Descripción: Las modificaciones post-traduccionales proveen mecanismos de respuestas rápidas frente a estímulos en contraste con la reprogramación génica que ocurre en una mayor escala temporal. La fosforilación es una modificación frecuente en la transducción de señales lumínicas en plantas. Con el objetivo de identificar aquellas proteínas cuyo estado de fosforilación cambia en respuesta a la luz, se llevó a cabo un estudio a gran escala de LC-MS/MS sobre el fosfoproteoma de plántulas etioladas de Arabidopsis thaliana inducidas por luz a tiempos cortos. Logramos identificar 37 proteínas cuyo estado de fosforilación cambia con la luz. Dado nuestro interés en la transducción de señales mediadas por fotorreceptores, nos enfocamos en 5 de estas proteínas cuya fosforilación es regulada por luz y dependiente de fotorreceptores. Una de ellas es CIP7 (“COP1-INTERACTING PROTEIN 7”), una proteína descripta en un único reporte como un factor de transcripción de localización nuclear que interacciona con el represor de la fotomorfogénesis COP1 (“CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 1”), y cuyo transcripto es inducible por luz. En nuestro ensayo, la Serina 915 de CIP7 sufre una desfosforilación inducida por luz en presencia de al menos alguno de los cuatro fotorreceptores más importantes durante la desetiolacion de plántulas (fitocromo A, fitocromo B, criptocromo 1 y/o criptocromo 2). Para estudiar si CIP7 participa en eventos tempranos de fotomorfogénesis, llevamos adelante su caracterización funcional y fisiológica. Reporteros transcripcionales pCIP7::GUS en plántulas etioladas de 5 días, revelaron que el promotor de CIP7 es activo en oscuridad en cotiledones y zonas de elongación de hipocotilo y raíz. Estos ensayos junto con resultados de experimentos RT-qPCR mostraron que la exposición prolongada a la luz inhibe la expresión de CIP7. Análisis de co-localización, revelaron que CIP7-YFP se localiza en microtúbulos corticales. También observamos que mutantes por CRISPR-Cas9 de CIP7 pierden la capacidad de elongar el hipocotilo en oscuridad. Estos resultados difieren de aquel anteriormente propuesto y sugieren que CIP7 sería un promotor del crecimiento del hipocotilo en oscuridad mediante la regulación de la dinámica de microtúbulos.

Descripción: La proteína de 24 kDa (p24) del potato virus X (PVX) es una de las tresproteínas responsables del transporte de este virus en plantas infectadas. Eneste trabajo de Tesis se obtuvieron anticuerpos específicos contra p24, con loscuales se pudo detectar y caracterizar su expresión en protoplastos y en tejido deplantas de tabaco infectadas. También, se obtuvieron plantas transgénicas queexpresan p24 y que pueden complementar el transporte de un mutante de PVXdefectivo en este gen. Las plantas transgénicas que producen altos niveles dep24 presentan un fenotipo alterado, que consiste en plantas enanas y cloróticas. Estas plantas mostraron resistencia a la infección con los tobamovirus tobaccomosaic virus (TMV)y tomate virus Ob (ToMV-Ob). Sin embargo, cuando se lasinfectó con PVX o con el potato virus Y (PVY), no mostraron diferencias en losniveles de virus con respecto a las plantas no transformadas, aunque lossíntomas de infección con PVX fueron más severos. Recíprocamente, las plantastransgénicas que expresan la proteína de movimiento (MP) de TMV mostraronresistencia a PVX cuando se inocularon con este virus. Por último, se realizaronestudios de complementación entre mutantes de TMV y de PVX defectivos entransporte, con las plantas transgénicas que expresan p24 y la MP de TMV, paraestudiar el grado de interacción entre los sistemas de transporte de ambos virus.

Descripción: Toda sucesión de aminoácidos forma una cadena lineal, pero sólo una minúscula fracción de esas cadenas puede adquirir ciertas estructuras tridimensionales estables en las condiciones apropiadas. Este proceso, denominado plegado, es característico de los polipéptidos que realizan actividades biológicas específicas en los organismos vivos: las proteínas naturales. La hipótesis central de este trabajo es que es posible comprender las relaciones entre las secuencias, la termodinámica de plegado y función biológicas utilizando las señales que ha dejado la evolución en las secuencias naturales. En particular, nos focalizamos en las proteínas repetitivas que constituyen un sistema privilegiado para enfrentarse al problema del plegado. Comenzamos construyendo, curando y analizando un set de datos de secuencias naturales con 1.2 millones de regiones Ankirinas, la familia repetitiva más numerosa. Encontramos que estas proteínas no están formadas por repeticiones de secuencia ordenadas al azar, sino que existen correlaciones características entre las unidades. En particular, los arreglos de repeticiones más largos están formados por repeticiones más similares entre sí. Utilizamos el set de secuencias naturales para aprender un modelo estadístico que infiera las restricciones evolutivas sobre arreglos repetitivos de distinto largo. Proponemos una familia de modelos que incorporan además de mutaciones puntuales, duplicaciones y eliminaciones de repeticiones completas. Encontramos que para reproducir los patrones de correlación entre repeticiones de arreglos naturales es necesario incorporar un mecanismo de ráfagas de duplicaciones que ponen al sistema fuera del equilibrio. Finalmente, proponemos un esquema para mapear localmente la información evolutiva de una secuencia en un modelo de Ising de grano grueso que describe el plegado de proteínas repetitivas. Logramos caracterizar la termodinámica de plegado de miles de proteínas de la familia Ankirina, utilizando solamente información de secuencia. Generamos curvas de plegado térmico y encontramos dominios e intermediarios de plegado que resultan altamente compatibles con resultados experimentales. Encontramos una gran variedad de mecanismos de plegado y demostramos que la estabilidad y la cooperatividad de un arreglo de repeticiones se pueden estimar directamente de las secuencias con un score energético sencillo.

Descripción: El CCl4 afectó a proteínas por distintos mecanismos. In vivo disminuyó transitoriamente laincorporación de (14)C-Leucina a proteínas nucleares (totales y distintas fracciones proteicas) y microsomaleshepáticas de rata, siendo el efecto máximo a la hora. La cicloheximida causó un efecto similar. Los metabolitos reactivos del CCl4 (tridonometilo ('CCl3) y triclorometilperoxilo (CCl3O2'))formados por activacióncon luz ultravioleta C (UVC)causaron el aumento de grupos carbonilos (↑CO)yla disminución del contenido de grupos sulfhidrilo (↓SH) en albúmina de huevo (alb) y el ↑CO en 20aminoácidos. El ↑CO en alb fue parcialmente inhibido por Trolox y EDTA pero no α-tocoferol. Losmetabolitos del CCl4;formaron HCCl3 por reacción con alb (parcialmente inhibido por Trolox) y cisteína,posiblemente por abstracción de hidrógeno, la luz UVC per se ↑CO,abrió el puente disulfuro, pero casino afectó los SH de la alb. El 'CCl3 y el CCl3O2 ↑CO y ↓SH en proteínas microsomales in vitro, por acción directa o víaproductos de peroxidación de lípidos (PL) ya que fue parcialmente inhibido por antioxidantes y EDTA. No afectaron los CO y SH de proteínas nucleares, mitocondriales y citosólicas in vitro. El NADPH in vitro (probablemente vía PL) ↑CO y ↓SH de proteínas microsomales y nucleares, pero no mitocondriales Produjo ↑SH pero no de CO de compustos citosólicos. El CCl4 in vivo aumentó transitoriamente el contenido de CO de proteínas microsomales pero node nucleares hepáticas de rata. Las alteraciones causadas por los metabolitos reactivos del CCl4 en proteínas permitirían explicaralgunas de las alteraciones observadas en la intoxicación por CCl4(pérdida de funciones celulares, daño ala bomba de calcio del retículo endoplásmico),que podrían causar la muerte o desencadenar mecanismosde protección celulares.

Descripción: En años recientes un gran número de trabajos se han enfocado a estudiar la forma de reducir la elevada absorción de lípidos, asociada a numerosos problemas de salud, tales como obesidad y problemas cardiovasculares. Si bien las metodologías para abordar el tema son variadas, al ser la lipólisis una reacción interfacial (la lipasa debe adsorberse a la interfase para llevar a cabo la digestión de los lípidos), las interfases aceite/agua (tanto la estructura como el área interfacial) resultan un punto crítico a estudiar. Por tal motivo, el objetivo del presente trabajo consiste en evaluar el impacto que presentan diferentes estructuras interfaciales en el proceso digestivo con el propósito de encontrar aquella que retarde (o inhiba) la acción digestiva llevada a cabo por la lipasa pancreática. Se analizaron estructuras interfaciales y emulsiones estabilizadas por: proteínas (β-lactoglobulina (βlg) y aislado proteico de soja (SPI)) y polisacáridos (hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC)). Se desarrolló un modelo de digestión in vitro constituido por dos etapas: gástrica (1h, pH 2,5) y duodenal (1h, pH 7), que contemplan la presencia de las principales enzimas y biopolímeros a concentraciones fisiológicas. El estudio se realizó en dos niveles: (1) Estudios de digestión de interfases aceite/agua (tensiómetro interfacial de gota) para obtener información sobre cómo los fluidos característicos de la digestión perturban tales películas interfaciales, caracterizándolos mediante los parámetros: tensión interfacial y módulo dilatacional interfacial; (2) Estudios de digestión de emulsiones estabilizadas por los mismos emulsionantes obtenidas mediante la técnica de ultrasonidos de alta intensidad. Se analizaron los cambios microestructurales de las gotas de aceite (microscopía óptica y técnicas de dispersión de luz) y se monitoreó el porcentaje de ácidos grasos liberados (% AGL) por acción de la lipasa pancreática. Se comprobó que tanto las estructuras interfaciales como las emulsiones presentan diferencias en cuanto a la resistencia a la acción digestiva llevada a cabo por la lipasa. Estas vienen determinadas por la naturaleza de cada estructura y las característicasinterfaciales de cada una. Las emulsiones estabilizadas por SPI y HPMC mostraron los menores % AGL en comparación con las emulsiones de βlg. El comportamiento observado no presentó relación con el área interfacial expuesta a la lipasa, sino más bien a la capacidad que presenta cada emulsionante en dificultar la acción de las sales biliares (SB), agentes indispensables para la acción de la lipasa. De esta manera, los resultados permitieron identificar a las SB como un factor clave en la regulación del proceso. En términos generales, los resultados contribuyen al mayor entendimiento sobre los mecanismos involucrados en la digestión de emulsiones y del rol crucial que juegan las estructuras interfaciales en el control de la lipólisis.

Descripción: El objetivo de la tesis fue estudiar el impacto de la hidrólisis enzimática de las proteínas de soja en sus propiedades interfaciales, de espumado y en la interacción con polisacáridos en condiciones de limitada compatibilidad termodinámica. La hidrólisis de la proteína de soja (SP) produjo un aumento del carácter tensioactivo a concentraciones de subfase donde SP adopta una conformación más condensada en la monocapa. A concentraciones bajas en la subfase en las cuales SP adopta una estructura expandida en la monocapa, un bajo grado de hidrólisis (2%) también produjo un aumento del carácter tensioactivo. Sin embargo un mayor GH (5,35%) redujo la actividad superficial. La hidrólisis también mejoró la elasticidad dilatacional y la viscoelasticidad relativa de las películas a concentraciones menores a la de colapso de la monocapa (2%). La correlación entre las propiedades superficiales y las propiedades de las espumas, corroboró que efectivamente el GH que se debe lograr en la proteína de soja debe ser muy pequeño a fin de mejorar su CE sin perder las propiedades de gelificación interfacial necesarias para formar películas muy viscoelásticas que presenten una alta estabilidad al drenado de líquido y al colapso. El efecto de los polisacáridos en las propiedades de espumado dependió del grado de hidrólisis de la proteína y del tipo de polisacárido de una manera compleja siendo la estabilidad de las espumas la resultante entre la contribución del polisacárido a la viscosidad del seno de la fase continua y a la viscoelasticidad y/o elasticidad de las películas interfaciales. Tanto los polisacáridos tensioactivos como los no tensioactivos, influyeron en la interfase aire-agua, promoviendo una mejora de las propiedades de las películas cuando se usan en combinación con proteína de soja. La presión superficial y viscoelasticidad de las películas de la proteína menos hidrolizada aumentó en presencia de los polisacáridos, sin embargo la de la más hidrolizada se redujo o no se modificó. Esto indica que una hidrólisis limitada es suficiente para mejorar las propiedades de la interfase aire-agua cuando la proteína se usa en combinación con polisacáridos. El agregado combinado de kappa-carragenano e hidroxipropilmetilcelulosa resultó una estrategia adecuada para generar espumas en base a hidrolizados proteicos de soja, con una elevada estabilidad al drenado y colapso bajo condiciones de calentamiento, sin reducir el volumen de la espuma. Por otro lado, estas espumas bajo refrigeración presentan una alta estabilidad debido a la gelificación del carragenano.

Descripción: Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Descripción: Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiologíade la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado deuna respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de célulascardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerposde pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron lafrecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocerel segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondientea la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los delhospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuenciasaminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieranproducir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran paraproteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Seobtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid richprotein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm deaproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró unaidentidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, ysegún ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasmadel parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con laenfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteínarecombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de laproteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteínarecombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda laproteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de loscardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteracioneselectrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia deinmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejarmejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de losantígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser masadecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a puntoesta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaronanticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en lainfección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia delatidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteracioneselectrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueroninmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimosque la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocenepítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínasrecombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento degenerar una vacuna contra T. cruzi.

Descripción: El virus de inmunodeficiencia de felinos (FIV) es un lentivirus que causa en gatos domésticos un síndrome de inmunodeficiencia similar al SIDA de humanos. Por ello, el sistema FIV-gato doméstico es considerado un modelo adecuado para el estudio de las infecciones producidas por el virus de inmunodeficiencia de humanos (HIV). El gen gag de FIV, al igual que el del resto de los lentivirus, codifica para el precursor poliproteico Gag el cual se ensambla en partículas virales en la membrana plasmática de la célula infectada. Gag es procesado por la proteasa viral en las proteínas maduras de la cápside: matriz (MA), cápside y nucleocápside. Sin embargo, se desconocía hasta el momento la contribución de cada uno de los dominios de Gag de FIV al ensamblado viral. Con el objeto de estudiar el proceso de ensamblado de FIV, utilizamos el sistema del virus vaccinia para producir la formación de partículas a través de la expresión del gen gag. Los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica realizados con células infectadas con este virus vaccinia recombinante demostraron que la poliproteína Gag de FIV se autoensambla en partículas con morfología lentiviral que son liberadas al medio extracelular. Para estudiar el rol de la proteína MA de FIV en la morfogénesis viral, se construyeron virus vaccinia recombinantes lleando mutaciones en este dominio del gen gag de FIV. La caracterización del fenotipo de estas proteínas Gag mutadas llevó a la identificación de dominios en la MA de FIV necesaios para el transporte de Gag a la membrana plasmática y para el ensamblado de partículas virales. Por otra parte, se decidió estudiar la relación estructural y funcional que existe entre la proteína MA de FIV y la del virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), caracterizando el fenotipo de ensamblado de virus quiméricos derivados de SIV o FIV, en los que se reemplazó total o parcialmente el dominio MA de un virus por el del otro. El reemplazo total de la MA de SIV por su equivalente de FIV (quimera SIV[MA FIV1-130]) interfiere con el ensamblado de Gag en viriones. La poliproteína quimérica Gag SIV(MA FIV1-130) no se asocia eficientemente a membranas a pesar de miristilarse en igual nivel que el precursor Gag de SIV. El defecto en el ensamblado de la proteína Gag SIV(MA FIV1-130) es revertido por mutaciones que incrementan el carácter básico de la MA de FIV (mutación G31K/G33K) o por la coexpresión con el precursor Gag salvaje de SIV. Esto último indica que la proteína Gag quimérica mantiene la capacidad de establecer interacciones Gag-Gag. Por otro lado, las proteínas Gag quiméricas SIV(MA FIV1-36) y SIV(MA FIV37-130) en las que se sustituyó parcialmente el dominio MA de SIV por la región equivalente de FIV, se ensamblan en viriones con la misma eficiencia que el precursor Gag salvaje de SIV. Sin embargo, estos viriones son incapaces de incorporar la glicoproteína viral de envoltura y resultan significativamente menos infecciosos que el virus SIV salvaje. Finalmente, se construyó el virus quimérico FIV(MA SIV1-130) que contiene la MA de SIV en reemplazo de la de FIV. Este virus quimérico no sólo se ensambla eficientemente en viriones, sino que además es capaz de replicarse en una línea celular linfoidea felina. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen así a comprender la homología funcional que existe entre las proteínas MA de lentivirus evolutivamente distantes.

Descripción: Las proteínas son moléculas sumamente diversas, responsables de las más variadas funcionesbiológicas. Toda esta diversidad se encuentra codificada en las secuencias de aminoácidosque las constituyen. En este trabajo se aplican modelos cuantitativos, derivados de mecánicaestadística, que permiten derivar propiedades generales (o macroscópicas) del plegado proteicoa partir de su secuencia primaria (propiedades microscópicas). El trabajo se enfoca enel estudio de proteínas repetitivas, cuya simetría en secuencia y estructura, y propiedadesderivadas de ellas, las han puesto en el centro del estudio del plegado proteico y del dise˜node biomoléculas con aplicaciones biotecnológicas. En este trabajo, la simetría en secuencia de las proteínas repetitivas han permitido reducirla dimensionalidad del problema, permitiendo un ajuste fino de los parámetros del modeloque no es posible en proteínas globulares de gran tama˜no. Cada proteína (o estado) recibe unapuntuación o energía que se encuentra relacionada con la estabilidad del plegado, e inclusopermite estimar el efecto de mutaciones puntuales. Por otro lado, el modelo presentado esutilizado para generar ensambles de nuevas variantes que son indistinguibles respecto de lasproteínas naturales mediante algoritmos de caracterización de secuencia actuales. Los modelos desarrollados permiten derivar medidas de correlación entre sustitucionesde aminoácidos en proteínas. Como es esperable, estas correlaciones reflejan distintas propiedadesfuncionales y evolutivas. Los análisis aquí desarrollados permiten distinguir las correlacionesoriginadas en la alta simetría de las secuencias de proteínas repetitivas y aquellasque evidencian contactos en la estructura nativa.

Descripción: Los organismos muestran variaciones rítmicas de su fisiología, metabolismo y comportamiento. Estas oscilaciones, que ocurren cada 24hs, son controladas por un reloj circadiano endógeno y entrenadas por variables ambientales como la luz y la temperatura. En Drosophila este reloj está formado por neuronas que en conjunto conforman una red. La sincronización y comunicación entre los distintos grupos de neuronas circadianas tiene que ser precisa para generar un output coherente y también debe ser lo suficientemente flexible para poder responder a los cambios ambientales. Se han estudiado muchos mecanismos que permiten la coordinación entre distintos grupos circadianos; todos ellos involucran neurotransmisores y neuropéptidos. A lo largo de este trabajo se describe otro tipo de comunicación a través de ligandos de la familia de Bone Morphogenetic Protein (BMP), una vía de señalización retrógrada involucrada en el desarrollo temprano, organogénesis y el crecimiento. Sabiendo que en la placa neuromuscular (NMJ) de la larva de Drosophila afecta la sinaptogénesis, la morfología sináptica y el control de la homeostasis se propuso que las LNvs (large ventral neurons), consideradas el marcapaso central del reloj, podrían utilizar esta vía para modular outputs circadianos como el comportamiento, la plasticidad estructural y niveles de PDF. Los resultados obtenidos a los largo de este trabajo muestran que la vía de BMP es activa en las LNvs. Algunos de sus ligandos son utilizados para comunicar información temporal pudiendo afectar en estadios adultos la actividad locomotora circadiana y generar cambios en la remodelación de las terminales axonales (plasticidad estructural) sugiriendo que es reclutada en diferentes momentos del día para modular outputs del reloj.

Descripción: Phytomonas es un género de la familia Trypanosomatidae que parasita plantas. Si bien muchos de sus componentes no provocan daño a sus respectivos huéspedes, otros en cambio, son responsables de afecciones que acarrean pérdidas económicas. Tal es el caso de las palmas aceiteras en paises como Colombia, Venezuela y Guyana, el café en Brasil y algunos reportes de daño en algunos frutos como el tomate, tanto en Brasil como en España (Granada). La especie objeto de este estudio no es patogénica y corresponde a la aislada de Euphorbia characias (planta laticífera). Contiene una adenilil ciclasa unida a membranas y un sistema transductor de señales de proteínas G, del tipo Gs y Gi. Estas proteínas afectan la actividad de la adenilil ciclasa y posiblemente participan en un mecanismo que involucra a una señal de tipo hormonal. Si bien no existen evidencias directas de la existencia de un receptor, la proteína del tipo Gi es capaz de interaccionar con el peptido tóxico Mastoparán, que mimetiza la acción de los receptores acoplados a proteínas G. Se analizaron distintas fracciones subcelulares para caracterizar una actividad de quinasa de proteínas modulada por AMPc (PKA). Las fracciones subcelulares purificadas por cromatografía en DEAE-celulosa mostraton dos picos de actividad enzimática frente a histona IIA y a kémptido como sustratos. Usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad catalítica de PKA de corazón bovino, se inmunoprecipitó un polipéptido con un peso molecular de 40 kDa. Estos datos en conjunto sugieren la presencia de dos tipos de actividad de quinasa de proteína de pendiente de AMPc (tipo I y 11). Experimentos in vivo con toxina del cólera, dieron como resultado un arresto del ciclo celular del parásito, poniendo en evidencia un efecto ambiguo de la vía de señalización mediada por AMPc, que requerirá de futuros estudios para su profundización. Datos preliminares, aunque incompletos nos dan un primer indicio de la conservación de este tipo de vía en una cepa patógena (responsable del Hartrot de las palmas aceiteras). La extrapolación de los resultados anteriores, nos permitirán diseñar aquellos experimentos tendientes a tratar de develar dónde reside la diferencia de patogenicidad de ambas cepas.

Descripción: Virus patogénicos como Adenovirus, Papilomavirus y Poliomavirus poseen proteínas capaces de interactuar con el supresor de tumores Retinoblastoma (pRb), controlador central del ciclo celular eucariótico. Dichas interacciones se establecen en sitios utilizados por pRb para unir blancos endógenos como el surco A/B donde se une el factor de transcripción E2F y el surco LxCxE donde se unen proteínas que poseen el motivo LxCxE. Estos virus hacen mímica de motivos lineales de interacción altamente conservados, y generalmente presentes en regiones intrínsecamente desordenadas, para interferir efectivamente con la red celular y tomar el control de la célula huésped conduciendo en algunos casos a transformación celular y oncogénesis. La oncoproteína viral E1A del Adenovirus (AdE1A) es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) y se une a pRb a través de dos motivos lineales necesarios para desplazar a E2F, el motivo E2F y el motivo LxCxE, que se encuentran separados por una región de 70 residuos o “linker”. En este trabajo, sugerimos que ciertas características de esta proteína desempeñan un papel esencial en los mecanismos de desregulación de pRb. Dado el limitado conocimiento mecanístico y estructural de alta resolución con respecto a AdE1A, su interacción con pRb y la contribución de la región “linker” en esta interacción, nos propusimos caracterizarlos para revelar información que servirá para comprender mejor las interacciones virus-hospedador. En primer lugar, desarrollamos un protocolo de expresión recombinante de AdE1A y mutantes individuales de motivos, con rendimientos de 9 mg/L y pureza superior al 95%. Experimentos biofísicos evidenciaron que AdE1A es un monómero intrínsecamente desordenado con radio hidrodinámico extendido y migración anómala en gel. En segundo lugar, ensayos de interacción muestran que AdE1A se une a pRb con estequiometría 1:1 y una muy alta afinidad (KD = 24 pM). Aunque los sitios individuales unen a pRb con menor afinidad (≈ KD = 110nM) que la E2F celular (KD = 1 nM), el modelado del sistema como un arreglo de dos motivos unidos por un “linker” de longitud óptima y altamente flexible permite explicar la potenciación de su afinidad global y la efectividad de la proteína AdE1A en el desplazamiento de E2F. En tercer lugar, estudios estructurales de RMN permitieron la asignación completa de la cadena carbonada de AdE1A y su caracterización a nivel de estructura secundaria y propensiones conformacionales evidenciaron su naturaleza desordenada y flexible. AdE1A se une a pRb a través de dos sitios independientes conformados por residuos centrales de los motivos E2F y LxCxE modulados por residuos flanqueantes con función complementaria, más interacciones débiles en la región “linker”. El análisis de la región “linker”, sugiere que existe un fino balance entre repulsión de cargas y contactos hidrofóbicos débiles con pRb en regiones de interacción secundarias, las cuáles se encuentran altamente conservadas a nivel evolutivo y que contribuirían a su capacidad de interacción con múltiples blancos celulares. Los resultados del presente trabajo contribuyen a comprender las bases moleculares de las interacciones entre proteínas de virus y hospedador y los mecanismos mediante los cuales los virus toman control de la célula huésped, lo cual allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de etiología viral.

Descripción: La habilidad para recordar eventos pasados es esencial para numerosos comportamientos adaptativos. La evocación de la memoria es un proceso complejo que involucra la reactivación de la información previamente adquirida desde un estado latente a un estado que permite su expresión. Entender cómo la información guardada en el cerebro se expresa es una pregunta central de la neurobiología de la memoria. Sin embargo, la información sobre mecanismos moleculares que subyacen la evocación, incluyendo el requerimiento de síntesis proteica, es escasa y fragmentaria. El complejo mTORC1, un regulador clave de la síntesis proteica, ha sido implicado en procesos de plasticidad sináptica y su requerimiento ha sido reportado para la formación de la memoria. Utilizando la tarea de evitación inhibitoria (EI), evaluamos el rol de mTORC1 en la evocación de la memoria de largo término. La infusión de rapamicina, un inhibidor selectivo de mTORC1, en el hipocampo dorsal 15 o 40 minutos, pero no 3 horas antes del testeo realizado a 24 horas bloqueó reversiblemente la expresión de la memoria incluso en animales que previamente habían expresado memoria. La infusión de emetina, un inhibidor general de la síntesis proteica, provocó un bloqueo similar de la expresión de la memoria. La inhibición de mTORC1 no interfirió con la expresión de una memoria de corto término y en cambio, sí afectó una memoria de largo término testeada a los 7 o 14 días, pero no a los 28 días. El bloqueo de la vía de mTORC1 en la corteza retrosplenial, otra estructura involucrada en la memoria de la tarea de EI también bloqueó la retención de la memoria. Además, la infusión de rapamicina afectó la evocación de una memoria asociada a una tarea con distinta valencia, como el reconocimiento espacial de objetos. Luego, teniendo en cuenta estos resultados, decidimos evaluar los potenciales mecanismos a través de los cuales la vía de mTORC1 participa en la evocación de la memoria. Considerando que mTORC1 es necesario durante la consolidación para incrementar los niveles de la subunidad GluA1 de los receptores AMPA en la sinapsis, primero evaluamos si existían mecanismos similares subyacentes a la evocación de la memoria. La infusión intrahipocampal de oligonucleoótidos antisentido para GluA1, pero no de oligonucleótidos sin sentido para GluA1 3 horas del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento de la tarea de EI bloqueó la expresión de la memoria. El mismo resultado fue obtenido luego de la infusión de oligonucleótidos antisentido para GluA2 3 horas antes del testeo, evidenciando el requerimiento tanto de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA para la evocación de la memoria. Este bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la infusión de los oligonucleótidos antisentido para GluA2 pudo ser revertido por la infusión de GluA23ɣ, un péptido que interfiere selectivamente con la endocitosis de los receptores AMPA, 1 hora antes del testeo llevado a cabo a las 48 horas posteriores al entrenamiento. Luego repetimos este experimento de doble infusión para GluA1(infusión de los oligonucleótidos antisentido de GluA1 3 horas previas al testeo seguido por infusión del péptido 1 hora antes del testeo llevado a cabo 48 horas luego del entrenamiento) pero esta vez el bloqueo de la endocitosis no fue suficiente para compensar la inhibición de la síntesis de GluA1. Después decidimos estudiar el rol del tráfico de las subunidades GluA de los receptores AMPA durante la evocación de la memoria y su relación con la vía de mTORC1.Para ello realizamos un experimento de doble infusión intrahipocampal en el cual primero realizamos una infusión del péptido GluA23ɣ 1 hora antes del testeo en la tarea de EI, seguida por una infusión de rapamicina 30 minutos antes del testeo que se llevó a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento. Observamos que en este caso GluA23ɣ previno el bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la inactivación de la vía de mTORC1. En resumen, nuestro trabajo indica que tanto la síntesis de novo de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA es requerida para la evocación de la memoria y sugiere que la vía de mTORC1 podría regular el tráfico de los receptores AMPA durante la evocación. Finalmente, testeamos si la inactivación de la vía de mTORC1 afecta los niveles de las subunidades GluA1 y GluA2 de los receptores AMPA usando Western Blot. Realizamos experimentos en lo que infundimos vehículo o rapamicina a los animales 30 minutos antes del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento en la tarea de EI y se extrajo el hipocampo inmediatamente después de la evocación. Evaluando la fracción de densidad postsinátptica, enriquecida en membrana postsináptica, encontramos un aumento en los niveles de GluA2 y una caída de GluA1. En la fracción correspondiente a los sitios extrasinápticos (SPM) no encontramos cambios para GluA2 mientras que la caída en los niveles de GluA1 se mantuvo. Para el homogenato total no encontramos cambios en los niveles de expresión de ninguna de estas subunidades. Nuestros resultados apoyan la idea de que la síntesis proteica mediada por la activación de la vía de mTORC1 es necesaria para la evocación de la memoria de largo término. Además, nuestros hallazgos apuntan a mTORC1 como un regulador clave de la evocación de la memoria que impacta en la expresión de diferentes subunidades de los receptores AMPA.

Descripción: Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista el cual posee múltiplesmecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y una variedad defactores de virulencia que contribuyen al desarrollo de infección en diversos sitios. Lasinfecciones por S. aureus se caracterizan por una fuerte respuesta inflamatoria mediada porla presencia de neutrófilos que son reclutados al sitio de la infección. Se ha demostrado el rolcrítico de la proteína A (SpA) en el desarrollo de neumonía mediante la inducción de lascascadas de señalización de TNF-α e IFN-β, las cuales conducen a la producción demediadores inflamatorios y al reclutamiento de neutrófilos. Asimismo SpA induce cascadasde señalización pro-inflamatorias en células mieloides y en células no inmunes. El objetivo general del presente trabajo fue determinar el rol de la proteína A de S. aureus en la activación y secreción de mediadores pro-inflamatorios en neutrófiloshumanos así como su capacidad de regular la sobrevida de los mismos. Se demostró que S. aureus y la proteína A contribuyen a modular el perfil inflamatorio de los neutrófilos enforma temprana mediante la inducción de citoquinas inflamatorias y quimioquinas. S. aureusindujo la activación de MAPKs contribuyendo a la producción de IL-8 y TNF-α por losneutrófilos. El estímulo con S. aureus provocó además la expresión sostenida de señalespro-inflamatorias hasta las 22 horas luego de la estimulación. La exposición prolongada delos neutrófilos a S. aureus indujo un aumento en los niveles de mortalidad y cambios en laproporción de neutrófilos apoptóticos/necróticos con un incremento de la proporción denecrosis. No obstante, la expresión de SpA resultó crítica para prevenir parcialmente lanecrosis masiva de los neutrófilos favoreciendo la muerte por apoptosis. Nuestros resultadossugieren que la proteína A de S. aureus desempeñaría un rol pro-inflamatorio durante elencuentro inicial con los neutrófilos lo cual contribuiría a la inducción de un microambientepro-inflamatorio incrementando la sobrevida de los neutrófilos. En estadios posteriores, laexpresión de proteína A desempeñaría un rol anti-inflamatorio ya que contribuiría a prevenirla necrosis masiva y disminuir los efectos deletéreos que la inflamación exacerbada podríatener sobre la bacteria.

Descripción: Las células deben sensar y responder a cambios en su ambiente para poder sobrevivir,reproducirse y desempeñar sus funciones fisiológicas. En particular, las células eucariotasusan muchos y variados mecanismos a en de transducir señales del exterior al interior dela célula. Uno muy importante es el que involucra a receptores acoplados a proteínas Gheterotriméricas. Estos receptores de siete pasos de membrana, al ser ocupados por susligandos, catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα de la proteína G asociada, lo que causa la disociación de la proteína G heterotrimérica en Gα y Gβγ. La respuesta a feromona sexual de levaduras es un sistema prototípico de este tipo demecanismos, muy estudiado bioquímica y genéticamente. En esta vía de transducción deseñales, la proteína de andamiaje Ste5 se une a Gβγ libre, lo que causa su reclutamientoa membrana y la activación de una cascada de MAP kinasas, resultando en arresto delciclo celular y cambios en el patrón de expresión génica. Las curvas dosis-respuesta (DoR)a feromona medidas en distintos puntos de la vía de transducción, como ocupación delreceptor, fosforilación de la MAPK del sistema o inducción transcripcional, muestran unasensibilidad muy similar, un fenómeno al que llamamos alineamiento de las curvas dosis-respuesta (DoRA). En esta tesis estudiamos de manera cuantitativa los primeros pasos en la activación dela respuesta a feromona en levaduras; la ocupación del receptor, la activación de la proteína G heterotrimérica y el reclutamiento a membrana de Ste5. Encontramos que el sistema esnotablemente robusto a variaciones en la cantidad de receptores, algo que no es fácilmenteexplicable por la teoría clásica de receptores. Estudiamos el mecanismo responsable deesta robustez, cuyo punto de acción pudimos mapear río arriba del reclutamiento de Ste5. Construimos un modelo matemático completo de la interacción entre el receptor y laproteína G: el modelo Carrousel. El análisis del mismo nos sugirió un mecanismo por elcuál el sistema puede medir la fracción de receptores ocupados en lugar de la cantidadde los mismos, lo que además explica el fenómeno de DoRA. Este mecanismo depende dela interacción fósica reportada entre la proteína RGS (reguladora de la señalización porproteína G, que inactiva al sistema) y el receptor (que lo activa). Pudimos probar quecepas mutantes en las que esta interacción no está presente, no muestran robustez a lacantidad de receptores. Por otro lado medimos curvas DoR del cambio de localización de Ste5 en células concantidades variables de Ste5. En base a esta información pudimos estimar la afinidad entreesta proteína de andamiaje y sus sitios de unión a membrana en células vivas, y cómo estaafinidad se modula durante la respuesta. Además, estudiamos el efecto de cambios en laabundancia de Ste5 sobre la respuesta, encontrando que la cantidad de esta proteína esun parámetro crítico del sistema.

Descripción: La reconsolidación y la extinción de la memoria son dos procesos mnésicos funcionalmente relacionados, ya que ambos están involucrados en el procesamiento y almacenamiento de nueva información relacionada con un aprendizaje anterior. Sin embargo, ambos procesos están basados en mecanismos muy distintos. Mientras que la reconsolidación involucra una desestabilización y reestabilización de la traza del aprendizaje original, la extinción genera una nueva traza que compite con la anterior. Trabajos previos de nuestro laboratorio revelaron por primera vez una relación mecanística entre reconsolidación y extinción, mostrando que la presentación de un estímulo condicionado (CS) puede inducir uno u otro proceso dependiendo de su duración. En este trabajo revelamos nuevas características paramétricas que determinan la inducción de la reconsolidación y la extinción, la cinética con la que estos procesos ocurren, y un hipotético mecanismo que los vincula, que tiene lugar tras el fin del CS. Encontramos que (a) durante toda la presentación del CS la memoria original permanece intacta y consolidada, mostrando que ni reconsolidación ni extinción son inducidas hasta la terminación del CS, independientemente de su duración, (b) la presentación de un único refuerzo (US) durante la exposición al CS tiene la capacidad de prevenir la inducción tanto de la extinción como de la reconsolidación, (c) la extinción de la memoria ocurre pocos segundos después del fin del CS, y (d) reconsolidación y extinción son inducidos de forma mutuamente excluyente tras un único CS, pero ambos procesos pueden dispararse por sendos CSs y desarrollarse simultáneamente. Como resultado, presentamos un modelo que integra estos hallazgos, reflejando la dinámica e interrelación entre los procesos de reconsolidación y extinción de la memoria.

Descripción: Los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) son O-glicoproteínas localizadas en las paredes celulares que se expresan ampliamente en todas las especies del Reino Vegetal, desde las algas verdes hasta las plantas vasculares. Los AGPs pertenecen a la superfamilia de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGP), que son postraduccionalmente modificadas de dos maneras, losresiduos de prolina se convierten en hidroxiprolina por hidroxilación enzimática, y luego la hidroxiprolina es O-glicosilada con arabinogalactano (AG). Los AGPs contienen un péptido señal en el extremo amino terminal, y la mayoría de ellos están unidos a la membrana plasmática a través de un anclaje de tipo glicosilfosfatidil-inositol (GPI) codificado en el extremo carboxilo terminal. En Arabidopsis thaliana, se han descrito 42 genes que codifican para diferentes tipos de AGP que se clasifican como AGP clásicos cuando el péptido maduro incluye sólo el dominio O-glicosilado. Un sub-tipo de AGPs clásicos son denominados AG-péptidos, en los que el O-arabinogalactano (AG) es unido a un péptido de sólo 10 a 13 aminoácidos de longitud, que determina la función de la proteína madura. En ese caso, el péptido actúa como una proteína de andamiaje para exponer su AGen la superficie de la célula. En este trabajo se estudió el rol biológico del AG-péptido 21 (AGP21) de Arabidopsis thaliana en el programa de desarrollo de las raíces. El AGP21 se determinó como un gen altamente expresado en las células epidérmicas de la raíz y, a su vez, la falta de los transcriptos que en lasplantas mutantes agp21 produce una alteración en el programa de desarrollo del pelo radical y en la expansión en la célula epidérmica. Además, se demostró que la expresión de AGP21 está regulada directamente por el factor de transcripción BZR1 de la vía Brasinoesteroide (BR). Los fenotipos asociados con la interrupción de la vía de señalización BR son similares a los encontrados en el mutante agp21 y en las raíces bloqueadas con el reactivo específico que se une a AGPs llamadobeta-glucosil-yariv. En estos casos, se observó un patrón de expresión anómalo en las células epidérmicas, los factores de transcripción que determinan la diferenciación del pelo radical, tales como GL2 (Glabra 2), RHD6 (Root Hair Defective6) y RSL4 (Root Hair Defective6-like 4). En base a los resultados obtenidos, se sugiere que AGP21 estaría actuando al menos parcialmente en lavía de señalización BR para la diferenciación celular de los pelos radicales, en la planta modelo Arabidopsis thaliana.

Descripción: Breast cancer represents the most common kind of cancer in women and it is estimatedthat more than one million new cases are diagnosed each year worldwide. It is a complexdisease, which presents a variety of subgroups with different genetic and histopathologicfeatures and therefore with different responses to treatments. Multiple signaling pathways are involved in malignant progression. Some of them arepromising targets for therapeutic intervention, including protein kinase C (PKC), involvedin cellular events such as proliferation, differentiation and apoptosis and the retinoidsystem, widely implicated in cell differentiation. Since different mammary malignancies exhibit differential expression of PKC isoforms, wehave developed (human and murine) mammary cell models overexpressing α or δ PKCisoforms. Using these models we studied how PKCα or PKCδ alters cell parametersassociated with tumor progression and metastatic dissemination while we assessed theresponse to treatment with retinoids (ATRA). Our results suggest that PKCα overexpression confers to the cells a retinoic acid-sensitivephenotype, through an arrest in the G0 / G1 phase of the cell cycle. Overexpression of PKCδ, in MDA-MB231 cells, induced a less aggressive phenotype, significantly reducing itsinvasive capability. Finally the lack of response of this cell line to ATRA treatment could bedue to the inability to trans-repress AP-1 sites.