Descripción: Las mitocondrias juegan un papel vital en el metabolismo energético; en el interior se produce la fosforilación oxidativa en la cadena de transporte de electrones y la generación de equivalentes de reducción por el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). La deficiencia de hemo producida por una síntesis reducida o un catabolismo acelerado provocaría un daño celular grave. Anteriormente, demostramos que los agentes porfirinogénicos afectaban a varios metabolismos en cerebro de ratones cepa CF1 y en un modelo genético murino de Porfiria intermitente aguda (AIP). El objetivo general de esta tesis fue estudiar los mecanismos por los cuales los anestésicos volátiles alteran el metabolismo mitocondrial. Los objetivos específicos fueron: I) Dilucidar el efecto de los anestésicos volátiles sobre la cadena respiratoria mitocondrial en el encéfalo de ratón. II) Comparar los resultados en animales con otros fármacos porfirinogénicos y en condiciones patológicas del precursor del metabolismo del hemo, ácido 5-aminolevulic (ALA). III) Evaluar, en el encéfalo del ratón, la posible relación entre la biosíntesis del hemo, el ciclo del ácido tricarboxílico y la cadena respiratoria. IV) Analizar la participación de la isoforma mitocondrial de la Óxido nítrico sintasa (mtNOS) en la regulación de la cadena respiratoria. Se observaron alteraciones bioquímicas en los Complejos de la cadena respiratoria que variaban según la cepa de ratones y la mutación. Los cambios observados en las actividades del ciclo de TCA darían como resultado una deficiencia de los equivalentes de reducción del donante, NADH y FADH2, y podrían justificar las alteraciones en las actividades de los Complejos de la cadena respiratoria informados anteriormente. Los resultados refuerzan nuestra resultados previos y apoyan la hipótesis de que habría más de un factor para explicar la patogénesis de los ataques agudos de la PAI además de confirmar la porfirinogenicidad de los anestésicos volátiles.

Descripción: Las Porfirias son enfermedades metabólicas producidas como consecuencia de alteraciones en la biosíntesis del Hemo. En la Porfiria Aguda Intermitente (PAI) se encuentra alterada la enzima Porfobilinógeno deaminasa (PBG-D); se caracteriza por ataques agudos con síndrome neuroabdominal. Los fármacos están involucrados en el desencadenamiento de esta Porfiria; entre ellos se encuentran los anestésicos. La acumulación de Ácido -aminolevúlico (ALA) contribuye a la manifestación neurológica. Con el fin de dilucidar los mecanismos que conducen a la neuropatía porfírica se utilizaron ratones knockout deficientes en la enzima PBG-D como modelo de PAI. Los objetivos específicos fueron: i) Investigar el efecto de anestésicos volátiles y de otras drogas porfirinogénicas sobre el metabolismo del hemo y otros metabolismos interrelacionados; ii) Evaluar la respuesta frente al sexo y la mutación utilizando ratones PAI (doble heterocigota) y T1 (homocigota); iii) Profundizar en la elucidación del mecanismo de acción de los anestésicos volátiles utilizando inductores o inhibidores del CYP2E1. La respuesta de los parámetros ensayados frente a los distintos agentes porfirinogénicos varió según el xenobiótico investigado, la mutación o el sexo de los animales. Los resultados indicarían que no habría sólo una causa para justificar el desencadenamiento del ataque agudo y entender las bases patofisiológicas que llevan al mismo.

Descripción: Las porfirias son desórdenes metabólicos causados por la deficienciaparcial primaria de alguna de las enzimas involucradas en el camino debiosíntesis del grupo hemo. En particular, las Porfirias Hepáticas Agudas,comprenden la Nueva Porfiria Aguda (NPA), Porfiria Aguda Intermitente (PAI),la Coproporfiria Hereditaria (CPH), y la Porfiria Variegata (PV). Individuos conestas patologías padecen ataques neuroviscerales. Por otra parte, en PV y CPHpueden aparecer además síntomas cutáneos. En cuanto a la naturaleza del ataqueporfirico, si bien no se conoce exactamente el mecanismo por el cual se generanlos disturbios neurológicos, se sabe que el precursor neurotóxico ALA puedeautooxidarse generando ROS. Siendo estas enfermedades genéticas, se describieron diversasmutaciones en los genes que codifican las enzimas deficientes. En este trabajonos focalizamos en el estudio molecular de la PV y diagnosticamos, mediante PCR y secuenciación automática, 10 nuevas familias Argentinas a nivelmolecular. Encontramos 5 mutaciones nuevas en la literatura mundial y otras 5previamente descriptas. Estas familias, sumadas a las anteriormente diagnosticadas en el CIPYP,elevan el total de familias Argentinas PV a 36. Comparamos los tipos demutaciones con el tipo de sintomatología en todas las familias, con el objeto dehallar alguna correlación entre dichos parámetros. Sin embargo, como ocurre enla mayoría de las poblaciones, no pudimos establecer una relación genotipofenotipoen nuestros pacientes. Con el objetivo de comprobar que la alteración genética presente en cadapaciente es efectivamente la causante de la patología, procedimos con lacaracterización funcional de las mutaciones nuevas. Empleando un sistema de expresión procariotico en el caso de las mutaciones missense y un sistema de minigenes en el caso de mutaciones de splicing, pudimos corroborar que lasprimeras reducen la actividad enzimática de la PPOX y que las segundasprovocan la exclusión del exón afectado durante el procesamiento del ARNm deeste gen. Las porfirias son patologías genéticamente heterogéneas y cada mutaciónes privativa de una o a lo sumo dos familias. En nuestro país se destaca lamutación c.1.042_1.043insT, dado que no sólo fue descripta únicamente en Argentina, sino que también está presente en el 40% de las familiasdiagnosticadas genéticamente. De esta forma, hipotetizamos la posible existenciade un ancestro común para la mutación en nuestra población y en función de éstarealizamos un análisis de haplotipos basado en microsatélites o STRs. Encontramos un haplotipo común a todos los pacientes portadores de la mutaciónen cuestión, el cual es significativamente diferente al de los controles y de otrospacientes PV. Así concluimos que existe un efecto fundador en nuestra poblaciónpara esta mutación en particular. Por último, teniendo en cuenta la relación existente entre el ataqueporfirico y el estrés oxidativo, nos propusimos estudiar parámetros de estrésoxidativo en pacientes y controles, con el fin de identificar algún marcador de ladisfunción neurológica. Los resultados obtenidos no son concluyentes dado queel número de individuos analizados es aún bajo y además porque se trata depacientes controlados y/o en tratamiento, cuyo sistema de defensa antioxidanteya logró, probablemente, adaptarse al cuadro porfirico.

Descripción: La regulación de la biosíntesis del Hemo a partir de ALA, en el hígado humano, se asemeja más a la del hígado de pollos que a la del hígado de ratas. Se estudiaron en forma comparativa las propiedades de cuatro enzimas del camino biosintético del Hemo en hígados y sacos vitelinos (SV) de embriones de pollos, principales sitios de biosíntesis de ese tetrapirrol, durante el desarrollo de los embriones de aves. En embriones de pollos se investigó la acción de metales y pesticidas órgano clorados y fosforados, sobre la biosíntesis del Hemo y los efectos toxicológicos y teratogénicos. La ontogenia de las enzimas del camino biosintético del Hemo respondió a los cambios en la intensidad de biosíntesis de dicho tetrapirrol en ambos tejidos. Se sugirió que el estado del desarrollo de los embriones debe ser tenido en cuenta al utilizar este sistema como biomarcador. Se purificó la ALA-D de SV. Estudios in vitro: los efectos de Pb²+, Cd²+, Cu²+, Mg²+, Zn²+, Na+, K+ y Li+ sobre la actividad de ALA-D, de hígados y SV de embriones de pollos, se explicaron considerando sus capacidades de ácido-base de Lewis, geometría de coordinación y configuración electrónica de valencia. Cd2+ y Cu2+ resultaron potentes inhibidores no alostéricos, aún más que Pb2+. Se demostró por primera vez la reactivación de la ALA-D de pollos por Mg2+, tanto luego de una demetalización, como sin ella. Se observaron efectos menores sobre PBG-D, URO-D y CPG-ox. Estudios in vivo: se estudiaron los efectos de Cd²+, Cu²+ y Pb²+, sobre las actividades de ALA-D, PBG-D, URO-D y CPG-ox, de hígados y SV de embriones de pollos. Cd²+ provocó mayor mortalidad en los embriones que Pb²+ y Cu²+. Estos tres metales resultaron teratógenos: Cd²+ > Pb²+ > Cu²+, aunque los mecanismos embriopáticos permanecen inciertos. Los efectos sobre las actividades de las enzimas del camino biosintético del Hemo, señalaron al SV como tejido de preferencia para el estudio de marcadores de toxicidad por metales. HCB y Paratión afectaron la síntesis de Hemo más en hígado, que en SV. La inalterada actividad de ALA-D, la leve activación de PBG-D y la inhibición de URO-D y CPG-ox,explicarían la fluorescencia observada en el hígado debida a la acumulación de porfirinas. El HCB fue el causante del daño hepático puesto de manifiesto a través de la examinación histológica. El daño hepático consistió alteraciones del parénquima, observado como necrosis hepática parcial, hepatocitos agrandados y espumosos, sinusoides colapsados y ausencia de pigmentos biliares en los canalículos y conductos biliares. La distribución de los lípidos también se vio alterada. El Paratión fue una droga muy letal, teratogénica y porfirinogénica, mientras que el HCB no fue particularmente letal ni teratogénico.