Descripción: El objetivo principal del presente trabajo fue analizar los mecanismos de la dispersión y depositación polínica en un sistema cultivo/malezas en relación con la estructura y la dinámica de la comunidad del sitio. El trabajo se realizó en la Estación Experimental - INTA Balcarce en una parcela de girasol (Helianthus annus). Se analiza la composición cuali y cuantitativa de la comunidad de malezas así como el desarrollo fenológico de éstas y del cultivo y su relación con las condiciones climáticas del área. Sincronicamente se realizaron muestreos aeropalinológicos en el cultivo. Además se elaboró una zonificación del área, se identificaron los ambientes, en cada una de alas cuales se hicieron censos de la estructura y composición florística para identificar el origen del polen. Los resultados mostraron que el desarrollo del sistema cultivo/malezas modifica los mecanismos involucrados en la dispersión y depositación a través del control del flujo y las fuentes polínicas como se pudo observar en la composición tipológica, riqueza y diversidad del diagrama polínico.

Descripción: En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua estáespacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido deagua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio tempranode la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, aligual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, seadapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación enel estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polenproporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, losnutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilasestigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no seconocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional deagua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas enel transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubopolínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en losgranos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. Eneste trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesosasociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad desecuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos entándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten losmismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en laselectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones deexpresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos deexpresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante laelongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraronuna fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubospolínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentesy específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieronplantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN dobleknockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidadafectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociadasolamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducciónde la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granosde polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen,reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente encondiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de susrespectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas decomplementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal seobservó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en lamembrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una bajapermeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa invitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforiladosespecíficamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresadaen polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. Enresumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaríainvolucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Descripción: Este trabajo estudia el contenido polínico de los recursos de la colmena (cargas corbiculares y miel inmadura) de un colmenar y de la producción demiel del mismo colmenar en la región del Delta del Río Paraná. El colmenarproduce dos cosechas de miel anuales. La variabilidad intra-anual estarelacionada con la sucesión fenológica de las floraciones, y la inter-anual conel clima. El contenido de la miel inmadura refleja la floración de la vegetaciónque rodea las colmenas. La miel madura muestra un enriquecimiento en elpolen de las floraciones tardías. El origen floral de las cargas corbicularesvarió a Io largo de la temporada, en cantidad, diversidad y calidad de lacosecha. Un incremento de la densidad de 0,5 a 12,5 colmenas por hectarea noprodujo diferencias ni en el contenido polínico de las cargas ni en el de lamiel con respecto al histórico del colmenar. El trabajo permitió establecer elmomento de la temporada en que los apicultores podrian trabajar en laproducción de mieles monoflorales. La variabilidad de las floraciones de unatemporada a otra hace difícilpredecir la magnitud de estas cosechas.

Descripción: Los LePRKs son receptores quinasa que se localizan en la membrana plasmática de polen, posiblemente mediando interacciones polen-pistilo. Previamente, hemos demostrado que LePRK2 se encuentra fosforilada en polen maduro y germinado, y se desfosforila cuando microsomas de polen son incubados con extractos de estigma-estilo. Esto sugiere que por lo menos LePRK2 podría estar transduciendo una señal del pistilo a través de la actividad de LePRK2. En esta tesis, mostramos que la desfosforilación de LePRK2 está mediada por una molécula proveniente del pistilo resistente al tratamiento térmico, alcalino y proteasas. Basándonos en la desfosforilación de LePRK2, desarrollamos un protocolo de purificación con el cual obtuvimos un pico aislado de ~3550 Da (determinado por UV-MALDI-TOF MS) correspondiente a esta molécula peptídica que nombramos MrX. Con el fin de evaluar los efectos de MrX en tubos polínicos en crecimiento, realizamos ensayos de germinación in vitro en presencia de MrX parcialmente purificado y determinamos la longitud del tubo polínico como marcador del estado fisiológico. La adición de MrX al medio de germinación resultó en un aumento del largo del largo del tubo polínico en una forma dependiente de la dosis, mientras que las fracciones control no tuvieron efecto alguno. Nuestra hipótesis plantea que las interacciones polen-pistilo a través del complejo de LePRKs involucran la percepción de MrX por LePRK2, seguido de una desfosforilación de ésta y un incremento de la tasa de crecimiento del tubo polínico.

Descripción: En esta Tesis Doctoral se aborda a la Aerobiología de una manera integral,evaluando todos los aspectos involucrados en el proceso aerobiológico. Este incluyeel estudio de los granos de polen desde su producción en la vegetación hasta suregistro en la atmósfera, además de todos los factores que intervienen tantobiológicos como físicos. Para ello, se analizaron los datos cuantitativos de lavegetación, de su floración, de los tipos polínicos emitidos y presentes en laatmósfera y de las condiciones de ésta antes, durante y después de la floración. En principio, se estudió la composición de la flora urbana de Mar del Plata,caracterizando el tipo de estrategia reproductiva de sus componentes, y ladiversidad, abundancia y distribución. Se determinó el período de floración de lasespecies y se estudió cuantitativamente la floración de las mismas. Especialatención y detalle tuvo la vegetación arbórea implantada. Se analizaron lasdiferencias interanuales en las fenofases florales principales y se determinaron lascondiciones climáticas estacionales previas al inicio de la floración responsables deesa variabilidad interanual. Fue posible describir el comportamiento reproductivogeneral del conjunto de especies emisoras y su relación con el clima. Se estudió el contenido de polen de la atmósfera de Mar del Plata. Seconfeccionó el calendario polínico de la zona que permite una caracterizaciónprecisa de la aeroflora y de su dinámica y la identificación de las tendenciasgenerales. Se compararon las productividades polínicas relativas de cada taxón ylos períodos de polinización entre especies y entre años. La estacionalidad delespectro polínico a lo largo del año responde a la fenología floral de las distintasformas de vida de las especies vegetales. Se analizó la relación polen-meteorología ya que la dispersión de partículasbiológicas como la de los granos de polen, puede considerarse gobernada por losparámetros físicos atmosféricos de las masas de aire. En particular, se estudiaronlos rasgos estacionales y diarios de la nube polínica para establecer el efecto de lasvariables meteorológicas instantáneas sobre los granos en suspensión. Seestableció que para elucidar de qué manera operan los factores responsables de lavariación interanual del polen atmosférico, se requiere un estudio detalladoseparando el efecto de las condiciones climáticas estacionales previas o ritmosendógenos cíclicos sobre la productividad polínica, de los efectos instantáneos delas condiciones meteorológicas durante la emisión y dispersión. La vegetación local y extralocal resulta ser la fuente principal del polen quese registra en la atmósfera y sus atributos determinan la composición y abundanciade los tipos polínicos. Se determinó que para las especies anemófilas laconcentración de polen depende de la abundancia de la vegetación. En larepresentatividad de la vegetación en el espectro de polen atmosférico, debenconsiderarse efectos particulares como cercanía y ubicación relativa de lasprincipales fuentes potencialmente emisoras y la estrategia reproductiva de lasespecies. Se analizó la expresión de la variabilidad fenológica en el registro polínico,observándose que los porcentajes de floración se corresponden con los porcentajesde granos de polen emitidos. Se evaluó la efectividad del registro polínico comoindicador de las tendencias fenológicas florales de la vegetación. Se verificó que losfactores que determinan la no correspondencia entre el polen y la floración, enalgún momento dentro de los períodos correspondientes, son principalmente, lasprecipitaciones y los vientos, además de la influencia de las características y tipode fuentes emisoras del polen. La visión integradora de la problemática aerobiológica que se propuso, larigurosidad y detalle que se planteó aquí para una aproximación de la relaciónpolen-vegetación-floración-clima-meteorología no había sido abordado hasta ahora. En definitiva, se interpretó a la concentración de polen en la atmósfera como uncomplejo multidimensional de interacciones entre variables ecológicas y climático-meteorológicas. En resumen, los patrones de polen en la atmósfera reflejan los patronesfenológicos florales de la vegetación emisora por lo Cual la dinámica de lavegetación puede ser investigada a partir del análisis aerobiológico. Lascondiciones climáticas determinan el momento e intensidad de la floración, y por lotanto, la concentración de polen en el aire; las condiciones meteorológicas puedenmodificar momentáneamente la cantidad de polen emitido, aunque no alteran elpatrón general.

Descripción: Se ha descripto que algunos ARNm de polen son sintetizados durante el desarrollo del poleny acumulados en grano de polen maduro deshidratado, para ser traducidos luego de lagerminación del polen. Nuestra hipótesis es que la regulación de la acumulación de estos ARNm de polen pre-sintetizados está mediada por cuerpos citoplasmáticos. Para probar dichahipótesis, analizamos la localización celular de algunos ARNm pre-sintetizados durante eldesarrollo del polen utilizando el sistema MS2-CP. Utilizamos como sistema biológico a Arabidopsis thaliana que permite llevar a cabo un análisis genético, molecular y de desarrollode la expresión específica de genes de polen. Por otro lado, estudiamos gránulos de estrés (SG) y cuerpos de procesamiento (PB) en polen maduro de Arabidopsis como posiblesestructuras celulares donde estos ARNm pre-sintetizados polínicos puedan ser almacenados. En otra línea de estudio, caracterizamos cuerpos de cajal (CB) para investigar si su número ytamaño varían durante los procesos de división celular y diferenciación celular que ocurrenen el desarrollo del grano de polen. Nuestros resultados demuestran la presencia de agregados de ARNm citoplasmáticos enpolen maduro en líneas transgénicas que contienen el sistema MS2-CP. Validamos ycuantificamos estos agregados de ARNm usando un análisis automatizado de MATLAB. Luego verificamos si estos agregados de ARNm co-localizan con gránulos de estrés y/ocuerpos de procesamiento mediante el análisis de líneas transgénicas que expresan el sistema MS2-CP y a la vez proteínas marcadas de SG o PB. Hemos demostrado que uno de cadacinco agregados, aproximadamente, co-localiza con alguna de las proteínas marcadoras de PB, lo que sugiere que los PB son sitios de almacenamiento de los ARNm en granos de polenmaduro. Además, analizamos de qué manera se afecta la presencia y la localización de losagregados citoplasmáticos en ausencia de los genes marcadores de SG y PB. Hemosdeterminado que dichas proteínas serían necesarias para la localización de los ARNm enacúmulos citoplasmáticos. Nuestros resultados además sugieren que los CB respondendurante el desarrollo del polen a las diferentes necesidades fisiológicas de los distintos tiposde células gametofíticas masculinas. Estos resultados contribuirán a entender los mecanismosde regulación transcripcional y traduccional en granos de polen de Arabidopsis thaliana.

Descripción: El objetivo general de este trabajo fue estudiar el desarrollo del grano de polen, del megagametófito, el endosperma y el embrión, como así también la anatomía de las estructuras esporofíticas relacionadas con estos procesos, en diez taxones de Poaceae, correspondientes a las tres subfamilias (Pooideae, Chloridoideae y Panicoideae) más ricamente representadas en la región de la depresión del Salado, Provincia de Buenos Aires. Los objetivos particulares fueron: ● Describir la Microsporogénesis y la Microgametogénesis. ● Realizar el estudio ontogenético ultraestructural de los cuerpos de Ubisch con el fin de aportar datos que ayuden a dilucidar su posible función y participación en la formación de la pared del grano de polen. ● Describir la Megasporogénesis y Megagametogénesis. ● Realizar el estudio ultraestructural del saco embrionario pre- y post-fertilización, a fin de aportar datos sobre el rol que cumplen las antípodas. ● Describir la Endospermogénesis, la Embriogénesis, el desarrollo total de los tegumentos seminales y las capas del pericarpio del fruto. ● Realizar el estudio anatómico del óvulo y del microsporangio. ● Relacionar las características embriológicas particulares de los taxones con las subfamilias a las cuales pertenecen. Todas las especies estudiadas, a excepción de Paspalidium geminatum, presentan un desarrollo normal del grano de polen, el cual se libera en estadio tricelular. La ontogenia del megagametófito corresponde al tipo Polygonum, con antípodas haustoriales bien desarrolladas y en número variable de acuerdo a las especies. En Paspalidium geminatum se observó la formación de varios gametófitos femeninos en distintos estadios de desarrollo en un mismo óvulo. En Stenotaphrum secundatum y Melica brasiliana son pocos los óvulos que forman megagametófitos viables, y una gran cantidad de óvulos abortivos fue observada. Por lo tanto, estas tres especies podrían tener una tendencia a un desarrollo de tipo apomíctico. El presente trabajo constituye un aporte original debido a que nada se conocía previamente sobre la embriología de estas especies nativas de Argentina. También representa una contribución a favor del desarrollo socio-económico del país, pues aporta información sobre la reproducción de algunas gramíneas útiles, nativas de una zona relevante desde el punto de vista de la producción agropecuaria en la Provincia de Buenos Aires. Dichos datos podrán ser de aplicación para proyectos donde genetistas y otros investigadores se dediquen al mejoramiento de pastizales.

Descripción: Antecedentes y objetivos: Esta tesis forma parte del programa de mejoramiento genético en el género Nierembergia, que iniciara en 2002 en el Instituto de Floricultura de INTA. Los objetivos generales que propuse al iniciarla, fueron: (i) conocer la compatibilidad interespecífica entre las especies nativas de valor ornamental y (ii) obtener híbridos interespecíficos como fuente de variación en el mejoramiento. Material y Métodos: En primer lugar se buscó establecer el grado de cercanía entre ocho especies del género Nierembergia: N. aristata, N. browalloides, N. calycina, N. ericoides, N. micrantha, N. linariaefolia var. linariaefolia, N. scoparia, N. veitichii en un análisis filogenético con los datos obtenidos usando el gen rpl14 y los espacios intergénico (IGS) trnK y trnL, como marcadores moleculares. En estas mismas especies se realizaron cruzamientos dirigidos aplicando polinización artificial seguida del estudio de la germinación de los granos de polen sobre el estigma y el crecimiento de los tubos polínicos a lo largo de los pistilos. Esto último permitió establecer la relación Estigma-Polen/Estilo- Tubo polínico (EPET) entre todas las especies consideradas. Con el fin de estudiar las barreras post fertilización tanto en los cruzamientos compatibles como en los incompatibles, se estudió del desarrollo del endosperma y del embrión. Finalmente se caracterizaron los híbridos interespecíficos. Resultados claves y Conclusiones: El análisis filogenético reveló la formación de tres subclados N. veitichii-N. aristata, N. linariaefolia-N. micrantha y N. scoparia-N. ericoides La distancia filogenética entre las especies que integran cada uno de ellos, fue corroborada por el análisis de compatibilidad interespecífica, y por los resultados de los estudios de endospermogénesis y embriogénesis. La combinación entre N. ericoides y N. scoparia resultó compatible, presentándose como óptima para la obtención de híbridos interespecíficos. En este género, el análisis filogenético utilizando los genes el gen rpl14 y los espacios intergénico (IGS) trnK y trnL constituye una herramienta del mejoramiento que permite predecir la compatibilidad interespecífica y consecuentemente obtener híbridos estables.

Descripción: Se presentan los resultados de estudios interdisciplinarios tendientes a aclarar las relaciones entre los géneros Bomarea y Alstroemeria. Se realiza el tratamiento taxonómico de las especies argentinas de la familia Alstroemeriaceae. Se presenta una breve historia nomenclatura de los géneros Alstroemeria y Bomarea y de las relaciones supragenéricas e infragenéricas. El tratamiento taxonómico incluye la posición sistemática de la familia, descripción de los géneros y clave para diferenciarlos, descripción y clave para reconocer las especies argentinas, sinonimias, ilustraciones, mapas de distribución y observaciones ecológicas de cada taxón. Para delimitar la posición sistemática de Bomarea y Alstroemeria, se realizaron observaciones morfológicas sobre: órganos subterráneos, fruto, semilla, polen, hoja, tallo, inflorescencia y morfología floral. Los estudios cariológicos incluyeron el análisis cariotípico de dos especies de Alstroemeria: A. psittacina y A. isabellana y dos especies de Bomarea: B. edulis y B. boliviensis. Se estudió el comportamiento meiótico de representantes de ambos géneros. Además, se dan a conocer por primera vez, valores de contenido de ADN de especies de Bomarea: B. boliviensis y B. macrocephala y de Alstroemeria: A. psittacina y A. isabellana, obtenidos mediante microdensitometría de Feulgen. Se evaluaron las semejanzas morfológicas entre las especies y entre 123 individuos de esos taxones. Para establecer esas relaciones fenéticas, se aplicaron técnicas numéricas: análisis de agrupamiento (fenogramas) y análisis de ordenación (componentes principales).

Descripción: La reproducción sexual en plantas incluye procesos en donde el movimiento de agua y solutos se encuentra finamente regulado, lo cual sugiere la participación de acuaporinas. La existencia de acuaporinas, facilitando estos flujos, provee una base molecular sólida para la regulación del transporte de agua y solutos a través de las membranas y de esta forma establecen conexiones entre dicho transporte, el desarrollo de las plantas y sus respuestas adaptativas a las condiciones a las que se encuentran expuestas tanto a nivel organismo, como tejido e incluso a nivel intracelular. Este trabajo de tesis se centró principalmente en la identificación y caracterización de las acuaporinas potencialmente involucradas en la reproducción desde los órganos reproductivos masculinos en Arabidopsis thaliana. Primeramente identificamos las tres acuaporinas específicas de granos de polen de Arabidopsis, AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1. En base a experimentos funcionales, utilizando ovocitos de Xenopus laevis como sistema heterólogo, pudimos determinar que AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 son transportadores de agua. AtTIP5;1 y AtTIP1;3 son también transportadores de urea y solamente AtTIP5;1 se encuentra regulado por pH externo. Estudios de localización subcelular evidenciaron que AtTIP5;1 se expresa en mitocondrias de polen. Por otro lado, AtTIP1;3 se encuentra en estructuras intracelulares no vacuolares del tipo vesículares, pero que no participan de mecanismos de endocitosis ni exocitosis. Finalmente, los experimentos fisiológicos in vitro sugirieron un papel de AtTIP5;1 en germinación del grano de polen actuando como regulador negativo. AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 se vincularon de forma directa o indirecta con el proceso de elongación del tubo polínico, destacándose los efectos más drásticos para AtTIP1;3. En cuanto a los experimentos fisiológicos in planta, encontramos que solamente AtNIP4;1 tiene afectados los parámetros de fertilidad con una reducción significativa en el número de semillas. En el marco de esta tesis doctoral hemos realizado una revisión de la información disponible de acuaporinas de plantas, evaluando los perfiles de expresión de las mismas en los diversos tejidos. Hemos discutido la nomenclatura utilizada para clasificar esta familia proteica y analizado la posibilidad de establecer relaciones filogenéticas y funcionales entre los distintos subgrupos: PIPs, TIPs, NIPs y SIPs. El conjunto de resultados desarrollados en esta tesis, en concordancia con los trabajos publicados en estos últimos años, nos ha permitido aventurar posibles roles en relación con la actividad de transporte de agua y/o solutos de las acuaporinas de polen; que van desde la migración celular hasta el control del daño y prevención de apoptosis. También nos ha permitido generar un modelo sobre el mecanismo de acción de las acuaporinas en el polen relativo a la actividad como transportadores de urea. Este modelo vincula la actividad de AtTIP5;1 y AtTIP1;3 con el reciclado del nitrógeno descripto en polen.