Descripción: Este trabajo está compuesto por dos capítulos referidos a dos patologías reproductivas femeninas con alteraciones severas en la dinámica folicular, que se producen de forma iatrogénica. En primer lugar, se estudian implicancias del factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B) en la patogénesis del Síndrome de Hiperestimulación Ovárica (OHSS). En segundo lugar, se estudia el efecto protector del esfingolípido ceramida-1-fosfatp (C1P) sobre la foliculogénesis en la Falla Ovárica Prematura (FOP) ocasionada por gonadotoxicidad de drogas quimioterapéuticas. I)Síndrome de estimulación ovárica (OHSS) El OHSS es una complicación iatrogénica severa del crecimiento y maduración folicular ocasionada por la inducción de la ovulación con gonadotrofinas en tratamientos de fertilización. La prevalencia de OHSS se encuentra entre el 5-10% de las pacientes que se someten a estas técnicas y una de sus características principales es el aumento de la permeabilidad de la microvasculatura. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) está involucrado en la patogénesis de este síndrome, induciendo alta permeabilidad vascular, y por consiguiente, la presencia de ascitis en las pacientes. En nuestro laboratorio, hemos demostrado que la inhibición del VEGF disminuye la severidad del OHSS en un modelo desarrollado en rata. Pero además, para que exista una vasculatura madura y funcional, colaboran junto al VEGF otros sistemas angiogénicos, como la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la familia de las esfingosina-1 fosfato. Sin embargo, hasta ahora ningún estudio ha mostrado la posible participación de estos sistemas en la patología mencionada. En base a estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: La desregulación de los sistemas de PDGF y S1P está involucrada en la patogenia de OHSS, afectando en parte a la angiogénesis ovárica y aumentando la permeabilidad vascular que conduce a la presencia de ascitis observada en este síndrome. Los objetivos específicos propuestos fueron: 1- Estudiar el efecto in vivo intraovárico que produce el agregado de PDGF-B sobre la permeabilidad vascular y la angiogénesis ovárica, y su relación con la dinámica folicular y luteal, y con la esteroidogénesis en un modelo de OHSS desarrollado en rata. 2-Estudiar el transporte de colesterol en fluidos foliculares humanos (FF) de pacientes sometidas a técnicas de reproducción asistida (ART) con alto riesgo de desarrollar OHSS y pacientes controles. 3-Evaluar el efecto in vitro que produce el agregado del esfingolípido S1P al FF proveniente de pacientes con alto riesgo de desarrollar OHSS sobre un cultivo primario de células vasculares de músculo liso. II) Falla prematura ovárica (FOP) La FOP es un desorden multicausal caracterizado por la desaparición o disfunción prematura de los folículos ováricos, que afecta al 1-2% de mujeres menores de 40 años. Estas pacientes presentan amenorrea, hiperestrogenismo y elevados niveles de gonadotrofinas. Las causas que provocan FOP pueden ser: genéticas, inmunes, infecciosas y/o iatrogénicas (quimioterapia, radioterapia). La mayoría de las drogas quimioterapéuticas,tales como ciclofosfamida y doxorubicina, poseen un fuerte efecto tóxico sobre el ovario, afectando tanto la reserva ovárica como la vasculatura. Hasta ahora, los tratamientos disponibles para FOP no son efectivos. Por otra parte, se ha demostrado que esfingolípidos como la ceramida, la esfingosina y sus formas fosforiladas, la ceramida-1-fosfato (C1P) y la esfingosina-1 fosfato (S1P), regulan procesos celulares escenciales, la apoptosis, la migración y la angiogénesis. Hasta ahora ningún trabajo ha evaluado la participación de C1P en ovario en condiciones patológicas, tal como la FOP inducida con quimioterapia. En base a estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: El C1P protege al ovario en la FOP inducida por quimioterapia a través de la modulación de la función ovárica, la mejora de la dinámica folicular y la angiogénesis. Los objetivos específicos fueron: 1- Analizar el efecto in vivo intraovárico del esfingolípido C1P en ovarios provenientes del modelo de FOP inducida por quimioterapia desarrollado en ratón hembra adulto sobre: el desarrollo folicular, la astresis, la apoptosis ovárica, los niveles de esteroides sexuales, el desarrollo y estabilidad vascular del ovario, los mecanismos de transducción de señales, la funcionalidad ovocitaria y la fertilidad de la hembra; 2- Evaluar el efecto in vitro que produce el C1P sobre la viabilidad y la funcionalidad celular en una línea celular de macrófagos expuestos a quimioterapia. En cuanto al modelo de OHSS, el tratamiento local con PDGF-B disminuyó el % de estructuras quísticas, los niveles de progesterona sérica, la expresión de las enzimas esteroidogénicas P450scc y 3β-HSD, la proliferación de células luteales y la permeabilidad vascular ovárica comparado a las ratas OHSS sin tratar. Por otra parte, aumentó el área peri-endotelial en cuerpos lúteos y quistes luteales, así como la deposición de colágeno IV en las membranas basales. Todos estos efectos indican una disminución en la permeabilidad vascular y presencia de ascitis, las cuales representan una de las mayores complicaciones causadas por el OHSS. Al estudiar los FF de pacientes con riesgo a desarrollar OHSS, se observaron alteraciones en los perfiles lipoporteicos y en proteínas relacionadas con el metabolismo del colesterol, así como también alteraciones en las células peri-endoteliales (claves para la estabilidad vascular) al ser tratadas con FF de pacientes con riesgo de OHSS, respecto de FF de pacientes control. Respecto al modelo de FOP inducida por quimioterapia en roedor, observamos que la ciclofosfamida tuvo fuertes efectos gonadotóxicos sobre el ovario (disminución de folículos pequeños y aumento de folículos atrésicos, aumento de la apoptosis, pérdida de la reserva ovárica, alteraciones vasculares, hormonales y disminución en la fertilidad). Todos estos efectos fueron prevenidos, al menos de manera parcial, por la co-administración local de C1P junto con la quimioterapia. Además, la ciclofosfamida causó modificaciones en la morfología uterina, que fueron prevenidas por el co-tratamiento con C1P. Por último, se estudiaron los efectos citotóxicos in vitro en macrófagos generados por ciclofosfamida, siendo estas las células inmunes más relevantes del ovario. C1P fue capaz de aumentar la viabilidad celular y la producción de citoquinas, y de deisminuir la apoptosis inducida por ciclofosfamida en este tipo celular. En conclusión, los resultados observados en el modelo de OHSS indican que el sistema de PDGF participaría activamente en el ovario, regulando la permeabilidad vascular y estableciendo una vasculatura funcional. En el futuro, en el ámbito clínico, este factor podría utilizarse como marcador predictivo y evitar el desarrollo del síndrome en las pacientes que comienzan un tratamiento de fertilización asistida. Por otra parte, los resultados obtenidos con el modelo de FOP inducida por quimioterapia sugieren que C1P es capaz de mejorar la dinámica folicular y de modular el desarrollo vascular en el ovario. Por lo tanto, C1P cumpliría un rol protector en el ovario, preservando la funcionalidad ovárica frente a la toxicidad causada por la quimioterapia. En el futuro, la administración de C1P podría implementarse como posible estrategia para proteger el ovario antes y/o durante el tratemiento antitumoral. De esta manera, aquellas pacientes que han padecido cáncer y están recuperadas tendrían mayor posibilidad de concebir un hijo.

Descripción: El objetivo de la presente investigación consistió en evaluar los efectos in vivo e in vitro de la inhibina A recombinante humana durante distintos estadios del desarrollo folicular. En particular se evaluó el efecto de esta glicoproteína sobre la proliferación de células de la granulosa en cultivo, sobre la apoptosis y la expresión de proteínas pro y anti apoptóticas y sobre la esteroidogénesis ovárica en ratas prepúeberes tratadas con DES o con PMSG. Los resultados indican que la inhibina A es producida in vitro por las células de la granulosa en cultivo obtenidas de ovarios de ratas estimuladas con DES y que su producción es estingulada por FSH, TGFβ y estradiol. También se observa que concentraciones fisiológicas de inhibina A disminuyen la proliferación celular inducida por estos tres factores. Además del efecto antiproliferatívo se observa, en este mismo modelo experimental, que la administración de inhibina A in vivo produce un retraso en el desarrollo folicular y un aumento de la apoptosis. Estos hallazgos fueron confirmados por ensayos in vitro donde se observa un aumento significativo de a fragmentación del ADN en folículos antrales tempranos incubados con inhibina A. Con respecto a la expresión de proteínas pro y anti apoptóticas la inhibina A produce tanto in vivo como in vitro un aumento en los niveles de Bax, mientras que los niveles de Bcl-2 permanecen constantes. Por otra parte la inhibina no tiene ningún efecto en la esteroidogénesis. En cuanto a los ensayos realizados con ovarios de ratas estimuladas con PMSG se observó que la inhibina A no tiene efecto alguno sobre la proliferación de células de la granulosa en cultivo. Tampoco se advirtió ningún efecto de esta glicoproteina sobre la fragmentación del ADN en cultivos de folículos preovulatorios. Por otra parte la administración in vivo de inhibina en estas ratas produce un retraso en el desarrollo folicular de folículos inmaduros, pero no tiene ningún efecto en el crecimiento de folículos preovulatorios. Asimismo, en todos los tipos foliculares estudiados se observa una disminución de la apoptosis. Como conclusión, estos resultados sugieren que la inhibina A posee una acción local en el ovario, siendo uno de los factores de acción autocrina o paracrina que regula el crecimiento folicular.

Descripción: La Falla Ovárica Prematura (FOP) es un desorden multicausal caracterizado por la desaparición o disfunción prematura de los folículos ováricos, que afecta al 1- 2% de mujeres menores de 40 años. Estas pacientes presentan amenorrea, hipoestrogenismo y elevados niveles de gonadotrofinas. La mayoría de las drogas quimioterapéuticas, tales como ciclofosfamida y doxorrubicina, poseen un fuerte efecto tóxico sobre el ovario, afectando tanto la reserva ovárica como la vasculatura. Hasta ahora, los tratamientos disponibles para FOP son poco efectivos o de alto costo económico. Este trabajo de investigación está compuesto por dos capítulos donde se evalúa la posible efectividad de dos terapias (“fotobiomodulatoria” y farmacológica) para prevenir la FOP inducida por quimioterapia. Para ello, se utilizó un modelo murino de FOP inducida por ciclofosfamida (CTX: agente alquilante). En primer lugar, se estudió el efecto protector de un tratamiento local con un láser de baja intensidad (LLL). En segundo lugar, se estudió el efecto protector de la aplicación sistémica de melatonina (MEL). Se propone como objetivo general evaluar la efectividad de estas dos terapias como nuevas estrategias no invasivas y de bajo costo para proteger al ovario de los efectos gonadotóxicos de CTX. Se ha demostrado que la terapia con láseres de baja intensidad (LLLT) es capaz de modular procesos biológicos tales como la proliferación, la apoptosis, la diferenciación celular, la inflamación, la migración y la angiogénesis. Hasta ahora ningún trabajo ha evaluado los efectos del LLL local en el ovario en condiciones patológicas. La LLLT es una herramienta de bajo costo, no invasiva y de gran versatilidad que ha demostrado tener efectos beneficiosos en el tratamiento de múltiples patologías donde las terapias farmacológicas convencionales han demostrado ser poco efectivas. La MEL es una neurohormona secretada por la glándula pineal de mamíferos y su rol principal es la regulación del ritmo circadiano. En las últimas décadas se encontró que también es sintetizada en varios órganos periféricos y que actúa en múltiples tipos celulares activando receptores específicos, MT1 y MT2. MEL es una molécula lipofílica con un fuerte efecto antioxidante, siendo capaz de ejercerlo ya sea neutralizando directamente Especies Reactivas del Oxígeno (ERO) o indirectamente mediante sus receptores. Se sabe que la quimioterapia posee efectos gonadotóxicos sobre el ovario. Los resultados mostraron que los animales que solo recibieron CTX presentaron un aumento en la atresia folicular, reducción de folículos antrales, aumento de la apoptosis, pérdida de la reserva ovárica, alteraciones vasculares y reducción en los niveles de progesterona. Todos estos efectos fueron prevenidos, al menos de manera parcial, por la aplicación local de LLLT o la aplicación sistémica de MEL. Adicionalmente, en ensayos in vitro en cultivos primarios de células de granulosa, se observó que la doxorrubicina (DOXO: antraciclina) indujo una marcada reducción en la viabilidad. Sin embargo, el LLLT fue capaz de reducir en forma parcial la apoptosis causada por la DOXO. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo sugieren que tanto la aplicación local de LLLT como la administración sistémica de MEL son capaces de mejorar la dinámica folicular, reducir la apoptosis y mejorar el desarrollo vascular en el ovario expuesto a CTX. Por lo tanto, ambos tratamientos serían capaces de proteger al ovario de la injuria gonadotóxica causada por CTX, posicionándolos como terapias “fertoprotectoras” viables durante un tratamiento con quimioterapia. De esta manera, aquellas pacientes que han padecido cáncer y están recuperadas tendrían mayor posibilidad de concebir un hijo.

Descripción: En este trabajo se han realizado experimentos para dilucidar la función local en el ovario de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH-I). Se han estudiado procesos fundamentales del desarrollo folicular como la síntesis de esteroides sexuales y la angiogénesis ovárica en su relación con la apoptosis folicular. En nuestro laboratorio se postuló que el GnRH-I ejerce una acción inhibitoria durante el desarrollo folicular actuando como modulador intraovárico. En ratas estimuladas con gonadotrofinas analizamos los niveles de esteroides sexuales y la expresión y contenido de enzimas ováricas responsables de la síntesis de esteroides luego del tratamiento con un agonista de GnRH-I, Acetato de Leuprolide (LA). Los efectos observados se han corroborado con experimentos realizados in vitro utilizando este mismo agonista. Además, estudiamos factores angiogénicos esenciales para el desarrollo y establecimiento de la vasculatura en el folículo ovárico, como también parámetros de la atresia folicular. El tratamiento con el agonista afectó la síntesis de esteroides ováricos al igual que el contenido folicular de las enzimas esteroidogénicas, produciendo una disminución en la síntesis de andrógenos y como consecuencia, en la producción de estradiol. Estos resultados se observaron en los experimentos realizados in vivo e in vitro. También se observó una disminución en el contenido de factores angiogénicos y de sus receptores, acompañado de un aumento de la actividad de caspasa-3, enzima efectora clave en el proceso de apoptosis folicular. Se concluyó que el factor GnRH-I actuaría en el ovario localmente afectando factores esenciales para el desarrollo folicular. Este factor interfiere en la foliculogénesis inducida por gonadotrofinas, alterando la síntesis de esteroides gonadales e inhibiendo la angiogénesis folicular. Esto alteraría el balance de los factores de supervivencia de las células foliculares, causando la activación de proteínas reguladoras de la apoptosis, llevando a los folículos en desarrollo al proceso de atresia.

Descripción: La antesis de una flor es un estadio crucial para el destino del ovarioya que estímulos endógenos -polinización O nivel hormonal elevado- oexógenos -aplicación hormonal- inducen el proceso de fructificación. Enausencia de estos estímulos el ovario deja de crecer e inicia un proceso desenescencia. Dada la importancia que posee la aplicación hormonal mejorando elestablecimiento de los frutos de tomate cuando la autopolinización resultaalterada por las condiciones ambientales, el objetivo de este trabajo fueestudiar el control de actividades proteolíticas durante los procesosalternativos de senescencia o fructificación del ovario. Como sistema experimental se emplearon ovarios no polinizados yfrutos en desarrollo obtenidos por polinización natural o aplicación deauxinas o giberelinas a ovarios no polinizados. La ausencia de estímulos endógenos o exógenos inició el programa desenescencia en los ovarios no polinizados, aunque éstos mantienen susensibilidad hasta por lo menos 20 dpa. Durante este periodo seevidenciaron parámetros característicos de la senescencia como ladisminución en los niveles de la subunidad mayor de la RuBisCO y elincremento en la actividad proteolítica sobre azocaseína, en los polipéptidosrelacionados antigénicamente con papaina y la tiolproteasa C14, y en laexpresión del gen C14-tiolproteasa. El proceso de fructificación, en cambio,fue acompañado por una disminución de estos parámetros. Los resultados obtenidos indicarían que en los ovarios no polinizadosla expresión y/o actividad de proteasa/s de la familia de la papaína esregulada temporal y espacialmente durante los procesos alternativos desenescencia o fructificación.

Descripción: El gen FMR1, responsable del Síndrome de Fragilidad del X (SFX), se localiza en el sitio FRAXAen el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3), está compuesto por 17 exones, abarcaaproximadamente 38 kilobases (kb) y su producto transcripcional es un ARN mensajero de 3,9 kbque puede sufrir splicing alternativo. En su región 5’ no codificante presenta una zona de tripletes CGG que puede variar en longitud. Según el tamaño de la expansión, los alelos se clasifican ennormales (5- 44 repeticiones), intermedios (45-54 repeticiones), premutados (55- 200repeticiones) o con mutación completa (>200 repeticiones). Mientras que la mutación completaes la causante del SFX, el estado de premutación se asocia a otros 2 desórdenes clínicos: Síndrome de temblor/ ataxia asociado a la Fragilidad del X (FXTAS), un desordenneurodegenerativo de inicio tardío y a la Insuficiencia Ovárica Primaria (IOP) asociada a la Fragilidad del X (FXPOI). La IOP se define como la presencia de amenorrea (de al menos 4 meses) antes de los 40 años, quese acompaña de un aumento en los niveles séricos de FSH (a niveles menopáusicos) y de bajosniveles de estradiol (hipoestrogenismo). Es un síndrome muy heterogéneo de patogénesismulticausal tales como alteraciones cromosómicas, enzimáticas, autoinmunidad, causasiatrogénicas e infecciosas. Tiene una incidencia del 1% en mujeres menores de 40 años y del 0,1%en menores de 30. FXPOI es la causa genética conocida más común de la IOP 46, XX y la premutación en FMR1 esresponsable del 4- 6% de todos los casos de IOP 46, XX. Aproximadamente el 2% de las mujeres 46, XX con IOP aislada y el 14% de la mujeres 46, XX con IOP familiar son portadoras de lapremutación en el gen FMR1. Asimismo, se ha descripto que alrededor del 20% de las mujeresportadoras de la premutación desarrollan IOP. A su vez, las mujeres portadoras se vuelvenmenopáusicas aproximadamente 5 años antes que las no portadoras. Si bien no todas las mujeresportadoras de la premutación experimentan una temprana pérdida de la fertilidad, todas ellasenfrentan el potencial adelantamiento en la aparición de condiciones asociadas con la deficiencia estrogénica (aumento en el riesgo de osteoporosis y de enfermedades cardiovasculares). Estudiosgenéticos epidemiológicos sugieren que el comienzo y la gravedad de la disfunción ováricaasociada a FXPOI son variables y podrían estar moduladas, potencialmente, por el largo de lasrepeticiones CGG y otros factores ambientales. El status de premutación per se pareciera estar influyendo en la expresión de la enfermedad. Dehecho, no se ha descripto que mujeres que poseen expansión completa de tripletes (>200repeticiones y con signos clínicos de Síndrome de Fragilidad del X) desarrollen IOP. Si bien no seconoce el mecanismo por el cual la premutación del gen FMR1 puede causar la disfunción ováricay la insuficiencia ovárica primaria, se ha postulado que puede ocurrir una disminución inicial delnúmero de folículos o una velocidad acelerada de la atresia. Es sabido que la proteína que codificaeste gen, FMRP, se expresa en altas cantidades en células germinales del ovario fetal. Asimismo,se ha descripto que esta proteína actúa como inhibidor de la traducción de algunos ARNmensajeros formando parte de los procesos de silenciamiento génicos mediados por miRNAs. Teniendo en cuenta su función, se ha postulado como posible hipótesis de la patogenia, que unaumento de FMRP en estadios tempranos del desarrollo de los ovocitos podría conducir a unahaploinsuficiencia de proteínas involucradas en este proceso, provocando una disminución delpool inicial de folículos. Sin embargo, y dado que en FXTAS se ha observado un aumento del ARN mensajero del gen como consecuencia de la premutación, se postula como mecanismosalternativo la existencia de un aumento del ARN mensajero en el ovario que ejerza un efectotóxico en el tiempo, con el consecuente incremento de la atresia folicular. Ninguno de estosmecanismos han sido aún comprobados en el ovario, más aún la función fisiológica de la proteínaen el mismo no está establecida. No se conoce además, si existe expresión diferencial a lo largodel desarrollo folicular. Considerando la escasa información que existe acerca de FMR1 y su expresión en ovario, nuestrotrabajo consistió, en una primera fase, en el estudio de la expresión de la proteína FMRP y sumensajero a lo largo de la foliculogénesis, en un modelo de rata. Se utilizaron 3 grupos de ratas: ratas prepuberales de 18 días, ratas prepuberales de 21-23 díastratadas con dietilestilbestrol (DES) para enriquecer a los ovarios en folículos antrales tempranosy ratas prepuberales de 21-23 días tratadas con gonadotrofina coriónica equina (PMSG) paraenriquecer los ovarios en folículos preovulatorios. En la primera parte del trabajo analizamos, por inmunohistoquímica, la expresión de FMRP en losdistintos tipos celulares del folículo. Hallamos que la proteína se expresa en células de lagranulosa, de la teca y en células estromales, con excepción de un grupo de células que rodea alfolículo. La expresión se detectó en los folículos en los tres estadios del desarrollo estudiados:preantrales, antrales tempranos y preovulatorios. La expresión de la proteína FMRP fue estudiada también por Western blot en los tres tiposfoliculares. Observamos una menor expresión en folículos preantrales y una mayor expresión enestadios más avanzados de la foliculogénesis. Por otra parte, se detectaron al menos 4 isoformasde la proteína cuyos patrones de expresión resultaron diferentes a los observados en testículo ycerebro. Teniendo en cuenta la función de la proteína como parte del complejo de silenciamientopost-transcripcional, estos resultados nos permitirían estimar que las diferencias observadas en losniveles de expresión de la proteína tendrían un rol en el correcto desarrollo del folículo. Asimismo, la presencia de isoformas distintivas en el ovario sugeriría una función específica paraalgunas de ellas en la gónada. La segunda parte del trabajo consistió en el estudio de la expresión del ARN mensajero de Fmr1en los 3 estadios foliculares. Por PCR en tiempo real observamos que el patrón de expresión eraopuesto al que se obtuvo para la proteína. En los folículos preovulatorios, el nivel del ARN fuemenor respecto al de los estadios anteriores. Estos resultados sugerirían que la expresión delmensajero y su proteína en el ovario están regulados de manera diferente y posiblementeindependiente. Por otro lado, identificamos por RT-PCR y posterior secuenciación, la existenciade varias isoformas del ARNm del gen, resultantes del splicing alternativo del mismo. Entre ellas,detectamos la isoforma que contiene al exón 12, la cual no ha sido previamente descripta en rata. El último aspecto que quisimos abordar en nuestro estudio fue el efecto biológico de laintroducción de tripletes en el rango de la premutación sobre una línea celular de células degranulosa humana (KGN). Par tal fin se transfectaron las células con un plásmido conteniendotripletes en el rango normal o de la premutación, río arriba de un gen reportero (GFP). Luego de 18 horas de transfección, los niveles de ARNm del gen reportero resultaron más elevados en lascélulas que poseían los tripletes en el rango de la premutación, en concordancia con lo observadoen diferentes experimentos y pacientes con FXTAS. Asimismo, detectamos una menor cantidadde células que expresan la proteína GFP, en presencia del plásmido con la premutación, en todoslos tiempos de transfección estudiados. A nivel neuronal se ha relacionado al estado de premutación con posibles efectos apoptóticos enla célula. Si bien nuestros estudios aún no demuestran que el efecto de la introducción de tripletesen el rango de la premutación resulte en un aumento en la apoptosis de las células KGN, losresultados obtenidos en esta tesis abren la posibilidad de que este mecanismo sea analizado en unfuturo. En conclusión, en esta tesis se describe por primera vez la expresión de la proteína FMRP y de sumensajero a lo largo del desarrollo folicular, y la presencia de algunas isoformas distintivas,producto del splicing alternativo del gen. Asimismo, se iniciaron los estudios tendientes ademostrar el efecto patogénico que posee la expresión de tripletes expandidos en células delovario.

Descripción: Las orexinas son neuropéptidos hipotalámicos que regulan el balance energético y el ciclo sueño/vigilia. Ejercen su acción mediante dos receptores (OX1 y OX2) en SNC y tejidos periféricos. En esta tesis se estudió si la expresión del precursor (PPO) y receptores de orexinas se hallaban relacionados con el control central de la función reproductiva, en ratas. Para ello, se evaluó dicha expresión en el eje hipotálamo-hipófiso-gonadal y áreas específicas del SNC en machos y hembras durante el ciclo estral y se correlacionó con la ingesta, el ciclo luz/oscuridad y el estado hormonal, mediante el uso de agentes bloqueantes de la ovulación y bajo los efectos de la castración y terapia de reemplazo. Posteriormente se profundizaron los estudios analizando la expresión de los receptores en sistemas in vitro y observando los efectos de antagonistas de los receptores de orexinas en la ingesta, hormonas, ovulación y morfología ovárica. La reproducción, el balance energético y el ciclo sueño/vigilia están integrados. Aquí se demuestra que la expresión de las orexinas y sus receptores está sujeta a una compleja regulación hormonal; y que las orexinas juegan un papel fundamental en la integración neuroendocrina de la reproducción.

Descripción: La endometriosis (EDT) es una de las enfermedades ginecológicas más frecuentes en mujeres en edad reproductiva. Se trata de una patología benigna, estrógeno dependiente, que se caracteriza por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina. Los principales síntomas son el dolor pélvico y la infertilidad. Las terapias médicas disponibles en la actualidad son insuficientes debido a las numerosas recidivas y los efectos adversos que generan. Resulta indispensable la búsqueda de tratamientos alternativos que inhiban los mecanismos involucrados en el desarrollo de la enfermedad, que puedan ser administrados por periodos prolongados sin interferir con la posibilidad de lograr un embarazo, que protejan la fertilidad y que resulten inocuos. Dado que los compuestos naturales cumplen con estas condiciones, hace algunos años que en nuestro grupo orientamos la búsqueda de terapéuticas hacia este tipo de compuestos, entre ellos, el resveratrol. Se trata de un polifenol presente en las uvas y sus derivados como el vino, frutos rojos y maníes, que ha demostrado tener potencial anticancerígeno. Estudios realizados en nuestro laboratorio comprobaron sus efectos inhibitorios sobre el desarrollo de la EDT experimental. Estos resultados nos alentaron a profundizar en la investigación de este compuesto y, para ello, nos propusimos dos objetivos específicos: estudiar los mecanismos a través de los cuales el resveratrol interfiere con el avance de esta patología utilizando distintos modelos in vitro y evaluar los efectos de un tratamiento oral prolongado, tal como el que requieren las pacientes, en un modelo murino de EDT, sobre el desarrollo de la enfermedad y sobre el ovario. En esta tesis demostramos que el resveratrol tiene efecto inhibitorio sobre la viabilidad celular y promueve la apoptosis en una línea celular proveniente del epitelio de una lesión endometriósica (12Z) y en una línea celular de estroma endometrial humano (St-T1b), modificando los niveles de expresión y cambios post traduccionales de proteínas involucradas en el proceso. Sobre las líneas celulares y sobre cultivos primarios de células estromales endometriósicas derivadas de tejido ectópico de pacientes con EDT, comprobamos que la fitoalexina regula la expresión de genes involucrados en la migración celular llevando a la inhibición de dicho proceso. Asimismo, observamos que el compuesto modula ciertos parámetros angiogénicos. Por otro lado, encontramos que el resveratrol aumentó los niveles de expresión génica de marcadores de pluripotencia en las líneas celulares 12Z y St-T1b y en los cultivos primarios mencionados previamente. Este trabajo constituye el primer reporte que demuestra en células endometriósicas la capacidad de la fitoalexina de mantener estable a las células pluripotentes evitando su proliferación e, incluso, tal como se plantea en bibliografía sería capaz de conducir a las células a un estado de estrés metabólico que promueve la muerte celular. Asimismo, conociendo el papel clave de los estrógenos en el desarrollo de la EDT, resultó alentadora la disminución ejercida por el resveratrol sobre los niveles de expresión proteica del receptor de estrógenos α (REα) y de la enzima aromatasa P450, sobre una línea celular epitelial de adenocarcinoma endometrial humano (ECC-1) y una línea celular de estroma endometrial humano (T-HESC). En el modelo in vivo de EDT experimental observamos que el resveratrol, redujo el número de lesiones endometriósicas desarrolladas, promovió la infiltración y la involución epitelial de las lesiones e indujo la apoptosis, tanto en las células epiteliales, como en las células estromales que conforman las lesiones. Asimismo, observamos que el compuesto provocó un aumento significativo en la cantidad de folículos primordiales y una disminución significativa en la cantidad de folículos atrésicos en el ovario. Estos resultados sugieren que la fitoalexina podría estar ejerciendo un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de las lesiones endometriósicas, a la vez que protege al ovario. Estos resultados, en conjunto con nuestros trabajos previos, avalan el estudio del resveratrol como una estrategia novedosa para tratar la EDT, que debe continuar profundizándose.

Descripción: El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es una patología reproductiva de alta incidencia en mujeres en edad fértil. La etiología del SOP se desconoce, pero actualmente se postula que un exceso androgénico intrauterino genera programación fetal. El SOP es una de las principales causas de infertilidad. Esto puede atribuirse no solo a disfunción ovárica ya que aun restableciendo la función ovulatoria o mediante técnicas de reproducción asistida, existe una alta tasa de aborto espontaneo lo que sugiere un problema de receptividad uterina. En este trabajo, nos propusimos estudiar los efectos de la hiperandrogenización prenatal (PH) sobre el tejido uterino en un modelo murino de programación fetal por exceso androgénico, el cual nos permite emular características de tipo SOP en ratas adultas. Nuestros resultados revelan que la PH conlleva a la expresión de dos fenotipos: ovulatorio irregular y anovulatorio, los cuales presentan hiperandrogenismo, quistes ováricos y alteraciones hormonales y metabólicas. En el útero, las vías de señalización responsables de la homeostasis celular se encontraron alteradas. Como consecuencia, se han observado cambios en la histomorfología uterina que se evidencian por un aumento del grosor uterino, displasia del epitelio luminal e hiperplasia glandular que se asocian con la presencia de un estado pro-oxidante y un estado pro-inflamatorio elevado. En conclusión, estos resultados revelan que la PH programa a largo plazo las vías de señalización responsables de la proliferación, supervivencia y muerte celular, generando una desregulación homeostática que se traduce en cambios en la histomorfología del útero lo que condicionaría su funcionalidad.

Descripción: El objetivo de esta tesis es el estudio de factores regulatorios, de producción yacción local, que controlan el desarrollo del folículo ovárico en mamíferos. Enparticular, se estudió el papel fisiológico de factores relacionados con el factor decrecimiento transformante-β (TGF-β).El modelo utilizado consistió en células de lagranulosa inmaduras de rata cultivadas en condiciones definidas. Se determinóque las células de la granulosa producen TGF-β bioactivo, encontrándose susecreción bajo control hormonal. El TGF-β producido ejerce acciones autocrinas,estimulando el crecimiento de células de la granulosa. La activina, otro miembrode la misma superfamilia, también es producida por las células de la granulosa yregula positivamente la proliferación de manera significativamente mayor que larealizada por el TGF-β. Factores paracrinos derivados del ovocito, probablementepertenecientes a la misma superfamilia, promueven el crecimiento de las célulassomáticas del folículo, indicando que el ovocito participa activamente en eldesarrollo folicular. Las acciones mitogénicas del TGF-β, activina o del factorderivado del ovocito sobre las células de la granulosa, son amplificadas por bajasconcentraciones de FSH, enfatizando la potencial relevancia de estos factoressobre la función ovárica. Asimismo, estos factores locales ejercieron unregulación diferencial de la producción de inhibinas A y B, llevando la relaciónentre las formas hacia la predominacia de inhibina B, de manera semejante a loencontrado in vivo en los estadios de crecimiento folicular. Estos resultados indican que factores intraováricos, relacionados con el TGF-β,juegan un papel importante en el desarrollo folicular, regulando el crecimiento y ladiferenciación de las células de la granulosa.

Descripción: Leptina, proteína de 16 kDa sintetizada y secretada principalmente por el tejido adiposo, parece serun regulador de la función reproductiva. En este trabajo evaluamos la acción de distintos niveles deleptina sobre la expresión de las principales isoformas de su receptor en el eje hipotálamo-hipófisis-ovario, y el efecto de NPY y 17β-estradiol sobre estos receptores en el eje hipotálamo-adenohipófisis,ambos durante el proceso ovulatorio. Utilizamos como modelo biológico ratas inmaduras estimuladascon gonadotrofinas y evaluamos mediante estudios in vivo e in vitro la expresión del mensajero (RTPCR)y de la proteína (western blot) de los receptores de leptina. Encontramos que tanto leptina comolas gonadotrofinas son capaces de regular diferencialmente la expresión del mensajero y de la proteínade ambos tipos de isoformas en el eje reproductivo, en forma dosis y tejido dependiente. Por otro lado, NPY y 17β-estradiol fueron capaces de inducir la expresión del mensajero y de la proteína de ambasisoformas en el eje hipotálamo-adenohipófisis a través del receptor de NPY tipo 1 y de los receptoresestrogénicos α y/o β, respectivamente. Como el efecto estimulatorio o inhibitorio de leptina sobre la función ovárica podría depender de laactivación diferencial de sus receptores, estudiamos las vías JAK2/STAT3 y ERK1/2, y la expresiónde SOCS3 (western blot) en el eje reproductivo durante el proceso ovulatorio. Utilizamos ratasestimuladas con gonadotrofinas las que recibieron los siguientes tratamientos: i) tratamiento agudo, lasque recibieron 5 dosis de leptina (5 μg c/u) o vehículo durante el proceso ovulatorio, o ii) tratamientodiario, las que recibieron 3 μg de leptina o vehículo por día durante 12 días a partir del destete. Observamos que el tratamiento agudo, que inhibe la función ovárica, i) disminuye la expresión de p-ERK1/2 en hipotálamo, adenohipófisis y ovario; ii) disminuye la expresión de p-STAT3 enadenohipófisis y ovario; y iii) aumenta la expresión de SOCS3 en adenohipófisis y ovario. En eltratamiento diario, que estimula la función ovárica, observamos que i) aumenta la expresión de p-STAT3 y p-ERK1/2 en hipotálamo y en ovario; ii) disminuye la expresión de SOCS3 en ovario; y iii)no hubo cambios en estas vías en adenohipófisis. Al evaluar in vitro la acción directa de leptina sobreestos caminos de señalización en ovario observamos que la presencia de leptina es capaz de aumentarla expresión de p-STAT3 a bajas y altas concentraciones, la expresión de p-ERK1/2 a bajasconcentraciones y los niveles de SOCS3 a altas concentraciones. Con estos resultados podemos concluir que las gonadotrofinas, leptina, NPY y 17β-estradiol soncapaces de regular la sensibilidad a leptina a lo largo del eje reproductivo por modular la expresión desus receptores, y que los cambios observados en las distintas vías de señalización inducidos pordiferentes niveles de leptina pueden ser, al menos en parte, responsables del efecto positivo o negativoque leptina ejerce sobre el proceso ovulatorio. Palabras claves: receptor de leptina, leptina, NPY, 17β-estradiol, hipotálamo, adenohipófisis, ovario,proceso ovulatorio, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Descripción: El objetivo de esta tesis fue el estudio de un modelo animal de tumor ováricocon ciertas similitudes con patologías ováricas hormono-dependientes yendocrinamente funcionales. El luteoma se desarrolla al autoinjertar un ovarioen el bazo de una rata hembra adulta bilateralmente ovariectomizada, por lahipergonadotrofinemia resultante. En estudios de un año de duracióndeterminamos que son tumores benignos y no modifican el estado general delanimal. La mayoria de los animales portadores de tumor cursan congonadotrofinas elevadas por un período de tiempo prolongado. Los luteomassecretan inhibina determinando un patrón particular de secreción de FSH. Invitro estos tumores presentan la esteroidogénesis basal alterada. La administración crónica de buserelina (análogo de GnRH)tuvo un claro efectoantitumoral: redujo la aparición de tumores e inhibió su crecimiento. A travésde receptores específicos de afinidad similar al ovario control, la buserelinaejerce un efecto directo sobre las células de luteomas: inhibe la secreción deprogesterona estimulada por LH. Las células tumorales son más sensibles aeste efecto que las células lúteas control. Sin embargo, los receptores para GnRH en las células de los luteomas se encuentran desacoplados de su viaclasica de segundos mensajeros: fosfolipasa C. En nuestros trabajos caracterizamos los luteomas en diversos aspectos queabarcan al animal entero hasta estudios subcelulares.

Descripción: Esta tesis está dirigida al estudio de factores regulatorios, de producción y acción local, quecontrolan el desarrollo del folículo ovárico en mamíferos. El modelo que se escogió es elbovino, del cual se obtuvo fluido folicular de folículos en diversos estadios de desarrollo asícomo también células de la granulosa con las que se establecieron cultivos primarios. Alternativamente se utilizó la línea celular BGC-1, obtenida a partir de cultivos primarios degranulosa bovina, la cual fue validada en términos de su respuesta proliferativa y productosde secreción característicos de los estadios inmaduros de desarrollo folicular. Se determinóque la actividad mitogénica presente en medios condicionados de células BGC-1 es debida ala presencia de fibronectina (FN). La expresión de ésta fue estimulada por la acción delfactor de crecimiento transformante β (TGF-β), el cual a su vez alteró el patrón de “splicing” del ARNm de FN, estimulando la inclusión del exón ED-I (FN-ED-I+). Posteriormente, se determinó por Western blot que existen importantes cambios en laexpresión de FN-ED-I+ a lo largo del desarrollo folicular, los cuales están correlacionadosinversamente con la actividad gonadotrófica en cada folículo, evaluada a través de los nivelesde estradiol en fluído folicular. Asimismo, el tratamiento de cultivos primarios con AMPc,mediador de la acción de gonadotrofinas, reduce sensiblemente la expresión de FN-ED-I+. Finalmente se determinó que el dominio ED-I confiere propiedades de factor decrecimiento a la FN, ya que un péptido recombinante de esta región promovió laproliferación de cultivos de células BGC-1. Estos resultados indican que la FN juega un papel importante en el desarrollo folicular,regulando la proliferación dc las células de la granulosa en las primeras etapas del desarrollofolicular.

Descripción: La insulino resistencia se define como la baja habilidad de la insulina para ejercer sus acciones metabólicas. Se sabe que este estado metabólico alterado es capaz de afectar a los tejidos de manera diferente. El período prenatal es un momento crítico del desarrollo en el cual el feto es vulnerable a alteraciones en el ambiente materno que predisponen al desarrollo de patologías durante la vida adulta. Con un modelo murino de programación fetal por exceso de andrógenos hemos logrado emular en ratas adultas características de tipo síndrome de ovario poliquístico, dando dos fenotipos característicos uno ovulatorio irregular y otro anovulatorio. Estos dos fenotipos presentan un estado metabólico alterado caracterizado por una hiperglucemia, hiperinsulinemia e insulino resistencia sérica; y una insulino resistencia hepática que afecta tanto el metabolismo de la glucosa como la lipogénesis. A su vez encontramos alteraciones en la vía de señalización de la insulina en el ovario de manera fenotipo dependiente; estas alteraciones conllevan a una disminución de la respuesta metabólica a la insulina que es capaz de comprometer la fisiología del ovario y que se traduce en las alteraciones ovulatorias encontradas. Estas alteraciones encontradas tanto a nivel metabólico como reproductivo son reversibles a distintos niveles luego de un tratamiento con metformina.

Descripción: El cuerpo lúteo (CL) es una glándula endocrina transciente que surge, luego de la ovulación, de la luteinización de las células de granulosa y tecales del folículo ovárico. Las células luteales son responsables de producir progesterona para permitir el comienzo y el mantenimiento del embarazo. En caso de no producirse la fecundación, el CL se degenera en un proceso denominado luteólisis, decayendo los niveles de progesterona. La formación y la regresión del CL requieren de una extensa reestructuración del tejido, cuyos mecanismos moleculares aún permanecen en gran parte desconocidos. La apoptosis o muerte celular programada ha sido relacionada con la regresión o luteólisis del CL en distintas especies. Sin embargo existen controversias acerca de la participación de este proceso en el CL. Los miembros de la familia de las caspasas son cisteín-proteasas que se encuentran involucradas tanto en los eventos tempranos como en los tardíos de la apoptosis, jugando un papel central en dicho proceso. La expresión de algunas caspasas ha sido descripta en la luteólisis, con resultados contradictorios de acuerdo a los distintos modelos estudiados. La hipótesis de esta tesis fue que cambios en la expresión y/o actividad de las caspasas están involucrados en la regresión o luteólisis del CL. Por lo antes expuesto, el objetivo de esta tesis fue evaluar los cambios de expresión y/o actividad de diferentes caspasas durante la formación y regresión del CL utilizando distintos modelos. Obteniéndose los siguientes resultados y conclusiones: Varios miembros de la familia de las caspasas (-2, -8, -9 y -3) se encuentran expresados y activos en el CL durante la fase lutea del ciclo menstrual natural del mono rhesus. Asimismo, se observó un aumento transciente en la actividad de las tres caspasas iniciadoras y la principal caspasa efectora en MLCL (donde los niveles de progesterona aún son elevados). La regulación de las caspasas en el CL de primates sería a nivel de la traducción o de la activación enzimática y no a nivel de la transcripción. En cuanto a los resultados obtenidos del modelo de remoción y reemplazo hormonal, éstos sugieren que las gonadotrofinas y esteroides locales, estarían regulando principalmente la activación de la cascada de las caspasas a nivel de las iniciadoras (-2, -8 y -9). Durante la formación y regresión del CL en el ciclo estral y la preñez en la rata, se observó una expresión y/o actividad dinámica en las caspasas iniciadoras (-2, -8 y -9) y la principal efectora (-3). La actividad de las caspasas-2, -3 y -9 aumentó en el CL del ciclo anterior en E durante la luteólisis funcional, seguido de un aumento en el número de células apoptóticas y disminución en el peso en el CL del ciclo anterior en DII. Asimismo, se observó un aumento transciente en la actividad de las tres caspasas iniciadoras y la principal caspasa efectora en el CL de preñez en los días 19 y/o 21 de gestación. Este aumento fue previo o coincidente con la disminución en los niveles luteales de progesterona. Por otro lado, se observó un aumento significativo en el número de células apoptóticas e incremento en la actividad de la 20α-HSD luego del parto. Por lo tanto, un camino apoptótico independiente de las caspasas podría estar involucrado en la regresión estructural del CL de la preñez luego del parto en la rata. El tratamiento in vivo con PGF-2α a ratas en el día 14 de preñez, disminuyó los niveles luteales de progesterona a las 24 horas post inyección y esta disminución podría ser la responsable del aumento significativo en la actividad de las cuatro caspasas evaluadas a las 36 horas post tratamiento. Mientras que, no fue capaz de producir cambios notorios en el porcentaje de células apoptóticas en el CL de la preñez a los distintos tiempos post inyección evaluados. En conclusión, la activación temprana de las caspasas en el ciclo mentrual del mono rhesus, y en el ciclo estral y la preñez de la rata, sugieren que estas proteasas están involucradas en la etapa temprana de la regresión del CL. Mientras que, la administración exógena con PGF-2α no necesariamente mimetiza la luteólisis fisiológica, ya que la caída en los niveles de progesterona precede la activación de las caspasas. Además, de acuerdo a los resultados obtenidos en los distintos modelos estudiados, el control en la expresión de las caspasas puede diferir respecto al de su actividad. Dado que la actividad de las tres caspasas iniciadoras evaluadas aumentan significativamente en el CL del ciclo menstrual del mono, de la preñez de rata y post administración de PGF-2α; ambos caminos apoptóticos (camino mitocondrial y camino de receptores de muerte) se encontrarían involucrados.

Descripción: A la fecha, se conocen 24 variantes de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH). Se ha demostrado en numerosos vertebrados,incluyendo mamíferos, que más de una variante de GnRH son expresadas en una misma especie. En la rata existen evidencias postulando la presencia de diferentes variantes de GnRH, conjuntamente con la ya caracterizada GnRH-I, ellas son: GnRH-II, gpGnRH, sGnRH y lGnRH-III. Por otro lado, se demostró la presencia de más de un receptor de GnRH (GnRHR) en distintas especies. Sin embargo, en un modelo ampliamente utilizado como lo es la rata, hay controversia acerca de los sistemas de GnRH presentes. El objetivo de esta Tesis, consiste en estudiar los distintos sistemas de GnRH presentes en rata. En este trabajo estudiamos extractos peptídicos de distintos tejidos mediante diferentes sistemas de RP-HPLC conjugado con detección con distintos RIA para GnRH, determinamos la actividad biológica de las diferentes variantes postuladas en rata y abordamos la búsqueda de un receptor diferente del conocido GnRHR tipo-I. Concluimos que, la actividad gonadotrófica hipofisaria parece estar mediada por el sistema GnRH-I/GnRHR tipo I. Demostramos la presencia de HypGnRH, aportamos fuertes evidencias de la expresión de GnRH-II en cerebro e hipófisis y postulamos la presencia de gpGnRH. No encontramos evidencias de la expresión de lGnRH-III o sGnRH. Establecimos que GnRH-I y GnRH-II poseen similares potencias en cuanto a su actividad hipofisaria, mientras que sGnRH y gpGnRH poseen una menor potencia. No detectamos efectos fisiológicos de lGnRH-III en células hipofisarias. Proponemos la existencia en células ováricas de un sitio de unión a GnRH diferente del expresado en hipófisis. Este trabajo evidencia la existencia de distintos sistemas de GnRH presentes en rata. Estos sistemas podrían participar en diferentes funciones como ser la modulación de la conducta sexual (ej GnRH-II), la regulación autócrina/parácrina de la respuesta gonadotrófica hipofisaria, regulación intra-ovárica de la función gonadal.

Descripción: El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es una de las principales causas de infertilidad femenina y está asociado a varias disfunciones metabólicas. La etiología de SOP se desconoce. Actualmente se postula un origen por programación fetal mediada por exceso andorgénico. Entre los factores asociados a su etiopatogenia, se encuentra el receptor activado por proliferadores de peroxisomas gama (PPARg), el cual es un sensor metabólico involucrado en la funcionalidad lipídica y reproductiva. PPARg actúa como factor de transcripción y se ha demostrado como regulador de la expresión de la adipoquina quemerina (asociada al desarrollo de trastornos metabólicos). En este trabajo, estudiamos los efectos de la hiperandrogenización prenatal (HP) sobre el sistema reproductivo y metabólico, y el rol de PPARg y quemerina sobre la funcionalidad ovárica en un modelo murino. Por otro lado, evaluamos el riesgo cardiovascular y el valor de quemerina como marcador metabólico en pacientes con SOP argentinas. Nuestros resultados revelan que la HP afecta el metabolismo lipídico sistémico y hepático, y la funcionalidad ovárica, involucrando una desregulación de PPARg y quemerina, y de la esteroidogénesis. Asimismo, conlleva a la expresión de dos fenotipos caracterizados por su ciclo estral: uno ovulatorio irregular y otro anovulatorio. Dichos efectos se detectan desde la pubertad tardía y persisten y se agravan a largo plazo, siendo mayores en el fenotipo anovulatorio. En cuanto a las pacientes con SOP determinamos el valor de corte de dos marcadores de riesgo cardiovascular. Encontramos que quemerina está incrementada en SOP y correlaciona con marcadores metabólicos. En conclusión, los resultados de este trabajo revelan que la HP conlleva efectos a largo plazo involucrando al sistema PPARg. Por otro lado, en cuanto a los pacientes con SOP, estos resultados resaltan la importancia del estudio y determinación de marcadores de riesgo metabólico en la población local.

Descripción: El cangrejo violinista Leptuca uruguayensis tiene como límite sur de su distribución geográfica la provincia de Buenos Aires, Argentina, donde la temporada reproductiva es corta. El objetivo de esta tesis fue estimar el esfuerzo reproductivo y comprender la estrategia de inversión energética que poseen las hembras de esta población en un estuario templado. En primer lugar, se estudió el patrón reproductivo de L. uruguayensis con una aproximación experimental en campo y laboratorio. Se registraron el tamaño de las hembras, el tiempo de incubación, el número de puestas que tienen y el tiempo entre las mismas. Luego, se evaluó la variación del estadio de desarrollo del ovario y el volumen del ovario y del hepatopáncreas a lo largo de la temporada reproductiva. Además, se analizaron las reservas en estos órganos mediante análisis bioquímicos. Esto permitió reconocer en la temporada reproductiva tres momentos, en cada uno de los cuales se registró un evento de puesta en la población. Debido a que las hembras de esta especie atraviesan dos temporadas reproductivas como adultas, se determinó que en el primer ciclo reproductivo, las hembras medianas y chicas pueden tener como máximo una puesta, mientras que, en el segundo ciclo reproductivo de sus vidas, las hembras grandes pueden tener hasta dos puestas. Además, se evidenció que las hembras emplean una estrategia reproductiva mixta en el manejo de la energía para la reproducción. Para conocer si el desempeño reproductivo de las hembras se modifica a lo largo de su vida, se evaluaron variables reproductivas teniendo en cuenta el ciclo reproductivo que atraviesan las hembras y el momento de la temporada reproductiva. Si bien las hembras de primer ciclo reproductivo mostraron menor fecundidad, el rendimiento reproductivo fue similar para todas las hembras, en todos los momentos de la temporada reproductiva. El volumen del huevo y los carotenoides se vieron afectados por los momentos de la temporada reproductiva y, la calidad nutricional de los huevos, por el ciclo reproductivo de la hembra. Debido a que se observó que sólo las hembras grandes son capaces de tener dos puestas en la misma temporada reproductiva, se evaluó la dinámica energética y el desempeño reproductivo de éstas. Se comprobó que las hembras grandes tienen la primera puesta de la temporada reproductiva utilizando mayoritariamente la estrategia de capitalización. Dos meses más tarde, tienen la segunda puesta utilizando en mayor medida la estrategia reproductiva de uso inmediato, mediante el incremento de la ingesta de energía evidenciado por el aumento en la tasa de alimentación. Las puestas de huevos producidas por las hembras en la primera puesta mostraron mayor fecundidad y peso que aquellas puestas que fueron producidas en la segunda puesta. Sin embargo, la energía asignada por las hembras grandes de L. uruguayensis a cada embrión fue similar en ambas puestas. Los resultados de este trabajo evidencian cómo las hembras de L. uruguayensis utilizan la energía disponible cuando la ventana de condiciones óptimas para reproducirse es estrecha, aplicando una estrategia reproductiva mixta que maximiza el uso de recursos asegurando un proceso reproductivo exitoso.