inyección, desarrollamos un sistema in vitro simplificado utilizando muestras de sangre de donantes sanos. El reclutamiento de leucocitos, mayoritariamente del sistema inmune innato; la liberación de citoquinas pro-inflamatorias estimuladas por BCG; y una incorporación eficiente de antígenos tumorales por monocitos, fueron los primeros eventos observados luego de la interacción de la vacuna con las células inmunes. Dichos eventos podrían generar un contexto favorable para el procesamiento y presentación antigénica, a pesar de los factores inmunosupresores liberados por las células irradiadas que componen CSF-470. En conclusión, la vacuna CSF-470 y adyuvantes BCG y GM-CSF estimulan la respuesta inmunológica antitumoral, y demostró su eficacia clínica en el tratamiento adyuvante de melanoma cutáneo.

Descripción: La enfermedad de Gumboro, causada por el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), es una enfermedad aguda, altamente contagiosa y de distribución mundial que afecta a pollos jóvenes. IBDV produce depleción de los linfocitos B que maduran en la bolsa de Fabricio (BF) por lo cual ocasiona atrofia de dicho órgano e inmunosupresión; y, de acuerdo a la cepa viral, una alta mortalidad en pollos jóvenes. En este trabajo de tesis se implementó la metodología de obtención de virus fowlpox recombinantes (FWPVr) y se obtuvo un inmunógeno basado en FWPVr que expresa como antígeno de interés la proteína VP2 de IBDV, principal antígeno viral inductor de respuestas inmunes protectoras. En primer lugar, se diseñó y construyó un vector de transferencia que permite obtener FWPVr por intercambio alélico con el gen fp9.030, como sitio blanco de inserción. Con este vector se obtuvieron los virus recombinantes FW-VP2 que portan y expresan la secuencia codificante de la proteína VP2. Mediante la evaluación de curvas de crecimiento viral in vitro se demostró que la inserción de genes foráneos interrumpiendo el gen fp9.030 no afecta la capacidad replicativa del virus recombinante. Posteriormente, se evaluó la protección conferida por una única inmunización con FW-VP2 por vía subcutánea o por vía intramuscular en pollos SPF (certificados como libres de patógenos específicos). Se observó que la aplicación de una dosis de FW-VP2 por vía subcutánea fue suficiente para reducir significativamente la atrofia de la BF detectándose sólo daños histopatológicos leves. Por otro lado, una única dosis de FW-VP2 aplicadopor vía intramuscular indujo protección frente al desafío con IBDV ya que se observó una reducción significativa del título del virus de desafío presente en las BF y un daño histopatológico leve a moderado en dicho órgano. Luego, el candidato vacunal FW-VP2 se evaluó en esquemas de inmunización de dosis múltiples. El esquema de vacunación de dos dosis con FW-VP2 redujo significativamente la atrofia de la BF (evaluada por el índice bursal y el daño histopatológico) y el título de IBDV en la BF. La aplicación de una tercera inmunización aumentó significativamente la cantidad de anticuerpos anti-VP2 circulantes pero no mejoró los parámetros de protección inducidos con dos inmunizaciones. Finalmente, se confirmó que las inmunizaciones con FW-VP2 inducen una potente respuesta anti-vector que impiden la formación de las lesiones nodulares características de las vacunas de FWPV (“toma de la vacuna”) y, subsecuentemente, el efecto de aplicación de las dosis de refuerzo (booster). En conjunto, los resultados demuestran que se implementó exitosamente la metodología de obtención de FWPV recombinantes y se confirmó que los virus FW-VP2 inducen protección frente al desafío con una cepa de virulencia intermedia de IBDV. A futuro, se evaluará la protección inducida por el candidato vacunal FW-VP2 frente a aislamientos de campo de IBDV y FWPV, con el propósito de desarrollar una vacuna bivalente para el sector avícola.

Descripción: Un desafío importante para el desarrollo de vacunas frente a infecciones adquiridas por víade mucosas es poder inducir una respuesta inmune local, con el fin de evitar la diseminación delpatógeno al resto del organismo. Actualmente, el esquema de inmunización utilizado ampliamenteen ensayos clínicos para HIV, y otros patógenos para los cuales se requiere inducir una respuestainmune celular específica, es el denominado “prime-boost” que consiste en la utilización de distintosvectores vacunales durante la inmunización tales como los vectores de ADN recombinantes yaquellos basados en el virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). En este trabajo de tesis doctoral se utilizó un esquema ADN-prime/MVA-boost por ruta demucosas, donde ambos vectores expresan la glicoproteína de envoltura de HIV y se analizó elefecto adyuvante de ADN-IL-12 con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) en ratones BALB/ccon el fin de potenciar la respuesta inmune específica frente al HIV a nivel sistémico y de la mucosadel tracto genital. Los resultados obtenidos demostraron que esta combinación de adyuvantesmejoró la respuesta inmune celular no sólo a nivel sistémico, sino también en ganglios drenantes dela mucosa genito-rectal, y más importante aún, en el tracto genital, observándose un incremento enla magnitud, amplitud y calidad de la respuesta. En conclusión, la combinación de los adyuvantes ADN-IL-12 + CTB podría serpotencialmente utilizada como adyuvantes de mucosas en vacunas ADN/MVA, no sólo paraantígenos de HIV sino también para otras enfermedades infecciosas con impacto en mucosas.

Descripción: Se obtuvo la cepa HVB-1ΔgEβlgal, a partir de la cepa HVB-1 LA en la cual elgen de la glicoproteina E (gE)fue reemplazado por el gen de la enzima ,βgalactosidasa,por técnicas de ingeniería genética. La cepafue caracterizada tanto a nivel genómico yantigénico,como en cuanto a sus propiedades de crecimiento en cultivo celulares. La inmunogenicidad de la cepa HVB-1ΔgE-βgal se mantuvo intacta,comparada con la cepa parental, cuando se la utilizó como un inmunógeno inactivado ypermitió la diferenciación entre animales vacunados e infectados en base a surespuesta de anticuerpos. Utilizado como vacuna atenuada, HVB-1ΔgE-βgal indujo una buena respuestainmune especifica que resultó protectora frente al desafio viral, independientemente dela via de inoculación. Además, se comprobó la seguridad de la cepa HVB-1ΔgE-βgalya que, en las condiciones de la experiencia, no se transmitió por contacto, ni fueabortigénica. Asimismo, se verificó la respuesta inmune difierencial inducida frente a lavacunación con la cepa desarrollada, con respecto a la inducida por la infección viral. La respuesta inducida por la vacuna atenuada en bovinos adultos fue sostenida durante 330 días y se mantuvo negativa contra gE. La vacuna atenuada fue altamente inmunogénica tanto cuando fueadministrada en animales adultos como en terneros jóvenes. En particular, en aquellosbovinos que al momento de la vacunación tenían 3 meses de vida, hijos de madresvacunadas y que por lo tanto contaban con niveles detectables de anticuerposespecificos. Si bien se evidenció un efecto de interferencia de los anticuerpos maternosfrente al desarrollo de una respuesta inmune específica,fue posible detectar el aumentode los anticuerpos frente a una revacunación realizada cuando los bovinos contabancon 8 meses de vida (l60dpv).

Descripción: La toxina Shiga 2 (Stx2) producida por Escherichia coli enterohemorrágica es la principalcausa de diarrea asociada a síndrome urémico hemolítico e insuficiencia renal. El 30 %de la población infantil que sufre SUH padece alteraciones en el sistema nervioso central (SNC). Nos propusimos determinar la expresión del receptor Gb3, el cual produce la entrada dela toxina en las células que lo poseen, en condiciones normales y luego de laadministración intracerebroventricular de Stx2 en cerebros de roedores. Observamos queel receptor Gb3 se expresa en neuronas y aumenta con la administración local de Stx2. La interacción Gb3-Stx2 en neuronas podría contribuir al daño producido por lasencefalopatías derivadas del SUH en niños intoxicados por ingestión de productoscontaminados por E. coli enterohemorrágica. También caracterizamos el efecto de dosissubletales de Stx2 (dsStx2) administrada vía intravenosa por ultraestructura que secorrelacionó con tests de comportamiento por primera vez. Este modelo translacional nosfue útil para determinar que dosis subletales de la toxina son capaces de generar un dañocronológico significativo de eventos en cerebros de ratones, que podría explicar laslesiones neurológicas que remiten o resultan ser permanentes en pacientes intoxicados. Un significativo edema perivascular se observó luego de 2 días de la administraciónsistémica de Stx2, daño en astrocitos a los 4 días, y en neuronas y oligodendrocitos luegode 8 días. También fue importante encontrar extravasación de mastocitos y sinapsisinterrumpidas. Finalmente el tratamiento de la Dexametasona, un antiinflamatorio, el Lactobacillus Plantarum, y/o anticuerpos anti-Stx2 logran neutralizar la acción de Stx2. Estos estudios servirán como antecedentes para desentrañar a futuro los mecanismoscelulares y moleculares involucrados en los procesos neuropatológicos durante la faseaguda de la intoxicación. En base a este conocimiento, agentes terapéuticos pueden serutilizados para neutralizar la Stx2 a nivel central.

Descripción: El Virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) es el agente etiológico responsable de una enfermedad aguda contagiosa e inmunosupresora que afecta pollos jóvenes y causa importantes pérdidas económicas. La vacunación con virus inactivados o vivo-atenuados constituye el principal método de prevención y control de IBDV. Sin embargo, estas vacunas presentan desventajas debido a su naturaleza viral. En consecuencia, existe la necesidad de reemplazar dichas vacunas por nuevas herramientas sanitarias que tengan alta eficiencia con menores efectos colaterales. VP2, la proteína de cápside del virus, es el principal inductor de inmunidad protectora por lo que es el candidato apropiado para el desarrollo de vacunas a subunidad. En el presente trabajo se desarrolló una vacuna recombinante para IBDV basada en la expresión transitoria de VP2 en Nicotiana benthamiana. Se caracterizó el antígeno y se evaluó la inmunogenicidad y capacidad protectora del mismo tras la inoculación por distintas vías tanto en pollos libres de patógenos específicos como en aves de producción. Los resultados demostraron que el inmunógeno recombinante fue efectivo en generar una respuesta inmune protectora por vía parenteral pero no por vía de mucosas a menos que la inoculación oral haya seguido a una primera inoculación intramuscular. A su vez, el inmunógeno logró incrementar los niveles de anticuerpos específicos en gallinas reproductoras que fueron transmitidos a la progenie. Estos resultados evidencian un potencial uso del inmunógeno producido en planta como una alternativa a las vacunas convencionales para la enfermedad infecciosa de la bursa.