Descripción: Una vez que la memoria de largo término es almacenada mediante el proceso de consolidación, la presentación de un recordatorio, tal como claves contextuales presentes durante el aprendizaje, puede desencadenar un proceso de labilización y reconsolidación. La labilización-reconsolidación de la memoria posee procesos que le son inherentes: reactivación, labilización y reestabilización de la traza mnésica. Si cualquiera de ellos es interrumpido, el proceso completo no tendrá lugar. La determinación de los mecanismos moleculares que subyacen a cada proceso es uno de los temas de intenso estudio y debate en este momento en el campo de la neurobiología de la memoria. La primera parte de esta Tesis consistió en la puesta a punto de un nuevo protocolo de condicionamiento pavloviano contextual (CPC) en el cangrejo Neohelice granulata. Esto nos permitió realizar posteriormente estudios comparativos con otro paradigma de condicionamiento contextual en el ratón, Mus musculus. De esta manera, obtuvimos evidencias que indican que el cangrejo Neohelice granulata establece una asociación entre un contexto (estímulo condicionado, EC) y un estímulo aversivo (estímulo incondicionado, EI). El EC está compuesto por las características del contexto (iluminación, textura, color, patrón, etc.) y el EI es un estímulo visual de peligro. Al inhibir la vía de señalización del factor de transcripción NF-κB encontramos que tanto la consolidación como la reconsolidación de la memoria se ven impedidas. Este efecto permitió el estudio de las características del recordatorio capaces de desencadenar la labilizaciónreconsolidación de la memoria. Observamos que el proceso de labilización-reconsolidación es desencadenado únicamente ante la presentación específica del estímulo condicionado. Posteriormente realizamos un estudio comparativo entre el CPC en cangrejos y el condicionamiento de miedo contextual en el ratón. Estudiamos mecanismos moleculares que subyacen a la labilización de la memoria, encontrando que la degradación de proteínas a través del sistema de ubiquitina-proteasoma juega un rol importante en la labilización tanto en cangrejos como en ratones. Finalmente, pudimos determinar que una de las funciones que puede cumplir el proceso de reconsolidación está vinculada al reforzamiento de la memoria. Este fenómeno de reforzamiento ocurre en el CPC de Neohelice, mientras que no fue encontrado en el condicionamiento de miedo contextual en el ratón.

Descripción: La eritropoyetina (Epo) es una hormona cuya función mas conocida es su participación en el proceso de eritropoyesis, aunque, cada vez adquieren mas trascendencia otras funciones. En particular, a través de una acción antiapoptótica, aseguraría la supervivencia para que las células eritroides puedan cumplir con su programa de diferenciación. Una actividad similar cumpliría en otros tejidos. Así, el efecto de Epo a nivel del sistema nervioso central tendría un efecto neurotrófico y neuroprotector, previniendo la muerte de las neuronas ante el estimulo hipoxico o de shock. Aunque el mecanismo por el cual Epo ejercería el efecto neuroprotector no se conoce con exactitud, han sido implicados distintos mecanismos de activación celular. En el presente trabajo de tesis buscamos dilucidar algunos de los caminos de señalización de la actividad antiapoptotica atribuida al a Epo. Para ello, se estudio la acción de la hormona en modelos de apoptosis en una linea celular de origen neuronal, así como también algunas de sus potenciales vías de acción, a nivel de procesos que involucran la inactivación de caspasas, la modulación de factores de la familia Bcl-2 y de receptores de muerte y caminos mediados por JAK/STAT y PI3K7Akt. En este estudio se evaluó, inicialmente, una potencial acción protectora de la Epo en la linea celular SH-SY5Y inducida a diferenciación con staurosporina (STP), sustancia que, ademas, constituye un potente agente proapoptótico. El pretratamiento de las células con Epo previno el desarrollo de células apoptoticas por mecanismos mediados por la regulación positiva de la expresión de receptores de Epo (REpo) y la inducción de Bcl-XL. La Epo ha sido también postulada como factor anti inflamatorioo, ya que existen evidencias que le adjudican un efecto deneutralizaciónn de los efectos de algunas citoquinaspro inflamatorias.. En base a estos hallazgos, y una vez demostrada la acción antiapoptotica de la Epo en nuestro modelo celular, enfocamos la siguiente etapa a describir una potencial accion protectora frente al daño celular inducido por la citoquina pro inflamatoria TNF-α. Observamos un efecto proapoptotico de la citoquina con resultados cuali y cuantitativos coincidentes entre la aparición de células apocalípticasas, lcondensaciónón de cromatina, ldegradaciónón del ADNasísí como el aumento de la actividad de las caspasas 8 y 3 y ldegradaciónon de PARP. La sensibilidad de las células a la acción del TNF-α se encontró relacionada con un aumento de la expresión del receptor 1 de TNF. Cuando las células fueron incubadas en presencia de Epo previo a la inducción de apoptosis por TNF-α, se observó un efecto protector similar al encontrado en ensayos con STP. La Epo impidió la modulación positiva de los receptores de muerte e inhibió la activación de caspasas por mecanismos que involucran caminos de señalización mediados por JAK/STAT y PI3K, e inducen aumento de Bcl-2 y activación de NF-κB. La activación de este ultimo también fue inducida por acción de TNF-α, aunque este efecto no alcanzo para impedir el efecto proapoptotico de la citoquina. En conclusión, en el presente trabajo se describen mecanismos relacionados con el efecto antiapoptotico de la Epo frente a la muerte celular programada de células de origen neuronal inducida por STP y por TNF-α. Además, se detectó posible cross-talk entre caminos de señalización mediadores de la activacion de NF-κB que involucran tanto a receptores de muerte como la activacion por Epo/REpo. Los resultados sugieren que la sensibilidad celular a la apoptosis inducida por receptores de muerte puede ser regulada por diversos factores y que modificaciones del balance llevarían a supervivencia o muerte celular. El estudio realizado sustenta la capacidad de la Epo en su acción como factor anti inflamatorio, lo que podría marcar un rol muy importante como agente neuroprotector.

Descripción: La isquemia cerebral es un grave problema para la Salud Pública en países emergentescomo la Argentina. Aún no se conocen completamente los mecanismos celulares ymoleculares que participan de la propagación del daño desde la zona del infarto isquémico (core) hacia las zonas cercanas del cerebro que se definen como área de la penumbraisquémica. Esta expansión del daño hacia zonas distales a la lesión isquémica original es loque define el mal pronóstico de los pacientes. Las moléculas asociadas al daño o DAMP (del inglés Damage Associatted Molecular Pattern) como la proteína astroglial S100B aumentan en el espacio extracelular luego de laisquemia y son capaces de activar la respuesta inmune innata mediada por los receptoresde patrones moleculares (PRR, del inglés Pattern Recognition Receptor). Considerando que S100B ha demostrado tener acciones sobre astrocitos y neuronas en cultivo, nuestrahipótesis de trabajo propuso que la liberación local de S100B desde el core isquémicoactivaría el PRR RAGE, facilitando la respuesta inflamatoria, y extendería así el daño haciael tejido cerebral circundante. Utilizando un modelo de isquemia cerebral en animales de experimentación,administraciones intra-corticales de S100B purificada, cultivos puros neuronales y cultivosenriquecidos en astrocitos pudimos establecer que: i) S100B induce la sobrevida o muerteneuronal en neuronas expuestas a excitotoxicidad por glutamato en una forma dependientede la dosis, de la expresión de RAGE y de la activación del factor de transcripción NF-κB; ii) S100B facilita la conversión de los astrocitos hacia el fenotipo reactivo proinflamatorio enforma RAGE/NF-κB dependiente; iii) S100B liberada desde un foco en el parénquimacerebral induce cambios en astrocitos similares a los observados días después de la lesiónisquémica. En función de nuestros resultados proponemos que en las zonas vecinas al core isquemico S100B tendría efectos neurodegenerativos directos o en forma secundaria promoviendo laconversión astroglial hacia un fenotipo proinflamatorio activando la ruta RAGE/NF-κB. Estacascada intracelular emerge como un tentador blanco molecular para futuras estrategiasterapéuticas.

Descripción: Los coactivadores de receptores esteroideos (SRC), cumplen un rol importante en varios procesos biológicos. En células normales estas moléculas están presentes en cantidades limitantes, siendo casi indetectables, sin embargo, en ciertos tumores se encuentran sobre-expresadas. RAC3 pertenece a la familia de coactivadores p160 y hemos demostrado previamente que es coactivador de NF-κB, un factor de transcripción que induce numerosas respuestas biológicas relacionadas con la proliferación, diferenciación celular, y protección de apoptosis entre otras. En este trabajo se estudió el rol de RAC3 en la sensibilidad a la apoptosis, inducida tanto por vía intrínseca como la vía extrínseca. En la línea celular de riñón embrionario humano (HEK293) estudiamos la vía mitocondrial inducida por H2O2 y en células de leucemia mieloide crónica humana (K562), la vía extrínseca asociada a receptores con dominios de muerte inducida por una citoquina perteneciente a la familia de TNF: TRAIL. Esta línea fue descripta como naturalmente resistente al tratamiento con TRAIL. Observamos que la línea tumoral K562 posee niveles altos de RAC3 respecto de la línea HEK293. La sobre-expresión natural o por transfección del coactivador inhibe la apoptosis vía una disminución de la activación de caspasas, aumento de la actividad NF-κB, AKT, p38 y disminución de ERK. Lo opuesto fue observado por disminución de RAC3 mediante RNAi en K562, sensibilizando a la apoptosis por TRAIL. Observamos además, que la sobre-expresión de RAC3 inhibe la translocación de AIF al núcleo a través de mecanismos que involucran una interacción física entre RAC3, AIF, Hsp90 y proteínas del citoesqueleto. Estas observaciones sugieren que RAC3, además de actuar como coactivador a nivel transcripcional tendría un rol citoplasmático, participando en las cascadas que controlan la muerte celular y contribuyendo de este modo al desarrollo tumoral.

Descripción: La sumoilación, un sistema de modificación post-traduccional reversible similar a la ubiquitinación, consiste en una cascada enzimática que lleva a la conjugación de SUMO a proteínas blanco. Esta modificación regula procesos como el tráfico intracelular, degradación de proteínas, estructura y replicación cromosómica y regulación de la transcripción. En este trabajo se caracteriza a R-SUME (por “RWDcontaining SUMoylation Enhancer), un nuevo gen con un dominio RWD, clonado de una línea celular hipofisaria sobre-expresora de gp130 con un potencial tumorigénico y angiogénico aumentado. En células en cultivo, R-SUME se localiza tanto en núcleo como en citoplasma e inhibe la actividad transcripcional de Stat3, lo cual podría funcionar como un mecanismo de feedback negativo sobre gp130. Dada la similitud estructural entre el dominio RWD y la conjugasa de SUMO Ubc9, se estudiaron los efectos de R-SUME sobre la cascada de sumoilación. Se observa por Western blot que R-SUME aumenta la conjugación de proteínas por SUMO-1, -2 y –3, efecto que depende de Ubc9. En experimentos de pull-down, R-SUME interactúa con una proteína de fusión GST-Ubc9 aún en ausencia de SUMO, sugiriendo una interacción directa. Esto concuerda con la colocalización de R-SUME con Ubc9 en el núcleo observada por microscopía de fluorescencia. R-SUME estimula la sumoilación de IκB, un blanco de SUMO conocido, in vivo e in vitro, lo cual lleva a una inhibición de la actividad transcripcional de NF-κB. En conjunto, estos resultados indican que R-SUME cumple un rol importante en la regulación de la sumoilación de proteínas, lo cual puede tener un efecto significativo en numerosos procesos celulares.

Descripción: En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

Descripción: La Apnea del Sueño (AS) es un grave problema para la Salud Pública que afectaa una notable proporción de la población. En animales de laboratorio la AS se modela através de la exposición a hipoxia intermitente (HI) que induce alteraciones neuronales,gliosis reactiva, expresión del receptor RAGE y de su ligando S100B en el SNC. En esta tesis, desarrollamos un modelo de exposición a HI en cultivos primariosde hipocampo de roedores y ello nos ha permitido disecar algunas de las rutas deseñalización que serían responsables de la neurodegeneración y la gliosis reactiva quese observa en modelos experimentales de AS. Así, demostramos que la exposición a HIinduce stress oxidativo, activación de HIF-1 y NF-κB, un fenotipo reactivo en laastroglía y el acortamiento de las neuritas. Estas alteraciones, que correlacionan conlos cambios observados en los animales expuestos al modelo de AS por HI, fueronprevenidos por la aplicación en el medio de cultivo de anticuerpos neutralizantes de RAGE así como por la sobreexpresión de un dominante negativo de RAGE entregadopor un vector viral o el bloqueo farmacológico de NF-κB y Akt. La manipulaciónexperimental de los niveles de S100B no fue tan efectiva para reducir estasalteraciones. Basándonos en estos resultados utilizamos el mismo enfoque para intentardisminuir las alteraciones neuro-gliales en el modelo experimental de AS por HI enroedores. Así, el bloqueo de RAGE con anticuerpos neutralizantes administradosintrahipocampalmente o la expresión del dominante negativo de RAGE entregado porun vector viral, tanto como el bloqueo farmacológico de NF-κB fueron efectivos paradisminuir la gliosis reactiva y la neurodegeneración. Estos resultados indican que RAGE y NF-κB estarían involucrados en lasalteraciones neuronales y la gliosis reactiva inducidas por la AS. Estas rutas deseñalización serian así interesantes blancos moleculares para el desarrollo deestrategias de neuroprotección útiles en la AS.

Descripción: A lo largo de los últimos años, se ha acumulado una vasta evidencia experimentalseñalando a NF-κB como uno de los factores de transcripción (FT) más relevantes en laformación y reprocesamiento de memorias de largo término (MLT) en distintosmodelos animales y tareas de aprendizaje. Sin embargo, poco se sabe de los genes queson regulados por este FT durante procesos mnésicos. El objetivo de mi tesis fueidentificar y caracterizar algunos de los genes que son regulados por este FT durante laconsolidación de la memoria de reconocimiento de objetos en el hipocampo de ratón. Los resultados obtenidos indican que durante este proceso, NF-κB regula la expresiónde genes de respuesta temprana y tardía, en particular, del FT ZIF268 y de la proteinquinasa Ca(2+)-Calmodulina-quinasa II δ (CaMKIIδ), una sub-unidad de CaMKII cuyafunción en el sistema nervioso central se desconoce. El entrenamiento al paradigma de Reconocimiento de Objetos Novedosos, que lleva a la formación de una memoria dereconocimiento de largo término, indujo la expresión de ambos genes. ZIF268 seexpresa de manera rápida y transitoria dentro de las primeras horas postentrenamientoy su expresión es necesaria para la formación de una MLT. Por elcontrario, la expresión de CaMKIIδ se induce en forma tardía y sostenida, y persistehasta por lo menos 7 días luego del entrenamiento. Sorprendentemente, nuestrosresultados indican que CaMKIIδ no afecta la formación de la MLT, sino la formación ymantenimiento de una forma de MLT más persistente. A continuación, mostramos quela ocupación nucleosomal en ciertas regiones claves del promotor de CaMKIIδ se veafectada hasta 7 días luego del entrenamiento. Esta es la primera vez que sedemuestra que este tipo de modificaciones epigenéticas tienen lugar durante laformación y mantenimiento de la MLT. Por último, hallamos que, en neuronaspiramidales del hipocampo, CaMKIIδ se localiza principalmente en el núcleo, dendritasy terminales pre-sinapticas. Nuestros estudios funcionales, junto con los delocalización sub-celular aportan los primeros indicios respecto a los mecanismosmoleculares en los que podría intervenir CaMKIIδ en el sistema nervioso central.

Descripción: El sistema circadiano de mamíferos, controlado por los núcleos supraquiasmáticos hipotalámicos (NSQ), modula variables comportamentales, hormonales e inmunológicas. Estas pueden, a su vez, modular la actividad de los NSQ por medio de vías de retroalimentación. En el presente trabajo estudiamos el efecto de dosis subpirogénicas de lipopolisacárido (LPS) de E.coli y de citoquinas proinflamatorias sobre el sistema circadiano de ratones C57Bl/6J. La administración de LPS (25μg/kg, i.p.) produjo retrasos de fase CT 15 y no tuvo efectos al administrarlo en otros horarios. Retrasos similares fueron obtenidos tras la administración endovenosa de LPS (25μg/kg) y con la administración intracerebroventricular (i.c.v.) de IL-1beta y TNFalfa. Si bien esto permite calificar al LPS y a las citoquinas como estímulos fóticos, no se observaron efectos aditivos cuando LPS y pulsos de luz fueron coadministrados, sugiriendo que existe alguna interacción entre las vías activadas por ambos estímulos. A CT 15 el LPS produjo un aumento de la inmunoreactividad de c-Fos en la región dorsal de los NSQ y la inducción de mPer en los núcleos paraventriculares hipotalámicos (NPV) sugiriendo que estas zonas podrían ser las receptoras de la información proveniente del sistema inmune. La administración de sulfasalazina, un inhibidor del factor de transcripción NF-κB, disminuyó significativamente el cambio de fase inducido por LPS, indicando que esta vía de transducción de señales participa en la interacción entre el sistema inmune y el reloj biológico. Analizamos el rol de los astrocitos como posibles mediadores de la interacción inmunecircadiana estudiando la expresión de GFAP en los NSQ y analizando la capacidad de estas células de responder a citoquinas y LPS por medio de la activación de NF-κB. El análisis de la inmunorreactividad de GFAP fue realizado a lo largo del día, mostrando una tendencia a presentar variaciones con valores máximos a ZT3 y mínimos a ZT21. La presencia de NF-κB en astrocitos fue demostrada por inmunomarcación en los NSQ y en cultivos primarios de glía de NSQ. In vitro, la actividad κB aumentó aproximadamente 3 veces en respuesta a LPS y TNFα , y 1.7 veces con IL-1α. Los resultados presentados permiten establecer un modelo de interacción recíproca entre los sistemas inmune y circadiano en el que el sistema circadiano modula variables inmunológicas a lo largo del día y éstas, a su vez, son capaces de informar al oscilador central acerca de su situación. Es probable que las respuestas del oscilador central involucren la activación del factor de transcripción NF-κB y estén mediadas por los astrocitos de los NSQ. La interacción entre estos sistemas podría tener relevancia tanto en condiciones normales como en condiciones patológicas.

Descripción: El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina pro-inflamatoria implicada en promover el crecimiento de ciertos tipos de cánceres. En el presente trabajo de Tesis se exploraron los caminos de señalización intracelulares que llevan al crecimiento de las células de cáncer de mama inducido por TNFα y su interacción con el receptor tirosina quinasa tipo I, ErbB-2. Nuestros resultados indicaron que el TNFα, actuando a través del receptor de TNFα tipo 1 (TNFR1), indujo la activación de las quinasas activadas por mitógenos p42 y p44 (p42/p44 MAPK), la quinasa del amino terminal de c-jun (JNK) y la fosfatidilinositol 3-fosfato quinasa / Akt (PI3-K/Akt), la activación del factor de transcripción Factor Nuclear κB (NF-κB) y la proliferación celular. También comprobamos que la administración de TNFα in vivo indujo el crecimiento del tumor C4HD en ratones Balb/c y que el tratamiento con un inhibidor selectivo de NF-κB, Bay 11-7082, resultó en la regresión parcial de dicho tumor de mama. Asimismo, el Bay 11-7082 bloqueó la capacidad del TNFα de inducir el aumento de la proteína promotora del ciclo celular ciclina D1 y de la proteína antiapoptótica Bcl-XL. Un importante hallazgo fue demostrar que el TNFα indujo la transactivación de ErbB-2 en células de cáncer de mama que sobreexpresan ErbB-2. En estas células, el TNFα activa a la tirosina quinasa c-Src, promueve la fosforilación de ErbB-2 en el residuo Tyr877, y favorece la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3. Este último proceso lleva a la fosforilación de Akt, a la activación del factor de transcripción NF-κB, y al aumento en la expresión de ciclina D1. La presencia del inhibidor de ErbB-2, AG825, o de ARN cortos de interferencia (siRNA) contra ErbB-2, pero no la del anticuerpo monoclonal humanizado trastuzumab (HerceptinMR) abolió la fosforilación de ErbB-2, la activación de NF-κB y la proliferación inducidas por TNFα. Nuestro trabajo revela que el TNFα es capaz de transactivar a ErbB-2 y utilizarlo como un intermediario en la generación de señales mitogénicas. Dado que el TNFα se encuentra presente en un alto porcentaje de cánceres de mama, nuestros hallazgos tendrían una gran importancia en la comprensión de la biología de tumores de mama que sobreexpresan ErbB-2 como así también en la elección del tratamiento al cual los pacientes son sometidos.

Descripción: La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ [factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-8 (IL-8)] están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.