Descripción: (NMDAR) en interneuronas corticales es central para la patofisiología de la esquizofrenia. En un trabajo previo de nuestro grupo, la ablación restringida del NMDAR a interneuronas parvalbúmina positivas del sistema córtico-límbico (KO) durante el desarrollo postnatal temprano resulta en fenotipos compatibles con esquizofrenia en la adultez. Para adentrarnos en la patofisiología subyacente analizamos el impacto de la mutación y el desarrollo sobre diferentes procesos fisiológicos en un área cortical involucrada en la esquizofrenia. Para ello colocamos tetrodos en la corteza prefrontal media (mPFC) de ratones anestesiados controles y KO, juveniles y adultos. Encontramos un incremento significativo en la frecuencia de disparo espontánea y una sincronización alterada con ritmos locales y distales en las neuronas de ratones KO juveniles y adultos. Dado que los ratones KO juveniles carecen del NMDAR pero no muestran el fenotipo compatible con esquizofrenia, los cambios mencionados anteriormente no pueden explicar las anormalidades comportamentales de los adultos. El podado sináptico normal de las aferencias locales y distales de la mPFC ocurre durante la adolescencia. Analizamos la conectividad funcional de la vía hipocampo ventral-corteza prefrontal media (vHP-mPFC) antes y después de la adolescencia. Los ratones adultos KO presentan una amplitud disminuida de la respuesta evocada en la mPFC. También medimos el estado de plasticidad del circuito y encontramos que los adultos KO y no los juveniles son más susceptibles de sufrir depotenciación a largo plazo (LTD). Proponemos que la ablación temprana del NMDAR en interneuronas lleva a un circuito cortical sobreexcitado e incordiando que propicia la depotenciación durante la adolescencia. Esto resulta en una conectividad funcional disminuida en adultos y podría subyacer el fenotipo compatible con esquizofrenia.

Descripción: Liberaciones subóptimas o excesivas de dopamina son rasgos característicos de variaspatologías muy frecuentes que incluyen a la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia,desorden de déficit atencional e hiperactividad (ADHD) y autoadministración compulsivade drogas de abuso. En este trabajo se estudió el rol del D2R mediante la generación deratones mutantes condicionales. En primer lugar, generamos ratones deficientes de D2R enlas neuronas dopaminérgicas (autorreceptores). Estos ratones tienen la síntesis y liberaciónde dopamina aumentada, son hiperactivos e hipersensibles a los efectos psicomotores dela cocaína, y tienen mayor motivación para trabajar por la comida. En segundo lugar,estudiamos los efectos de la pérdida de D2Rs en animales adultos que se habíandesarrollado normalmente en comparación con ratones deficientes en D2Rs constitutivosque desarrollan programas compensatorios tempranos. La abrupta remoción de los D2R enla adultez provocó una marcada disminución de la locomoción, problemas severos en elaprendizaje y la coordinación de rutinas motoras. En algunos casos, se observó rigidez ytemblor en los animales en reposo con características de parkinsonismo. Los resultadosobtenidos, demostraron la importancia de la estricta regulación mediada por los D2R (prey postsinápticos) en el control de la actividad locomotora, la sensibilidad a drogas deabuso y el estado motivacional de los animales.

Descripción: Los estudios de localización del D4R han resultado complicados debido a la falta de radioligandos suficientemente específicos y la baja abundancia de su ARNm para su detección por autoradiografía e hibridación in situ, respectivamente. Los numerosos anticuerpos generados aportaron resultados no coincidentes entre distintos laboratorios. Aquí, mediante la utilización de un ratón transgénico portador de un BAC recombinante que expresa la proteína EGFP bajo el control transcripcional del gen completo del receptor D4 de ratón (Drd4), determinamos que el Drd4 se expresa principalmente en la corteza prefrontal. También se vió señal positiva en el pálido ventral, el núcleo parabraquial lateral y el núcleo olfatorio anterior. Este resultado demuestra que el gen Drd4 se expresa en un número de áreas más restringido que los reportados hasta el momento. En la segunda parte, generamos ratones mutantes condicionales en donde el exón 2 de Drd2 fue flanqueado por sitios loxP (ratones Drd2flox/+). Utilizando ensayos neuroquímicos, farmacológicos y conductuales demostramos que los ratones Drd2flox/+ son indistinguibles de sus hermanos control. La cruza de ratones mutantes condicionales con ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre bajo el control transcripcional del promotor del gen de nestina permitió inactivar la expresión de Drd2 exclusivamente en neuronas del sistema nervioso, manteniendo intacta la expresión de Drd2 hipofisaria (ratones denominados cD2KO). Los ratones cD2KO presentaron curvas de crecimiento disminuídas como consecuencia de un descenso en la expresión hipotalámica de GHRH y de los niveles hipofisarios de GH y, en consecuencia, se observó una reducción en los niveles plasmáticos de IGF-I así como también un patrón feminizado de proteínas mayoritarias de la orina. Así, la alteración del eje hipotalámico-hipofisario-somático modificó el comportamiento social entre machos evidenciado a través de tres paradigmas experimentales de interacción social como el test de agresión Intruso vs. Residente y los tests de interacción social y territorial del tubo de doble entrada y de marcación territorial con orina.

Descripción: Las enfermedades neurodegenerativas son la principal causa de discapacidad y muerte prematura en personas mayores a nivel mundial. Diversas patologías neurodegenerativas presentan inclusiones insolubles compuestas principalmente por la proteína TDP-43 (Transactive response DNA-binding Protein 43). Esta proteína fue identificada como el componente predominante de los agregados citoplasmáticos observados en la mayoría de los casos de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y en aproximadamente la mitad de los casos de demencia frontotemporal (DFT-TDP). Estos y otros desórdenes neurodegenerativos con presencia de agregados de TDP-43 se conocen actualmente como “proteinopatías de TDP-43”. Recientemente, se ha generado y caracterizado un novedoso modelo de ratones transgénicos para TDP-43 con expresión regulable dirigida a neuronas del cerebro anterior, utilizando el promotor CaMKIIα acoplado a un sistema tTA (controlado por tetraciclina), modelo empleado en el presente trabajo. Estos ratones expresan una variante de localización citoplasmática de la proteína (TDP-43-ΔNLS) y recapitulan una serie de características neuropatológicas de las proteinopatías de TDP-43, incluyendo neurodegeneración selectiva, gliosis, degeneración del tracto corticoespinal, inclusiones citoplasmáticas de TDP-43, disminución de la expresión nuclear normal de TDP-43 endógeno y cambios globales de la expresión génica. Sin embargo, la contribución específica de la expresión de TDP-43-ΔNLS a nivel conductual no ha sido evaluada en profundidad. En el presente trabajo de tesis doctoral, se buscó realizar una caracterización conductual detallada y una evaluación de la neurodegeneración en estos ratones. Para lograr este objetivo, se llevó a cabo una batería de tests conductuales para evaluar fenotipos motores, cognitivos y sociales, y se estudió la pérdida neuronal a diferentes tiempos luego de la inducción del transgén. Se observó que los ratones transgénicos TDP-43-ΔNLS con 1 mes de inducción presentan una performance motora alterada, incluyendo hiperlocomoción espontánea en el test de campo abierto, pérdida del balance y coordinación en el rotarod, y un alto grado de espasticidad medido por el fenotipo de clasping. El análisis cognitivo reveló alteraciones en las memorias de reconocimiento, espacial y aversiva, medidas por el test de reconocimiento de objeto novedoso, laberinto en forma de “Y” y evitación inhibitoria pasiva, respectivamente. Más aún, los ratones TDP-43-ΔNLS presentaron déficits en conductas sociales, un aspecto clave de la DFT. Con el fin de analizar si estos síntomas son reversibles, se suprimió la expresión del transgén por 14 días en ratones de 1,5 meses de edad (0,5 meses de inducción del transgén), los cuales ya presentan un fenotipo conductual anormal pero una neurodegeneración leve, y se observó una reversión de los déficits motores y cognitivos. Sin embargo, la performance social permaneció alterada. Cuando se suprimió la expresión del transgén en ratones adultos de 6,5 meses de edad (5,5 meses de inducción del transgén), los cuales muestran una neurodegeneración evidente, los déficits motores resultaron irreversibles. Finalmente, para comprender las bases moleculares y celulares del efecto de la sobre-expresión de TDP-43-ΔNLS en las alteraciones conductuales, incluyendo las funciones cognitivas, se analizó el patrón de expresión y activación de genes relacionados con fenómenos de actividad y plasticidad sináptica (Zif268, c-Fos, Arc). El análisis por inmunofluorescencia de diferentes regiones cerebrales (involucradas en el procesamiento de las conductas alteradas en estos ratones) reveló una profunda disminución de la expresión de estos genes en los animales transgénicos. Debido a que dichos genes son regulados positivamente luego de una tarea conductual y son necesarios para el procesamiento cognitivo, también se evaluó su respuesta luego de exponer a los ratones a una sesión en el test de campo abierto. Los animales transgénicos TDP-43-ΔNLS mostraron una reducida o ausente inducción de Zif268, c-Fos y Arc en la corteza e hipocampo. En conjunto, los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que los ratones TDP-43-ΔNLS presentan diversos déficits conductuales característicos de DFT con enfermedad de motoneurona. Adicionalmente, estos resultados sugieren que la alteración conductual mediada por TDP-43 está sostenida por cambios funcionales en la población de neuronas afectadas, independientemente de una neurodegeneración extensa, y que distintos síntomas podrían tener diferentes grados de susceptibilidad a la mejora. Además, la reducción en la expresión e inducción de los genes tempranos inmediatos Zif268, c-Fos y Arc sugiere un novedoso mecanismo mediado por TDP-43 que sustentaría las conductas alteradas evidenciadas en los ratones TDP-43 y, potencialmente, en las proteinopatías de TDP-43.

Descripción: Determinar los vínculos existentes entre cambios a nivel genético y la evolución del cerebro humano es uno de los mayores desafíos a los que se enfrenta la era post-genómica. Nuestra hipótesis es que la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes relacionados con el desarrollo y la función cerebral en el linaje humano, habría sido crítica para la evolución neuroanatómica de nuestro cerebro y sus capacidades cognitivas diferenciales. Estos nuevos territorios de expresión estarían codificados en parte por cambios en la secuencia de regiones regulatorias de genes que se expresan en cerebro. En nuestro laboratorio, la utilización combinada de herramientas bioinformáticas propias y el análisis de resultados generados por otros laboratorios nos ha permitido identificar las zonas del genoma humano que acumulan mayor número de regiones nocodifi- cantes quemuestran signos de evolución acelerada ( Human Accelerated Regions: HARs) en comparación con otras especies de mamíferos y vertebrados. En este trabajo nos propusimos analizar el agrupamiento y la distribución de HARs para un locus en particular: el gen FOXP2 . Para ello decidimos considerar la estructura tridimensional que adopta la cromatina en esta región, es decir el Dominio Topológi- camente Asociado en el que se localiza este gen (TAD- FOXP2 ), en particular en la placa cortical humana de 16 semanas de gestación, tejido embrionario donde se expresa este gen y ocurre un pico de neurogénesis y migración neuronal. Determinamos que el TAD- FOXP2 se encuentra dentro de las regiones más aceleradas de todo el genoma, lo que podría significar una regu- lación transcripcional diferencial para este gen en humanos. El gen FOXP2 ha sido ampliamente estudiado en evolución humana, debido a que ciertas mutaciones en la región codificante de este gen impactan directamente en el desarrollo de la capacidad del habla. Por otra parte, se ha encontrado que en humanos este factor de transcripción presenta dos sustituciones no sinónimas en su secuencia codificante, a pesar de ser uno de los genes más conservados entre vertebrados, tanto en secuencia como en territorios de expresión. Sorprendentemente, estas sustituciones ya estaban presentes en los genomas de Neandertales y Denisovanos, miembros del género Homo ya extintos. Sumado a esto, se ha reportado que FoxP2 juega un papel importante en el aprendizaje vocal no innato en varias especies (pinzones, canarios, murciélagos, ballenas, entre otras). No obstante, su rol específico en la ejecución de estas vocalizaciones no está claro, ya que este factor de transcripción regula múltiples genes importantes para el desarrollo cerebral, y además también se expresa en otras especies que no presentan aprendizaje vocal y en otros tejidos no relacionados con la capacidad del habla. Resulta clave comprender la fina regulación a la que está sujeta este gen y su potencial rol como factor de transcripción en territorios de expresión novedosos. Decidimos entonces estudiar en detalle las regiones aceleradas en humanos que se agrupan en el TAD- FOXP2 , con el fin de caracterizar potenciales regiones regulatorias de este gen que evolucionaron de manera humano específica. Analizamos in vivo la actividad transcripcional de los 12 HARs contenidos dentro del TAD- FOXP2 utilizando peces cebra y ratones transgénicos. Mediante el uso de genes reporteros e inmunohistoquímica, pudimos determinar que 5 de los 12 HARs presentes en esta región presentan actividad de enhancer transcripcional. Además, 2 de ellos (HACNS750 y HACNS169) mostraron ganancias de expre-sión a lo largo del sistema nervioso al comparar las regiones ortólogas humanas (derivadas) versus chimpancés (ancestrales), en tejidos donde se expresa FOXP2 . Para estas regiones diferenciales, encontramos evidencia adicional que soporta su actividad enhancer a partir de distintos análisis in silico. Nuestros resultados indican que secuencias reguladoras en el locus FOXP2 fueron seleccionadas por un proceso evolutivo espe-cífico del linaje Homo , lo que sugiere que la maquinaria transcripcional que controla este gen también podría haber evolucionado de manera diferencial a lo largo de nuestra historia evolutiva, contribuyendo de esta manera con el desarrollo de nuestro cerebro y en particular con nuestra excepcional capacidad del habla.

Descripción: En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

Descripción: El melanoma es una neoplasia que surge como consecuencia de la proliferacióndescontrolada de los melanocitos. El comportamiento de este tipo tumoral esimpredecible dado que puede variar desde la regresión espontánea hasta unarápida progresión y muerte del portador del tumor. El aumento de la incidenciade esta enfermedad se halla entre las más altas, y hasta el momento no se handesarrollado terapias que sean realmente efectivas. Varios estudios, han demostrado que el desarrollo del melanoma de piel es másdesfavorable en pacientes hombres que en mujeres, y que la supervivencia de lasmujeres es considerablemente mayor. Ha sido teóricamente propuesto que los andrógenos tienen un papel clave en elpeor pronóstico masculino, y que una terapia con antiandrógenos podría tenerseen consideración en pacientes hombres con melanoma. En este trabajo de Tesis se investigó, en primer lugar, la presencia de receptoresandrogénicos (RA) en el melanoma humano, se procedió luego a lacaracterización bioquímica y biológica de los mismos y por último se analizó lainfluencia de la acción antiandrogénica en el curso clinico de esta enfermedad. En los estudios realizados se utilizaron tres lineas derivadas de melanomahumano obtenidas en el laboratorio: IIB-MEL-J, IIB-MEL-LES e IIB-MEL-LAN. Los análisis de Scatchard de las tres lineas estudiadas, utilizando la unión delandrógeno sintético marcado R1881, revelaron la presencia de un solo tipo dereceptor con una constante de disociación aparente (Kd) de 11 nM a 37 °C y unacapacidad de binding de 326 fmol/mg de proteina, 58,4 fmol/10 6 células o de 35.000 sitios por célula para IIB-MEL-J, una Kd de 15 nM a 37 °C y unacapacidad de binding de 280,6 fmol/mg de proteína, 30,8 fmol/10 (6)células o de 18.500 sitios por célula en el caso de IIB-MEL-LES y Kd de 14 nM a 37 °C,capacidad de binding de 206,4 fmol/mg de proteína, 25,59 fmol/10 (6) células o de 15.400 sitios por célula en el caso de IIB-MEL-IAN. Los estudios sobre la especificidad de la unión del ligando radiactivo a estosreceptores, revelaron un comportamiento atípico de los mismos en las tres líneasanalizadas. No sólo los andrógenos testosterona (T), dihidrotestosterona (DHT), R1881 y el antiandrógeno hidroxi-flutamida (OH-Flu) compitieron con [3H]R188l,sino que estradiol (E2), progesterona (Pg) y cortisol (F), a 500 X deexceso, también fueron capaces de desplazar la unión del esteroide sintético al RA. A nivel inmunocitoquímico, no existieron evidencias de la presencia dereceptores estrogénicos o de progesterona en las tres líneas de melanoma,mientras la inmuno- reactividad para RA fue positiva en las tres líneasestudiadas. La tinción nuclear fue vigorosa, y la intensidad marcada, por encimadel 70% de las células analizadas. La presencia del RA fue analizada, además, en biopsias correspondientes ametástasis de melanomas provenientes de distintos pacientes. En todos los casosla reactividad obtenida con el anticuerpo monoclonal (AMC) ANI-IS fuepositiva y la intensidad marcada. Estudios in vitro sobre la acción de distintas hormonas y antihormonas revelaronque DHT, T, E2, o Pg estimularon la proliferación celular de IIB-MEL-J, IIB-MEL- LES e IIB-MEL-IAN mientras OH-Flu, casodex (Cas) o Tamoxifeno (Tam) la inhibieron significativamente. La acción inhibitoria del crecimiento celular ejercida por los antiandrógenostambién se manifestó in vivo cuando se utilizó flutamida (Flu) en ratonesatímicos portadores de tumores. Estos animales mostraron una disminuciónsignificativa del crecimiento tumoral y un marcado aumento de la sobrevidarespecto de animales controles o sometidos a distintas terapias. Los resultados indican la existencia de RA en melanoma humano y un claroefecto protector por parte del antiandrógeno Flu.

Descripción: En este trabajo de tesis presentamos un modelo experimental de carcinogénesis mamariapor MNU y MPA en el ratón BALB/c. En nuestro laboratorio ya se había desarrollado un modelode inducción de adenocarcinomas mamarios por MPA, en el cual los tumores, que aparecen conuna latencia mayor al año, son en su mayoria ductales, hormono-dependientes y expresan en sumayoría altos niveles de RE y RP. En este trabajo hemos desarrollado la caracterización de lostumores inducidos por MNU + MPA en cuanto a su morfología y hormono-dependencia. Ademáscaracterizamos el rol de MPA como promotor tumoral y los efectosde la ovariectomía y de lasialoadenectomía en la inducción de tumores. Hemos desarrollado las condiciones de dosis necesarias como para poder estudiar alcarcinógeno MNU como un agente exclusivamente iniciador en el proceso de carcinogénesismamaria y pudimos definir la acción de promotor tumoral del progestágeno MPA. A partir de los experimentos aquí presentados, definimos también una acción especificadel MPA que es previa a la iniciación, favoreciendo ya sea por modificación o por incrementoen el número celular, la transformación neoplásica. A este efecto lo denominamos "permisividad". Las experiencias realizadas en los animales ovariectomizados, demostraron la importanciade las hormonas ováricas. La ovx generó un patrón de atrofia mamaria evidenciable por la técnicade montaje total de las mamas y en este caso, la acción de MNU fue casi nula, lo que sugiereque éste ejerce su acción sobre una celula o grupo de células presente en una glándula sometidaa estímulos hormonales. El MPA pudo suplir la ausencia de los ovarios debido quizá a su acciónprogestacional, elevando los valores de incidencia tumoral a niveles del control positivo. Se obtuvieron resultados interesantes en el análisis del rol de las glándulas salivares enanimales pretratados con MPA y MNU en la inducción tumoral. Registramos una significativadisminución en los valores de incidencia tumoral en aquellos animales tratados con MPA ysialo, frente a los controles intactos. Considerando que el MPA provoca un aumento de EGFsérico proveniente de las glándulas salivares y basándonos en datos previos de este efecto en elmodelo de carcinogénesis mamaria por MPA, confirmamos también que el EGF también juegaun importante rol en el modelo de cocarcinogénesis MNU+MPA, probablemente afectando la fasede promoción. Los tumores de mama surgidos en estos experimentos fueron clasificados comoadenocarcinomas con distintos grados de metaplasia pavimentosa. Las diferencias histológicastan marcadas entre los tumores inducidos por MNU y MPA y la mayoría de los tumoresinducidos exclusivamente por MPA nos indujeron a definir estos fenómenos como tiposdiferentes de carcinogénesis. La metaplasia pavimentosa fue un atributo exclusivo del MNU,siendo más evidente en los grupos expuestos a un mayor número de dosis de MNU. También fueevidente el la mayor incidencia de fenómenos metaplásicos en animales inoculados con MNUa los dos meses de MPA que a la semana. Todo lo analizado más datos previos nos inducen apensar que existe una fuerte correlación entre la histología y el agente iniciador (en nuestromodelo MNU). Estudios de montajes de glándulas mamarias revelaron que la metaplasiapavirnentosa precede al desarrollo de la lesión invasora. Los estudios de parámetros biológicos confirman los resultados anteriores demostrandouna diferencia muy notable entre ambos modelos experimentales. Como ya se mencionóanteriormente, si bien la mayoría de los inducidos por MPA son hormono-dependientes, todoslos inducidos en estos experimentos salvo alguna excepción fueron tumores autónomos. Nuevamente estos resultados nos llevaron a teorizar sobre posibles mecanismos de acciónde las hormonas y el carcinógeno en los distintos grupos experimentales discutiendo laprobabilidad de que ambos compuestos actúen sobre poblaciones celulares diferentes o siactuarían sobre la misma población de células madre induciendo diferentes cambios genéticos quelas llevan a diferenciar en forma diferencial. Por otra parte comprobamos que en este modelo de inducción tumoral, el MPA actúacomo un verdadero promotor tumoral, eliminando la posibilidad que esta hormona favorezca laaparición de las neoplasias mamarias, por un mecanismo inmunosupresor hipotético, ya que elestado inmunológico de los animales tratados con ambas sustancias estaba en valores normalese inclusive superiores a los normales. Curiosamente hemos demostrado que el MPA produce unamuy fuerte inmunoestimulación, confirmando a su vez que este efecto es netamente hormonaly no un mero efecto adyuvante inespecífico ya que fue revertido por un antiprogestágeno. Por último hemos demostrado también por primera vez que el MPA y el MNU actúancomo co-carcinógenos en el útero. Si bien el MPA y el MNU ambos inducen HGQ, losdeciduomas sólo fueron inducidos en animales tratados con MPA en presencia o ausencia de MNU, pero en distintos protocolos en los cuales los animales han sido tratados por un tiempocon MPA se han observado algunos carcinomas de endometrio e hiperplasias epiteliales severas,no detectadas cuando los animales tuvieron un inóculo de MNU muy cercano al de MPA. También hemos demostrado que MNU induce un alto porcentaje de leucemias cuya incidenciafue mucho menor en los grupos pretratados con MPA. En resumen, este modelo experimental si bien es interesante para dilucidar las funcionesdel MPA en el proceso de carcinogénesis no resulta un buen modelo de cáncer de mama humanoya que las características biológicas y morfológicas de los tumores son bastante diferentes a lamayoría de lo tumores humanos.

Descripción: En esta Tesis Doctoral se estudiaron distintos aspectos de la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal (HHG) en un modelo de ratones transgénicos que produce niveles elevados de la hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) y desarrolla tumores gonadales (ratones hCGDE+). Se partió de la hipótesis que los elevados niveles de esteroides sexuales inducidos por la hipersecreción de hCG desde edades tempranas del desarrollo, actuarían sobre el eje HHG alterando la síntesis y secreción de hormonas y factores claves en la función reproductiva, participando directa o indirectamente en el inicio y progresión de los tumores gonadales que presentan estos ratones. En una primera etapa se caracterizó en profundidad el fenotipo de machos y hembras hCGDE+, estudiando parámetros morfológicos, bioquímicos y moleculares de la función gonadal e hipotálamo- hipofisaria. Se observaron marcadas diferencias sexuales en el modelo, donde los machos transgénicos resultaron severamente comprometidos a nivel de la regulación de la unidad hipotálamo-hipofisaria desde edades tempranas del desarrollo, mientras que las hembras mostraron alteraciones gonadales que condujeron al desarrollo de teratomas ováricos al inicio de la edad reproductiva. En una segunda etapa se aplicaron tratamientos antihormonales y gonadectomía, siendo nuestro particular interés estudiar el rol de los esteroides sexuales en el fenotipo de los machos y hembras hCGDE+. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la hipersecreción de hCG, a través de la estimulación de la esteroidogénesis gonadal, altera la funcionalidad del eje reproductivo y participa en el desarrollo de patologías gonadales.

Descripción: Aunque está clínicamente aceptado que la diabetes predispone a sufrir infecciones severas y los estudios sugieren una asociación entre esta patología y las infecciones, no se conocen los mecanismos que median entre la diabetes y la inmunosupresión. A su vez, el estrés tiene un significativo reconocimiento en el desarrollo y la evolución de la diabetes. Es así que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta inmune en la diabetes mellitus tipo 1, ampliando el conocimiento acerca de los factores genéticos y no genéticos que participan en la evolución del estado diabético y en la alteración de la respuesta inmune. Para esto, se utilizó un modelo experimental murino de diabetes mellitus tipo 1 en dos cepas de ratones: BALB/cByJ y C57Bl/6J y se analizó la respuesta inmune encontrándose que, en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ, la repuesta inmune determinada in vivo e in vitro se encontraba afectada, mientras que en los ratones de la cepa C57Bl/6J no lo estaba. A continuación se investigó el efecto del estrés sobre la respuesta inmune en la diabetes. Para esto se utilizó el modelo de estrés crónico moderado (CMS) aplicado luego de la instauración de la diabetes. Los resultados mostraron que en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ el CMS provocó alteraciones más tempranas sobre la proliferación linfocitaria probablemente mediadas por el aumento en la glucemia. En estos ratones se observó una correlación positiva entre la glucemia y catecolaminas. En cuanto al efecto sobre la cepa C57Bl/6J, sólo se encontró un aumento en las glucemias sin estar presente la alteración inmune. Dado que la hiperglucemia es el principal factor involucrado en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, se evaluó su participación en los efectos observados. Para esto, se analizó el efecto de la alta glucosa sobre la actividad linfocitaria normal. Las altas concentraciones de glucosa sobre linfocitos provenientes de la cepa BALB/cByJ afectaron directamente la proliferación y condujeron a la muerte de las células, alteración que no se observó en los linfocitos provenientes de la cepa C57Bl/6J. Entre los mecanismos que estarían implicados en los efectos deletéreos de la alta glucosa se destacó el aumento en el estrés oxidativo. Estos resultados señalan la influencia del condicionamiento genético y del estrés en el deterioro de la respuesta inmune en el estado diabético. Si bien la extrapolación de estos resultados a pacientes con diabetes debe ser tomada con precaución, puntualizan la importancia de un temprano y adecuado control de la glucemia como así también de los factores ambientales que puedan alterarla.

Descripción: La proopiomelanocortina (POMC) es una prohormona que se produce en la pituitaria y en neuronas del núcleo arcuato (Arc) del hipotálamo, donde participa en el control central de la ingesta y en la analgesia inducida por estrés. Ratones y humanos mutantes en POMC desarrollan obesidad temprana severa y estudios genéticos en diferentes poblaciones humanas mostraron un fuerte ligamiento entre el locus de POMC y características relacionadas con la obesidad. Para identificar las secuencias regulatorias que controlan la expresión del gen de POMC en el Arc, se realizó un análisis de expresión en ratones transgénicos combinado con estudios de footprinting filogenético. Se identificaron dos secuencias altamente conservadas entre los mamíferos en la región 5’ distal de POMC, nPE1 y nPE2, que son necesarias y suficientes para dirigir la expresión de transgenes a neuronas de POMC en el Arc, independientemente del promotor proximal, responsable de la expresión de POMC en la pituitaria. La eliminación de cualquiera de estas dos regiones separadamente no afecta la correcta expresión transgénica en el Arc, mientras que la eliminación de ambas impide la expresión de transgenes en las neuronas hipotalámicas de POMC, mostrando cierta redundancia funcional. La secuencia humana ortóloga también dirigen la expresión de transgenes a neuronas de POMC en el Arc, demostrando conservación funcional. nPE2 está conservado en todos los mamíferos, mientras que nPE1 está presente solamente en mamíferos placentarios. nPE2 puede dirigir la expresión de transgenes a neuronas de POMC en el Arc independientemente de nPE1 y mimetiza el patrón de expresión de POMC durante el desarrollo. El análisis delecional en nPE2 mostró que dos regiones de 45 pb dentro de nPE2 son esenciales para su función enhancer en ratones adultos y embriones. Estas dos regiones son únicas en el genoma del ratón y presentan una alta concentración de potenciales sitios de unión para factores de trascripción que están conservados. El análisis delecional y el footprinting filogenético permitieron acotar las regiones regulatorias que son críticas para dirigir la expresión de transgenes a neuronas de POMC en el Arc. Este trabajo provee la plataforma para la realización de futuros análisis bioquímicos que permitan encontrar los factores de transcripción involucrados en la regulación de la expresión neuronal del gen de POMC.

Descripción: La exposición ambiental al arsénico es un problema de salud pública debido a que afecta a un gran número de poblaciones del mundo y a que es un agente carcinógeno para humanos. Por tal motivo surge la necesidad del desarrollo de estudios que permitan comprender el modo de acción para poder prevenir los efectos nocivos relacionados con la ingestión de arsenito a través del consumo de agua. El presente trabajo se desarrolló con la finalidad de detectar la influencia de los compuestos arsenicales en posibles procesos cancerosos pre-existentes o simultáneos al consumo del agua con arsenito. Por lo que se diseñaron los experimentos en ratones a los que se les suministr{o arsenito de sodio de manera cr{onica en el agua de bebida. Se tomaron en cuenta distintas dosis (2, 20 o 200 ppm) y distintos momentos de superposición con el proceso clásico de carcinogénesis (antes o después del esquema DMBA/TPA). El efecto del arsenito de sodio en el proceso de carcinogénesis experimental se evidenció en una menor cantidad de tumores en todas las condiciones que bebieron arsenito respecto del control. Pero esas formaciones tumorales evidenciaron una tendencia al aumento del índice de malignidad respecto a los ratones de las condiciones de control. Por otro lado es de destacar que la condición que recibió mayor dosis (200 ppm) bebió un 50% menos que las otras condiciones y que tuvo una tendencia a tener menor peso corporal. Para comprender los efectos sistémicos que puede causar el consumo crónico de arsenio, se estudió ex vivo la población de macrófagos provenientes ya sea de la cavidad peritoneal como del tronco bronqueo-alveolar de dichos ratones. En todos las condiciones la población de macrófagos mantiene la capacidad fisiológica de autorregular su reactividad. Esta característica es más evidente en los macrófagos peritoneales. Por otro lado se observó un aumento sustancial en el número de macrófagos respecto a los ratones que no recibieron ningún tipo de tratamiento. Por último se realizaron estudios in vitro para caracterizar el efecto del arsenito sobre el metabolismo celular tanto de las líneas celulares de estirpe epitelial como de macrófagos alveolares. En los macrófagos alveolares tratados in vitro no se detectaron cambios significativos en la viabilidad celular y en la apoptosis con las concentraciones menores a 2uM para 24-96 hs, pero a concentraciones mayores se observó una marcada disminución en la viabilidad y un significativo aumento de la apoptosis. Para caracterizar el estatus matabólico se estudió la dinámica del proceso de generación de sales de formazona a partir del MTT la cual se modificó a concentraciones mayores a 2uM y por otro lado, se evaluó la actividad específica del MTT tomada como parámetro de actividad metabólica, sin encontrar modificaciones. Pero la actividad específica del NBT como parámetro de generación de anión superóxido se incrementó significativamente. El arsenito modifica el metabolismo y el estatus oxidativo de los macrófagos alveolares in vitro cuando se encuentran en un medio enriquecido con arsenito. En las líneas celulares se estudiaron in vitro los mismos parámetros. En cuanto a la dinámica de generación de formazona así como en la respuesta apoptótica sólo se observaron cambios significativos con conentraciones mayores a 7,5uM. Los resultados obtenidos muestran un resultado paradójico, menos tumores pero mayor malignidad, acorde con las distintas facetas conocidas para éste compuesto, por lo que es necesario hacer hincapié en el tiempo de exposición al mismo, los posibles eventos pre-cancerígenos y la variabilidad interindividual.

Descripción: La diarrea asociada a Rotavirus A (RVA) representa una de las principales causas demortalidad infantil a nivel mundial. Si bien la vacunación masiva contra RVA ha logrado disminuirsignificativamente las muertes causadas por este patógeno, la disponibilidad y la eficacia de lasvacunas en zonas de bajos recursos es limitada. Por otra parte, el manejo clínico de la infecciónpor RVA se basa en la administración de Sales de Rehidratación Oral (SRO), mientras que lasopciones terapéuticas específicas resultan limitadas. El principal objetivo de este trabajo fueestudiar y optimizar la utilización de dos fragmentos correspondientes a la porción variable deanticuerpos de cadena pesada derivados de llama (VHH) dirigidos contra la proteína VP6 – 2KD1 y 3B2– para la prevención y el tratamiento de la diarrea asociada a RVA y comparar su eficaciarespecto de otras opciones terapéuticas disponibles. En primer lugar, se analizó la eficacia de ambos clones de VHH anti-VP6 para laprevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RVA en un modelo de ratón (BALB/c)lactante inoculado con una cepa virulenta de RVA murino (EcW, G16P[16]I7). En el tratamientoprofiláctico, los VHH fueron administrados oralmente dos horas antes de la inoculación viralmientras que en el tratamiento terapéutico, los VHH fueron administrados oralmente luego de lainoculación viral, tanto en forma previa a la aparición de los síntomas (pre-sintomático) como luegode la ocurrencia de diarrea (post-sintomático). En todos los casos, ratones lactantes de cuatro díasde vida fueron inoculados con 1778 DD50 (Dosis Diarrea 50) de RVA murino a los 0 Días Post Inoculación (DPI) y examinados diariamente para determinar la ocurrencia de diarrea y recolectarmuestras de heces. Los ratones tratados y el control no tratado fueron sacrificados en formasecuencial entre los 0 y los 6 DPI para el tratamiento profiláctico y los 0 a 7 DPI en el caso de lostratamientos terapéuticos pre y post-sintomáticos. Luego de la eutanasia, se colectaron muestrasde intestinos y de suero. 1. Ensayos profilácticos. Se evaluó la eficacia de dos dosis de VHH,utilizando cuatro camadas de ratones lactantes para cada tratamiento diario: 160 μg de 2KD1+3B2 (N = 31) y 200 μg de 2KD1+3B2 (N = 30). En ambos casos, el tratamiento comenzó a los -1 DPI ycontinuó hasta los 6 DPI. En el DPI 0, los VHH fueron administrados dos horas antes de lainoculación viral. Los controles incluidos fueron ratones inoculados no tratados (control no tratado)y ratones no inoculados (control normal). 2. Ensayo terapéutico pre-sintomático. Se evaluaroncuatro tratamientos orales: 160 μg de 2KD1+3B2 (80 μg de cada uno) (N = 25), 200 μg de 2KD1+3B2 (100 μg de cada uno) (N = 28), 200 μg de 3B2 (N = 24), 200 μg de 2KD1 (N = 30). Paraambos ensayos, se determinó también la presencia de anticuerpos anti-RVA en muestras desueros e intestino a los 0, 7 y 40 DPI. Asimismo, se evaluó el surgimiento de una respuesta inmunehumoral contra el tratamiento de VHH por medición de anticuerpos anti-VHH intestinales y séricosa esos tiempos y el posible surgimiento de mutantes virales de escape al tratamiento mediante PCR, secuenciación completa y análisis filogenéticos del gen codificante de VP6 en muestras deintestinos y heces positivas para RVA luego de 4-6 días de tratamiento. Los resultados obtenidos mostraron que ambas dosis profilácticas de 2KD1+3B2 redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea al igual que el título infeccioso enintestino y la excreción viral en heces. En relación al tratamiento terapéutico pre-sintomático, laadministración conjunta de 2KD1 y 3B2 (200 μg) redujo significativamente la duración y severidadde la diarrea, la infección intestinal y la excreción fecal en relación al grupo no tratado. Mientrasque la misma dosis de 2KD1 o 3B2 (200 μg) también redujo la duración de la diarrea por RVA conrespecto al control, 2KD1 resultó más efectivo en la disminución de la infección intestinal y laexcreción de RVA en heces. Si bien ambos clones presentaron amplia actividad neutralizantecontra diferentes cepas de RVA in vitro, el clon 2KD1 requirió menores concentraciones que 3B2para neutralizar algunas variedades, en particular la cepa de RVA murino usada en los ensayosprevios. Asimismo, 2KD1 presentó valores de afinidad por las partículas de RVA tres veces mayorque 3B2 (EC50). Ni el tratamiento profiláctico ni el tratamiento terapéutico pre-sintomático con VHHanti-VP6 interfirieron con la respuesta inmune humoral del hospedador frente a RVA. Tampoco sedetectaron mutantes virales de escape al tratamiento a nivel de la proteína VP6 en ningún caso. Tratamiento terapéutico post-sintomático. En este caso, los ratones fueron inoculados con 1778 DD50 de RVA murino al cuarto día de vida como ya fuera descripto y recibieron un tratamientodiario de 200 μg de 2KD1 a partir de los 2 DPI, cuando todos los ratones presentaban diarrea,hasta los 7 DPI. El tratamiento terapéutico post-sintomático con 200 μg de 2KD1 redujo la infecciónintestinal por RVA y la excreción viral en heces en relación al control no tratado. Aunque hubo unatendencia a reducir la duración de los síntomas, las diferencias no fueron significativas. Con el objetivo de evaluar la prevención de la diarrea por RVA en un modelo deadministración continua de los VHH, se realizó un nuevo ensayo involucrando ratonas transgénicasque expresaban los VHH anti-VP6 (2KD1+3B2) en leche materna, regulados bajo el promotor del Virus de Tumor Mamario Murino. En este caso, los ratones fueron inoculados a los cuatro días devida con una dosis menor de RVA murino (800 DD50) y se utilizaron cuatro camadas de ratonestransgénicos amamantados por madres transgénicas y cuatro camadas de ratones wild typeamamantados por madres wild type como control. Para descartar que la transgénesis de losejemplares pudiera tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad por RVA, se efectuó unensayo de cross-fostering en el cual las progenies de cuatro madres transgénicas fueronamamantadas por madres wild type y viceversa. Los ratones transgénicos alimentados por madrestransgénicas presentaron una menor prevalencia de diarrea a los 3, 4 y 7 DPI en relación alcontrol. A los 8 DPI, estos ratones habían resuelto por completo el cuadro clínico. Asimismo,redujeron la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en comparación con elcontrol. Con respecto a los ensayos de cross-fostering, los resultados obtenidos fueroncontradictorios. Si bien los ratones wild type amamantados por madres transgénicas redujeron laprevalencia y duración de la diarrea en relación a los ratones amamantados por madres wild typecomo se esperaba, presentaron mayores títulos infecciosos en el intestino y una mayor excreciónviral fecal. Con el propósito de comparar la eficacia de la administración oral de VHH anti-VP6 conotras opciones terapéuticas disponibles para tratar la diarrea por RVA, se realizó un últimoexperimento en el modelo de ratón lactante infectado con 1778 DD50 de RVA murino paracomparar la eficacia de los nanoanticuerpos con dos drogas sintéticas (nitazoxanida, crema debismuto) y dos hierbas aromáticas usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diarrea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + SRO, 2KD1(50 mg/kg) + SRO,nitazoxanida (15 mg/kg), crema de Bismuto (750 mg/kg), A. citrodora (infusión, 2 g/kg); P. aduncum (infusión, 2 g/kg). En este caso, los VHH fueron disueltos en SRO dado que la adición de esteexcipiente aumentaba significativamente la resistencia proteolítica frente a enzimas gástricas. Aexcepción de los ratones tratados con nitazoxanida, los restantes tratamientos redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea por RVA en relación al control no tratado. En relación a los títulos infecciosos a nivel intestinal, los ratones tratados con VHH anti-VP6, cremade Bismuto y nitazoxanida disminuyeron la severidad de la infección mientras que aquellostratados con A. citrodora y P. aduncum no mostraron mejoras. La excreción viral en heces sólo seredujo en los ratones tratados con VHH y nitazoxanida pero no se apreciaron diferenciassignificativas en el resto de los tratamientos. El presente trabajo de tesis muestra que la administración oral de VHH anti-VP6 constituye,no sólo un tratamiento profiláctico efectivo frente a la diarrea asociada a RVA, sino también unaherramienta terapéutica eficaz y segura contra la infección por este virus, incluso luego de laaparición de los primeros síntomas. En este sentido, la terapia oral con VHH anti-VP6 representaríaun mejoramiento considerable en relación a otras opciones terapéuticas disponibles actualmente. Asimismo, los VHH anti-VP6 podrían ser empleados como una estrategia complementaria a lavacunación, especialmente en poblaciones que han mostrado menor eficacia de inmunización. Entérminos generales, el uso de anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 presenta un enorme potencialpara su implementación en pacientes inmunocomprometidos y en países de bajos recursos, dondela mortalidad por RVA continúa siendo elevada y las actuales vacunas muestran menor eficacia.

Descripción: El objetivo de este trabajo fue interrelacionar las alteraciones conductuales, neuroquímicas e inmunológicas inducidas por estrés crónico en dos cepas endocriadas de ratones, BALB/c y C57BL/6. Se utilizó un modelo de estrés crónico moderado (CMS) que consiste en la aplicación de varios estresores de moderada intensidad, de manera crónica, alternada e impredecible durante varias semanas. Se observó que los ratones BALB/c expuestos a CMS presentaron una menor capacidad de aprendizaje y memoria compatible con alteraciones estructurales y neuroquímicas observadas en el hipocampo, como disminución de la neurogenésis, disminución de la actividad y del nivel proteico de nNOS, perfil proteico diferencial de isoformas de PKC, entre otras. Estas alteraciones no fueron encontradas en los ratones C57BL/6 expuestos a CMS. En lo que respecta a la respuesta inmune, los BALB/c CMS presentaron una disminución en la proliferación de linfocitos T y un aumento en la proliferación de linfocitos B estimulada por mitógenos. Así como un desbalance de citoquinas hacia Th2. Por el contrario, los animales C57BL/6 CMS mostraron un aumento en la reactividad en los linfocitos T sin presentar cambios en la correspondiente a los linfocitos B y un desbalance de citoquinas hacia Th1. Respecto a la participación de las hormonas clásicamente relacionadas al estrés (catecolaminas y corticosterona), los resultados indicaron que no existe una coincidencia temporal entre el aumento de dichas hormonas y la aparición de las alteraciones mencionadas. Además, los cambios observados en los ratones BALB/c CMS pudieron ser revertidos por la administración de Copaxone®, que estimula débilmente la respuesta autoinmune induciendo un aumento de las citoquinas Th1. Estos hallazgos señalan que las terapias basadas en la modulación del sistema inmune podrían ser útiles para el tratamiento de déficit cognitivos inducidos por estrés. Palabras claves: psiconeuroinmunología, ratones BALB/c y C57BL/6, estrés crónico, aprendizaje y memoria, neurogénesis, óxido nítrico sintasa, proteína quinasa C, balance Th1/Th2, Copaxone®.