Descripción: Las hipótesis para el estudio de las bases neurobiológicas del aprendizaje y la memoria consideran que la información es almacenada por el sistema nervioso como cambios en las conexiones entre neuronas. Estos cambios son el resultado de un proceso de transformación inducido por la experiencia y dirigido en cada neurona por la activación de las vías de transducción, que por medio de la accion de quinasas, regulan cambios de corto término y la expresión de genes responsables de los cambios perdurables que subyacen la memoria de largo término. En la presente tesis se estudió la participación de la proteína quinasa dependiente de AMP-cíclico (PKA) en la formación de una memoria de largo término y aspectos de su activación fueron estudiados en estrecha relación con la experiencia y el tipo de memoria inducido. Con este objetivo se utilizó el paradigma de memoria contexto-señal del cangrejo Chasmagnathus granulatus, en el cual el animal aprende a reconocer la inocuidad de un estímulo inicialmente peligroso. Ante la falta de conocimiento previo sobre esta vía de transducción en crustáceos, se estudió la distribución de la actividad basal y total de PKA en sistema nervioso de cangrejo y se identificó y caracterizó a las isoformas I y II de la misma. Mediante la administración de un inhibidor de PKA, a distintos tiempo respecto del entrenamiento, se determinó la existencia de dos períodos en los cuales la actividad de PKA es fundamental para la consolidación. El primero durante el entrenamiento y el segundo en una ventana temporal entre 4 y 8 horas después del mismo. La medición de la actividad de PKA durante la consolidación permitió comprobar que la activación de PKA es parte de los mecanismos de la consolidación directamente inducidos por la experiencia. Se determinó que durante el segundo período de dependencia de PKA para la consolidación existe un aumento de la isoforma de PKA más sensibles al AMPc, PKA I, que estaría involucrado en el aumento de actividad de PKA necesario durante esa etapa de la consolidación. Finalmente, se estudió que aspectos temporales y mecanísticos de la activación de PKA son función específica de la activación inducida por distintas experiencias. La participación diferencial de isoformas de PKA es sugerida.

Descripción: En años recientes un gran número de trabajos se han enfocado a estudiar la forma de reducir la elevada absorción de lípidos, asociada a numerosos problemas de salud, tales como obesidad y problemas cardiovasculares. Si bien las metodologías para abordar el tema son variadas, al ser la lipólisis una reacción interfacial (la lipasa debe adsorberse a la interfase para llevar a cabo la digestión de los lípidos), las interfases aceite/agua (tanto la estructura como el área interfacial) resultan un punto crítico a estudiar. Por tal motivo, el objetivo del presente trabajo consiste en evaluar el impacto que presentan diferentes estructuras interfaciales en el proceso digestivo con el propósito de encontrar aquella que retarde (o inhiba) la acción digestiva llevada a cabo por la lipasa pancreática. Se analizaron estructuras interfaciales y emulsiones estabilizadas por: proteínas (β-lactoglobulina (βlg) y aislado proteico de soja (SPI)) y polisacáridos (hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC)). Se desarrolló un modelo de digestión in vitro constituido por dos etapas: gástrica (1h, pH 2,5) y duodenal (1h, pH 7), que contemplan la presencia de las principales enzimas y biopolímeros a concentraciones fisiológicas. El estudio se realizó en dos niveles: (1) Estudios de digestión de interfases aceite/agua (tensiómetro interfacial de gota) para obtener información sobre cómo los fluidos característicos de la digestión perturban tales películas interfaciales, caracterizándolos mediante los parámetros: tensión interfacial y módulo dilatacional interfacial; (2) Estudios de digestión de emulsiones estabilizadas por los mismos emulsionantes obtenidas mediante la técnica de ultrasonidos de alta intensidad. Se analizaron los cambios microestructurales de las gotas de aceite (microscopía óptica y técnicas de dispersión de luz) y se monitoreó el porcentaje de ácidos grasos liberados (% AGL) por acción de la lipasa pancreática. Se comprobó que tanto las estructuras interfaciales como las emulsiones presentan diferencias en cuanto a la resistencia a la acción digestiva llevada a cabo por la lipasa. Estas vienen determinadas por la naturaleza de cada estructura y las característicasinterfaciales de cada una. Las emulsiones estabilizadas por SPI y HPMC mostraron los menores % AGL en comparación con las emulsiones de βlg. El comportamiento observado no presentó relación con el área interfacial expuesta a la lipasa, sino más bien a la capacidad que presenta cada emulsionante en dificultar la acción de las sales biliares (SB), agentes indispensables para la acción de la lipasa. De esta manera, los resultados permitieron identificar a las SB como un factor clave en la regulación del proceso. En términos generales, los resultados contribuyen al mayor entendimiento sobre los mecanismos involucrados en la digestión de emulsiones y del rol crucial que juegan las estructuras interfaciales en el control de la lipólisis.

Descripción: El objetivo de la tesis fue estudiar el impacto de la hidrólisis enzimática de las proteínas de soja en sus propiedades interfaciales, de espumado y en la interacción con polisacáridos en condiciones de limitada compatibilidad termodinámica. La hidrólisis de la proteína de soja (SP) produjo un aumento del carácter tensioactivo a concentraciones de subfase donde SP adopta una conformación más condensada en la monocapa. A concentraciones bajas en la subfase en las cuales SP adopta una estructura expandida en la monocapa, un bajo grado de hidrólisis (2%) también produjo un aumento del carácter tensioactivo. Sin embargo un mayor GH (5,35%) redujo la actividad superficial. La hidrólisis también mejoró la elasticidad dilatacional y la viscoelasticidad relativa de las películas a concentraciones menores a la de colapso de la monocapa (2%). La correlación entre las propiedades superficiales y las propiedades de las espumas, corroboró que efectivamente el GH que se debe lograr en la proteína de soja debe ser muy pequeño a fin de mejorar su CE sin perder las propiedades de gelificación interfacial necesarias para formar películas muy viscoelásticas que presenten una alta estabilidad al drenado de líquido y al colapso. El efecto de los polisacáridos en las propiedades de espumado dependió del grado de hidrólisis de la proteína y del tipo de polisacárido de una manera compleja siendo la estabilidad de las espumas la resultante entre la contribución del polisacárido a la viscosidad del seno de la fase continua y a la viscoelasticidad y/o elasticidad de las películas interfaciales. Tanto los polisacáridos tensioactivos como los no tensioactivos, influyeron en la interfase aire-agua, promoviendo una mejora de las propiedades de las películas cuando se usan en combinación con proteína de soja. La presión superficial y viscoelasticidad de las películas de la proteína menos hidrolizada aumentó en presencia de los polisacáridos, sin embargo la de la más hidrolizada se redujo o no se modificó. Esto indica que una hidrólisis limitada es suficiente para mejorar las propiedades de la interfase aire-agua cuando la proteína se usa en combinación con polisacáridos. El agregado combinado de kappa-carragenano e hidroxipropilmetilcelulosa resultó una estrategia adecuada para generar espumas en base a hidrolizados proteicos de soja, con una elevada estabilidad al drenado y colapso bajo condiciones de calentamiento, sin reducir el volumen de la espuma. Por otro lado, estas espumas bajo refrigeración presentan una alta estabilidad debido a la gelificación del carragenano.

Descripción: Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Descripción: El virus de inmunodeficiencia de felinos (FIV) es un lentivirus que causa en gatos domésticos un síndrome de inmunodeficiencia similar al SIDA de humanos. Por ello, el sistema FIV-gato doméstico es considerado un modelo adecuado para el estudio de las infecciones producidas por el virus de inmunodeficiencia de humanos (HIV). El gen gag de FIV, al igual que el del resto de los lentivirus, codifica para el precursor poliproteico Gag el cual se ensambla en partículas virales en la membrana plasmática de la célula infectada. Gag es procesado por la proteasa viral en las proteínas maduras de la cápside: matriz (MA), cápside y nucleocápside. Sin embargo, se desconocía hasta el momento la contribución de cada uno de los dominios de Gag de FIV al ensamblado viral. Con el objeto de estudiar el proceso de ensamblado de FIV, utilizamos el sistema del virus vaccinia para producir la formación de partículas a través de la expresión del gen gag. Los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica realizados con células infectadas con este virus vaccinia recombinante demostraron que la poliproteína Gag de FIV se autoensambla en partículas con morfología lentiviral que son liberadas al medio extracelular. Para estudiar el rol de la proteína MA de FIV en la morfogénesis viral, se construyeron virus vaccinia recombinantes lleando mutaciones en este dominio del gen gag de FIV. La caracterización del fenotipo de estas proteínas Gag mutadas llevó a la identificación de dominios en la MA de FIV necesaios para el transporte de Gag a la membrana plasmática y para el ensamblado de partículas virales. Por otra parte, se decidió estudiar la relación estructural y funcional que existe entre la proteína MA de FIV y la del virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), caracterizando el fenotipo de ensamblado de virus quiméricos derivados de SIV o FIV, en los que se reemplazó total o parcialmente el dominio MA de un virus por el del otro. El reemplazo total de la MA de SIV por su equivalente de FIV (quimera SIV[MA FIV1-130]) interfiere con el ensamblado de Gag en viriones. La poliproteína quimérica Gag SIV(MA FIV1-130) no se asocia eficientemente a membranas a pesar de miristilarse en igual nivel que el precursor Gag de SIV. El defecto en el ensamblado de la proteína Gag SIV(MA FIV1-130) es revertido por mutaciones que incrementan el carácter básico de la MA de FIV (mutación G31K/G33K) o por la coexpresión con el precursor Gag salvaje de SIV. Esto último indica que la proteína Gag quimérica mantiene la capacidad de establecer interacciones Gag-Gag. Por otro lado, las proteínas Gag quiméricas SIV(MA FIV1-36) y SIV(MA FIV37-130) en las que se sustituyó parcialmente el dominio MA de SIV por la región equivalente de FIV, se ensamblan en viriones con la misma eficiencia que el precursor Gag salvaje de SIV. Sin embargo, estos viriones son incapaces de incorporar la glicoproteína viral de envoltura y resultan significativamente menos infecciosos que el virus SIV salvaje. Finalmente, se construyó el virus quimérico FIV(MA SIV1-130) que contiene la MA de SIV en reemplazo de la de FIV. Este virus quimérico no sólo se ensambla eficientemente en viriones, sino que además es capaz de replicarse en una línea celular linfoidea felina. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen así a comprender la homología funcional que existe entre las proteínas MA de lentivirus evolutivamente distantes.

Descripción: El órgano vomeronasal (OVN) es una estructura quimiorreceptora presente en lamayoría de los mamíferos. No hay estudios sobre este órgano en el Orden Xenarthra. En lapresente Tesis Doctoral, se realiza un estudio de las características ultraestructurales ylectinohistoquímicas de este órgano. Se propone el uso del diclobenil como instrumento útilpara el estudio de la dinámica celular del mismo. También se propone a la Proteína G comomarcadora de neuronas en diferente estado de desarrollo. Además, se caracteriza cualitativay cuantitativamente la actividad bioeléctrica de los bulbos olfatorios y la neocorteza frontalde animales con desaferentación vomeronasal. Los hallazgos morfológicos y fisiológicospresentados, constituyen la base indispensable para ulteriores estudios sobre los factoresque regulan la dinámica celular y la neoformación neuronal. Por último, se suministranevidencias de una nueva función del OVN relacionada con la neurofisiología del Sueño. Esto abre nuevas e inesperadas perspectivas para la investigación del papel fisiológico deeste órgano.

Descripción: Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista el cual posee múltiplesmecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y una variedad defactores de virulencia que contribuyen al desarrollo de infección en diversos sitios. Lasinfecciones por S. aureus se caracterizan por una fuerte respuesta inflamatoria mediada porla presencia de neutrófilos que son reclutados al sitio de la infección. Se ha demostrado el rolcrítico de la proteína A (SpA) en el desarrollo de neumonía mediante la inducción de lascascadas de señalización de TNF-α e IFN-β, las cuales conducen a la producción demediadores inflamatorios y al reclutamiento de neutrófilos. Asimismo SpA induce cascadasde señalización pro-inflamatorias en células mieloides y en células no inmunes. El objetivo general del presente trabajo fue determinar el rol de la proteína A de S. aureus en la activación y secreción de mediadores pro-inflamatorios en neutrófiloshumanos así como su capacidad de regular la sobrevida de los mismos. Se demostró que S. aureus y la proteína A contribuyen a modular el perfil inflamatorio de los neutrófilos enforma temprana mediante la inducción de citoquinas inflamatorias y quimioquinas. S. aureusindujo la activación de MAPKs contribuyendo a la producción de IL-8 y TNF-α por losneutrófilos. El estímulo con S. aureus provocó además la expresión sostenida de señalespro-inflamatorias hasta las 22 horas luego de la estimulación. La exposición prolongada delos neutrófilos a S. aureus indujo un aumento en los niveles de mortalidad y cambios en laproporción de neutrófilos apoptóticos/necróticos con un incremento de la proporción denecrosis. No obstante, la expresión de SpA resultó crítica para prevenir parcialmente lanecrosis masiva de los neutrófilos favoreciendo la muerte por apoptosis. Nuestros resultadossugieren que la proteína A de S. aureus desempeñaría un rol pro-inflamatorio durante elencuentro inicial con los neutrófilos lo cual contribuiría a la inducción de un microambientepro-inflamatorio incrementando la sobrevida de los neutrófilos. En estadios posteriores, laexpresión de proteína A desempeñaría un rol anti-inflamatorio ya que contribuiría a prevenirla necrosis masiva y disminuir los efectos deletéreos que la inflamación exacerbada podríatener sobre la bacteria.

Descripción: Las células deben sensar y responder a cambios en su ambiente para poder sobrevivir,reproducirse y desempeñar sus funciones fisiológicas. En particular, las células eucariotasusan muchos y variados mecanismos a en de transducir señales del exterior al interior dela célula. Uno muy importante es el que involucra a receptores acoplados a proteínas Gheterotriméricas. Estos receptores de siete pasos de membrana, al ser ocupados por susligandos, catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα de la proteína G asociada, lo que causa la disociación de la proteína G heterotrimérica en Gα y Gβγ. La respuesta a feromona sexual de levaduras es un sistema prototípico de este tipo demecanismos, muy estudiado bioquímica y genéticamente. En esta vía de transducción deseñales, la proteína de andamiaje Ste5 se une a Gβγ libre, lo que causa su reclutamientoa membrana y la activación de una cascada de MAP kinasas, resultando en arresto delciclo celular y cambios en el patrón de expresión génica. Las curvas dosis-respuesta (DoR)a feromona medidas en distintos puntos de la vía de transducción, como ocupación delreceptor, fosforilación de la MAPK del sistema o inducción transcripcional, muestran unasensibilidad muy similar, un fenómeno al que llamamos alineamiento de las curvas dosis-respuesta (DoRA). En esta tesis estudiamos de manera cuantitativa los primeros pasos en la activación dela respuesta a feromona en levaduras; la ocupación del receptor, la activación de la proteína G heterotrimérica y el reclutamiento a membrana de Ste5. Encontramos que el sistema esnotablemente robusto a variaciones en la cantidad de receptores, algo que no es fácilmenteexplicable por la teoría clásica de receptores. Estudiamos el mecanismo responsable deesta robustez, cuyo punto de acción pudimos mapear río arriba del reclutamiento de Ste5. Construimos un modelo matemático completo de la interacción entre el receptor y laproteína G: el modelo Carrousel. El análisis del mismo nos sugirió un mecanismo por elcuál el sistema puede medir la fracción de receptores ocupados en lugar de la cantidadde los mismos, lo que además explica el fenómeno de DoRA. Este mecanismo depende dela interacción fósica reportada entre la proteína RGS (reguladora de la señalización porproteína G, que inactiva al sistema) y el receptor (que lo activa). Pudimos probar quecepas mutantes en las que esta interacción no está presente, no muestran robustez a lacantidad de receptores. Por otro lado medimos curvas DoR del cambio de localización de Ste5 en células concantidades variables de Ste5. En base a esta información pudimos estimar la afinidad entreesta proteína de andamiaje y sus sitios de unión a membrana en células vivas, y cómo estaafinidad se modula durante la respuesta. Además, estudiamos el efecto de cambios en laabundancia de Ste5 sobre la respuesta, encontrando que la cantidad de esta proteína esun parámetro crítico del sistema.

Descripción: Los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) son O-glicoproteínas localizadas en las paredes celulares que se expresan ampliamente en todas las especies del Reino Vegetal, desde las algas verdes hasta las plantas vasculares. Los AGPs pertenecen a la superfamilia de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGP), que son postraduccionalmente modificadas de dos maneras, losresiduos de prolina se convierten en hidroxiprolina por hidroxilación enzimática, y luego la hidroxiprolina es O-glicosilada con arabinogalactano (AG). Los AGPs contienen un péptido señal en el extremo amino terminal, y la mayoría de ellos están unidos a la membrana plasmática a través de un anclaje de tipo glicosilfosfatidil-inositol (GPI) codificado en el extremo carboxilo terminal. En Arabidopsis thaliana, se han descrito 42 genes que codifican para diferentes tipos de AGP que se clasifican como AGP clásicos cuando el péptido maduro incluye sólo el dominio O-glicosilado. Un sub-tipo de AGPs clásicos son denominados AG-péptidos, en los que el O-arabinogalactano (AG) es unido a un péptido de sólo 10 a 13 aminoácidos de longitud, que determina la función de la proteína madura. En ese caso, el péptido actúa como una proteína de andamiaje para exponer su AGen la superficie de la célula. En este trabajo se estudió el rol biológico del AG-péptido 21 (AGP21) de Arabidopsis thaliana en el programa de desarrollo de las raíces. El AGP21 se determinó como un gen altamente expresado en las células epidérmicas de la raíz y, a su vez, la falta de los transcriptos que en lasplantas mutantes agp21 produce una alteración en el programa de desarrollo del pelo radical y en la expansión en la célula epidérmica. Además, se demostró que la expresión de AGP21 está regulada directamente por el factor de transcripción BZR1 de la vía Brasinoesteroide (BR). Los fenotipos asociados con la interrupción de la vía de señalización BR son similares a los encontrados en el mutante agp21 y en las raíces bloqueadas con el reactivo específico que se une a AGPs llamadobeta-glucosil-yariv. En estos casos, se observó un patrón de expresión anómalo en las células epidérmicas, los factores de transcripción que determinan la diferenciación del pelo radical, tales como GL2 (Glabra 2), RHD6 (Root Hair Defective6) y RSL4 (Root Hair Defective6-like 4). En base a los resultados obtenidos, se sugiere que AGP21 estaría actuando al menos parcialmente en lavía de señalización BR para la diferenciación celular de los pelos radicales, en la planta modelo Arabidopsis thaliana.

Descripción: Breast cancer represents the most common kind of cancer in women and it is estimatedthat more than one million new cases are diagnosed each year worldwide. It is a complexdisease, which presents a variety of subgroups with different genetic and histopathologicfeatures and therefore with different responses to treatments. Multiple signaling pathways are involved in malignant progression. Some of them arepromising targets for therapeutic intervention, including protein kinase C (PKC), involvedin cellular events such as proliferation, differentiation and apoptosis and the retinoidsystem, widely implicated in cell differentiation. Since different mammary malignancies exhibit differential expression of PKC isoforms, wehave developed (human and murine) mammary cell models overexpressing α or δ PKCisoforms. Using these models we studied how PKCα or PKCδ alters cell parametersassociated with tumor progression and metastatic dissemination while we assessed theresponse to treatment with retinoids (ATRA). Our results suggest that PKCα overexpression confers to the cells a retinoic acid-sensitivephenotype, through an arrest in the G0 / G1 phase of the cell cycle. Overexpression of PKCδ, in MDA-MB231 cells, induced a less aggressive phenotype, significantly reducing itsinvasive capability. Finally the lack of response of this cell line to ATRA treatment could bedue to the inability to trans-repress AP-1 sites.

Descripción: El objetivo de esta tesis fue caracterizar el papel de lactoferrina (LF) y otros factores solubles endógenos, en la defensa de la glándula mamaria contra la infección. También, se buscó analizar la potencial aplicación de estos elementos para el diagnóstico y la predicción de la mastitis bovina y para la generación de ganado resistente a esta enfermedad. Para abordar estos objetivos se realizaron estudios bioquímicos, microbiológicos y epidemiológicos que se presentan en 4 apartados de resultados. En el primer apartado de resultados se propuso estudiar la relación entre el incremento de los niveles de LF asociados a la infección intramamaria y el agente causal involucrado. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de LF aumenta con la infección clínica o subclínica y que la infección con Streptococcus uberis está asociada a mayores niveles de LF en leche. Además se demostró que Strep. uberis es capaz de inducir la síntesis de LF in vitro y que este microorganismos es resistente a LF, lo que estaría indicando una asociación entre la respuesta mediada por LF a la infección y la sensibilidad a LF de los patógenos. En el segundo apartado de resultados se profundizaron los hallazgos del primero realizando un estudio de cohorte de 80 vacas durante una lactancia completa. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la respuesta de LF es mayor en los primeros días de lactancia; que los cuartos mamarios positivos para infecciones presentan también concentraciones de LF aumentadas antes y después de la infección y que cuartos con mayores concentraciones de LF durante el periparto presentan mayor riesgo de infectarse durante la lactancia. En el tercer apartado de resultados se analizó la actividad antimicrobiana de β- lactoglobulina (β-LG) sobre bacterias causantes de mastitis. Se demostró que β-LG inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Strep. uberis pero no el de Escherichia coli en forma dosis dependiente. Este espectro de inhibición parece complementario al de LF. Además, se hallaron diferencias de actividad específica entre dos variantes alélicas de β-LG: β- LG A y β-LG. Por último se demostró que LF y β-LG pueden actuar en conjunto para inhibir el crecimiento de Strep. uberis y Staph. aureus. En el cuarto apartado de resultados se realizaron digestiones enzimáticas de LF y los péptidos obtenidos fueron caracterizados bioquímica y microbiológicamente. Uno de estos péptidos, identificado como la molécula lactoferricina (LFcin), presentó mayor actividad antimicrobiana que LF y una cinética de inhibición diferente. El péptido LFcin fue expresado en forma recombinante como proteína de fusión con β-LG en células CHO. Esta proteína quimérica demostró alta actividad antimicrobiana contra Staph. aureus y Strep. uberis pero no contra E. coli. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis aportan información relevante sobre el papel de LF y β-LG en la infección intramamaria y sobre la potencial aplicación diagnóstica y terapéutica de estos elementos.

Descripción: Los tratamientos disponibles contra la Enfermedad de Chagas son poco efectivos ypueden presentar efectos secundarios severos. Existe una urgente necesidad de encontrarnuevos blancos moleculares y nuevas terapias antiparasitarias. El primer objetivo de estetrabajo consistió en la búsqueda de extractos naturales con capacidad de interrumpirinteracciones entre proteínas que participan en procesos esenciales del parásito y presentancaracterísticas divergentes respecto de su contraparte en humanos. El rastreo se realizósobre la interacción entre las proteínas p14 y Sf3b155 a través de un ensayo basado en latransferencia de energía resonante bioluminiscente (BRET). Contrariamente al objetivooriginal, encontramos que un extracto de Nardophyllum bryoides provocó un aumento de laseñal de BRET, lo cual reflejaría su capacidad de modular positivamente la interacción;asimismo, el extracto presentó propiedades antiproliferativas sobre cultivos de epimastigotes. Por otra parte, se planteó la identificación de nuevos blancos moleculares a partir de dosestrategias. La primera se basó en la caracterización de potenciales interacciones entreproteínas del parásito, en particular, a través de la búsqueda de ligandos de una proteínaexclusiva de T. cruzi, TcCLB.504427.180, que presenta dominios WW y podría participar endiversos procesos fisiológicos. La segunda, se enfocó en la búsqueda de nuevos efectoresde la vía del AMPc en T. cruzi. Si bien la primera estrategia no arrojó resultados positivos, elsegundo enfoque nos permitió demostrar que la proteína TcCLB.508523.80 es capaz de unir AMPc y que podría estar involucrada en la invasión de la célula hospedadora. Estasevidencias sugieren que TcCLB.508523.80 sería un novedoso sensor primario del AMPc enla biología del parásito.

Descripción: Las interacciones específicas entre proteínas gobiernan una gran parte de los procesos celulares y el desarrollo de compuestos con capacidad de modularlas resulta de gran interés para expandir las posibilidades terapéuticas accesibles en la actualidad. Rac1 pertenece a la familia Rho de GTPasas pequeñas y posee un rol central en la regulación de procesos celulares fundamentales. Su desregulación se ha establecido como un componente crucial en el desarrollo y la progresión tumoral, así como también en procesos de metástasis en varios tipos de cáncer. En el presente trabajo de Tesis se exploraron diversas estrategias con el objetivo de sintetizar potenciales inhibidores de interacción proteína-proteína (IPP) dirigidos a Rac1 y sus proteínas activantes, los factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs). En primer lugar, se sintetizó una familia de compuestos basados en N,N’-bis(aril)guanidinas de modo tal de extender los estudios de relación estructura-actividad realizados hasta el momento para este tipo de inhibidores. Adicionalmente, se exploraron estrategias basadas en la reacción multicomponente de Ugi con el objetivo de diseñar moléculas nuevas que posean fragmentos claves con capacidad de dirigirlas hacia el sitio de unión de interés. Las moléculas sintetizadas fueron evaluadas in vitro, tanto en ensayos fenotípicos como contra el blanco molecular. Los resultados obtenidos mostraron el potencial de las estrategias empleadas para desarrollar inhibidores de IPP, que permitieron diseñar moléculas novedosas con cualidades promisorias como agentes antitumorales.

Descripción: La Esferocitosis Hereditaria (ESH) es una anemia hemolítica de observación frecuente,caracterizada por alteraciones cuali y/o cuantitativas –genéticamente determinadas– de las proteínasde la membrana eritrocitaria. Consecuentemente, se debilita la unión entre la membrana eritrocitariay el citoesqueleto subyacente, produciéndose la pérdida progresiva de la membrana con formaciónde hematíes de forma esférica, osmóticamente frágiles, que son selectivamente atrapados ydestruidos en el bazo. Muchas alteraciones en diferentes genes pueden generar la mismaenfermedad. Clínicamente se caracteriza por anemia, ictericia y esplenomegalia. La ESH es la anemia hemolítica hereditaria más frecuente en Argentina. A pesar de ello, es muyescasa la información sobre su comportamiento en nuestro país. Los objetivos de esta tesis son: a) Investigar avances en la metodología de diagnóstico a partir del análisis e implementación denuevas pruebas que han sido desarrolladas durante la última década; b) Establecer aspectosdemográficos de la ESH en la población atendida por nuestro grupo de trabajo; c) Dilucidar algunosmecanismos involucrados en la enfermedad. En este trabajo se utilizaron las pruebas tradicionales (fragilidad osmótica eritrocitaria y prueba deautohemólisis) y se desarrollaron por primera vez en nuestro país las nuevas pruebas diagnósticas (citometría de flujo con 5’eosina maleimida, criohemólisis hipertónica y fragilidad osmótica porcitometría de flujo) estableciendo sus puntos de corte, sensibilidad, especificidad y valorespredictivos. El análisis de los resultados de los ensayos electroforéticos de las membranaseritrocitarias permitió establecer que las deficiencias de espectrina y ankirina son las prevalentes ennuestra población. En los casos en que fue posible, el estudio se extendió al grupo familiar primariopudiendo detectar portadores sanos y establecer el patrón de herencia. Para poder realizar el diagnóstico en forma precoz, se desarrollaron las nuevas pruebas utilizandosangre capilar, estableciendo la presencia de la patología en neonatos de hasta 2 días de vida. El seguimiento clínico permitió observar la alta frecuencia de crisis hemolíticas asociadas aepisodios febriles por lo que se decidió evaluar la posibilidad de que el agravamiento de la anemiafuera debido, en parte, a un efecto directo de la temperatura sobre los esferocitos. Se pudo observarque la hipertermia induce eriptosis mediada por la entrada de calcio a la célula, lo que podríacontribuir al empeoramiento de la anemia o al desarrollo de la misma en individuos asintomáticos. La heterogeneidad clínica no pudo relacionarse al tipo de alteración proteica ni a los resultados delas pruebas diagnósticas. En la búsqueda de una alteración en común que pudiera correlacionar conla severidad de la anemia encontramos una expresión disminuida de acuaporina 1 (AQP-1), canal responsable del flujo de agua en el eritrocito, independientemente de la proteína de membranaafectada. El trabajo de tesis presentado implica un avance metodológico por haber desarrollado las nuevastécnicas diagnósticas en nuestro país y haber establecido la equivalencia para realizar los estudioscon sangre capilar, conduciendo a un diagnóstico certero y precoz en los neonatos. Los antecedentesy el seguimiento clínico permitieron describir el comportamiento de la enfermedad en los pacientespertenecientes a nuestra población. Por otra parte, los estudios in vitro, que mostraron sensibilidad de los eritrocitos de los pacientes ala temperatura y asociación de la disminución de AQP-1 en eritrocitos con la severidad de laenfermedad, abren un nuevo camino en la investigación de la esferocitosis hereditaria con unapotencial aplicación terapéutica a futuro.

Descripción: El objetivo de este trabajo fue estudiar el impacto de la incompatibilidad/compatibilidad termodinámica entre las proteínas del lactosuero y diferentes hidroxipropilmetilcelulosas, sobre las transiciones térmicas de las mezclas deshidratadas de dichos biopolímeros, la formación de los geles mixtos, las propiedades de las películas interfaciales mixtas, y el fraccionamiento de las proteínas lactoséricas. En todas las experiencias se caracterizó, previamente, el comportamiento de los componentes solos. Los resultados demostraron que los sistemas ternarios WPC/HPMC/agua se comportan como una emulsión agua-en-agua, donde la micro-estructura de la misma está determinada por la relación de volúmenes entre las fases segregadas. En el caso de las transiciones térmicas se observó que las mezclas compatibles (sin separación de fases) presentaron una única temperatura de transición vítrea (Tg) que se ajustó con modelos previamente descriptos en literatura. Por el contrario, las mezclas acuosas que presentan una separación total (incompatibilidad) o parcial de las fases (compatibilidad limitada), la Tg quedó determinada por la morfología y el grado de segregación de las fases. Así mismo, se encontró que dicha micro-estructura define tanto el comportamiento reológico (carácter sólido, G’; viscoelasticidad relativa, tan δ) como las características macroestructurales (dureza) de los geles mixtos los cuales están determinados por el componente (WPC o HPMC) que constituye la fase continua. Sin embargo, la temperatura de gelificación (Tgel), al igual que la temperatura de transición vítrea (Tg), quedó determinada por la morfología y el grado de separación de fases. Por otra parte, las mezclas de proteínas del lactosuero (β-lactoglobulina) e hidroxipropilmetilcelulosas (E50LV) en condiciones de limitada compatibilidad termodinámica y concentraciones que permiten la saturación de la interfase por ambos biopolímeros, presentaron un comportamiento competitivo en la interfase aire-agua, modulado por el pH. Debido a su mayor carácter tensioactivo y buenas propiedades formadoras de películas, la HPMC dominó tanto la presión superficial como las propiedades reologicas de las películas interfaciales. Finalmente, se demostró la capacidad de los “sistemas acuosos de dos fases” (ATPS, Aqueous Two-Phase Systems) constituidos por WPC/HPMC, para fraccionar las proteínas lactoséricas de bajo PM (α-lactalbúmina y β-lactoglobulina). En términos generales, este trabajo aporta al conocimiento del entendimiento de las interacciones entre proteínas y polisacáridos y su posible aplicación tanto en el campo científico como en el tecnológico.

Descripción: Las vacunas contra la fiebre aftosa inducen anticuerpos contra las proteínasestructurales y contra algunas proteínas no estructurales presentes en dichaspreparaciones. Con el objeto de diferenciar animales infectados con el VFA devacunados, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectaranticuerpos contra una proteína no estructural del VFA. La proteína no estructural 3AB1 fue expresada en bacterias y en células de insecto y posteriormente utilizadapara la detección de anticuerpos anti-3AB1. Los estudios realizados por ELISA y “Western blot" mostraron que sueros de bovinos infectados reaccionan con laproteína no estructural 3AB1 mientras que sueros de bovinos vacunados, sueros debovinos sin infectar y sueros de animales infectados con diferentes virus bovinos noreconocen dicha proteína. Sin embargo, se hallaron anticuerpos contra el antígeno VIA (antígeno asociado a la infección viral), tanto en animales vacunados como eninfectados. La detección de anticuerpos anti-3AB1 en sueros de animalesinfectados experimentalmente entre los 7 y los 560 días post-infección indica quelos ensayos basados en la utilizaciónde la proteína no estructural 3AB1 pueden seraplicados al diagnóstico de la fiebre aftosa.

Descripción: - El dibutiril - cAMP y los análogos de cAMP específicos para el sitio 2 de lasubunidad regulatoria de la proteína quinasa A inhiben el crecimiento polarizadoen el hongo Mucor rouxii en forma dosis dependiente, sin alterar los parámetrosde crecimiento. - Este efecto se observa en todas las condiciones nutricionales oambientales ensayada; puede lograrse también con inhibidores de lafosfodiesterasa de alta afinidad para cAMP. El efecto es reversible. - Los resultados experimentales sugieren que la proteina quinasa A estáinvolucrada en esta inhibición y que la especificidad de los compuestos paraproducirla depende de las altas concentraciones enzimáticas presentes en lossistemas vivos. - Se postula la necesidad de una actividad especifica crítica de la proteínaquinasa A. la cual debe ser alcanzada por las células para germinar. - El tratamiento con inhibidores de los microfilamentos produce las mismasalteraciones morfológicas. observadas al microscopio óptico, que los análogos decAMP. - El análisis por microscopía electrónica de la ultraestructura de la paredcelular revela que presenta alteraciones e irregularidades. - Estas alteraciones son similares a los efectos producidos por tratamientocon inhibidores de la polimerización de actina en hongos de especiesrelacionadas (datos de la literatura). Estas observaciones sugieren que laproteína quinasa A podría actuar a través de un mecanismo que involucre alcitoesqueleto de actina.

Descripción: Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la informaciónexistente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo selleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye lainformación 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado deestructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estosúltimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuidahomogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existenfragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegadofinal, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de laestructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden serremovidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βLcomo modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteínacorrectamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aúnen trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no poseepuentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es unmodelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topologíamedianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de laestructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vistacinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas tambiénse estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas atal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegadopor GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmenteplegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantespara el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estadosparcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructuradoen dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización nocoincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos escompatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de laβ-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar lainterdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por lahélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizarontres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados debacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario,dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14,demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirirestructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia deresiduos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia noimpide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, queestá conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructurasecundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulofundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad dereplegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuoseliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampascinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través delestado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literaturareferidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan unplegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que lacadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local enla secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían unpapel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que lacadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado.

Descripción: El desarrollo de las plantas es un proceso que ocurre bajo fluctuaciones del ambiente lumínico que son percibidas por fotorreceptores específicos, principalmente los fitocromos phyA y phyB, y los criptocromos cry1 y cry2. El estudio de las respuestas de mutantes simples y múltiples de fotorreceptores en diferentes condiciones lumínicas es una herramienta muy útil para analizar las vías de señalización. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal estudiar los mecanismos moleculares y bioquímicos de la transducción de señales lumínicas mediadas por fitocromos y criptocromos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana. En el primer capítulo estudiamos la participación de la subunidad α de la proteína G heterotrimérica (GPA1) en los caminos de señalización de los fotorreceptores. Los mutantes cry1 fueron los únicos simples mutantes que mostraron una reducción en la unión de GTPγS35, a niveles similares a los observados en el mutante gpa1. Hallamos interacción génica entre cry1 y GPA1 en la apertura del gancho apical en oscuridad y en la acumulación de antocianas en luz azul. Estas respuestas fueron dependientes de la presencia de sacarosa en el medio. Análisis moleculares nos llevaron a proponer un modelo en el que la posible modificación posttraduccional de GPA1 mediada por cry1 alteraría su actividad. En el segundo capítulo realizamos un estudio comparativo de los perfiles proteicos entre plántulas cuádruples mutantes phyA phyB cry1 cry2 y plántulas salvajes utilizando la técnica de geles bidimensionales. La identificación de proteínas sub-expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con la drástica reducción en la tasa fotosintética, el contenido de clorofila y el concomitante retraso en el desarrollo del mutante. Las proteínas sobreexpresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 estuvieron involucradas en respuesta a estrés por temperatura y por sequía. Sin embargo, sólo la expresión de éstas proteínas no permitió explicar el comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 en condiciones de estrés. La reducción en la cantidad relativa de ácidos grasos insaturados de las membranas del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con una mayor sensibilidad a un shock de bajas temperaturas y una mayor tolerancia a un shock de altas temperaturas. Las posibles significancias fisiológicas y ecológicas de estos resultados son discutidas en esta tesis.