Descripción: El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad delmaíz en nuestro país provocando grandes pérdidas económicas. El virus es transmitido porchicharritas de la familia Delphacidae e infecta además diversas gramíneas como trigo, cebada,avena y sorgo, dando lugar a síntomas severos. El genoma del MRCV está formado por diezsegmentos de ARN doble cadena (ARNdc) que codifican para trece proteínas. Durante el ciclode infección, el MRCV replica en cuerpos de inclusión citoplasmáticos virales denominadosviroplasmas, y nuestro grupo demostró que están compuestos principalmente por la proteínano estructural P9-1 (Maroniche, 2011). Para otros reovirus se ha demostrado que losviroplasmas contienen además ARN viral y proteínas virales minoritarias junto concomponentes celulares del hospedante. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad en primerlugar se analizaron las interacciones de las proteínas del MRCV entre sí utilizando la técnica dedoble híbrido de levaduras (Y2H). Se identificaron cuatro interacciones positivas: P6 con P6 ycon P9-1, P9-1 con P9-1, y P9-2 con P9-2. Se definieron además las regiones de P6 y de P9-1involucradas en las interacciones utilizando mutantes de deleción y se encontró que la regióncentral de P6 con un posible dominio “coiled-coil” es necesaria para la interacción consigomisma y con P9-1, mientras que los últimos 24 residuos de P9-1 intervienen en la formación dedímeros de P9-1. Estos resultados, junto con resultados previos del grupo (Maroniche, 2011),permitieron postular a P6 como componente minoritario del viroplasma e indicaron que laregión C-terminal de P9-1 sería necesaria para la formación del viroplasmas. Adicionalmente se evaluó la interacción de las proteínas virales P6, P7-2, P9-1, P9-2 y P10 conproteínas celulares que son candidatas a cumplir roles relevantes en la interacción MRCVhospedante. Ente otros resultados, se encontró que P7-2 interactúa con la proteína SKP1 (SPhase Kinase Associated Protein 1) componente del complejo E3 ligasa del sistema ubiquitinaproteasoma (UPS). Estos resultados son de gran relevancia ya que sugieren que P7-2 tiene lacapacidad de interferir con el UPS. Para continuar con la caracterización de las proteínas virales P9-1 y P6 e identificar posiblescomponentes celulares asociados con los viroplasmas, se realizaron relevamientos de una biblioteca de ADN copia (ADNc) de hoja de trigo por Y2H. Se encontró que P9-1 es capaz deinteractuar con una proteína con posible función de aldosa 1-epimerasa y otra con posiblefunción de aciltransferasa. Por su parte, P6 mostró interacción con una posible tiorredoxina. Dado que las proteínas identificadas intervienen en el metabolismo de la planta, se postulaque su interacción con proteínas virales podría estar asociada con la generación de síntomas. Finalmente se determinó que tanto P6 como P9-1 contienen potenciales motivos PEST dedegradación vía proteasoma. Se construyeron mutantes sin estos motivos y se observó unincremento en los niveles de acumulación de P6 y P9-1 mutadas en plantas, sugiriendo que los PEST serían funcionales. Si bien aún resta comprender los mecanismos precisos que subyacen a las interaccionesproteína-proteína encontradas en este trabajo de Tesis y sus consecuencias biológicas, estosresultados significan un importante avance en el conocimiento de la función y rol de lasproteínas codificadas por el MRCV, en especial de P6 y P9-1.

Descripción: El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país y es transmitido de manera persistente y propagativa por delfácidos. Diversas evidencias indican que los virus de este género se originaron de un virus de insectos ancestral y más recientemente adquirieron la capacidad de infectar plantas. La replicación viral está limitada al floema de gramíneas donde provoca síntomas severos, mientras que ocurre en diversos tejidos y es asintomática en los delfácidos vectores. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA) que codifican para trece proteínas. El actual manejo de la enfermedad se realiza a través del monitoreo y control del principal insecto vector, D. kuscheli. Sin embargo, no se han desarrollado prácticas adecuadas ni existen cultivares resistentes en el caso de un eventual brote. El desarrollo de nuevas tecnologías de bajo impacto ambiental que permitan controlar efectivamente la virosis depende de la generación de conocimiento básico sobre la interacción hospedante-virus, particularmente sobre el ciclo viral y de los mecanismos de defensa de ambos hospedantes. El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo de regulación génica específico de secuencia que a su vez funciona como sistema de defensa antiviral. Con el objetivo de caracterizar la respuesta diferencial en plantas e insectos infectados con MRCV, se realizó un ensayo de infección controlada utilizando el insecto vector D. kuscheli y plántulas de trigo como modelo hospedante. Se secuenciaron los RNAs pequeños de ambos hospedantes y se caracterizó el perfil de aquellos derivados del genoma viral (vsiRNAs). Se determinó que, mientras que la respuesta en plantas se caracteriza por la generación de “puntos calientes” muy marcados de vsiRNAs en prácticamente todos los segmentos, en insectos la acumulación resultó más homogéneamente distribuida. Por otro lado, la proporción de vsiRNAs derivados de ambas hebras fue prácticamente la misma en ambos hospedantes, por lo que se presume que la maquinaria de silenciamiento tiene acceso a todo el largo de los segmentos en algún momento del ciclo infectivo. Adicionalmente, en plantas se observó una acumulación preferencial de vsiRNAs en el primer tercio de gran parte de los segmentos genómicos, y una correlación inversa entre la acumulación de vsiRNAs y el largo de los segmentos. En D. kuscheli, se identificaron piRNAs por primera vez en esta especie y se descartó la participación directa de los mismos en el silenciamiento antiviral. Finalmente, el análisis del perfil mutacional del virus dentro de cada hospedante evidenció la presencia de sitios altamente variables que son únicos para cada hospedante y que dan lugar mayoritariamente a mutaciones no sinónimas que probablemente se deban a un proceso adaptativo. Dentro de los mecanismos desencadenados por los virus durante el establecimiento de la infección se encuentra la modulación de la expresión de genes del hospedante. Esto puede conducir a cambios en la expresión de genes potencialmente involucrados en la producción de síntomas y/o que intervienen en mecanismos de defensa como el silenciamiento génico que restringen la replicación viral. Con el objetivo de identificar alteraciones en la acumulación de RNAs mensajeros ante la infección con MRCV, se realizó un RNAseq en plantas de trigo infectadas a dos etapas tempranas: 12 y 21 días post infección. Se realizó la anotación manual del genoma de trigo recientemente liberado (TGACv1) y se determinaron los genes diferencialmente expresados a cada tiempo utilizando dos métodos estadísticos. Estudios de enriquecimiento funcional revelaron que la infección con MRCV induce la sobreexpresión de genes que intervienen en la traducción, la biosíntesis de celulosa y la modificación de ácidos nucleicos. Dentro de las categorías de genes subexpresados se encuentran algunos relacionados con vías hormonales implicadas en el desarrollo y crecimiento de la planta: auxinas, citoquininas y brasinoesteorides. El MRCV y la mayor parte de los fijivirus poseen tres segmentos bicistrónicos S5, S7 y S9, y se desconoce el mecanismo implicado en la traducción de los ORFs ubicados hacia el extremo 3’. El segmento S5 presenta un marco abierto de lectura (ORF5-2) parcialmente superpuesto al primero (P5-1). Estudios de genómica comparativa de secuencias del S5 de varias especies de fijivirus permitieron la identificación de una secuencia “UCU_UUU_CG” altamente conservada que podría funcionar como un sitio de deslizamiento ribosomal en la región superpuesta hacia el extremo 5' del ORF 5-2. En este trabajo de Tesis, se llevaron adelante experimentos de traducción in vitro del segmento S5 utilizando diferentes construcciones mutantes que comprobaron experimentalmente la existencia del frameshift que da lugar a una proteína de fusión P5-1/2. Si bien aún resta ahondar en los mecanismos moleculares que ulteriormente determinan la sintomatología, los resultados contenidos en esta Tesis constituyen un insumo sumamente valioso para continuar avanzando en la comprensión del patosistema y poder eventualmente dar lugar a productos biotecnológicos que formen parte de un diseño racional, integrado y sustentable de estrategias de control de la enfermedad.

Descripción: El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.