Descripción: Mediante la aplicación de diferentes enfoques de Biología Computacional, en esta Tesis se abordaron tres proyectos genoma de tomate: i) el genoma mitocondrialdel cultivar élite Heinz se secuenció, ensambló y anotó; ii) se ancló la secuenciacompleta del genoma de la especie silvestre de tomate Solanum pennellii, el padredonante de la conocida población de líneas de introgresión (IL), al mapa genéticoy iii) mediante genómica comparativa y análisis de QTL (loci de caracterescuantitativos) se identificaron genes candidatos asociados a variaciones en lafotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de las plantas. Losresultados del ensamblado del genoma mitocondrial del tomate mostraron que lasinserciones nucleares de origen mitocondrial (del inglés, numts: nuclearmitochondrial DNA segments) están presentes aún en los tomatescontemporáneos. Este hallazgo fue validado por hibridación fluorescente in situ lacual mostró un número particularmente elevado de numts en el cromosoma 11 delcultivar Heinz. En la segunda parte de esta Tesis se presenta la secuencia completadel genoma de S. pennellii la cual fue ensamblada de novo en 4.591 scaffolds, de loscuales, el 97,1% fueron anclados (mediante una base de datos interna de 16.940marcadores moleculares) al mapa genético del tomate. Por último, en el capítulofinal de esta Tesis, el potencial como herramientas para la investigación y elmejoramiento de cultivos de las secuencias genómicas aquí presentadas, sedemostró por el genoma del cultivar S. lycopersicum M82, ensamblado porreferencia. En esta parte, se identificaron 87 genes candidatos involucrados en ladeterminación de loci de caracteres cuantitativos responsables de variaciones en lafotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de la planta presentesen 11 regiones (BINs) de las líneas de introgresión de tomate.

Descripción: La β-lapachona,o-nafloquinona extraída del lapacho (Tabebuia avellanadae),ha sido propuesta como tripanocida, antiviral y citostático, induce apoptosis onecrosis en numerosas líneas celulares tumorales (Li y col, 1999; Planchon y col, 1999) e inhibe la transcripción del virus HIV (1) (Li y col, 1993). La CG 9-442, esuna o-naftoquinona derivada de la β-lapachona, que ha sido sintetizada como posibleagente antitumoral (Schaffner-Sabba y col, 1984). En el presente estudio se demostró que la adición de CG 9-442 a unasuspensión mitocondrial de hígado de rata: l) estimuló el consumo de O2 en estado "4" e inhibió el consumo de O2 en estado "3", disminuyendo en consecuencia elíndice de control respiratorio; en presencia de malato-glutamato o succinato, comosustratos respiratorios; 2) inhibió la peroxidación lipídica; 3) inhibió el aumento devolumen mitocondrial “swelling”, por Ca 2+ y 4) inhibió el potencial de membrana. En partículas submitocondriales, la adición de CG 9-442: l) estimuló laoxidación de NADH insensible a rotenona, antimicina A, mixotiazol o cianuro ; 2)determinó la formación del radical semiquinona, detectado por EPR, y un estímuloen la producción del radical anión superóxido, en presencia de NADH y antimicina; 3) no consumió O2, en presencia de succinato, rotenona y cianuro; 4) inhibió laactividad NADH oxidasa, tanto en presencia como en ausencia de superóxidodismutasa y catalasa; 5) inhibió la actividad succinato oxidasa; 6) inhibióligeramente las actividades succinato deshidrogenasa y succinato-ubiquinona óxidoreductasa, 7) no tuvo efecto significativo sobre las actividades NADHdeshidrogenasa, NADH-citocromo c reductasa y citocromo c oxidasa. Con fines comparativos se realizaron estudios con las p-naftoquinonasmenadiona y atovaquone (esta última de uso clínico). Los resultados aquí presentados muestran que la CG 9-442, produce dañosen la función mitocondria] en células de mamíferos, que se traducenfundamentalmente en: la producción de radicales libres, un efecto inhibitorio sobrela cadena de transporte de electrones mitocondrial, un efecto desacoplante y lainhibición del potencial de membrana mitocondrial. Se postula a la mitocondriacomo blanco importante para la citotoxícidad de la CG 9-442 descartándose laperóxidación lipídica como causa de la misma. Los datos presentados no descartanotras organelas como blancos para los efectos citotóxicos de esta quinona. Estos estudios pueden ser importantes para contribuir al diseño de diferentesnaftoquinonas farmacológicamente activas. Teniendo en cuenta que, los parámetrosquímico cuánticos de la β-lapachona y su derivada CG 9-442, no difierensignificativamente (Paulino y col., 1994), este trabajo constituye una contribucióna las investigaciones realizadas con la β-lapachona, potencial citostático en estudiopreclínico (Dolan y col., 1998).

Descripción: El objetivo de esta tesis es identificar nuevos genes involucrados enneurodegeneración en Drosophila melanogaster y comprender su función y elmecanismo por el cual provoca dicha patología. En particular, se hizo foco en orsai. Encontramos que adultos envejecidos con la expresión de orsai reducida en lasneuronas que controlan el comportamiento rítmico locomotor presentaban una caídaen la ritmicidad y un alargamiento del período. La reducción de ORSAI en el cerebroadulto envejecido provoca que estos presenten signos de neurodegeneración másseveros que sus controles. También se encontró que la reducción de los niveles de este gen en larvasprovoca arresto en el segundo estadio y la consiguiente letalidad temprana. Estaslarvas tienen un comportamiento anómalo frente a la comida, alejándose de la mismay reptando en un modo de clásico forrajeo, a pesar de tener alimento disponible, hastasu muerte. Encontramos que acotando la reducción de ORSAI a las tráqueas fenocopiaal mutante. También determinamos que la respiración mitocondrial está severamentereducida en el mutante. La alteración de los niveles de ORSAI en distintos tejidos, tantolarvales como adultos, provoca diversos fenotipos, lo que demuestra la importancia deeste gen para la homeostasis celular. El fenotipo en las tráqueas podría, a través de procesos hipóxicos, explicar elcomportamiento de forrajeo en larvas y, sumando a esto la disfunción mitocondrial,los fenotipos observados en adultos.

Descripción: orsai (osi), un gen hasta ahora no caracterizado de Drosophila melanogaster, codifica una pequeña proteína con un solo dominio reconocible, el LYR. Las proteínas que poseen un dominio LYR se caracterizan por ser parte estructural de los complejos mitocondriales o reguladores del funcionamiento de dichas organelas. En humanos, el mal funcionamiento de estas proteínas provoca serios problemas metabólicos con consecuencias que van desde retraso en el crecimiento e incapacidad de procesar lípidos hasta la muerte prematura. Esta tesis está enfocada en caracterizar la función de orsai, cuyo mutante posee menor tamaño que un individuo control, sufre arresto en el desarrollo y muerte en etapas tempranas del desarrollo larval. La disfunción de orsai provoca defectos estructurales mitocondriales y metabólicos diversos, que culminan en células incapaces de crecer apropiadamente. OSI posee una localización nuclear en la mayor parte de los tejidos analizados, y su disfunción no afecta el ensamblado de los complejos mitocondriales, por lo que proponemos que la función de orsai está asociada a la regulación del funcionamiento de la cadena respiratoria. A través de experimentos de complementación génica, se ha logrado rescatar parte de los fenotipos provocados por la falta de orsai tanto a nivel celular como del organismo mediante la sobreexpresión de la proteína humana ETFRF1 (LYR5m). Proponemos así que la deficiencia de orsai en Drosophila melanogaster sería un buen modelo de estudio para las enfermedades asociadas a la desregulación de proteínas LYR en humanos.

Descripción: Las mitocondrias juegan un papel vital en el metabolismo energético; en el interior se produce la fosforilación oxidativa en la cadena de transporte de electrones y la generación de equivalentes de reducción por el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). La deficiencia de hemo producida por una síntesis reducida o un catabolismo acelerado provocaría un daño celular grave. Anteriormente, demostramos que los agentes porfirinogénicos afectaban a varios metabolismos en cerebro de ratones cepa CF1 y en un modelo genético murino de Porfiria intermitente aguda (AIP). El objetivo general de esta tesis fue estudiar los mecanismos por los cuales los anestésicos volátiles alteran el metabolismo mitocondrial. Los objetivos específicos fueron: I) Dilucidar el efecto de los anestésicos volátiles sobre la cadena respiratoria mitocondrial en el encéfalo de ratón. II) Comparar los resultados en animales con otros fármacos porfirinogénicos y en condiciones patológicas del precursor del metabolismo del hemo, ácido 5-aminolevulic (ALA). III) Evaluar, en el encéfalo del ratón, la posible relación entre la biosíntesis del hemo, el ciclo del ácido tricarboxílico y la cadena respiratoria. IV) Analizar la participación de la isoforma mitocondrial de la Óxido nítrico sintasa (mtNOS) en la regulación de la cadena respiratoria. Se observaron alteraciones bioquímicas en los Complejos de la cadena respiratoria que variaban según la cepa de ratones y la mutación. Los cambios observados en las actividades del ciclo de TCA darían como resultado una deficiencia de los equivalentes de reducción del donante, NADH y FADH2, y podrían justificar las alteraciones en las actividades de los Complejos de la cadena respiratoria informados anteriormente. Los resultados refuerzan nuestra resultados previos y apoyan la hipótesis de que habría más de un factor para explicar la patogénesis de los ataques agudos de la PAI además de confirmar la porfirinogenicidad de los anestésicos volátiles.

Descripción: La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro.

Descripción: El cultivo de embriones en medio suplementado con suero se utiliza durante el desarrollo parcial o total de embriones producidos in vitro (PIV). Este suplemento de composición compleja y variable se ha asociado con un alto grado de alteraciones de la estructura mitocondrial que provocaría una deficiente utilización y posterior acumulación de lípidos, respecto del medio sin suero. En esta tesis, se evaluó esta asociación y se determinó el día de desarrollo en que la adición de suero al medio produce menores daños mitocondriales en embriones bovinos. El estudio de la ultraestructura mitocondrial en estadios iniciales de clivaje de embriones bovinos in vitro permitió completar la información disponible sobre la estructura de la organela, e interpretar el efecto del medio de cultivo sobre la organela. No se encontraron indicios que atribuyan al suero el daño mitocondrial morfológico in vitro, en embriones bovinos de 2 a 16 células. Se encontraron en cambio, modificaciones que podrían ser ventajosas para el desarrollo embrionario cuando la adición del suero al medio de cultivo se produce en el día 3 de desarrollo. Como alternativa procedimental al cultivo de embriones en medio con suero, en esta tesis se estudiaron el crecimiento y la adhesión de embriones y ovocitos humanos, en condiciones libres de suero y de productos animales. El cultivo de embriones en medio definido sin suero es de enorme interés en humanos, pues de él depende el desarrollo de líneas de células troncales embrionarias humanas (CTEh) con grado clínico. En este sentido, se emplearon condiciones de mínima complejidad durante el proceso de derivación de células troncales de grado clínico, utilizando una matriz de fibronectina como sustrato y medio de cultivo sin suero.

Descripción: La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesivaproducida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el dañocelular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferencial” o “Differential Display” (DD) observamos que la expresióndel gen de origen nuclear CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) estabadisminuída en un modelo celular de FQ. Dado que el DD es una técnica queaporta evidencias pero es susceptible a falsos positivos y negativos, se decidióque el primer enfoque de esta Tesis fuera corroborar los resultados del DD. Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguidade PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 endistintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt enpresencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un genque se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fuedeterminar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó laexpresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocalpudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localizaciónmitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellosademás reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S enlugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos enmitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) paramitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % lacapacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además,en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transportede electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante laquimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividaddel complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencialde CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aúnno publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante latécnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desdediferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueronreemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CImreportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por laexpresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ).

Descripción: La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa que afecta al 1% de la población mayor de 60 años. Se caracteriza por déficits motores, temblor en reposo y una pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Substantia Nigra Pars Compacta. Otro rasgo típico es la aparición de agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy cuyo principal componente es una pequeña proteína, α-sinucleína. Esta proteína se une a las membranas lipídicas y en su conformación de α-hélice podría modular la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas pre-sinápticas e influiría en la liberación de neurotransmisores. En condiciones patológicas, α-sinucleína sería capaz de unirse a las mitocondrias y se ha propuesto que esta unión provocaría disfunción mitocondrial y estrés oxidativo que colaborarían en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de este trabajo propone que AS se incorpora a la mitocondria y se distribuye en sus distintos compartimientos. En esas localizaciones, esta proteína generaría disfunción mitocondrial incidiendo negativamente sobre distintos parámetros metabólicos, sobre la dinámica mitocondrial y la autofagia. En el presente trabajo se estudió la localización específica de α-sinucleína en mitocondrias aisladas de cerebro de rata. Se emplearon técnicas de microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica de transmisión, Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), fraccionamientos celulares y mitocondriales, western blots y distintos ensayos bioquímicos. Los resultados obtenidos en mitocondrias aisladas mostraron que AS 1μM se asocia a la mitocondria, mayoritariamente en la membrana externa y AS 10μM y 50 μM se encuentra principalmente internalizada. La microscopía electrónica confirmó la localización de α-sinucleína en el interior de la mitocondria y también en la periferia. Mediante un experimento de FRET se demostró un posible rol para el transportador de membrana externa TOM en la incorporación de AS. El análisis de la funcionalidad mitocondrial reveló que α-sinucleína altera el consumo de O2, elpotencial de membrana, la producción de ATP y aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, se utilizaron células SH-SY5Y transfectadas con α-sinucleína para estudiar el efecto sobre la viabilidad celular, la producción de ATP, la generación de especies reactivas de oxígeno, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Los resultados revelaron una disminución significativa de la viabilidad, en paralelo a una disminución en la producción de ATP y generación aumentada de especies reactivas. Además, α-sinucleína indujo disipación del potencial de membrana mitocondrial, desbalance de los procesos de fisión-fusión y desencadenamiento de la autofagia y mitofagia. Estos últimos procesos actuarían como un mecanismo de rescate celular disminuyendo la muerte y eliminando la mitocondrias dañadas. Este trabajo agrega evidencia novedosa al conocimiento de la localización de α-sinucleína en los distintos compartimientos mitocondriales, sus efectos sobre la funcionalidad mitocondrial y la relevancia de la disfunción de la organela en el destino celular. De este modo representan una contribución a la comprensión de los procesos que llevan a la patogénesis de la Enfermedad de Parkinson.

Descripción: En esta Tesis de Doctorado hemos estudiado la activación hormonal de la esteroidogénesis en una línea murina de células de Leydig MA-10, en relación con la activación de las quinasas reguladas por estimulación extracelular (ERK1/2, de la familia de MAP quinasas, MAPKs). Los estudios incluyeron la estimulación hormonal de las células MA-10 y el seguimiento de la distribución subcelular de fosfo-ERK1/2 por inmunoblot y microscopía confocal. Se halló que bajo estimulación con la hormona trófica gonadotrófina coriónica (hCG) u 8Br-AMPc (un análogo permeable de su segundo mensajero, AMPc) ERK1/2 es activada y retenida en mitocondria por efecto de PKA. Este efecto está mediado por el aumento de MEK1/2 (quinasa río arriba de ERK1/2) fosforilada en mitocondria. Está bien estudiado que uno de los factores que incrementa el transporte de colesterol a la mitocondria y la producción de esteroides es la proteína StAR (Steroidogenic Acute Regulatory). Hallamos que la estimulación hormonal promueve su interacción con ERK dado que StAR posee un dominio de interacción para MAPKs. Demostramos que ERK1 fosforila StAR in vitro en el residuo de Serina232 sólo en presencia de colesterol. Se determinó su importancia al observar que la mutación de este residuo disminuye marcadamente la esteroidogénesis in vivo. De este modo, la máxima producción de progesterona se observó en mitocondrias aisladas suplementadas con colesterol más ERK1 y PKA activas. Estas observaciones nos llevan a concluir que la doble fosforilación de StAR ligado a colesterol por ERK y PKA en mitocondria, aporta cargas negativas en la proteína. Estas cargas permitirían la interacción de StAR con VDAC (voltage-dependent anion channel) asociado a multicomplejos mitocondriales, favoreciendo el transporte de colesterol a la membrana mitocondrial interna y el mantenimiento de la esteroidogénesis.

Descripción: La presente tesis doctoral constituye una contribución original respecto de las complejidades subyacentes a la enseñanza y el aprendizaje de modelos de Biología Celular y de Química Biológica. Considerando como punto de partida que el procesamiento de información depende de los marcos teóricos preexistentes en cada sujeto, la investigación presenta evidencias sobre dos tipos de dificultades que operan en los fenómenos de adquisición de conocimientos específicos: en la Parte A se profundiza sobre obstáculos epistemológicos de aprendizaje de los modelos de célula, lisosomas y endocitosis, y mitocondrias y síntesis de ATP. En la Parte B se muestran dificultades en la comprensión a partir de la lectura de un texto sobre desnaturalización reversible de proteínas. La investigación se configuró en dos instancias metodológicas claramente diferentes, de tipo cualitativo, en correspondencia con los objetivos de sendas Partes A y B. Las poblaciones convocadas para el análisis también fueron diferentes: en la Parte A se convocaron estudiantes que desconocían contenidos de Biología Celular y -posteriormente- estudiantes avanzados de Profesorados en Biología y Química. En la Parte B, se convocaron estudiantes de primer y segundo año de las carreras universitarias de Biología (FCEN-UBA) y Bioquímica (FBI-UBA), y a cuatro expertos, tres en química biológica y uno en físico-química. Los dispositivos didácticos mediadores de los discursos de enseñanza fueron: un videojuego educativo ambientado en un modelo de célula 3D, en la Parte A; y, un apartado de un texto de bioquímica utilizado en materias de introducción a la bioquímica universitaria, en la Parte B. Las fallas de aprendizaje detectadas en la Parte A derivaron en necesarias reflexiones histórico-epistemológicas para la reconstrucción de los modelos científicos de célula, lisosoma y endocitosis, y mitocondria y síntesis de ATP, desde las fuentes literarias donde fueron comunicadas inicialmente, hasta el análisis de la evolución de dichos modelos en textos de enseñanza. La complejidad del texto sobre desnaturalización reversible de proteínas detectada en la Parte B condujo a la reconstrucción histórico-epistemológica sobre la construcción de dicho modelo. Para dichas reconstrucciones debieron analizarse numerosos artículos científicos publicados durante décadas de investigaciones, muchas de ellas de investigadores merecedores de Premios Nobel. Las hipótesis planteadas en cada parte de la Tesis derivaron en conclusiones didáctico-epistemológicas originales, que son fuertes sugerencias innovadoras para utilizar tanto para la enseñanza de conceptos centrales de la Biología Celular, como fuentes de reflexión para la escritura de textos de Bioquímica.

Descripción: Las células pluripotentes humanas pueden ser de origen embrionario, (CMEH), o inducidas (CMPih). Sus características más atrayentes residen en su inagotable potencial proliferativo y su pluripotencia o capacidad de diferenciarse a tejidos pertenecientes a las tres capas germinales. Las CMEH están constituidas por una población de células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Las CMPih son células somáticas que han sido reprogramadas mediante la expresión ectópica de factores de transcripción fundamentales para el mantenimiento del estado indiferenciado (por ejemplo: Oct3/4; Sox2 con Klf4 y c-Myc o Nanog y Lin28) (KazutoshiTakahashi et al, 2007). Las CMPih una vez reprogramadas adquieren características de auto-renovación y capacidad de diferenciarse dando origen a células de las tres capas germinales. La capacidad de estas células pluripotentes para recapitular sistemas celulares humanos experimentalmente in vitro es alta y constituye una herramienta muy valiosa para el estudio tanto de los mecanismos moleculares que subyacen el desarrollo humano como de enfermedades neurodegenerativas o cardíacas entre otras. La proteína Alfasinucleina (αSin) es una proteína pequeña de 14 KDa altamente desorganizada de localización ubicua en el citosol y en las terminales sinápticas de las neuronas. En condiciones normales es soluble, pero en concentraciones elevadas, frente a cambios en el pH, ocambios en los niveles intracelulares de Ca2+se agrega produciendo neurofilamentos conocidoscomo cuerpos de Lewy. Dichos agregados se han observado en formas esporádicas y hereditarias de la Enfermedad de Parkinson (EP), así como en la demencia de Lewy. En el presente trabajo se utilizaron células pluripotentes diferenciadas a neuronas como plataforma para el modelaje de la sobre-expresión de αSin wt y 2 mutantes asociados a la EP Familiar. El análisis del impacto de este tratamiento sobre los cultivos celulares utilizados se centró en la evaluación de la homeostasis mitocondrial en un contexto de sobreexpresión en contraste con el control no tratado. El enfoque sobre la mitocondria se debe a que existen múltiples genes asociados con la EP que convergen en el mantenimiento de la homeostasis de dicha organela como un factor etiológico crucial en la iniciación y el desarrollo temprano de la enfermedad. Los parámetros analizados fueron morfología, estado redox, transporte y biodinámica mitocondrial. Se logró utilizar exitosamente células pluripotentes humanas diferenciadas como modelo neuronal humano, proveyendo evidencia novedosa del impacto de la sobreexpresión de αSin sobre la homeostasis mitocondrial neural. Estos efectos están asociados, por un lado, a las mutaciones presentes en las variantes estudiadas, así como a los niveles de expresión y localización de la proteína respecto a la mitocondria. Asimismo, hemos probado que la fisión mitocondrial dependiente de αSin requiere de una interacción directa entre la proteína y/o agregados de la misma con la membrana externa mitocondrial. Determinamos además que la interacción de αSin con membranas mitocondriales depende en gran parte de su secuencia N-terminal, ya que la disrupción de dicho dominio en el gen de αSin endógeno por edición génica CRISPR-Cas9 indujo cambios en la morfología y biodinámica mitocondrial en las neuronas derivadas a partir de la línea celular editada, lo que soporta un rol fisiológico de la proteína dependiente de su dominio N-terminal. El rol fisiológico y patológico de αSin en la homeostasis mitocondrial axonal evidenciado, aporta al objetivo de un camino etiológico común subyacente a la patología de la EP, que en última instancia es fundamental para el entendimiento de las enfermedades neurodegenerativas y es una herramienta muy útil para el diseño de estrategias terapéuticas y/o preventivas para el tratamiento de las mismas.