Descripción: SPARC (proteína secretada acídica y rica en cisteínas) es una glicoproteína sobreexpresada en una gran variedad de tumores favoreciendo la progresión tumoral y metástasis. Su rol biológico ha sido demostrado además en remodelación de tejidos, migración celular endotelial, morfogénesis y angiogénesis. Nuestro laboratorio ha demostrado que la transfección estable de células tumorales de melanoma con una secuencia de ADN antisentido de SPARC, promovió la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo murino in vivo. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares por los cuales SPARC ejerce su efecto protumoral. Esta tesis de doctorado se enfocó en la búsqueda de intermediarios moleculares por los cuales SPARC favorece la progresión tumoral. Mediante análisis proteómicos globales aplicados al modelo de melanoma humano con disminución forzada de la expresión de SPARC, pudimos dilucidar un mecanismo molecular por el cual SPARC actúa sobre la progresión tumoral. Esta vía se centra en el eje TGFbeta1/ colágeno tipo I/ integrinas alfa2beta1 a través del cual SPARC regula la invasividad celular mediada por catepsina B. Por otro lado, se demostró que SPARC induce el cambio de E‐ a N‐caderina de membrana permitiéndoles a las células de melanoma transmigrar a través de una monocapa de células endoteliales mediante un mecanismo molecular independiente al descripto para la inducción de catepsina B. Además, las células deficientes en SPARC presentaron una expresión disminuida de genes asociados con propiedades mesenquimales revelando que SPARC está involucrada activamente en la transición epitelio‐mesenquimal y en la progresión metastásica.

Descripción: Los tumores están compuestos de una masa heterogénea de células tumorales que incluyen células estromales asociadas que pueden convertirse en una barrera para la lograr una terapia exitosa contra la enfermedad. En los últimos años, los Adenovirus Replicativos Condicionales (CRAds) regulados por promotores recombinantes surgieron como una nueva modalidad de terapia para el cáncer. SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en células tumorales como en endotelio y en los fibroblastos activados de tumores. A partir de estos datos, decidimos utilizar al promotor de SPARC para dirigir la replicación de los virus tanto en las células tumorales como en las células que forman parte del tumor. Logramos clonar un promotor que demostró mayor actividad en las células que expresan SPARC (F512) que se utilizó para dirigir la replicación de un CRAd (Ad-F512). Ad-F512 tiene efecto oncolítico en diferentes líneas celulares de melanoma y en ensayos in vivo se observó la eliminación de tumores SB2. Por el contrario, los tumores de melanoma A375N, Mel J y el tumor SB2/WI-38, que combina células de melanoma con fibroblastos, su efecto oncolítico es muy reducido. Para aumentar su eficacia adicionamos secuencias de ADN conteniendo elementos de respuesta a diferentes condiciones pato‐fisiológicas que caracterizan al tejido tumoral para aumentar la replicación. A partir de los resultados obtenidos, seleccionamos el promotor kBF512HRE conteniendo elementos de respuesta a hipoxia (HRE) y elementos de respuesta a NFkB (kB). Construimos el CRAd Ad-kBF512HRE que eliminó el tumor SB2/WI-38 en todos los ratones pero no se observa el mismo efecto sobre tumores Mel-Les y A375N. A partir de estos resultados se cambió la fibra adenoviral involucrada en el pegado al receptor celular y el virus resultante, Ad-5/3-kBF512HRE tiene efecto anti-tumoral sobre los tumores Mel-Les. Estos resultados indican que la adición de elementos de respuesta a condiciones que caracterizan al tejido tumoral y el cambio de la proteína involucrada en la unión al receptor celular aumentan el efecto terapéutico de un CRAd en las líneas celulares resistentes y, además, pueden sobrepasar la restricción en la replicación que implica la presencia de células estromales.

Descripción: La Proteína Secretada Acídica y Rica en Cisteínas (SPARC en Ingles) ha sido asociada con efectos pro- y anti-angiogénicos. En esta tesis inicialmente se ensayó la actividad de la proteína SPARC de diferentes fuentes y todas fueron capaces de inhibir la proliferación, adhesión y migración de células endoteliales. SPARC obtenida de melanoma produjo un efecto bifásico en la proliferación de fibroblastos, aunque sobre las células tumorales no demostró efectos detectables. Por otro lado, SPARC fue capaz de modular la migración de células endoteliales inducida por factores angiogénicos como VEGF y PDGF. A bajas concentraciones SPARC estimulo la migración de las células endoteliales y a altas la inhibió. En esta última condición dicho efecto estuvo acompañado por el incremento en la capacidad de inducir la diferenciación de las células endoteliales, independientemente de los factores presentes en el medio. Además, encontramos que los niveles de SPARC disminuyen en hipoxia sugiriendo que la modulación de los niveles de SPARC por la tensión de oxigeno sería responsable de los efectos moduladores de la angiogénesis tumoral. Nuestros datos demuestran que SPARC puede actuar como un factor proangiogénico o anti-angiogénico en función de su concentración y los factores con los que interactúa. Hemos demostrado que tiene un rol único en la modulación de la angiogénesis tumoral actuando sobre la diferenciación, migración y proliferación de las células endoteliales.

Descripción: Las células madre mesenquimales (CMM) han sido ampliamente estudiadas en los últimos 30 años por su gran potencial clínico. Numerosas evidencias muestran que los efectos restauradores y regenerativos de las CMM se deben principalmente a sus efectos paracrinos mediados por su secretoma. Estas células liberan factores de crecimiento y citoquinas que modulan procesos celulares como la proliferación, la diferenciación, la inmunomodulación, la migración, la angiogénesis y la supervivencia. El secretoma de las CMM está compuesto tanto por factores solubles, como por factores liberados dentro de vesículas extracelulares (VE). Los exosomas, que se encuentran entre las VE secretadas por las CMM, son pequeñas vesículas de entre 50 y 120 nm de diámetro que están demostrando ser una valiosa fuente de información específica así también como huellas digitales de la progresión de enfermedades y como potenciales biomarcadores en diferentes estados fisiopatológicos. Por otra parte, la regeneración de heridas es un proceso complejo que requiere la migración celular, el desarrollo de un entorno inflamatorio, la angiogénesis, la granulación, la formación de tejido, la re-epitelización y la remodelación de la matriz extracelular (ME). Las CMM y su secretoma tienen un papel activo en este proceso, y se ha demostrado que la aplicación terapéutica de estas células mejora los resultados de la cicatrización de heridas. Por este motivo, en los últimos años se han estudiado diferentes maneras de modificar y aumentar las capacidades regenerativas de las CMM con el objetivo de desarrollar posibles terapias para la curación de heridas cutáneas. SPARC, también conocida como osteonectina, parece ser un actor clave del proceso regenerativo. SPARC es una glicoproteína multifuncional que se une al Ca2+ y pertenece a la familia de las proteínas de la ME. En animales adultos, su expresión se limita en gran medida a los tejidos en reparación o remodelación ya sea por heridas, enfermedades o procesos naturales, como los huesos y la mucosa intestinal. Se ha demostrado que SPARC regula el mecanismo de acción de varios factores de crecimiento y angiogénicos, así como también interactúa con diversas integrinas y proteasas regulando su expresión y actividad. Todas estas proteínas intervienen en numerosos mecanismos asociados al proceso de cicatrización tales como la migración, proliferación, diferenciación, angiogénesis y supervivencia celular, por lo que SPARC podría tener un rol clave en la regulación de este proceso regenerativo. Como se mencionó anteriormente, las CMM son una herramienta prometedora para el desarrollo de futuras terapias. Hasta la fecha, se ha producido una rápida expansión de los estudios tanto preclínicos como clínicos que utilizan el secretoma derivado de las CMM con las ventajas de un sistema libre de células. Aunque este secretoma parece ser una terapia prometedora para diversas enfermedades y lesiones, todavía resta saber más sobre la generación, la naturaleza y la modificación del mismo. En este trabajo, analizamos el potencial regenerativo del secretoma de células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton de cordón umbilical. Dado que SPARC está implicada en la remodelación y ensamblaje de la ME, así como en la regulación de los procesos de migración y proliferación celular, entre otros, hipotetizamos que la sobreexpresión de SPARC en las CMM tiene un efecto directo sobre la composición de su secretoma y potencialmente les conferiría una mayor capacidad regenerativa. Para abordar nuestra hipótesis, modificamos mediante un sistema lentiviral simple y reproducible a las CMM para que sobreexpresen la proteína de secreción SPARC (+SPARC). Además, generamos una línea de células en las cuales noqueamos parcialmente la expresión de SPARC (KD-SPARC) con el fin de analizar en mayor profundidad el rol de esta proteína en el proceso regenerativo. Por otro lado, en busca de desarrollar en un futuro una plataforma biotecnológica que sea fácilmente trasladable a la clínica, nos propusimos poner a punto un sistema de cultivo en suspensión que permita hacer más eficiente el proceso de cultivar, amplificar y aislar el secretoma de las CMM. Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos permiten concluir que el cultivo 3D de CMM puesto a punto es una plataforma eficiente que permite obtener grandes cantidades de células y aislar su secretoma, ahorrando tiempo y espacio de trabajo. Demostramos que modificamos la expresión de la proteína SPARC en las CMM con un protocolo simple y reproducible. Mediante ensayos in vitro utilizando queratinocitos y fibroblastos de piel humana tratados con el medio condicionado (MC) de CMM wild type (WT) y modificadas, demostramos que el secretoma de derivado de las CMM induce cambios sobre la migración y proliferación de las células tratadas. Más aún, estos cambios son SPARC-dependientes y tipo celular-específicos. Asimismo, el tratamiento con los MC de células WT, +SPARC y KD-SPARC en un modelo de cicatrización de heridas in vivo, nos permitió reforzar los resultados obtenidos anteriormente, observando una aceleración del proceso regenerativo con MC de células +SPARC y un evidente retraso en la cicatrización de los ratones tratados con el MC derivado de CMM KD-SPARC. En conjunto, estos hallazgos demuestran que SPARC cumple un clave en el proceso de cicatrización de heridas cutáneas, convirtiéndolo en un blanco terapéutico de interés que debe continuar siendo estudiado y caracterizado con el objetivo de desarrollar a futuro terapias regenerativas más eficientes.

Descripción: El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuyaexpresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de lasneoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo,en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación alcrecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajonos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como delas células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC enninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos nivelesde expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras depacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en amboscomponentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que laelevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que laexpresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelioes negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumorhumano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y laetapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN,encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelulary de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmenteidentificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimientotumoral y la diseminación metastásica.