Descripción: E7 es una proteína de expresión temprana del papilomavirus humano. Es una proteína pequeña de aproximadamente 100 aa, que consta de dos dominios estructurales. El dominio C-terminal, globular y de plegamiento independiente, cuya estructura fue descrita recientemente y el dominio N-terminal, intrínsecamente desordenado. Se han descrito hasta el momento más de 40 blancos celulares que interaccionan con E7, siendo su blanco principal la proteína supresora de tumores Retinoblastoma (pRB) y hasta el momento no se ha reportado ninguna actividad enzimática. E7 se la denomina oncoproteína ya que posee la capacidad de transformar la célula que la expresa. En nuestro laboratorio se observó que esta proteína posee la capacidad de formar oligómeros de alto peso molecular, E7SOs, al desplazar el Zn que coordina el dominio C-terminal. Este oligómero comparte características con las fibras amiloides ya que posee una estructura del tipo beta repetitiva. E7SOs posee actividad chaperona tipo holdasa y se observó que este oligómero se localiza en el citosol de líneas celulares transformadas, en células transfectadas y en biopsias de tejidos cancerosos infectados con HPV. Los estudios realizados in vivo propusieron que esta partícula tiene la funcionalidad de almacenamiento de la oncoproteína. En el presente trabajo de tesis se estudió la ruta de formación de E7SOs. Se analizó la cinética de formación de los mismos monitoreando diferentes sondas que reportaron distintos arreglos estructurales en la reacción. Debido a que E7SOs posee una geometría esférica, se aplicó un modelo elaborado para estudiar el ensamblado de cápsides virales, que puede ser aplicado a la formación de oligómeros esféricos. Los resultados demostraron que E7SOs posee un ensamblado novedoso, ya que requiere de la formación previa del monómero desplegado de E7, como sucede en el ensamblado de fibras amiloides, pero no posee un oligómero de menor tamaño como núcleo de la reacción. Se definió a la ruta de formación de E7SOs como un ensamblado truncado hacía la formación de fibras amiloides. Muchos blancos celulares se han descrito para E7, no obstante en la mayoría de estas interacciones se desconoce su consecuencia biológica y poco se sabe de las características de estas interacciones, como regiones de unión, competencia por otros ligandos, etc. Por otro lado, la única interacción analizada en detalle es la que E7 realiza con su principal blanco pRB. En este trabajo de tesis se halló y se caracterizó in vitro, bajo diferentes técnicas biofísicas, la interacción de E7 con un nuevo blanco, la proteína E2. E2 es codificada por el genoma viral y es el factor de transcripción negativo de E7. En consecuencia con los resultados obtenidos de este estudio, se propuso que la interacción de estas proteínas presenta un mecanismo de ajuste en la concentración de las mismas dentro de las células. Esto propiciaría la modificación del ambiente celular dando lugar a diferentes estadios de la infección viral y su consecuencia con la proliferación celular y la cancerogénesis carcinogénesis relacionada con el virus.

Descripción: Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Descripción: La cepa 16 de HPV es responsable del 50% de los casos de cáncer de cuello de útero asociado a Papilomavirus. La proteína E2 es el único factor de transcripción viral y posee cuatro o más sitios de unión en su genoma, cuya interacción diferencial está asociada a las distintas etapas del ciclo viral. Para cumplir su función regulatoria, E2 debe discriminar entre los distintos sitios específicos, a través de diferencias mínimas en la afinidad, en presencia de un enorme exceso de sitios no específicos , en el contexto del genoma. Con el objetivo de comprender las bases estructurales de esta discriminación, nos propusimos estudiar la estructura de la proteína libre en solución y su complejo con ADN, así como caracterizar equilibrios conformacionales de ambos ligandos. Se realizó principalmente mediante RMN que, además de proporcionar estructuras con detalle atómico, permite el estudio de la dinámica, fundamental en procesos de reconocimiento de este tipo. En la presente tesis se describe la estructura de E2C de HPV-16, cuya topología no difiere de la de otras proteínas de su familia. E2C presenta una estructura plástica, con una gran exposición al solvente de su esqueleto proteico, y un loop flexible en la interfaz con el ADN. La estructura no se modifica significativamente al unir un ADN, pero sí lo hace su dinámica y su exposición al solvente que resultan muy disminuidas. El loop β2−β3, por otro lado, permanece flexible aun encontrándose a corta distancia del ADN sugiriendo una importancia de esta flexibilidad en la interacción. La ausencia de cambio estructural entre la proteína libre y unida, sugiere un papel activo de los sitios de unión de ADN en la discriminación de afinidades. En solución estos sitios se presentan precurvados y sensibles al efecto del magnesio o la temperatura.Independientemente de las variaciones conformacionales de los sitios libres, una vez unidos adoptan una conformación similar y complementaria a una región de E2C. Sin embargo, se mantendrían pequeñas diferencias entre los distintos complejos. El uso de oligonucleótidos de distintas longitudes permitió la identificación de una interacción novedosa que, junto con otras características propias de E2C que se describen, explicaría la alta actividad regulatoria de esta proteína.

Descripción: El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiologíadesconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerposdirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En losúltimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir unarespuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollarautoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo deinmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y lacaracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. Enparticular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor detranscripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pbcomprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. Lainmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-aguaresulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopesdiscontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable demantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonalcontra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADNseñala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólocuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótidodurante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunizacióncon la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en unarespuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentescon la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencialnecesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematososistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sidoobtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteínaviral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con elpatrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcionalrealizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenidodos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formarun complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada poranticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficiede unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dosanticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótidoutilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADNno-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen aloligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando uncomplejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón demutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a lasencontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. Enconjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonalesanti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual elcomplejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.

Descripción: Las proteínas E6 de papilomavirus humano de alto riesgo participan en la progresión tumoral, mayoritariamente por su habilidad de promover la degradación de p53. Los transcriptos de HPV muestran un patrón de procesamiento complejo, donde E6*I es el transcripto más abundante en HPV de alto riesgo, correspondiendo en secuencia de aminoácidos a los primeros 50 aminoácidos de E6. Actualmente, no hay información estructural o bioquímica de este polipéptido que contiene la mitad del primer motivo de unión a Zn de E6, debido a la dificultad de obtener una estructura compacta y monomérica en tan pequeño polipéptido. En este trabajo se muestra que E6*I de HPV16 puede plegarse en oligómeros con alto contenido de hélice-α o láminas-β a pH 7.5 y 5.0 respectivamente, en ausencia de Zn. Los oligómeros-β son altamente estables y no se ven afectados por la presencia de Zn, mientras que los oligómeros-α tienden rápidamente a agregar, evitando esto la presencia de Zn. Dos moléculas de E6*I unen una molécula de Zn, sugiriendo una coordinación tetraédrica de alta afinidad (KD < 10⁻¹² M), que resulta en un dímero de E6*I mediado por Zn con significativa estructura secundaria. Previamente se encontraron en el citosol de líneas celulares transformadas por HPV oligómeros endógenos de E6, y nosotros proponemos que las características determinantes de esta agregación se encuentran dentro de E6*I. Los efectos reportados de E6*I están asociados a la regulación negativa de la proteína E6, y la relación entre ambas especies modula la degradación de p53 y otras cascadas de señalización de apoptosis. En este trabajo, demostramos la interacción directa y específica entre las proteínas E6 y E6*I de HPV16. La abundancia en la célula de E6*I con una naturaleza “camaleón” correlaciona con la plasticidad para unir blancos celulares, y su destino está asociado a un balance entre los niveles de proteína, la disponibilidad de Zn, el potencial redox y la oligomerización. Este pequeño pero complejo polipéptido está asociado a un efecto más que a una función de un producto viral que, cuando se encuentra en altas concentraciones, puede directa o indirectamente afectar varios procesos celulares.