Descripción: Los eventos hipóxicos que ocurren sobre el SNC en desarrollo, poseen consecuenciasnocivas dada la alta vulnerabilidad del tejido nervioso a la falta de oxígeno. El presente trabajo estudia los efectos sobre el Téctum óptico en desarrollo de unevento hipóxico agudo normobárico sobre embriones de aves. Encontramos que ladisminución de oxígeno en tales condiciones produce una discreta pero significativamuerte neuronal de fenotipo mayoritariamente apoptótico. Mediante lainmunomarcación observamos que existe un aumento en la expresión de NGF comoestrategia de rescate celular frente a la injuria, mientras que ésta produceparalelamente una disminución en la activación del receptor TrkA. Este fenómeno escorrelacionado con la muerte apoptótica observada a las 6 horas de reoxigenación. Observamos además un efecto neuroprotector por parte del NGF sobre las neuronassometidas a hipoxia, efecto que se ve abolido en presencia de un inhibidor de laactivación del receptor TrkA. Concluimos que el efecto neuroprotector ejercido por el NGF ante un evento de injuriahipóxica, posee al receptor TrkA como una molécula iniciadora clave y consideramos elmomento de finalización de la hipoxia, como un período de susceptibilidad y regulaciónen el que el balance y estado de receptores, serían críticos en el destino de las célulasque sufren daño por hipoxia.

Descripción: Los eventos de hipoxia tienen consecuencias nocivas que se manifiestan de múltiples formas en el SNC durante el desarrollo. El presente estudio analiza los daños generados en el tectum óptico por una hipoxia aguda normobárica sobre embriones de aves. Encontramos que tanto la vulnerabilidad diferencial como el retraso temporal de la muerte celular son dos fenómenos producto del evento hipóxico. Dicho daño se caracteriza por ser independiente de aferencias de la retina y por presentar una muerte celular mediada por la vía apoptótica intrínseca. Esto fue determinado ultraestructuralmente y bioquimicamente mediante la inmunomarcación de proteínas involucradas en la cascada apoptótica. Por otro lado, se determinó que la muerte celular propia del desarrollo presenta un perfil morfológico y bioquímico apoptótico similar al observado en condiciones de hipoxia. Frente a la evidente semejanza entre estos dos procesos de muerte postulamos que la hipoxia en nuestro modelo genera un desequilibrio transitorio en la homeostasis del tectum óptico, incrementando la muerte celular propia del desarrollo. Además, observamos una disminución transitoria en la actividad de la vía de supervivencia PI3K/Akt durante el evento hipóxico. Los resultados preliminares derivados de la administración de drogas que logran estimular esta vía de supervivencia en cultivos de embriones ex ovo, sugieren un rol ejecutor de esta vía en la muerte hipóxica. Por último, hemos determinado que la administración de estradiol posterior al evento hipóxico presenta efectos neuroprotectores a través de la unión a receptores y posiblemente mediante acciones no genómicas a través de PI3K/Akt.

Descripción: ambos cambios dependientes de óxido nítrico. En segundo lugar, se ha establecido que el precondicionamiento con un estímulo hipóxico de baja intensidad, confiere tolerancia parcial a una injuria hipóxica más severa 24 h después. Mediante la administración de moduladores de las HIF-prolil hidroxilasas, demostramos que la acumulación de HIF-1 durante el precondicionamiento es necesaria para que se manifieste la tolerancia a una injuria hipóxica posterior. Por último, observamos que la administración de inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS y el precondicionamiento hipóxico, aplicados en forma conjunta, tuvieron un efecto aditivo, logrando una neuroprotección completa. Los resultados obtenidos sugieren que los efectos neuroprotectores de los inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS en nuestro modelo se deben a efectos independientes de la acción de NO sobre la vía de HIF-1.

Descripción: En el presente trabajo de tesis se estudió el perfil de aparición y la modulaciónfarmacológica del complejo receptor GABAA a lo largo de la ontogenia del lóbulo ópticode las aves. Dicha estructura mesencefálica presenta un tejido rico en sinapsis GABAérgicas involucradas en la funcionalidad de los circuitos de procesamiento visual ylas variaciones bioquímicas de estos receptores se consideran representativas de eventosplásticos en las conexiones neuronales durante el desarrollo. En este estudio se utilizaron diversas técnicas en la preparación de las membranassinápticas (ciclos de lavado y congelación-descongelación) como estrategia paradeterminar variaciones entre estadios del desarrollo en los complejos receptores que nohubieran sido detectables utilizando una única metodología. Los resultados obtenidos mostraron un período de sobre-expresión transitoria delos sitios receptores GABAérgicos correspondiente al nacimiento y período postnatalinmediato, coincidiendo con la etapa de mayor plasticidad sináptica a lo largo deldesarrollo. Esta sobre-expresión se debió fundamentalmente a un incremento en ladensidad máxima de sitios receptores. En la preparación de membranas sinápticassometidas a congelación-descongelación se observaron dos poblaciones de sitiosreceptores, de alta y baja afinidad por GABA. Los mismos fueron detectados en todoslos estadios del desarrollo estudiados con excepción de los más tempranos, en los cualesla fracción de receptores sensible a la congelación no se hallaría aun presente en elterminal sináptico. Por otro lado, en las membranas sinápticas no congeladas solamentefue detectable la población de baja afinidad. Al evaluar a lo largo de la ontogenia la modulación de la unión de [³H]GABA asus sitios receptores por barbitúricos y neuroesteroides, se observó que dichosmoduladores producían una estimulación alostérica de los sitios receptores GABAérgicos de baja afinidad en todos los estadios del desarrollo ensayados, indicandoque los sitios modulatorios están acoplados a los sitios receptores GABAérgicos desdeetapas prenatales tempranas. El perfil de acción fue diferente para cada modulador siendo en ambos casosedad-dependiente. Se observó una heterogeneidad de sitios modulatorios, tanto parabarbitúricos en estadios prenatal y de recién nacidos, como para neuroesteroides enanimales adultos. La mayor sensibilidad a los moduladores se manifestó en los estadiostempranos del desarrollo -prenatal para barbitúricos y recién nacidos paraneuroesteroides-, coincidiendo con etapas en las cuales el receptor presenta granvariabilidad en sus respuestas funcionales. La heterogeneidad de sitios modulatorios para neuroesteroides, junto al hallazgode una nueva relación estructura-actividad para estas sustancias, no coincidente con lapreviamente conocida en mamíferos, indican una compleja interacción de estos esteroidescon el receptor GABAA en aves y sugieren un probable rol regulatorio de los mismos enetapas ontogenéticas tempranas. Por otro lado, los sitios receptores GABAérgicos de alta afinidad fueroninsensibles a la acción de los moduladores empleados, y no presentaron ademásvariaciones ontogenéticas significativas. Estos resultados permiten postular que, si biendichos sitios pueden representar una subpoblación real de receptores revelada por lacongelación, la misma careceria de una funcionalidad biológica explicable. La aplicación de diversas metodologías en la observación del perfil de apariciónde los sitios receptores GABAérgicos, así como en el estudio de la modulación de dichossitios, demostró que en todos los casos los estadios tempranos del desarrollo presentabanlas mayores variaciones entre distintas preparaciones de membranas sinápticas. Estasdiferencias en sensibilidad a la metodología entre estadios reflejarian una modificación enla estructura molecular del complejo receptor GABAA a lo largo de la ontogenia. Al analizar la acción estimulatoria conjunta de barbitúricos y neuroesteroides semanifestaron notorias diferencias en todos los estadios del desarrollo estudiados entre lasdos preparaciones de membranas sinápticas empleadas. Se observó que en membranassinápticas no congeladas ambos moduladores actuaban a través de un sitio dereconocimiento común, mientras que en membranas congeladas presentaban efectosaditivos y eran diferencialmente desplazados por un antagonista GABAérgico, indicandouna diferenciación de sus sitios de acción. La fracción proteica extraída durante la congelación de membranas fireconcentrada y aplicada a las mismas, produciendo una significativa disminución en laaditividad de efectos observada para ambos moduladores. Este resultado, conjuntamentecon los anteriores permite postular la existencia de factores endógenos asociados alcomplejo receptor, removidos durante la congelación-descongelación de las membranassinápticas. Los mismos serían mediadores de un efecto común de barbitúricos yneuroesteroides in vivo, estando por lo tanto relacionados con la modulación delreceptor GABAA a lo largo de la ontogenia. Los resultados obtenidos demuestran por lo tanto significativas variacionesontogenéticas en el complejo receptor GABAA, tanto en sus sitios de reconocimiento de GABA como de ligandos modulatorios. Estas variaciones son relevantes paracomprender las modificaciones en las respuestas funcionales del complejo receptor a lolargo del desarrollo. En forma similar, la existencia de factores endógenos asociados alreceptor es de importancia en la determinación de sus mecanismos naturales demodulación en la sinapsis. El presente estudio provee entonces los fundamentos bioquímicos que puedenutilizarse para comprender la función de estos receptores durante el desarrollo del Sistema Nervioso Central.

Descripción: La toxina Shiga 2 (Stx2) producida por Escherichia coli enterohemorrágica es la principalcausa de diarrea asociada a síndrome urémico hemolítico e insuficiencia renal. El 30 %de la población infantil que sufre SUH padece alteraciones en el sistema nervioso central (SNC). Nos propusimos determinar la expresión del receptor Gb3, el cual produce la entrada dela toxina en las células que lo poseen, en condiciones normales y luego de laadministración intracerebroventricular de Stx2 en cerebros de roedores. Observamos queel receptor Gb3 se expresa en neuronas y aumenta con la administración local de Stx2. La interacción Gb3-Stx2 en neuronas podría contribuir al daño producido por lasencefalopatías derivadas del SUH en niños intoxicados por ingestión de productoscontaminados por E. coli enterohemorrágica. También caracterizamos el efecto de dosissubletales de Stx2 (dsStx2) administrada vía intravenosa por ultraestructura que secorrelacionó con tests de comportamiento por primera vez. Este modelo translacional nosfue útil para determinar que dosis subletales de la toxina son capaces de generar un dañocronológico significativo de eventos en cerebros de ratones, que podría explicar laslesiones neurológicas que remiten o resultan ser permanentes en pacientes intoxicados. Un significativo edema perivascular se observó luego de 2 días de la administraciónsistémica de Stx2, daño en astrocitos a los 4 días, y en neuronas y oligodendrocitos luegode 8 días. También fue importante encontrar extravasación de mastocitos y sinapsisinterrumpidas. Finalmente el tratamiento de la Dexametasona, un antiinflamatorio, el Lactobacillus Plantarum, y/o anticuerpos anti-Stx2 logran neutralizar la acción de Stx2. Estos estudios servirán como antecedentes para desentrañar a futuro los mecanismoscelulares y moleculares involucrados en los procesos neuropatológicos durante la faseaguda de la intoxicación. En base a este conocimiento, agentes terapéuticos pueden serutilizados para neutralizar la Stx2 a nivel central.