Descripción: Virtualmente todas las células de mamíferos están bajo la influencia del radical libre denominado óxido nítrico (NO). Las enzimas responsables de la síntesis del NO se conocen como óxido nítrico sintasas (NOS 6 NO-sintasas). En mamíferos, se han clonado tres isoenzimas de la NO-sintasa. Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de Ca++ y se expresan constitutivamente, mientras que la isoforma inducible es Ca++ independiente y se induce en presencia de lipopolisacáridos y citocinas. Todas las isoformas pertenecen a la farnilia de los citocromos P-450, utilizan L-arginina como sustrato, con oxígeno molecular y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato forma reducida (NADPH) como co-sustratos. Las funciones del NO fueron descriptas primeramente en tres sistemas fisiológicos (vascular, nervioso e inmune) y a partir de dicho estudio se fueron descubriendo funciones del NO en otros sistemas como el reproductor, respiratorio y excretor. En reproducción, se vio que el NO induce la erección peniana, estimula al factor liberador de la hormona luteinizante (LH-RH) y modula la síntesis de prostaglandinas uterinas y ováricas durante la luteólisis en la rata. Sin embargo, hasta el momento no se había descripto la participación del NO en el proceso de fertilización. En el presente trabajo se presentan evidencias de la existencia de la enzima NO-sintasa en la gameta masculina murina y su participación en la fertilización in vitro. Mediante ensayos farmacológicos determinamos que la adición de inhibidores específicos de la NO-sintasa (NG-nitro-L-arginina (NO2-arg) ó NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)) durante el proceso de capacitación in vitro disminuye el porcentaje de ovocitos fertilizados. Esta inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Dado que el proceso de fertilización se encuentra afectado en presencia de L-NAME y NO2-arg, medimos la motilidad espermática y el patrón de hiperactivación. A los 120 min de incubación, el L-NAME disminuye el porcentaje de espermatozoides mótiles e hiperactivados, mientras que un generador de NO como el nitroprusiato de sodio (NP) acelera estos parámetros de manera concentración dependiente. Considerando que el NO también podía participar en la reacción acrosomal, medimos el efecto del L-NAME sobre espermatozoides reaccionados espontáneamente ó en presencia de un inductor fisiológico como la progesterona. En estos casos, la exocitosis acrosomal también se halla inhibida; la inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Contrariamente, 0.1 mM de spermine-NONOate (generador de NO) estimula la reacción acrosomal en espermatozoides previamente capacitados a niveles semejantes a los obtenidos con 15 microM de progesterona. Luego de los ensayos farmacológicos, evidenciamos la presencia de la NO-sintasa espermática mediante ensayos inmunológicos. Por inmunofluorescencia indirecta localizamos la NO-sintasa en el acrosoma y en la cola de espermatozoides no capacitados. Durante la capacitación, la fluorescencia desaparece del acrosoma y se mantiene en el flagelo, otorgando a esta enzima un potencial significado fisiológico en el proceso de capacitación y/o de reacción acrosomal. Seguidamente, realizamos ensayos de Western Blot, los cuales nos permitieron demostrar que anticuerpos anti-NOS neuronal, endotelial e inducible reconocen una única fracción proteica de 140 kD bajo condiciones desnaturalizantes y no reductoras en espermatozoides frescos de ratón. Cuando realizamos los experimentos cinéticos, detectamos la presencia de formación de NO, medida como conversión de L-arginina a L-citrulina en espermatozoides intactos y vivos (condiciones in vivo). Los espermatozoides sintetizan NO durante el proceso de capacitación alcanzando un plateau a los 120- 180 min de incubación. Además, la producción de NO depende de la concentración de L-arginina presente en el medio de incubación y es inhibida por L-NAME pero no por aminoguanidina (inhibidor específico para la NO-sintasa de caracter inducible), sugiriendo la existencia de una NO-sintasa espermática de caracter constitutivo. Considerando que en los ensayos farmacológicos evidenciamos la participación de la NO-sintasa del espermatozoide en la exocitosis acrosomal inducida por progesterona, se estudió también la modulación de este esteroide sobre la formación de NO en espermatozoides capacitados. Así, observamos que 15 microM de progesterona estimula directamente la síntesis de NO durante el período ensayado (90-120 min). Basándonos en trabajos realizados en nuestro laboratorio intentamos relacionar al NO con la síntesis de prostaglandinas e hidroxiácidos. Para ello, en primer término, demostramos que los espermatozoides de ratón son capaces de sintetizar PGE2 e hidroxiácido 5-HETE y luego observamos que el NP estimula la síntesis de estos metabolitos en la gameta masculina. Sin embargo, la síntesis basal de prostaglandinas no se ve modificada en presencia de L-NAME. Los resultados de este trabajo evidencian por primera vez la presencia de la NO-sintasa en el espermatozoide de ratón y demuestran su participación en el proceso de fertilización, modulando la motilidad espermática y la exocitosis acrosomal. Podemos afirmar entonces, que el NO sintetizado por la NO-sintasa espermática, es necesario para que el espermatozoide pueda expresar su plena capacidad fertilizante in vitro.

Descripción: El óxido nítrico (NO) es un radical libre altamente reactivo, que puede actuar comomensajero intracelular e influir en el desarrollo tumoral. Resultados de nuestro grupo deinvestigación indican que la expresión de la enzima óxido nítrico (NO) sintasa inducible (iNOS) en tumores vesicales humanos es un factor de mal pronóstico que se asocia conrecurrencias más tempranas y con un mayor grado histológico. Teniendo en cuenta que iNOS no se expresa en el urotelio vesical de individuossanos, y que es una entidad clave del proceso inflamatorio, característico del cáncer devejiga (CaV), surgió la hipótesis de que la inhibición de esta enzima puede ser un blancoterapéutico para pacientes cuyos tumores expresen iNOS. Para analizar esta hipótesis comenzamos estudiando el rol del NO comoconsecuencia de la expresión de iNOS, en la progresión del CaV. Para ello utilizamos unmodelo murino de CaV que imita muy bien la patología en humanos. Cuando las líneascelulares MB49 y MB49-I son inoculadas en la vejiga de ratones singeneicos generantumores no invasores del musculo (NMI) y tumores invasores del músculo detrusor (MI),respectivamente. La línea invasora MB49-I, expresa altos niveles de iNOS, y enconsecuencia mayores niveles de NO, comparado con la línea MB49. Asimismo, poseeincrementados varios pasos del proceso de invasión y metástasis como es su capacidadde migración e invasión, la actividad de enzimas proteolíticas, y la capacidad de generarmetástasis pulmonares. Detectamos que el NO es un factor de sobrevida para células de CaV, queexpresan iNOS y que al inhibirlo, se reduce la activación de vías de proliferación comola vía de las MAPK, y parámetros de progresión tumoral como la producción de enzimasproteolíticas, migración, angiogénesis y el crecimiento metástatico en pulmón. Analizamos, por otra parte las consecuencias de la inhibición de iNOS en elcrecimiento tumoral empleando tres estrategias. La primera fue evaluar la actividad de L-NAME (inhibidor farmacológico pan NOS) de manera sistémica en ratones portadoresde tumores de vejiga creciendo en el subcutáneo o en la vejiga de ratones singeneicos. La segunda, fue también una inhibición farmacológica, utilizando el inhibidor específicode iNOS 1400w, en forma local, y la tercera aproximación involucró el silenciamientogenético de la enzima iNOS en la línea invasora. Las tres estrategias mostraronresultados similares demostrando que tanto L-NAME sistémico, como 1400w local y laablación genética reducen significativamente el crecimiento tumoral de células queexpresan iNOS. Asimismo, hemos demostrado que los niveles urinarios de NO, determinadoscomo nitrito, son un marcador de seguimiento en tumores de vejiga, y que la disminuciónde dichos niveles está asociado a una respuesta a tratamiento. Es así que proponemos que la inhibición de la actividad iNOS sería una terapiapromisoria para pacientes cuyos tumores expresen la enzima.

Descripción: En los mamíferos, la regresión luteal o luteólisis es un evento determinante para elproceso reproductivo ya que garantiza la finalización de un ciclo no concepcional,permitiendo el inicio de otro ciclo potencialmente fértil. Estudios recientes demostraronla acumulación de leucocitos durante la luteólisis, asociada a la producción decitoquinas pro-inflamatorias y radicales libres. Es por esto que el objetivo del presentetrabajo de tesis fue estudiar la participación de la Interleuquina-1 beta (IL-1β) en laluteólisis funcional. Además, dado que inhibidores de la NOS prolongan la vida del CL,se analizó si el óxido nítrico (NO) estaba involucrado en el mecanismo de acción de la IL-lβ. Para ello, se utilizó el modelo de la rata pseudopreñada, en el cual la administración de PMSG induce la formación de CLs con una vida media de aproximadamente lO días. Al comparar el CL en regresión (día 9 de psp) respecto del CL funcional (día 5 de psp)se observó que durante la luteólisis espontánea aumentó la producción endógena de IL-lβ y de PGF2α, mientras que disminuyeron la biosíntesis de P, los niveles del mRNA yde la proteína StAR y el contenido de glutation reducido (molécula antioxidante). La IL-Iβ fue capaz de reducir la biosíntesis de P y de aumentar la producción de PGF2α, incrementando los niveles proteicos de la COX-II pero no los de COX-I,enzimas responsables de la síntesis de PGs. Además, la IL-lβ moduló el estadooxidativo del CL funcional ya que aumentó el índice de lipoperoxidación (TBARs) yredujo el contenido de glutation reducido. Por lo tanto, la incubación de los explantesováricos (día 5 de psp) en presencia de la IL-lβ reprodujo, en los CLs funcionales, lascaracterísticas observadas en los CLs en regresión sugiriendo que la IL-lβ promueve laluteólisis funcional. Mientras que los niveles del mRNA de la iNOS aumentaron en el CL en regresión, elcontenido del mRNA de la eNOS disminuyó en un 50% en el día 9 de psp. A su vez, laproducción de NO fue mayor en el CL en regresión, evidenciando la presencia de unsistema generador de NO en los explantes ováricos en las distintas etapas del desarrolloluteal. La IL-lβ estimuló la síntesis de NO y la incubación con el sustrato de la NOS, la L-Arginina,disminuyó la síntesis de P y aumentó la de PGF2α. Por otro lado, la presenciadel L-NAME revirtió los efectos inducidos por la IL-lβ, indicando que el NO estaríainvolucrado en el mecanismo de acción de la citoquina. La activación de la iNOS sería un evento necesario en la acción biológica de la IL-lβ,ya que la citoquina aumentó la expresión del mRNA y de la proteína iNOS, mientrasque el 1400W, inhibidor selectivo la iNOS, revirtió completamente su acción sobre la P. La acumulación de GMPc se incrementó por el tratamiento con IL-lβ y, mientras que el 8-Bromo-GMPc, un análogo del GMPc, disminuyó la biosíntesis de P, la presencia delinhibidor de la guanilato ciclasa soluble, el ODQ, anuló la reducción en laesteroidogénesis inducida por la IL-lβ .Estos resultados sugieren que el GMPc participaen el mecanismo de acción de la IL-lβ. Más aún, dado que el ODQ anuló el efectoantiesteroidogénico inducido por la L-Arginina, el GMPc sería un intermediarionecesario en el efecto inhibitorio del NO sobre la biosíntesis de P. Los resultados del presente trabajo de tesis sugieren que la IL-Iβ participa en laluteólisis funcional a través de un mecanismo que involucra al NO, la isoforma iNOS yel GMPc.

Descripción: Durante el desarrollo prenatal los organismos son vulnerables a factores que puedenafectar su homeostasis. Ha sido demostrado que el estrés durante la preñez tieneefectos en la descendencia que pueden perdurar hasta la adultez, afectandonumerosos procesos fisiológicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún nohan sido completamente dilucidados. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación del óxido nítrico (NO) en lasalteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal (EP). Se observó un incremento en el comportamiento de tipo ansiogénico y un peordesempeño en una tarea de aprendizaje asociativo en machos EP que revirtióparcialmente con un dador de NO. Se detectó una disminución de la óxido nítrico sintasa (NOS) en el hipocampo demachos adultos, mientras que en las hembras no se encontraron cambios. En elhipotálamo se observó un incremento en nNOS en hembras EP, mientras que en losmachos no se observaron cambios. La exposición a estrés agudo en la adultez estimulóel incremento de corticosterona en plasma, que revirtió más lentamente en losmachos EP que en los controles. En las hembras, la recuperación fue más rápida en las EP que en controles. El tratamiento con un dador de NO atenuó la respuesta al estrésen ambos grupos de hembras y en los machos EP, pero no en los controles, en los quefacilitó la reversión. El tratamiento con un inhibidor de nNOS anuló en todos los gruposla reversión de la corticosterona a niveles basales luego del estrés agudo. Por lo tanto,la señalización mediada por NO estaría involucrada en las alteraciones conductuales yneuroendócrinas descriptas en este modelo.

Descripción: En el presente trabajo se analizó el efecto del óxido nítrico (ON) sobre la proliferación de megacariocitos (MCs). Células mononucleares (CMN) o CD34+ fueron cultivadas en medio líquido en presencia de nitroprusiato de sodio (NPS), 2,2′-(Hidroxinitrosohidracino)bis-etanamina (DETA/ON) o 1-propil-1'-(3- aminopropil)-2-hidroxi-2-nitrosohidrazina (PAPA/ON) y luego estimuladas con trombopoyetina. El número del MCs disminuyó por el tratamiento con los dadores de ON. La estimulación de CMN o células CD34+ con factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) o interferón-γ (IFN-γ) incrementó los niveles endógenos de ON y suprimió el crecimiento de MCs. Además, el tratamiento con inhibidores de la síntesis de ON revirtió parcialmente la inhibición del crecimiento de MCs inducida por TNF-α e IFN-γ aunque el incremento de los niveles de ON fue completamente suprimido. El análisis del contenido de ADN por citometría de flujo demostró que la apoptosis es el mecanismo asociado con el efecto citotóxico del ON. El tratamiento de MCs con ON promovió un aumento en los niveles de GMPc y establecimos el rol central de este segundo mensajero durante la apoptosis de MCs mediante diversas estrategias farmacológicas para modular sus niveles intracelulares. Además, los MCs tratados con PAPA/ON mostraron un aumento tanto en la expresión del fragmento activo de caspasa-3 como de su actividad biológica y paradójicamente aumentó la expresión de Bcl-xL. Por otra parte, el ON no fue capaz de modular la formación de proplaquetas ni la producción de plaquetas en cultivo pero si de inhibir la adhesión de MCs a células endoteliales. Estos hallazgos en conjunto señalan al ON como un regulador negativo de la megacariocitopoyesis.

Descripción: En el presente trabajo abordamos la implantación embrionaria en ratas controles ydiabéticas desde el punto de vista del fenómeno vasoactivo que conlleva. Las prostaglandinas son necesarias para permitir la implantación de losembriones en el lumen, ya sea incrementando el flujo sanguíneo y lavasodilatación del útero durante la decidualización endometrial, como regulando Ia actividad contráctil del tejido miometrial. El óxido nítrico ha sido reconocido como agente vasodilatador y miorrelajante, yparte de su efecto es mediado a través de la regulación de la síntesis deprostaglandinas en diversos procesos fisiológicos. Se ha determinado variaciones en la síntesis uterina de prostaglandinas y deóxido nítrico en la preñez temprana en la rata, y se ha establecido una relacióncausal entre ambos mecanismos fisiológicos durante la implantación embrionaria. En el útero dichos agentes vasoactivos aumentan durante los días peri-implantatoriosde la preñez, como resultado de la combinación de la acción de losesteroides ováricos y de agentes locales derivados del embrión o de la madre. Las isoformas Cab-dependiente y Cap-independiente de la enzima sintetizadorade óxido nítrico son las responsables del incremento en la actividad enzimática enel día de la implantación. La inhibición de la síntesis intraluminal de óxido nítricoreduce el número de embriones implantados en un 50%, probablemente alterandola adecuada irrigación sanguínea al sitio de implantación. También se determinóque la producción uterina de prostaglandina E y qu depende tanto de laproducción de óxido nítrico como de señales embrionarias tempranas. Nuestros resultados indican además, que la acción vasoactiva del óxido nítrico yde las prostaglandinas puede modularse de manera tal de compensaralteraciones metabólicas en la rata diabética de tipo no-insulino-dependiente, ypermitir que el proceso implantatorio ocurra eficientemente en esta patología.

Descripción: La autoinmunidad es una causa importante de enfermedad en los seres humanos. El síndrome de Sjögren es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una pérdida progresiva de la secreción salival y lagrimal. La cepa de ratones diabéticos no obesos (NOD) es el modelo murino más ampliamente utilizado para el estudio de esta enfermedad debido a que el desarrollo de la sialoadenitis está acompañado por una disminución de la respuesta secretoria. Estudios en las glándulas salivales sugieren que el óxido nítrico podría tener un papel en la regulación de la secreción salival. Por tal motivo nuestro objetivo es investigar si la disfunción secretoria de los ratones NOD está asociada a alteraciones en la actividad de la óxido nítrico sintasa y su relación con la aparición de infiltrados linfocitarios en las glándulas o la expresión de citoquinas en las mismas. Los resultados expuestos indican que las glándulas salivales de ratones NOD presentan una menor actividad de NOS a partir de las 12 semanas comparada con la de BALB/c de la misma edad y ratones NOD de 8 semanas. La disminución es total en el caso de las glándulas submaxilares. El efecto sobre la NOS coincide con una reducción del flujo salival estimulado por pilocarpina sola o pilocarpina y VIP. Ambos efectos preceden al aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias en las glándulas y en el suero y a la aparición de infiltrados linfomononucleares en las glándulas. Además los resultados apoyan la hipótesis de una regulación negativa de la NOS por CaM KII, como el mecanismo responsable de la disminución de la actividad observada.

Descripción: La quiescencia miometrial es un requerimiento fundamental de todas las especies parallegar al término de la gestación. La falla en el mantenimiento de la relajación uterina amenudo provoca parto prematuro, una de las principales causas de morbilidad ymortalidad fetal. En este trabajo se investigó el efecto de la progesterona (P4), hormona responsable delmantenimiento de la quiescencia de la musculatura lisa uterina, sobre factores quesuprimen o estimulan la actividad contráctil miometrial como el óxido nítrico (NO), el GMPc y las prostaglandinas (PGs). Se estudió el perfil de síntesis de NO y la expresión de las isoformas de NOS uterinasdurante la preñez temprana, media y tardía, observándose que la actividad Caindependiente y el nivel proteico de la NOsintasa inducible (iNOS) y la NOS endotelial (eNOS) estaban aumentados durante la gestación y descendían antes del parto. Estoshallazgos mostraron una relación temporal entre los niveles de NO producido por el úterogestante y las concentraciones de P4 sérica. La administración de RU-486, antagonista de la P4, produjo una disminución de laactividad de las NOS y del nivel proteico de la iNOS, mientras que el tratamiento con P4en los días previos al parto, provocó un incremento en la síntesis de NO y en el nivelproteico de la iNOS. Estos hallazgos muestran que la P4 podría modular la producción de NO durante la preñez. La P4 aumentó la acumulación de GMPc,hecho que fue abolido en parte por la incubacióncon Aminoguanidina, inhibidor selectivo de la iNOS, sugiriendo que el efecto de la P4sobre el NO trasciende al GMPc. La producción de PGF2α y PGE2; se encontró disminuida durante la preñez, como asítambién el nivel proteico de las Ciclooxigenasas (COX) 1 y 2. La P4 inhibiósignificativamente la liberación uterina de PGF2α y PGE2 y el nivel proteico de la COX-2. A pesar que durante la preñez se detectó baja actividad de la PLA;secretoria, enzima quelibera el sustrato de las PGs, no se observó una modulación de la misma por la P4. El metabolismo de la PGF2α evaluado por la actividad de PG dehidrogenasa (PGDH),resultó incrementado durante la preñez y por la administración de progesterona. Estos resultados nos indican que los niveles de PGs estarían modulados negativamentepor la progesterona, que actuaría aumentando su metabolismo a través de la PGDH einhibiendo las COX. Cuando se estudió la posible interrelación entre los sistemas de NO y PGs se observó quela administración in vivo de un inhibidor selectivo de la COX-2 redujo el efecto del RU-486sobre la síntesis de NO y que las PGs in vitro inhibían la actividad de la NOS. Por otro lado un dador de NO fue capaz de aumentar la síntesis de PGE2 sin modificar lade PGF2α. Estos datos nos permiten sugerir la existencia de una interrelación entre el NO ylas PGs en el útero de la rata gestante. Este trabajo demuestra que la progesterona es capaz de modular la síntesis de lasprincipales moléculas involucradas en la regulación de la contractilidad uterina durante lagestación.

Descripción: El óxido nítrico (NO) cumple importantes funciones durante la preñez (implantación, decidualización, vasodilatación y relajación miometrial). Sin embargo, en altas concentraciones como las encontradas en los casos de sepsis, el NO tiene efectos tóxicos dado su carácter de radical libre. El objetivo de este trabajo es caracterizar la producción del NO en útero y decidua en la reabsorción embrionaria inducida por lipopolisacárido (LPS) y determinar cuáles son las isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) implicadas en dicho mecanismo. Se ha observado que el LPS produce un 100% de reabsorción embrionaria a las 24 horas, con una expulsión del feto a las 48 hs. El LPS incrementó la producción de NO en decidua y útero con un máximo en su producción a las 6 horas. Este incremento se debe a la inducción de la expresión de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa en decidua y útero, y de la isoforma neuronal (nNOS) solamente en decidua que fue detectada por western blot e inmunohistoquímica. El LPS aumentó la expresión de iNOS en decidua y células miometriales y la expresión de nNOS en células de la decidua. El LPS produjo, además, la fibrinólisis y la infiltración de macrófagos iNOS y CD14(receptor de LPS) positivos. Por otro lado, el LPS indujo la expresión de CD14 en las glándulas endometriales que podrían amplificar la respuesta inflamatoria. La Aminoguanidina (AG), un inhibidor de la actividad de la isoforma iNOS, revirtió la reabsorción embrionaria inducida por LPS. Este hecho podría explicarse por una inhibiciónen la producción de NO, pero también podría deberse a una inhibición de la infiltración celular y de la fibrinólisis. El tratamiento con LPS produjo un aumento en el daño oxidativo de la decidua debido al anión peroxinitrito,evidenciado por la nitración de las tirosinas proteicas, hecho que también fue revertido por AG. A su vez, se cuantificó un aumento en la síntesis de prostaglandinas en decidua y útero debido al LPS, pero la AG sólo revirtió el efecto en útero. Estos resultados demuestran que el NO cumple un papel fundamental en la reabsorción embrionaria inducida por LPS.

Descripción: La anandamida (AEA), el endocannabinoide más abundante en el tracto reproductivo, es un importante mediador de los procesos de implantación y desarrollo embrionario pero niveles elevados de esta molécula en el útero son perjudiciales. A su vez, el óxido nítrico (NO) y las prostaglandinas (PGs) están involucrados en la reabsorción embrionaria (RE) inducida por lipopolisacárido (LPS). En varios trabajos se ha descripto que el LPS modula la producción de AEA y que ésta interacciona con el NO y las PGs. Por ello, estudiamos si este endocannabinoide estaba implicado en la RE inducida por LPS en el útero y la decidua de ratón durante la preñez temprana, evaluando su participación en un modelo in vitro. Observamos que tanto en el útero como en la decidua, el LPS tiene importantes efectos sobre el sistema endocannabinoide (SEC) modulando la síntesis y la degradación de AEA y la expresión de los receptores de estos compuestos (receptores de cannabinoides, CB). Demostramos también que la AEA induce su propio catabolismo en la decidua. Por otro lado, encontramos que la AEA media el efecto estimulatorio del LPS sobre la síntesis de NO y la expresión de la NO sintasa inducible (NOSi), a través de sus receptores específicos. También hallamos que la AEA participa en la modulación que ejerce el LPS sobre el camino biosintético de las PGs, hecho que puede contribuir a la contracción miometrial que favorece la expulsión de los fetos en un proceso de sepsis. Se estudiaron distintas enzimas del camino biosintético y del metabolismo de las PGs, y se observó que la AEA aumenta la expresión de la Ciclooxigenasa-2 (COX-2) mientras que inhibe la de la PGE sintasa microsomal 1 (PGESm-1) e incrementa la síntesis del metabolito de PGE2 (PGEM). Por otro lado, el efecto deletéreo de la endotoxina sobre los tejidos estudiados pudo ser bloqueado en parte cuando se co-incuba con antagonistas de los receptores de cannabinoides, sugiriendo que estos compuestos son parte del mecanismo de acción del LPS.

Descripción: Antecedentes: El Cd2+ es un importante contaminante ambiental. Desde el punto de vista endocrinológico se conoce que afecta los niveles séricos de hormonas adenohipofisarias en humanos, pero su mecanismo de acción permanece desconocido. Objetivos: Estudiar los mecanismos de acción del Cd2+ sobre la adenohipófisis utilizando un modelo de células en cultivo. Validar el modelo in vitro realizando estudios in vivo. Evaluar posibles estrategias terapéuticas. Resultados: El Cd2+ afectó de manera directa la viabilidad y la liberación de prolactina de las células adenohipofisarias. El Cd2+ produjo estrés oxidativo y aumento de los niveles citosólicos de Ca2+. Distintos antioxidante redujeron su efecto, tanto sobre la viabilidad como sobre la liberación hormonal. El Cd2+ aumentó la producción de NO, el cual fue citoprotector. El tratamiento in vivo con Cd2+ causó estrés oxidativo en la hipófisis y el hipotálamo y también aumentó la expresión de las óxido nítrico sintasas (NOS)1 y 2. La melatonina previno el daño oxidativo pero no los cambios a nivel hormonal. Conclusiones: El estrés oxidativo parece ser el principal mediador de los efectos citotóxicos del Cd2+ in vitro. El modelo in vitro parece reproducir los efectos in vivo del Cd2+. Aunque la melatonina previno el daño oxidativo no hizo lo mismo con los cambios a nivel hormonal. Esto sugiere que otros mecanismos estarían involucrados en el efecto del Cd2+ sobre la liberación hormonal in vivo. Aun así, los antioxidantes podrían servir, potencialmente, para el tratamiento de las intoxicaciones con Cd2+.

Descripción: En este trabajo se investigó en el útero de ratonas preñadas la participación de los sistemas óxido nítrico-NOS, PGs-COX y endocannabinoides-receptores CB en el inicio del parto prematuro (PP) y el parto a término (PaT), así como las interacciones entre ellos. En primer lugar se estableció un modelo de parto prematuro (PP) inducido por lipopolisacáridos bacterianos, usado como herramienta en los estudios posteriores. Seguidamente se estudiaron las prostaglandinas y las enzimas encargadas de su síntesis, las ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2). Se encontró que tanto en los momentos previos al PaT como al PP aumenta la producción de PGE2 y PGF2α. Este aumento parece deberse a una inducción de la COX-2, ya que el meloxicam, un inhibidor selectivo de esta isoforma, fue capaz de revertir el aumento de las prostaglandinas y de prevenir el PP y retrasar el PaT. En cuanto al NO, se encontró que su síntesis se ve incrementada en el PP, mientras que disminuye en el PaT. Cuando se estudiaron las isoenzimas encargadas de su síntesis, se encontró que la iNOS varió siguiendo el mismo patrón, mientras que la eNOS y la nNOS permanecieron sin cambios. La administración del inhibidor selectivo de la iNOS aminoguanidina resultó capaz de demorar el PP. Se estudió también la síntesis de anandamida (AEA), el principal endocannabinoide, hallándose que aumenta en el PaT pero permanece sin cambios en el PP. La actividad de la FAAH, encargada de la degradación de la AEA no mostró cambios en ninguno de los dos casos y los niveles de los receptores de cannabinoides, CB1 y CB2, no variaron en el final de la gestación. Sin embargo el aumento de la AEA al final de la gestación no resultó preponderante para el inicio del parto. Los estudios de interacciones demostraron que la AEA posee la capacidad de inducir la síntesis de PGs e inhibir la actividad de NOS, y que ambos efectos son ejercidos vía el receptor CB1. A su vez, la síntesis de AEA no parece ser afectada por las prostaglandinas, mientras que sería inhibida por altos niveles de NO e inducida por bajos niveles de NO. Finalmente, se encontró que las PGs solo actúan sobre la síntesis de NO, inhibiéndola, cuando esta se encuentra exacerbada. Nuevamente el NO presentó un efecto dual al estudiar como regulaba la producción de PGs, ya que cuando se sintetiza en altas cantidades estimula la producción de PGs, pero la inhibe cuando es producido en bajos niveles.

Descripción: En este trabajo se ha evaluado el rol de la leptina sobre el desarrollo embrionario, el metabolismo lipídico embrionario y placentario, y la producción de NO embrionaria y placentaria en la rata sana, en modelos experimentales de diabetes y en la placenta de mujer sana y con diabetes mellitus. La leptina está disminuida en tejido placentario de ratas y mujeres diabéticas, y en embriones de ratas diabéticas. En estos últimos es capaz de regular negativamente la producción embrionaria de NO, importante morfógeno, que se encuentra en niveles elevados en embriones de rata diabética. La hormona, en cambio, modula positivamente la producción de NO en placenta de rata sana y diabética. La leptina provoca una disminución en las concentraciones de lípidos neutros en embriones de rata diabética. En la placenta de estos animales, donde se observa un incremento del catabolismo lipídico y una disminución en la síntesis lipídica de novo, así como en la placenta de rata sana, la hormona regula negativamente los niveles lipídicos, a través de un aumento en la actividad catabólica placentaria, sin influenciar la síntesis lipídica de novo. Estas funciones de la leptina se evidencian también en el tejido placentario humano. El trabajo realizado ha permitido identificar en el embrión y la placenta funciones parácrinas de la leptina relacionadas con el metabolismo lipídico y nitridérgico. Las anomalías en los niveles de leptina embrionarios y placentarios en la diabetes, vinculan a esta hormona con las alteraciones reproductivas inducidas en esta patología.

Descripción: El óxido nítrico (NO) es un mediador clave de múltiples procesos biológicos. En la adenohipófisis, además de regular la secreción hormonal, el NO puede inducir apoptosis o bien tener un papel citoprotector. Esto muestra que esta molécula tiene un papel activo en la regulación de la vida y muerte celular adenohipofisaria. El objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar la participación del NO en los procesos de muerte celular en la adenohipófisis y sus mecanismos de acción, estableciéndose dos objetivos puntuales: 1. Investigar los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por altas concentraciones de NO, situación que puede presentarse durante procesos inflamatorias. 2. Investigar el proceso de regulación de la muerte celular luego de la ovariectomía y dilucidar el papel del NO en este proceso. Los resultados del primer objetivo han permitido identificar algunos de los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por concentraciones micromolares de NO en las células adenohipofisarias. Dentro de los mecanismos que caracterizan a la vía apoptótica mitocondrial, se pudo establecer la sobreproducción mitocondrial de especies reactivas del oxígeno (ROS) como uno de los eventos disparadores de esta cascada apoptótica. Este aumento de ROS indujo cambios en la expresión de Bax y Bcl-2 y la activación posterior de la caspasa 3, que llevó finalmente a la muerte celular. Paralelamente a esta secuencia de eventos, el NO modificó la actividad de las diferentes enzimas antioxidantes y alteró los niveles intracelulares de glutatión, lo cual demuestra un papel activo del sistema de defensa antioxidante celular durante el desarrollo de este proceso apoptótico. Los resultados del segundo objetivo mostraron, tanto in vivo como in vitro, que luego de la ovariectomía hay un aumento de la muerte celular en la glándula debido a la inducción de apoptosis. Paralelamente, se observó un incremento en los niveles adenohipofisarios de NO. Estos cambios pudieron ser prevenidos por el tratamiento con inhibidores de la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) demostrando, por primera vez, que el NO tiene un papel clave en la ejecución de la muerte celular desencadenada en la adenohipófisis luego de la ovariectomía.

Descripción: La Diabetes Mellitus es un transtomo sistémico con alteraciones del metabolismo de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas. La forma clínica predominante es la diabetes tipo 2 o no-insulino dependiente, siendo la enfermedad cardiovascular, la principal causa de muerte en estos pacientes. El desarrolllo de la diabetes está precedido por un período de resistencia a la insulina y de hiperinsulinemia. La incidencia de hipertensión arterial y el stress oxidativo están aumentados en los pacientes diabéticos y asociados a alteraciones vasculares. Se evaluó la disfunción endotelial en la diabetes tipo 2 mediante diferentes estudios clínicos en pacientes y se realizaron estudios experimentales con células endoteliales humanas, ratones y macrófagos. Se propusieron como objetivos: - Determinar la presencia de activación plaquetaria y la expresión de proteínas adhesivas. - Evaluar el metabolismo del óxido nítrico y la expresión de NOS. - Estudiar la liberación de citoquinas y FvW. - Determinar los niveles plasmáticos de ET-l en los pacientes diabéticos y su interacción con el NO. - Relación entre los niveles plasmáticos de insulina, PAI-l y Péptído C. - Evaluación de la función endotelial a través de la medición de la respuesta vasodilatadora a la isquemia hiperémica. - Seguimiento secuencial de los parámetros metabólicos, vasoactivos y marcadores de disfunción endotelial en una población de individuos hipertensos bajo tratamiento con una droga antihipertensiva y en otra población sin tratamiento farmacológico. - Estudiar la acción de los AGEs en células endoteliales obtenidas a partir de cordón umbilical humano. Determinar la migración de las CE en presencia de AGEs. Realizar co-cultivos de células endoteliales con eritrocitos provenientes de pacientes diabéticos tipo 2. - Determinar la respuesta en un modelo experimental animal (ratones Balb/c) expuesto a distintas concentraciones de albúmina glicosilada. - Estudio comparativo entre macrófagos murinos y la línea celular U-937, monoblastos de origen humano, diferenciada a macrófagos. La acción de los AGEs observada en los experimentos in vitro e in vivo reprodujo, en parte, los resultados obtenidos en los pacientes estudiados. Los pacientes diabéticos expresaron marcadores de activación plaquetaria y presentaron alteraciones en el metabolismo del NO y su interrelación con la ET-l. Las proteínas reactantes de fase aguda tales como FvW, Fibrinógeno y PAI-1 estuvieron elevadas y asociadas a la condición de insulino-resistencia. Las drogas antihipertensivas tipo IECA mejoraron significativamente la función endotelial, disminuyendo el riesgo de eventos trombóticos.

Descripción: La rama gruesa ascendente del asa de Henle reabsorbe el 30% del cloruro de sodio (NaCl) filtrado por el glomérulo. Aproximadamente 60% del ión sodio (Na+) es reabsorbido a través del transporte activo transcelular. Como resultado del transporte activo de solutos, existe un voltaje luminal positivo en esta segmento, que favorece la reabsorción del Na+ restante a través de la vía paracelular. El óxido nítrico (NO) promueve natriuresis y diuresis, en parte debido a la inhibición del transporte de solutos en la rama gruesa ascendente del asa de Henle. Se sabe que el NO inhibe la reabsorción transcelular de sal, pero se desconocen sus efectos sobre la vía paracelular. Para evaluar el efecto del NO en la selectividad de esta última, comenzamos por medir los potenciales de dilución causados por la reducción de la concentración de NaCl en la solución del baño basolateral a 64/56, 32/24 ó 16/8 mM Na+/Cl- en túbulos de la rama gruesa ascendente del asa de Henle aislados y perfundidos. A partir de los diferentes potenciales de dilución calculamos el radio de permeabilidad Na+/Cl- (PNa+/PCl-). Dicho radio es una medida de permeselectividad paracelular, y encontramos que era ~2 en todos los casos. Estos datos indican que la vía paracelular en este segmento del nefrón es más selectiva para Na+ que para el ión cloro (Cl-) por un factor de 2, e indican que el transporte transcelular no se alteró de manera significativa por la dilución de NaCl en el baño basolateral. En los experimentos siguientes empleamos la solución conteniendo 32/24 mM de Na+/Cl-. Al utilizar dos dadores de NO químicamente distintos o el sustrato para la producción endógena de NO, L-arginina, se observó una disminución de PNa+/PCl-. Estos resultados demuestran que NO tiene un efecto sobre la selectividad de la vía paracelular, pero no indican específicamente cómo las permeabilidades absolutas de cada ión se ven afectadas. Para investigar el efecto del NO sobre PNa+ y PCl- individualmente, es necesario medir tanto PNa+/PCl- como la resistencia transepitelial (Rt). La Rt refleja solamente las vías de transporte conductivas y, en la rama gruesa ascendente del asa de Henle, representa mayormente la resistencia de la ruta paracelular. Bajo condiciones control, el valor de Rt hallado fue 7700 ohm-cm. Cuando se agregó L-arginina, la Rt disminuyó, y dicho efecto fue bloqueado por el inhibidor de NOS, L-NAME. Estos resultados demuestran que el NO disminuye la función de “barrera” de la ruta paracelular. A continuación medimos una vez más el efecto del NO producido de manera endógena sobre los potenciales de dilución y PNa+/PCl-. Con estos datos y los valores de Rt obtenidos, calculamos PNa+ y PCl- individualmente, hallando que el NO incrementó PNa+ un 40% y PCl- un ~100%. La mayoría de las acciones del NO en el túbulo proximal y la rama gruesa ascendente del asa de Henle están mediadas por guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Es por esto que investigamos si este segundo mensajero está mediando los efectos del NO sobre la vía paracelular observados en nuestro modelo. El GMPc disminuyó PNa+/PCl- y Rt, provocando el aumento de PNa+ y PCl- de manera similar al NO. Estos datos sugieren que GMPc está mediando el efecto final del NO sobre las permeabilidades absolutas. El GMPc puede activar dos mediadores posteriores en la vía de señalización, la proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG) y la fosfodiesterasa 2 (PDE2). Por lo tanto, evaluamos cuál de ellos está mediando las acciones del NO. En presencia del inhibidor de PKG, KT5823, el dador de NO no tuvo efecto significativo sobre el potencial de dilución. En contraste, cuando repetimos este experimento utilizando un inhibidor de PDE2, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución, de manera similar a lo descripto anteriormente para aquellos experimentos donde solamente utilizamos un dador de NO. Estos datos indican que PKG, y no PDE2, es el mediador del efecto del NO sobre la ruta de transporte paracelular. La Rt y la selectividad iónica de la vía paracelular están reguladas por una familia de proteínas llamadas claudinas. La rama gruesa ascendente del asa de Henle expresa claudina-19, que ha sido anteriormente relacionada con la regulación de la permeabilidad de Na+. Además, la claudina-19 puede formar combinaciones heteroméricas y heterotípicas con las claudinas-3 y -16 en este segmento. Para evaluar si los efectos de NO sobre la vía paracelular están mediados por un poro del cual al menos la claudina-19 forma parte, medimos los potenciales de dilución en presencia o ausencia de un anticuerpo contra un dominio extracellular de la claudina-19 o contra la proteína Tamm-Horsfall (control). Cuando el anticuerpo anti-claudina-19 estaba presente, ni el dador de NO, ni el sustrato para la producción endógena de NO -L-arginina- tuvieron efecto sobre los potenciales de dilución. En presencia del anticuerpo anti-Tamm-Horsfall, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución. Estos datos sugieren que los efectos del NO sobre la vía paracelular son mediados por un poro formado al menos por una unidad de la claudina-19. Finalmente, modelamos matemáticamente el efecto del NO sobre la concentración luminal de Na+ a lo largo de la rama gruesa ascendente del asa de Henle basándonos en nuestros resultados. Bajo condiciones control, en ausencia de NO, la concentración luminal de Na+ decae exponencialmente a 22.4 mM al final de dicho segmento. Cuando consideramos el efecto del NO sobre la vía paracelular únicamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 33.9 mM, más alta que en control, indicando que se absorbe menos Na+. Al tener en cuenta el efecto del NO sobre la vía transcelular solamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 46.2 mM, y al considerar su efecto sobre ambas vías combinadas, 52.5 mM. Por lo tanto, el efecto del NO sobre la ruta paracelular provoca una reducción en la reabsorción neta de Na+. La magnitud de dicha reducción es similar a aquella resultante de NO actuando sobre la ruta transcelular, pero el efecto del NO sobre ambas vías combinadas tiene una dinámica de antagonismo.

Descripción: ambos cambios dependientes de óxido nítrico. En segundo lugar, se ha establecido que el precondicionamiento con un estímulo hipóxico de baja intensidad, confiere tolerancia parcial a una injuria hipóxica más severa 24 h después. Mediante la administración de moduladores de las HIF-prolil hidroxilasas, demostramos que la acumulación de HIF-1 durante el precondicionamiento es necesaria para que se manifieste la tolerancia a una injuria hipóxica posterior. Por último, observamos que la administración de inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS y el precondicionamiento hipóxico, aplicados en forma conjunta, tuvieron un efecto aditivo, logrando una neuroprotección completa. Los resultados obtenidos sugieren que los efectos neuroprotectores de los inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS en nuestro modelo se deben a efectos independientes de la acción de NO sobre la vía de HIF-1.

Descripción: En el presente trabajo se estudiaron anomalías en el corazón y elpulmón fetal en un modelo de diabetes moderada en rata y se evaluaron los efectos dela administración de agonistas de los receptores activados por proliferadoresperoxisomales α y γ (PPARα, PPARγ) sobre dichas alteraciones. En el corazón y el pulmón fetal de rata diabética se evidenció en forma sexodependiente,sobreacumulación de lípidos, disminución en la expresión de enzimas deoxidación lipídica, aumento en la producción de óxido nítrico (NO) y lipoperoxidos ydisminución de la expresión de PPARα y PPARγ. La administración intrafetal de agonistas de PPARα (LTB4) y PPARγ (15dPGJ2)hacia finales de la gestación o tratamientos maternos con dietas enriquecidas enácidos grasos agonistas de los PPAR durante toda la preñez, mostraron regular variosparámetros alterados por la diabetes materna en corazón y pulmón fetal, entre ellos laanómala expresión de los PPAR y de enzimas y transportadores involucrados en elmetabolismo lipídico, la sobreproducción de NO y el daño oxidativo a lípidos. Variosde los efectos de los agonistas de PPAR variaron de acuerdo al órgano y el sexo fetal. Además, los tratamientos dietarios mostraron efectos particulares de acuerdo al tipode ácido graso suplementado en la dieta materna. De esta forma se identificaron anomalías en el metabolismo de lípidos ymarcadores de un estado pro-inflamatorio y pro-oxidante en corazones ypulmones fetales durante la gestación de rata diabética a término, que sevinculan con alteraciones en la expresión y función de los receptores nucleares PPAR. Estas anomalías podrían condicionar el desarrollo y función de dichosórganos teniendo consecuencias en la vida posnatal. A su vez, se describieronefectos benéficos de los agonistas de PPAR como moduladores de las alteracionesfetales provocadas por la diabetes materna.

Descripción: El objetivo de este trabajo de tesis fue el estudio a nivel molecular de la interacción dela melatonina (N-acetil-S-metoxitriptamina) con dos radicales libres de relevanciabiológica, el radical oxhidrilo (OH·) y el óxido nítrico (NO). Para el desarrollo del presente trabajo se analizaron estas interacciones químicas desdeun enfoque teórico, mediante técnicas de simulación computacional, desde un enfoqueexperimental, a través del estudio de las mismas en condiciones aisladas y controladas,y a través de la evaluación de los alcances fisiológicos de las reacciones propuestas. Para evaluar las interacciones con los diferentes blancos se analizó, en primer término,la superficie de energía potencial de la melatonina mediante técnicas de dinámicamolécular basadas en campos de fuerzas clásicos y métodos semiempíricos. Se prestóespecial atención a los aspectos relacionados con su libertad conformacional en vacío yen solución acuosa. Asimismo, se analizó la dependencia de las propiedadesmoleculares con la conformación. La reacción con el radical oxhidrilo se estudió mediante técnicas de estructuraelectrónica, evaluando los posibles mecanismos de reacción y realizando una exhaustivacaracterización de los intermediarios. El estudio de la interacción con NO se puede dividir en dos partes: i) la identificación ycaracterización de los productos de reacción y la elucidación de los mecanismosoperantes en diversos medios; y ii) el estudio del efecto de la melatonina sobre labiosíntesis de NO en la retina de hámster. Finalmente, mediante el uso de técnicas de resonancia magnética nuclear y de dinámicamolecular, se realizó un estudio detallado de la interacción entre la melatonina y lacalmodulina, una proteína con probado efecto estimulatorio en la biosíntesis del NO.