Descripción: Los Sistemas de Secreción de Proteínas tipo I (T1SS) permiten a una amplia variedad de bacterias Gram-negativas secretar proteínas al medio extracelular; estos sistemas participan en varias respuestas fisiológicas como la adaptación al medio ambiente y contribuyen a la virulencia en diversos patógenos. Los T1SS están formados por un componente de membrana interna (ABC) un componente de fusión de membrana (MFP) y un componente de membrana externa (OMF). Los genes de los dos primeros (e inclusive el OMP) suelen estar formando un operón y pueden estar adyacentes a los genes que codifican sus proteínas sustrato. En la bacteria simbionte Rhizobium leguminosarum, el T1SS, PrsDE, es responsable de la secreción de diversas proteínas que participan en la supervivencia del rizobio en el suelo, favoreciendo la formación de estructuras comunitarias denominadas biofilms. A. tumefaciens es un fitopatógeno de alto interés agronómico y biotecnológico. A pesar de la relevancia que los TISS muestran tener en diversas bacterias Gram negativas, hasta la fecha no se ha avanzado en el estudio y la relevancia fisiológica de estos sistemas de secreción en este fitopatógeno. En este trabajo, se aisló a partir de una biblioteca genómica proveniente de A. tumefaciens el cósmido pIJ7760 que fue capaz complementar el fenotipo de secreción de cepas mutantes en el sistema PrsDE de R. leguminosarum. Se determinó que dicho cósmido alberga los genes de un sistema homólogo al que se denominó AspD-AspE, Agrobacterium secretion protein D and E) formado por un componente ABC (dominio de unión a ATP) y otro MFP (proteína de fusión de membranas), respectivamente. Este sistema fue responsable de la secreción de una proteína, a la que se denominó Hla, de función desconocida codificada rio arriba de aspDE. El análisis de las secuencias del cósmido permitió identificar, río arriba de hla, genes cuyo productos presentan alta similitud de secuencia aminoacídica con receptores de hemo (denominado hlaR) y a factores sigma y anti sigma (denominados hlaS y hlaI). Las zonas promotoras de ambos loci presentaron secuencias consenso de reconocimiento del regulador RirA que responde a la concentración de hierro extracelular. Rio arriba de estos genes se identificó un probable sistema ABC de captación de hemo (denominado ahuUVTB) que presenta en su región promotora secuencias de reconocimiento de RirA y del regulador del metabolismo del hemo IrrA. El análisis de las proteínas presentes en el medio extracelular en diversas condiciones de cultivo y nutricionales permitió reflejar un complejo control y una regulación diferencial de la secreción de la proteína Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 y A. tumefaciens C58. Se observó una muy elevada secreción de Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 en medios ricos de cultivo. Se determinó que esta desregulación se debe a que la cepa de A34 contiene una mutación ancestral en algún regulador desconocido hasta la fecha que provoca un fenotipo pleiotrópico. Este regulador es codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI y regula, la secreción de Hla. El estudio de la regulación en el pariente heterólogo R. leguminosarum mostró que la secreción de Hla también se ve reprimida por los reguladores globales de respuesta a hierro descriptos en Rhizobiaceae, RirA e IrrA. Por otro lado, el agregado de hemoglobina como fuente de hemo extracelular, indujo la secreción de Hla como proteína mayoritaria en el contexto heterólogo de Rhizobium. El análisis del contexto genético de hla mostró que este gen está incluido en un locus sinténico a otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo a través de hemóforos, aunque Hla no presenta similitud de secuencia aminoacídica con hemóforos caracterizados. Sin embargo, la purificación por columna de afinidad de hemina mostró que Hla presenta capacidad de unir hemina y sería el primer hemóforo descripto en la familia Rhizobiaceae. Mediante mutagénesis dirigida se generó una mutante de secreción en aspD de A. tumefaciens C58. Los fenotipos asociados a esta mutante mostraron un carácter pleiotrópico, tanto la autoagregación bacteriana, la adhesión a soporte abiótico y la motilidad en agar se vieron afectadas. En A. tumefaciens la secreción de Hla respondió principalmente a condiciones microóxicas/anóxicas, además de a la ausencia de hierro y presencia de hemo. Interesantemente, la mutante deficiente en la secreción de Hla fue incapaz de inducir la formación de tumores en Kalanchoe sp. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo sugieren que el T1SS AspDE, participaría en la captación de hemo extracelular a través de la secreción de un nuevo hemóforo (Hla) probablemente en condiciones microaerófilas y de bajo hierro presentes en el contexto del tumor.

Descripción: Rhizobium leguminosarum es una α-proteobacteria que puede establecer simbiosis con ciertas leguminosas. La formación de un biofilm puede favorecer la persistencia en suelos y en la rizosfera y también contribuir a la competitividad para la infección de la leguminosa. En esta tesis se estudiaron factores importantes para la adhesión a diversos sustratos y la formación de biofilms. Uno de los factores estudiados fue la proteína de adhesión RapA1, secretada a través del sistema PrsDE. Se sobreexpresó RapA1 y se observó que esto produjo diversos fenotipos de superficie, incluido el aumento de adhesión a sustratos abióticos y la formación aumentada de biofilms in vitro. Se estudió la relación entre RapA1 y el exopolisacárido acídico (EPS) y el requerimiento del EPS y PrsDE para formar biofilms en flujo continuo. Se analizó la localización de RapA1 y de otras proteínas relacionadas y se estudiaron posibles mecanismos involucrados en la localización. Algunos estudios complementarios sobre el efecto de RapA1 sobre la superficie, efecto de expresión de otras Raps y regulación de genes relacionados con la adhesión fueron encarados de manera inicial. La interacción entre Polisacáridos de superficie y adhesinas proteicas resulta clave para la adhesión y formación de biofilms, dos fenómenos importantes en la biología de Rhizobium y de relevancia para la humanidad.

Descripción: Esta tesis aporta conocimientos sobre el rol de factores extracelulares producidos por la bacteria fijadora de nitrógeno Rhizobium leguminosarum bv. viciae en la formación de biofilms. Los rizobios se unieron a un soporte abiótico a través de un polo, formando microcolonias y agregados tipo racimo, que culminaron en una estructura tridimensional característica (biofilm) con grupos de bacterias igualmente orientadas. El EPS acídico y el antígeno O del LPS fueron esenciales desde las etapas tempranas (adhesión al soporte y formación de microcolonias). Las EPS-glicanasas PlyA y PlyB, secretadas por el sistema tipo I PrsD-PrsE, influyeron en la maduración del biofilm clivando el EPS. El sistema PrsD-PrsE resultó ser responsable de la secreción de adhesinas tipo Rap, que participarían en las interacciones entre bacterias durante la formación del biofilm. La producción de fibrillas de celulosa estaría reprimida en las cepas estudiadas, aunque la inducción de su síntesis ante determinados estímulos podría influir fuertemente en la agregación celular. Dentro de otro objetivo de esta Tesis, se identificaron los genes de los componentes ABC y MFP de un nuevo sistema de secreción de proteínas tipo I, codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI. Este sería responsable de exportar la proteína extracelular EP49, cuya secuencia codificante es contigua. EP49, presentó varias repeticiones de un nonapéptido característico de proteínas de la familia de toxinas RTX, como la rizobiocina A y la proteína formadora de poro NodO de Rhizobium lo que sugiere que interaccionaría con Ca^2+.

Descripción: Rhizobium leguminosarum sintetiza un polisacárido acídico secretado mayormente al medio extracelular (EPS) y parcialmente retenido en la superficie bacteriana como polisacárido capsular (CPS). Las proteínas Rap son sustratos del sistema de secreción tipo I PrsDE (SSTI) que comparten al menos un dominio Ra/CHDL (cadherina-like). Se ha demostrado que algunos de estos sustratos están involucrados en el desarrollo de la matriz del biofilm ya sea por clivaje del polisacárido que emerge de la superficie de la célula (las glicanasas Ply) o alterando las propiedades adhesivas de la bacteria (proteínas RapA). En esta tesis se demuestra que una nueva proteína Rap (RapD) se libera completamente al medio extracelular co-secretada con otras proteínas Rap de manera PrsDE dependiente. Más aún, en biofilms se encontraron niveles extracelulares incrementados de RapD en condiciones de cultivo que favorecen la producción de EPS. No se observaron fenotipos evidentes asociados a las propiedades adhesivas o formación de biofilms en la mutante deficiente en rapD. Sin embargo, por cromatografía de exclusión molecular del EPS producido por la cepa silvestre (wild type) de R. leguminosarum bv viciae 3841, las mutantes isogénicas simples rapA2 y rapD y la doble mutante rapA2rapD, se demostró que ambas proteínas Rap tienen un rol en la regulación del tamaño de las cadenas del EPS que se libera al medio extracelular. Los estudios biofísicos indicaron que el calcio gatilla cambios conformacionales en la proteína RapD hacia una estructura dominada por láminas β, como ocurre en las cadherinas. Más aún, la presencia de calcio induce la multimerización de RapD mientras que el agregado de EPS indujo cambios conformacionales adicionales en la proteína. Estudios de ELISA y BIA (binding inhibition assay) indicaron que RapD se une específicamente al EPS y que la galactosa estaría involucrada en esa interacción. Estas observaciones indican que RapD es una proteína lectina que interacciona con calcio y que es capaz de establecer multímeros y modificar las propiedades del EPS, el principal componente estructural de la matriz del biofilm del rizobio.

Descripción: Brucella spp. son las bacterias causantes de la brucelosis, la enfermedad zoonótica con más incidencia en el mundo. Brucella es un patógeno exitoso que probablemente infecta animales desde hace millones de años, y se encuentra extremadamente adaptado al estilo de vida intracelular. La virulencia de este patógeno reside en su capacidad de invadir al hospedador, resistir los mecanismos de defensa y, establecerse y replicar en el inhóspito nicho replicativo. El nicho replicativo se caracteriza por ser escaso en nutrientes, tener baja tensión de O2 y someter a Brucella al daño oxidativo. A pesar de que Brucella no posee factores de virulencia “clásicos” posee una batería de mecanismos fisiológicos y adaptaciones metabólicas que en definitiva son los que le permiten sortear las defensas de los hospedadores y adaptarse a la vida intracelular. En este trabajo de tesis, se ha caracterizado y estudiado una parte de la fisiología básica de Brucella, como lo es el metabolismo de las flavinas. Se ha hecho foco en los genes rib, en particular en ribH2 que codifica una enzima lumazina sintasa (LS) que cataliza el penúltimo paso la ruta biosintética de la riboflavina. Se describió la regulación de la expresión de ribH2 por el elemento regulatorio riboswitch FMN, y se identificaron posibles proteínas que interactúan con RibH2 en Brucella. También, se estableció una relación directa entre virulencia y el metabolismo de flavinas en Brucella, resaltando la importancia de RibH2 para la supervivencia, tráfico y persistencia de las bacterias durante la infección en los modelos in vitro e in vivo. El rol de las flavinas en la simbiosis de Rhizobium leguminosarum con plantas, también fue estudiado. Los resultados muestran que el papel que juegan las proteínas RibH2 en el establecimiento bacteriano con el hospedador eucariota no está restricto sólo a Brucella, sino que parece ser compartido por otros Rhizobiales. Los hallazgos de este trabajo de tesis pueden dar lugar a nuevos estudios que lleven al desarrollo de vacunas y drogas contra la brucelosis y mejoras en las cepas bacterianas de inoculantes para uso agronómico.

Descripción: Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantasluguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (porejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser unaalternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). También pueden ser usadas para proteger semillas,reduciendo el uso de insecticidas químicos. El gen cry 4B de B. thuringiensisisraelensis que codifica para una proteína tóxica para díptero fue usado comomodelo. Para introducir dicho gen se usó el plásmido pTR101, un vectoraltamente estable, en Rhizobium en ausencia de presión de selección. Lasconstrucciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobiummeliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudosutilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Seobservaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto unpolipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodosconstituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, elgen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducidoen Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, paraevitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen dereplicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede sermovilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Losanálisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa nide crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es unacaracterística de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primeradescubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamentehomólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. Elanálisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similara las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaronla presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensissubespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blotse confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasificadentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, tambiénlleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepastóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillusthuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversafamilia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt hasido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferentepatotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso delserotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvasde lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepasmosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista enlas cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis ymorrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potenciamosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y nomosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbolfiligenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro dedistribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablementetambién de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en elmecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstasúltimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistenciadesarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos demuchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como laresultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt.

Descripción: Los rizobios fijan N2 en asociación simbiótica con plantas leguminosas. En esta simbiosis, existen grupos con propiedades inusuales: las leguminosas que nodulan en tallo y los rizobios fotosintéticos. En este trabajo se identificó y caracterizó a los rizobios de especies nativas de Aeschynomene y Sesbania que nodulan en tallo. Se analizó la diversidad genotípica entre las cepas, y en particular, las propiedades fotosintéticas de los rizobios de Aeschynomene. Las cepas aisladas se caracterizaron mediante rep-PCR (repetive sequence based-PCR), análisis de restricción del gen ribosomal 16S y de la región intergénica ribosomal 16S-23S (ARDRA y 16S-23S rDNA IGS-RFLP, respectivamente) y análisis de secuencia del gen 16S rRNA. Los rizobios de Aeschynomene rudis y A. denticulata son fotosintéticos y todos pueden clasificarse como Bradyrhizobium sp.. Los datos de rep-PCR revelaron una alta diversidad entre los aislamientos, con un grupo genotípicamente diferente correspondiente a las cepas que producen cantaxantina. El análisis de secuencia del 16S rDNA de una cepa representativa confirmó la posición de los rizobios fotosintéticos en un grupo filogenético diferente dentro del grupo Bradyrhizobium. La expresión del aparato fotosintético es regulada por oxígeno y luz en forma diferente a lo descripto en otras cepas de bradyrizobios fotosintéticos: la acumulación de bacterioclorofila (BChl) es mayor en condiciones microaeróbicas y producen pigmentos fotosintéticos en oscuridad. Sin embargo, bajo luz continua, condición en la que no se observa acumulación de BChl, la expresión de los polipéptidos de la antena del aparato fotosintético es alta, lo que sugiere una regulación a nivel postranscripcional. Los rizobios aislados de Sesbania spp. son taxonómicamente diversos. Según el análisis de secuencia del 16S rDNA, los microsimbiontes de Sesbania virgata pueden clasificarse como Azorhizobium doebereinerae, una especie nueva recientemente descripta, y los de S. exasperata como Rhizobium sp., relacionados a Rhizobium giardinii. Entre los aislamientos de cada una de las especies también existe una gran diversidad detectada por rep-PCR pero con una alta proporción de cepas hermanas. Las cepas de Rhizobium sp. probablemente representen una especie nueva entre los rizobios, ya que poseen solo un 97% de identidad de secuencia del 16S rDNA con las especies más relacionadas, además de diferencias fenotípicas en la utilización de sustratos carbonados y las condiciones de crecimiento.