Descripción: Los procesos de invasión tumoral y diseminación metastásica involucrantanto moléculas de adhesión como proteasas tumorales. Entre las moléculas deadhesión la fibronectina (FN), una glicoproteína de alto peso molecular presente enla matriz extracelular (ME) y en varios fluidos corporales, juega un importante rol enmuchos aspectos de la interacción célula-célula y célula-sustrato incluyendoadhesión, spreading y migración, cicatrización y transformación maligna. El activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) es una enzimaproteolítica capaz de activar el sistema fibrinolítico por conversión del plasminógenoen plasmina e interviene en numerosos fenómenos de remodelación de matricestisulares. Los tejidos cancerosos suelen contener un exceso de uPA, hecho quegenera una intensa actividad degradativa en torno de la masa tumoral primaria. Deesta manera, las células tumorales son capaces de degradar diferentescomponentes de la matriz extracelular y migrar a través de estos defectos,constituyendo un paso crucial en el proceso de invasión y metástasis. En el presente trabajo se muestra el desarrollo de modelos de cáncerexperimental útiles para estudiar el rol de las proteasas y los componentes de la MEen la biología de la progresión tumoral. En una primera instancia se establecieron y caracterizaron las líneascelulares LM3 y LMM3. obtenidas por subcultivos sucesivos in vitro a partir decultivos primarios de los adenocarcinomas mamarios murinos M3 y MM3respectivamente. Durante la evolución de la línea LM3 se observó un incremento enla capacidad de crecer en forma independiente del anclaje, un desplazamiento haciaun nivel triploide en la distribución del número cromosómico y la perdida gradual dela expresión de FN. La capacidad invasiva local y la capacidad metastásicaespontánea de la línea LM3 se incrementaron con el aumento del número derepique, en asociación con la progresiva pérdida de expresión de FN y el incrementoen los niveles de uPA unido a la membrana celular. Por otra parte, las células LMM3mantuvieron la incapacidad para expresar FN y la alta capacidad metastásicaespontánea ya observada en su tumor parental MMS, adquiriendo además unamayor invasividad local. Con el fin de analizar el rol de la FN en el proceso metastásico, células dela línea LMM3 se transfectaron en forma estable con distintas construccionesconteniendo variantes wt (salvaje) y RGD (-) del cDNA de FN humana y seobtuvieron, de esta manera, clones celulares capaces de re-expresar esta FNhumana recombinante. Si bien ninguno de estos clones fue capaz de ensamblar unamatriz extracelular in vitro, los mismos mostraron una reducción en su capacidadmigratoria y un incremento en sus propiedades adhesivas. Todos los clonescelulares analizados mostraron una reducción significativa en su potencialmetastásico experimental cuando se los comparó con clones control y con la lineacelular parental. Una tendencia similar se observó en la capacidad metastásicaespontánea. Estos resultados indican que la re-expresión de FN, carente del sitio deunión a células RGD e incapaz de formar matriz extracelular. es suficiente paradisminuir el potencial metastásico de las células tumorales. Además de tener un efecto directo en la adhesión y migración celular, laexpresión de FN podría estar modulando otros eventos celulares asociados a lacascada metastásica. Con el fin de analizar esta hipótesis, se estudió el potencialangiogénico y la capacidad de producir uPA, una proteasa altamente correlacionadacon el fenotipo invasivo, de los diferentes clones celulares. Independientemente de la integridad de la secuencia RGD, todos losclones transfectados con el gen de FN mostraron una reducción significativa en lacapacidad angiogénica respecto del clon control, indicando que la FN podríaprevenir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, ya sea capturando o impidiendola liberación de factores angiogénicos. Por otra parte, la re-expresión de FN produjo un incremento en los nivelesde uPA secretados al medio condicionado en todos los clones analizados, si bienaquellos que expresan la variante RGD (-) secretaron un 50% menos de uPA queaquellos que expresan la variante wt. Por otro lado, los clones FNwt fueronincapaces de unir uPA a la superficie celular, mientras que los clones RGD (-), aligual que el clon control, conservan esta capacidad. El tratamiento de células LMM3o del clon control con FN exógena indujo un aumento en la secreción de uPA y unacaída en la capacidad de unir uPA a la membrana plasmática, en forma similar a losefectos inducidos por la re-expresión de FN en los clones. La modulación por FN dela actividad uPA secretada y asociada a la membrana celular mostró serdependiente de la secuencia RGD y de la integrina β1. Estos resultados sugierenque la capacidad de la FN de bloquear el desarrollo de las metástasis en los clonescelulares analizados puede también estar parcialmente generada por la disminuciónen la capacidad de unir uPA a la superficie celular mediada por la FN, generando lareducción de la capacidad migratoria e invasiva de las células. En la presente tesis se describe por primera vez un mecanismo por elcual la FN interviene en la prevención de la diseminación metastásica de maneraindependiente de la formación de ME y del principal sitio de unión a células, lasecuencia RGD. Además, demostramos que la FN es capaz de modular la expresiónde uPA y de su receptor uPAR. Por otra parte se sugiere la existencia de otrosmecanismos que influyen en el potencial metastásico. En la presente tesis seproveen además nuevas evidencias acerca de cómo moléculas de la ME puedenmodular el fenotipo metastásico.

Descripción: La terapia antiangiogénica se basa en estrategias moleculares que intentanbloquear la neovascularización tumoral y así detener la progresión de la masa neoplásica. Las células endoteliales suelen responder al estímulo estrogénico. La angiogénesis implica laproliferación del endotelio junto a la remodelación de la matriz extracelular, dondeparticipan, las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs). En el presente trabajose investigaron los posibles mecanismos antiangiogénicos del potente antiestrógenonafoxidina y el intrincado papel del TIMP-1 en la vascularización y progrésión tumoral. Seencontró que el tratamiento in vitro de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) con dosis no citotóxicas de nafoxidina disminuye de manera dosis-dependiente laproliferación. Nafoxidina redujo también la adhesión, la capacidad de extensión sobre elsustrato y la migración de las células endoteliales, e indujo un aumento en la activación de la MMP-2 y en la secreción de TIMP-1. Además, inhibió significativamente la invasión y laformación de cordones endoteliales sobre Matrigel. La acción antiangiogénica de nafoxidinapodría asociarse a acciones indirectas, mediadas a través del aumento del TIMP-1, comotambién a efectos directos del antiestrógeno sobre las células HUVEC. Los cotratamientosin vitro con nafoxidina y el éster de forbol PMA indicaron que la acción antiangiogénicapodría estar relacionada con la inhibición de vías de señalización intracelular dependientes dela proteína quinasa C. El cotratamiento con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX y elderivado de CAMP dbcAMP sugirieron la participación de múltiples vías de señales en laacción antiangiogénica de nafoxidina. Otros ensayos in vitro con el inhibidor de fosfolipasa D n-butanol, el ionósforo A23187 y el bloqueante de canales de calcio verapamilo indicaronla importancia de estas vías de señales en la formación de capilares endoteliales. Finalmente,se exploraron in vivo los efectos de nafoxidina y TIMP-1, empleando un modelo singénicode carcinoma mamario en ratones BALB/c y un melanoma murino inoculado en hídridos C57BL/6j-CBA transgénicos que sobrexpresan TIMP-1 humano en hígado y lo vuelcan a lacirculación. Los datos obtenidos en animales ratifican La complejidad de los mecanismosregulatorios que operan in vivo durante la vascularización tumoral y diseminaciónmetastásica. Este trabajo aporta elementos útiles para el futuro diseño de ensayos clínicoscon nuevos agentes antiangiogénicos para el tratamiento del cáncer.

Descripción: A pesar de los formidables avances logrados en el tratamiento, prevención y detección temprana de un gran número de cánceres, el desarrollo de procesos metastásicos en pacientes afectados con esta enfermedad continúa representando una reducción significativa en su supervivencia y calidad de vida restante. De hecho, la diseminación metastásica de un tumor primario a un segundo sitio es la causa principal de muertes por tumores sólidos. El desarrollo de metástasis requiere que las células tumorales completen una cascada de acontecimientos constituida por etapas bien definidas, que implican interacciones muy diversas entre las células tumorales y el organismo hospedador. El potencial invasivo de las células malignas depende de tres fenómenos: alteraciones en la adhesión celular, degradación proteolítica localizada de la matriz extracelular y movilidad de las células tumorales. Dicho potencial puede verse modificado por alteraciones genéticas en las células tumorales que podrían constituir posibles puntos de intervención terapéutica. La ubiquitinación representa una de las modificaciones post-traduccionales cuyo estudio ha despertado un creciente interés en el ámbito de la oncología molecular, debido a su gran potencial a nivel terapéutico en el tratamiento del cáncer. Prueba de esto último es el hecho que, en muchos casos, alteraciones en distintos componentes de la cascada de ubiquitinación están asociadas a la trasformación maligna de células tumorales y al desarrollo de procesos metastásicos. La cascada de ubiquitinación consiste en una red compleja de enzimas que median la unión covalente de múltiples unidades de ubiquitina a las proteínas, y representa una de las vías metabólicas más importantes que participa en el control de la proteostasis a nivel celular. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos moleculares que rigen esta cascada enzimática, junto con el desarrollo de compuestos que inhiben o activen componentes específicos, posee un gran potencial a nivel terapéutico. En el contexto de lo señalado en los párrafos anteriores, el objetivo de esta tesis doctoral es identificar y caracterizar componentes de la cascada de ubiquitinación que representen potenciales nuevos blancos moleculares que puedan ser utilizados en futuros desarrollos y mejoras de las terapias antitumorales actuales. A tal fin se realizó un screen genético utilizando tecnología de ARN de interferencia (shARN) para encontrar nuevos genes relacionados con el proceso de ubiquitinación que regularan positivamente el potencial migratorio de células tumorales. En particular se focalizó la atención en células derivadas de Cáncer de Mama Triple Negativo (CMTN), una neoplasia maligna que posee un mal pronóstico, presenta alto riesgo de recurrencia metastásica y para la cual no se posee en la actualidad una terapia eficaz y específica. Mediante este procedimiento se identificó USP19, una enzima deubiquitinasa (DUB), como un nuevo regulador de los procesos de migración e invasión celular. Asimismo se validó, tanto in vitro, como así también en modelos animales in vivo, el rol que este gen cumple en el control de procesos de tumorigénesis resaltando su alto potencial como posible futuro punto de intervención terapéutico en el tratamiento del cáncer.

Descripción: El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres en Argentina. La angiogénesis es crucial para el crecimiento y progresión del PCa. El perfil de diseminación de estos tumores muestra tendencia a desarrollarse en el hueso como único sitio de progresión, donde las células tumorales interactúan con el microambiente interrumpiendo el equilibrio formación/degradación del hueso. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos que el aumento de expresión de hemo oxigenasa-1 (HO-1) en líneas de PCa disminuye su proliferación, invasión y migración in vitro y el crecimiento tumoral in vivo. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar el efecto de HO-1 sobre la angiogénesis y progresión del PCa. Comprobamos que la sobre-expresión de HO-1 en PC3 disminuye la expresión de genes pro-angiogénicos in vitro. Un ensayo de angiogénesis in vivo mostró que la inoculación intradérmica de las células con expresión estable de HO-1 (PC3HO-1), generaba tumores menos vascularizados, con reducida densidad de la microvasculatura e inmunomarcación disminuida de marcadores angiogénicos. Mediante un sistema de co-cultivo de células PC3 con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs), comprobamos que la disminución de la proliferación de los PMOs inducida por las células tumorales, se restauraba cuando éstas fueron pre-tratadas con el inductor farmacológico de HO-1 (hemina). No se observaron alteraciones en la expresión de genes involucrados en la diferenciación y resorción ósea. Sin embargo, el tratamiento con hemina indujo DKK-1 en las células PC3 co-cultivadas y el estrés oxidativo y la vía de FoxO en los osteoblastos. Estos resultados se confirmaron utilizando explantes de calvarias. La inyección intra-ósea de PC3HO-1 produjo una robusta remodelación ósea. Mediante un microarray de tejidos derivados de metástasis de pacientes resistentes a la castración creciendo como xenotransplantes en ratones SCID se determinó que HO-1 presentaba inmunomarcación heterogénea. En conjunto, estos resultados demuestran que HO-1 es un factor clave para el control de la angiogénesis y altera el microambiente tumoral impactando sobre la progresión ósea del PCa.

Descripción: El cáncer de próstata es la enfermedad oncológica más diagnosticada y la tercera causa de muerte por cáncer en la población masculina de Argentina, mientras que a nivel mundial es la segunda en incidencia y la quinta causa de muerte por cáncer en hombres. Presenta un amplio espectro de manifestaciones clínicas; cuando se encuentra localizado es mayoritariamente curable pero, al expandirse a tejidos extraglandulares, el pronóstico de cura disminuye drásticamente, teniendo a las metástasis óseas como principal causa de muerte. Las células metastásicas de los tumores prostáticos presentan tropismo preferencial por el hueso, sitio en el cual se establecen aproximadamente el 90% de sus tumores metastásicos. Allí, las células tumorales interactúan con el microambiente óseo y provocan un desbalance en el proceso fisiológico de remodelación, que requiere una actividad perfectamente coordinada entre los osteoclastos y los osteoblastos para llevar adelante la degradación y la formación de tejido óseo de manera equilibrada. Si bien se demostró que las células óseas liberan factores que favorecen el crecimiento y la sobrevida de las células tumorales prostáticas y que esa interacción, a su vez, promueve la progresión metastásica, aún no se conoce por completo la naturaleza molecular de ese diálogo entre ambos tipos celulares. En la actualidad, a pesar de ser posible la detección temprana de los tumores prostáticos, continúa siendo un desafío poder predecir con precisión el riesgo de progresión y, por ende, determinar el tipo de tratamiento adecuado para cada paciente en particular. Al momento del diagnóstico, el predictor de referencia es la estadificación desarrollada por la Sociedad Internacional de Patología Urológica (ISUP), que se basa en la puntuación histológica de Gleason. El puntaje ISUP ofrece mejoras respecto de la puntuación de Gleason original; sin embargo, no resulta suficiente para pronosticar con certeza el curso de la enfermedad en una alta proporción de pacientes, siendo necesario encontrar nuevos biomarcadores que permitan agregar valor predictivo a los parámetros clínico-patológicos ya utilizados. En los últimos años, cobró mayor relevancia el estudio de las vesículas extracelulares, evidenciándose que están involucradas en las diferentes etapas de la progresión tumoral. En particular, los exosomas son un tipo de vesículas extracelulares pequeñas con biogénesis endocítica, que están presentes en los fluidos corporales y suelen ser un reflejo de sus células de origen. El contenido de estas vesículas incluye proteínas, lípidos, ADN y distintos ARNs. En consecuencia, los exosomas emergen como potenciales nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la enfermedad a través de métodos poco invasivos como las biopsias líquidas. Con estos antecedentes, se planteó la hipótesis que los tumores prostáticos liberan exosomas que transportan biomoléculas que acondicionan el nicho metastásico óseo. Por lo tanto, el objetivo general de esta tesis fue estudiar la comunicación intercelular entre las células tumorales prostáticas y las células óseas, centrándose en la comunicación a través de vesículas símil exosomas (ELVs, exosome-like vesicles), e identificar mecanismos moleculares involucrados en esta interacción intercelular. Empleando un ensayo de co-cultivo indirecto entre células tumorales prostáticas PC3 y células precursoras óseas MC3T3 (preosteoblásticas) o Raw264.7 (preosteoclásticas), se pudo evidenciar un potencial tráfico de vesículas extracelulares desde las células PC3 hacia las células óseas. Luego, se procedió a aislar estas vesículas a partir de medios condicionados de mono-cultivos de PC3; las cuales pudieron ser caracterizadas como ELVs mediante microscopía electrónica de transmisión, citometría de flujo y Western Blot. Posteriormente, se incubaron las células precursoras óseas (MC3T3 o Raw264.7) con las vesículas aisladas de PC3, observándose cambios morfológicos y en el perfil transcripcional. Además, se realizó un análisis bioinformático a partir de datos transcriptómicos de repositorios públicos (GSE109356, GSE117744 y GSE35813) en los que se analizó el contenido de microARNs (miRNAs) de ELVs de PC3. Se determinó cuáles eran los 100 miRNAs más abundantes en cada conjunto de datos y se identificaron los 16 miRNAs comunes a los tres conjuntos. El análisis de ontología génica de los 16 miRNAs junto con sus ARNs mensajeros (mRNAs) blanco, determinó que se encuentran asociados a inflamación, regeneración ósea, transición epitelio-mesenquimal, adhesión celular y vías de señalización en cáncer, entre otras. También se evaluó el contenido de ARNs de las ELVs derivadas de PC3 por arrays de expresión, focalizando el estudio en los 30 lncRNAs más abundantes, cuyos mRNAs blanco se encuentraron involucrados en vías relacionadas con modificaciones de la cromatina, regulación de la transcripción y la traducción, degradación del ARN, proteólisis, diferentes tipos de uniones intercelulares, adhesión celular y procesos metabólicos, entre otros. Por otro lado, se analizaron datos transcriptómicos de vesículas extracelulares aisladas de plasma de pacientes con cáncer de próstata y de hombres sanos (GSE71008). Al comparar la abundancia de los ARNs contenidos en las vesículas de ambos grupos, se encontraron 6 ARNs no codificantes largos (lncRNAs), 9 miRNAs y 15 mRNAs con abundancia diferencial. Además de ser candidatos interesantes a biomarcadores de diagnóstico de la enfermedad, se observó que estos ARNs están involucrados en múltiples procesos de gran importancia en el hueso, sugiriendo un rol de estas vesículas extracelulares en la preparación del nicho metastásico óseo. Para evaluar si también podrían tener utilidad como indicadores de progresión de la enfermedad, se utilizaron los datos de 482 tumores primarios de TCGA-PRAD, encontrando una firma de lncRNAs y mRNAs que presenta una asociación significativa con el tiempo de sobrevida libre de progresión de los pacientes y permite aumentar el valor predictivo del sistema de estadificación ISUP para determinar el riesgo de progresión de cada paciente. En síntesis, este trabajo permitió ampliar el conocimiento sobre los efectos de las ELVs derivadas de células tumorales prostáticas PC3 sobre las células óseas y el rol que podrían tener en la preparación del nicho metastásico. También se identificaron perfiles de ARNs que permitirían mejorar el diagnóstico y agregar valor predictivo al parámetro de referencia utilizado para la predicción del riesgo de progresión del cáncer de próstata.

Descripción: Se estudió el efecto de los mastocitos (MC), la heparina y heparinas sin actividadanticoagulante sobre el desarrollo tumoral. Empleando el fluorocromo tris (2,2’-bipiridina)rutenio (II), que se une a los grupos sulfatos de la heparina, se realizó la identificacióncitoquímica de MC de cavidad peritoneal y se cuantificó comparativamente el contenido deheparina de los gránulos de MC de ratones portadores de tumor (MCP) y de ratones normales (MCN) mediante análisis de imagen. Los MCN que poseen el doble de heparina que los MCPinhibieron la proliferación in vitro y la incidencia tumoral in vivo de un adenocarcinomamamario murino de moderada capacidad metastásica en pulmón (M3). Observamos que las células M3 poseen receptores para heparina de alta afinidad, a los quepueden también unirse una heparina parcialmente N-desulfatada N-Acetilada (N-des N-Ac). Ambas heparinas inhibieron la proliferación de las células tumorales in vitro e incrementaron laadhesión celular mientras que otras heparinas modificadas (parcialmente O-desulfatada (Odes), N-desulfatada (N-des), O/N-desulfatada N-Acetilada (O/N-des N-Ac)) no se unen a losreceptores y no tuvieron efecto sobre la proliferación y la adhesión. Estos resultados muestranque la unión de la heparina a los receptores se correlaciona con el efecto antiproliferativo y elaumento de la adhesión celular. Solamente la heparina inhibió la formación de metástasisexperimentales en pulmón, siendo el efecto revertido por un inhibidor selectivo del activadorde plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) (el compuesto B623). Para determinar elmecanismo por el cual la heparina posee efecto antimetastásico se estudió: a) el efectofibrinolítico de las heparinas mediado por uPA; b) la actividad procoagulante de ratonesportadores de tumor y el efecto de las heparinas en la coagulación y c) la producción deactividad heparinasa por parte de las células tumorales M3 y la susceptibilidad de las heparinasa ser degradadas por esta enzima. El análisis global de los resultados sugiere que el efectoantimetastásico se asocia a la actividad anticoagulante.

Descripción: El cáncer de próstata (CaP) es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado en hombres. En estadíos avanzados la enfermedad puede diseminarse siendo el hueso el principal sitio de metástasis. Este no es un evento aleatorio, sino que se generan loops regulatorios de retro-alimentación entre las células de CaP y las células del microambiente de la metástasis, interrumpiendo la homeostasis del hueso. El hueso es un tejido dinámico que se somete a una remodelación mediada por el balance de osteoblastos y osteoclastos. La disrupción de este equilibrio por la presencia de células tumorales convierte el nicho óseo normal en un nicho tumoral o metastásico. Como en otras malignidades la generación de daño oxidativo a macromoléculas y componentes celulares, y el proceso inflamatorio asociado, promueven la carcinogénesis prostática y su progresión. Se ha demostrado que las células óseas producen factores que aumentan el crecimiento y sobrevida de las células tumorales y que esta interacción, a su vez, favorece la progresión metastásica. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente y existen pocos modelo experimentales apropiados para estudiar dicha interacción. La inducción de Hemo oxigenasa 1 (HO-1) surge como un proceso de defensa celular fundamental frente a estímulos de estrés e inflamatorios. Previamente demostramos que HO-1 cumple funciones críticas antitumorales en la carcinogénesis prostática. Nuestra hipótesis se basa en que HO-1 modifica el microambiente tumoral modulando la expresión de factores inflamatorios y angiogénicos alterando la interacción entre la célula prostática y la ósea. Los objetivos de este trabajo de tesis fueron: evaluar el impacto fisiológico in vivo de la carencia de HO-1 en el metabolismo óseo de ratones Knock-out (KO) para Hmox-1 (gen de HO-1); determinar el perfil transcripcional de genes involucrados tanto en la tumorigénesis como en la remodelación ósea en un sistema de co-cultivo donde células de CaP compartían el medio con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs) aislados de ratones BALB/c Hmox-1 +/+, +/- o -/-; o en co-cultivo con células precursoras de osteoblastos (MC3T3) u osteoclastos (Raw264.7). También analizamos mediante proteómica el secretoma en los medios condicionados del co-cultivo de células de CaP con precursores óseos. El análisis histomorfométrico de los fémures de ratones transgénicos para Hmox-1 reveló una disminución de la densidad ósea concomitante con la pérdida de copias de este gen. En línea con esto se observó un menor número y actividad de osteoblastos y osteoclastos, indicando un metabolismo óseo disminuido. Se observó una correlación entre los niveles de expresión de Hmox-1 y diferentes genes implicados en la diferenciación de osteoblastos o en la regulación de la fisiología ósea como Runx2, Col1a1, Csf-1 y Opg, coincidiendo no solo con el menor número y actividad de osteoblastos, sino también con la disminución general del metabolismo óseo antes mencionada. Mediante citometría de flujo se detectaron dos poblaciones de PMOs con diferentes niveles de ROS; la población con niveles altos estaba significativamente reducida en los animales KO, demostrando que estas células presentaban una tolerancia restringida al estrés oxidativo. En líneas generales, el co-cultivo con células PC3 derivó en un perfil de expresión génica pro-osteolítico en las células óseas, el cual fue parcialmente revertido cuando las células tumorales se encontraban pre-tratadas con Hemina, inductor farmacológico de HO-1. Entre los principales factores alterados se encuentran PTHrP, OPG, RANKL y RUNX2, todos ellos fuertemente implicados en el proceso de remodelación ósea. En resumen, los niveles de HO-1 impactan sobre la expresión de factores osteoblastogénicos y osteoclastogénicos, impactando en el balance óseo y alterando la comunicación entre las células del CaP y las células óseas.

Descripción: El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuyaexpresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de lasneoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo,en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación alcrecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajonos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como delas células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC enninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos nivelesde expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras depacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en amboscomponentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que laelevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que laexpresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelioes negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumorhumano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y laetapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN,encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelulary de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmenteidentificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimientotumoral y la diseminación metastásica.

Descripción: La sobreexpresión/amplificación del receptor con actividad tirosina-quinasa ErbB-2 define unsubtipo agresivo de cáncer de mama (CM) con incidencia elevada de metástasis, denominado ErbB-2 positivo. En esta Tesis revelamos un nuevo sentido de la interacción entre el ErbB-2 y Stat3, otro actor clave en CM, la cual subyace la diseminación metastásica. Encontramos que Stat3no solo induce la expresión del ErbB-2, sino que también lo recluta como coactivador en elpromotor del microARN-21, un microARN promotor de metástasis. El ErbB-2 induce además laexpresión del microARN-21 actuando como factor de transcripción. El microARN-21, a su vez,inhibe la expresión de PDCD4, un supresor de metástasis. En la clínica, encontramos en tumores ErbB-2 positivos una correlación inversa entre la coexpresión nuclear Stat3/ErbB-2 y la expresiónde PDCD4, la expresión del microARN-21 y de PDCD4, y la expresión de PDCD4 y la presencia demetástasis ganglionares. A pesar de que terapias dirigidas al ErbB-2, como el trastuzumab y el lapatinib, han probadoser beneficiosas, las respuestas tienden a ser limitadas en magnitud y duración. Aquí, describimosun mecanismo de acción novedoso para estos agentes. Encontramos que el trastuzumab y ellapatinib, a través del bloqueo de las vías de PI3K/AKT y MAPK, inhiben al oncogén c-Myc, lo cualaumenta los niveles del microARN-16, un potente supresor tumoral. La incapacidad de inducir laexpresión del microARN-16 subyace fenómenos de resistencia. Identificamos a CCNJ y FUBP1como blancos novedosos del microARN-16, responsables de sus efectos antiprolfierativos, ydemostramos que los niveles del microARN-16 y FUBP1 predicen la respuesta al trastuzumab enadyuvancia, en pacientes con CM ErbB-2 positivo. Postulamos al microARN-16 como un agenteterapéutico innovador para tumores resistentes al trastuzumab y/o lapatinib.

Descripción: El Hexaclorobenceno (HCB) es un pesticida organoclorado considerado como probable carcinógeno humano. A nivel regional, este contaminante fue encontrado en leche materna de puérperas y en muestras de leche vacuna para consumo humano. Es un tóxico tipo dioxina, y como tal se une al receptor de hidrocarburos aromáticos (RHA), un factor de transcripción que modula procesos tales como apoptosis, proliferación y migración celular. El RHA está presente en el citosol e interacciona con el complejo que contiene a la quinasa de tirosina c-Src. Cuando estos tóxicos se unen al RHA, se pueden desencadenar dos mecanismos: 1) que el complejo tóxico-RHA se transloque al núcleo y module la expresión de genes con elementos de respuesta a dioxinas (DREs) en sus promotores y 2) que se libere la c-Src del complejo citosólico y active receptores de factores de crecimiento, como el Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (HER1). Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que el HCB aumenta el desarrollo y malignidad de tumores mamarios inducidos por N-Nitroso-N-metilurea en rata. En este mismo modelo se observó que el HCB activa la vía de señalización de c-Src/HER1 y disminuye la actividad del receptor de estrógenos (REα) en los tumores mamarios. Por otro lado, en estudios in vitro se demostró que el tóxico incrementa la proliferación y la actividad de c-Src en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (+REα). La tumorigénesis ocurre frecuentemente como resultado de la sobreexpresión de proteínas como el HER1 y la c-Src, que están involucradas en procesos celulares normales. Estas proteínas están usualmente sobreexpresadas en cáncer de mama en estadíos tardíos, y cooperan en la formación y progresión tumoral al favorecer procesos como la proliferación, migración e invasión celular, actividad de metaloproteasas y metástasis. Los objetivos de este trabajo fueron investigar en ensayos in vitro, utilizando una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (-REα) los efectos del tóxico en: a) la migración e invasión celular, b) la actividad y expresión de c-Src y HER1, c) la estimulación de las vías de señalización de ERK1/2, Akt2 y STAT5b, d) la actividad y expresión de metaloproteasas 2 y 9 (MMP2 y 9), y e) si los efectos observados dependen de las vías de señalización en estudio y de la unión del pesticida al RHA. Por otro lado, nos propusimos estudiar en ensayos in vivo, la acción del HCB sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos espontáneos y experimentales. Nuestros resultados muestran que el HCB estimula las vías de transducción de señales de c- Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, la migración e invasión celular, la expresión de MMP2 y 9, así como la secreción y actividad de MMP9 en la línea celular MDA-MB-231, in vitro. Observamos que la migración e invasión celular inducida por el tóxico están mediadas por c-Src, HER1 y el RHA. A su vez, la secreción y actividad de la MMP9 estimulada por el HCB depende de HER1 y del RHA, mientras que el aumento en la expresión de MMP2 depende tanto de c-Src, HER1 como del RHA. Asimismo, en un modelo de xenotrasplante con la línea celular MDA-MB-231 en ratones atímicos, demostramos que el pesticida estimula el crecimiento tumoral (0.3 y 3 mg/kg p.c.), mientras que induce la activación de c-Src, HER1, ERK1/2 y STAT5b e incrementa los niveles proteicos de MMP2 y 9 en los tumores mamarios en todas las dosis ensayadas. Por otro lado, en estudios de metástasis espontánea con tumores C4-HI en ratones BALB-c, encontramos que el HCB (0.3 y 3 mg/kg p.c.) aumenta el crecimiento de los tumores mamarios y el número de micrometástasis en hígado y pulmón. En los estudios de metástasis experimental con la línea celular LM3 en ratones BALB-c, el pesticida (3 mg/kg p.c.) incrementa el tamaño de las metástasis en pulmón. En conclusión, en el presente trabajo demostramos por primera vez, que el HCB promueve la migración e invasión celular por las vías de c-Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, así como la expresión de MMP2 y MMP9 de manera dependiente del RHA. A su vez, observamos que el tóxico estimula el crecimiento tumoral y metástasis en pulmón e hígado en modelos experimentales de cáncer de mama.

Descripción: El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y se clasifica en dos tipos principales: de células pequeñas y de células no pequeñas (NSCLC). El factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) regula un amplio espectro de funciones celulares y juega un rol importante en las enfermedades del pulmón, incluyendo el NSCLC. El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar el papel del TGFβ en la progresión tumoral de la línea de adenocarcinoma de pulmón murino LP07. Más aún, se realizó un estudio retrospectivo con muestras de tumores de pacientes con NSCLC estadios I-III para evaluar el rol clínico-patológico y la significancia pronóstico de moléculas moduladas por TGFβ; incluyendo la galectina-1 (gal-1), el receptor de TGFβ tipo I (TβRI) y los factores de transcripción FoxM1 y DEC2. En el modelo experimental LP07, el TGFβ moduló múltiples aspectos vinculados con la progresión tumoral, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la migración, la actividad de enzimas proteolíticas, la secreción de citoquinas, la angiogénesis, el acondicionamiento del órgano blanco de la metástasis y la retención de las células tumorales en el pulmón. Se demostró que si bien el tratamiento con TGFβ retrasó el crecimiento en el sitio primario, no indujo un programa de quiescencia sostenido, y se observó un cambio hacia la progresión maligna en el sitio metastásico. En los pacientes con NSCLC, se definió el valor como biomarcadores de pronóstico de la expresión alta de gal-1 conjuntamente en las células tumorales y el estroma, así como la expresión alta de TβRI en la membrana de las células tumorales, que se asociaron con menor supervivencia global y mayor riesgo de caída, respectivamente, luego del ajuste por otros pronosticadores. Por otro lado, la expresión del supresor tumoral candidato DEC2 en las células tumorales se asoció con una mejor supervivencia global, en particular para los pacientes con tamaño tumoral T2. La evaluación de la expresión del marcador de proliferación FoxM1 en las células tumorales o el infiltrado no arrojó datos de importancia clínica, aunque el análisis conjunto de la expresión contrapuesta de FoxM1 y DEC2 en los tumores podría aportar información de pronóstico en una cohorte de pacientes mayor. En conjunto, este trabajo demuestra la modulación por TGFβ del comportamiento de los tumores de pulmón y proporciona potenciales herramientas de pronóstico y posibles blancos moleculares para el tratamiento.

Descripción: La Terapia por Captura Neutrónica en Boro (BNCT) es una aplicación de la tecnología nuclear al área biomédica, que se basa en la acumulación selectiva de compuestos borados dentro del tumor y la subsiguiente irradiación con neutrones, generando una reacción de captura neutrónica que libera radiación de partículas de alta transferencia lineal de energía (LET) y corto alcance que resultan letales para la célula. De esta manera BNCT dañaría preferencialmente el tumor sin causar daño significativo al tejido normal. Nuestro grupo demostró la eficacia terapéutica de la aplicación a nivel experimental de distintos protocolos de BNCT in vivo, utilizando las fuentes de neutrones disponibles inicialmente, es decir los reactores nucleares de experimentación RA-1 (San Martín, Buenos Aires) y RA-6 (Bariloche, Río Negro). Luego, en 2005, la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) construyó una fuente de neutrones térmicos para aplicaciones biomédicas de BNCT en el reactor nuclear RA-3 (Ezeiza, Buenos Aires). Entre los objetivos del presente trabajo se planteó realizar una adaptación y caracterización dosimétrica de la nueva fuente que permitiera realizar estudios radiobiológicos de BNCT en el modelo experimental de cáncer bucal de la bolsa de la mejilla del hámster. Se evaluaron las respuestas del tumor, tejido precanceroso y tejido normal en forma comparativa con las otras fuentes utilizadas anteriormente. Los conocimientos obtenidos en estos estudios se emplearon para llevar adelante líneas de investigación para optimizar los protocolos de BNCT, maximizando su eficacia terapéutica, minimizando su radiotoxicidad y evaluando su potencial aplicación a otras patologías. En este contexto y dado el interés de la comunidad internacional de explorar el potencial terapéutico de BNCT para el tratamiento de metástasis hepáticas, otro objetivo principal de esta tesis doctoral fue realizar una evaluación sistemática de la eficacia terapéutica del BNCT en un modelo experimental de metástasis hepática, y considerar la potencial radiotoxicidad del tratamiento sobre el hígado. Se realizó la puesta a punto de un modelo in vivo en ratas, se desarrolló y caracterizó dosimétricamente un sistema adecuado de blindaje para luego realizar los estudios de BNCT in vivo en la fuente del reactor RA-3. Se evaluó la respuesta del tumor y aspectos de la radiotoxicidad en hígado para contribuir al conocimiento de la radiobiología de BNCT en el tratamiento de esta enfermedad. Los conocimientos de la radiobiología de BNCT obtenidos en modelos experimentales permitirían optimizar BNCT para distintas patologías.

Descripción: Numerosas evidencias indican que los progestágenos están involucrados en el crecimiento y progresión de carcinomas mamarios. En el presente trabajo, se evaluaron los mecanismos moleculares de acción de los progestágenos en modelos de carcinoma mamario con diferentes fenotipos. Para ello se incluyeron en el estudio el modelo de carcinoma mamario murino C4HD, que expresa receptores de progesterona (RP) y de estrógeno (RE), en el cual los progestágenos inducen una respuesta proliferativa, la línea de carcinoma mamario murnina LM3, que carece de RP y RE y es altamente invasiva y metastásica, y la línea de carcinoma mamario humana que no expresa el RP T47D-Y. Se ha demostrado que el RP es capaz de actuar tanto como factor de trancripción como activador de vías de señalización. Para determinar cuales de estas funciones están involucradas en las respuestas a progestágenos, se realizaron experimentos de reconstitución en las líneas negativas para el RP en las cuales se expresó la isoforma B de este receptor, la mutante C587A-RP, incapaz de unirse al DNA y la mutante RP-B-mPro que no es capaz de activar vías de transducción de señales. Independientemente de la presencia del RE, se demostró que el tratamiento con progestágenos indujo la proliferación celular, la regulación de la actividad de proteasas, como de las metaloproteasas 2 y 9 (MMP-9 y MMP-2) y del activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), mediante la activación de las p42/p44MAPKs y la vía PI-3K/Akt en células que expresan el RP o la mutante C587A-RP. Sin embargo, el tratamiento con progestágenos no modificó el crecimiento de las células LM3 transfectadas con la mutante RP-BmPro. Por otra parte, se demostró que la expresión del RP en ausencia de ligando disminuyó significativamente la proliferación celular respecto a las células negativas para el RP. Este efecto resulta de la acción del RP tanto como factor de transcripción como activador de vías de señalización. Finalemente, demostramos por primera vez que los progestágenos inducen el desarrollo de metástasis de células de carcinoma mamario mediante efectos no genómicos del RP. Los resultados del presente trabajo proveen un mecanismo molecular y fisiológico para la utilización de terapias en las cuales bloqueando específicamente la interacción del RP con vías de señalización se podría inhibir el crecimiento y desarrollo de metastásis en tumores de mama que expresan el RP.

Descripción: Las galectinas son una familia de proteínas capaces de decodificar la información contenida en glicanos presentes tanto en la superficie celular como en la matriz extracelular, modulando así distintos procesos fisiopatológicos. En particular, galectina-1 (Gal1) se une a los residuos terminales de N-acetilactosamina en N- y en O-glicanos, sólo si estos carecen de terminales de ácido siálico (AS) en posición α2-6 (glicofenotipo permisivo para la unión de Gal1). El objetivo principal de mi proyecto de tesis doctoral es explorar el rol del eje Gal1/glicanos tanto en la mama normal como neoplásica, haciendo foco en cómo esta interacción modula los procesos de invasión y diseminación metastásica. En primer lugar, nos propusimos identificar cuáles son las células productoras de Gal1 en la mama normal murina y humana utilizando datos públicos de estudios de single cell RNA sequencing (scRNAseq) que abarcan las distintas fases del desarrollo mamario. Observamos que en la mama normal Gal1 (codificada por el gen Lgals1) se expresa principalmente en las células del linaje basal/mioepitelial y en células madre multipotenciales (MaSC). Utilizando la técnica de RNA velocity, comprobamos la dinámica de expresión de Gal1 en dichos linajes celulares. Para analizar más en profundidad la relevancia de Gal1 en el epitelio mamario, se analizaron las mamas normales de ratones C57BL/6 WT y Lgals1-/- (Gal1KO) luego de promover la ramificación de los ductos y las terminales con el análogo sintético de la progesterona MPA. Sorpresivamente observamos que los ratones Gal1KO tenían severamente afectada la capacidad de desarrollar las ramificaciones terminales, antes y después de ser estimulados con MPA, sugiriendo que Gal1 cumple un rol relevante en la fisiología de la glándula mamaria. Debido a que las células neoplásicas son capaces de cooptar los mecanismos fisiológicos de diseminación e invasión para generar metástasis, nos propusimos investigar el rol de Gal1 en el modelo murino transgénico para el oncogén HER2 FVB/N-Tg (MMTV/NeuT), capaz de desarrollar lesiones preneoplásicas y metástasis entre las 14 y 18 semanas de vida. Datos provenientes del análisis de RNAseq revelaron que Gal1 se regula positivamente en lesiones tempranas tumorales (LT: 14 semanas) con respecto a los tumores primarios (TP: 18 semanas) sugiriendo que la expresión de esta lectina constituye un evento temprano en fenómenos de tumorigénesis. Estos resultados sugieren que la expresión de Gal1 y su unión a las células tumorales podrían estar asociadas a la diseminación tumoral. En efecto, observamos que el tratamiento de cultivos 3D de LT con Gal1 promovió un fenotipo invasivo caracterizado por el aumento de marcadores de células madre tumorales (CSC) y transición epitelio mesenquimal (TEM) tales como TWIST, SNAIL y SLUG y la disminución de E-caderina. Posteriormente, nos propusimos analizar la relevancia de Gal1 en procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama humano HER2+. Para ellos, seleccionamos líneas tumorales de mama humanas con distinto potencial metastásico (JIMT-1 y BT- 474). La línea JIMT-1 (más agresiva) presentó mayor expresión de Gal1 y menor expresión de la sialiltransferasa ST6Gal1 que cataliza la adición de AS en posición α2-6. A partir de estos hallazgos hipotetizamos que la unión de Gal1 a la célula tumoral podría promover un fenotipo maligno. En este contexto observamos que el tratamiento con Gal1 de la línea JIMT-1, incrementó la frecuencia de CSC (CD44high/CD24low). A su vez, promovió la migración celular, un aumento de marcadores de TEM y fomentó la formación de mamosferas en cultivo. Para evaluar el efecto in vivo de la administración de Gal1 utilizamos un PDX (patient derived xenograft) derivado de una paciente con cáncer de mama HER2+; donde el tratamiento con Gal1 recombinante (intratumoral) promovió un aumento en la diseminación metastásica en el pulmón del huésped. Para determinar la relevancia clínica de nuestros hallazgos analizamos bases de datos públicas con información transcriptómica de pacientes con cáncer de mama (TCGA-BRCA). Encontramos que aquellos pacientes con tumores de mama de todos los subtipos que presentaban simultáneamente alta expresión de mensajero de Gal1 (LGALS1) y bajos niveles de ST6GAL1 (LGALS1high/ST6GAL1low), evolucionaron con un peor pronóstico y una menor sobrevida libre de enfermedad. Mas aún, el análisis de enriquecimiento (GSEA) reveló que dichos pacientes tienen regulada positivamente la vía de TEM, e inhibidas las vías asociadas a la respuesta inmune antitumoral. El análisis de enriquecimiento de células inmunes (MIXTURE), demostró que estos tumores exhiben un menor infiltrado de células T CD8+ citotóxicas y una mayor frecuencia de macrófagos inmunosupresores con fenotipo M2. Finalmente, debido a que los tumores producen cantidades sustanciales de Gal1 que se libera al medio extracelular a través de una vía no tradicional y aún desconocida, presumimos que Gal1 podría externalizarse en exosomas, contribuyendo así a la inmunosupresión a distancia y específica de tejido. Observamos que exosomas CD63+ purificados a partir de células de cáncer de mama murino triple negativo 4T1 y humano HER2+ JIMT-1 contenían altos niveles de Gal1. Además, Gal1 colocalizó con el marcador de exosomas CD63 y luego de la lisis de los mismos, detectamos niveles más altos de Gal1 en el medio extracelular (ME). La inhibición de la esfingomielinasa neutra, una enzima clave en la vía de liberación del exosomas, por GW4869 disminuyó el contenido de Gal1 en el ME. La adición de exosomas Gal1+ (y no aquéllos derivados de células Gal1 KO), inhibió la proliferación in vitro de células T CD4+ y CD8+ y disminuyó la expresión de Gzmb e IL-2 en células T CD4. Nuestros datos demuestran que Gal1 es secretada a través de exosomas derivados de células de cáncer de mama presentando capacidad inmunosupresora sobre células T. En resumen, nuestros resultados en conjunto demuestran la relevancia de Gal1 en la glándula mamaria normal, y enfatizan su rol crítico en la diseminación metastásica e inmunosupresión a distancia en cáncer de mama. En base a nuestros datos experimentales usando modelos murinos y humanos, y validados desde el punto de vista clínico, proponemos a la dupla génica LGALS1/ST6GAL1 como posible biomarcador capaz de predecir la sobrevida de pacientes en cáncer de mama humano y como un posible blanco terapéutico de nuevas terapias antimetastásicas.

Descripción: Los mecanismos por los cuales los estrógenos y los progestágenos, a través de sus respectivos receptores (RE y RP), participan en el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama es un tema de gran interés ya que su detección se utiliza como factor pronóstico y orienta la terapéutica hacia una de tipo hormonal. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo experimental de adenocarcinomas mamarios murinos inducidos por acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Se establecieron líneas tumorales hormono-dependientes (HD) y hormono-independientes (HI) que expresan RE, alfa (REα) y beta (REβ), y las dos isoformas del RP (RPA y RPB). Los tumores HI se clasifican en respondedores (sensibles) y resistentes a la terapia con antiprogestágenos. Hemos generado a su vez por presión selectiva variantes tumorales con resistencia adquirida a los mismos. Utilizando tres familias tumorales de este modelo, demostramos que los tumores sensibles expresan mayor nivel de RPA que de RPB, mientras que lo opuesto se observa en los resistentes. Esta diferencia sería un posible marcador para discriminar un tumor sensible de uno resistente. Pudimos determinar que la resistencia adquirida puede revertir ya sea por tratamiento hormonal, o por cultivo y en todos los casos esta reversión se ve acompañada de la reexpresión de RPA. Demostramos que el silenciamiento de RPA en los tumores con resistencia adquirida se debe a metilación del promotor de PRA y que el tratamiento con el agente desmetilante 5azadC desensibiliza los tumores al antiprogestágeno. No hemos podido hasta el momento dilucidar cuál es el mecanismo que silencia la expresión de RPA en los tumores con resistencia adquirida, sin embargo la plasticidad que observamos en la expresión de esta isoforma nos hace pensar que se trataría de algún otro mecanismo epigenético. La fuerte correlación que hemos observado a lo largo de este trabajo de investigación entre la expresión de RPA y la sensibilidad a los antiprogestágenos sugieren que la terapia con antiprogestágenos debería ser considerada como posible tratamiento para tumores de mama con alta expresión de RPA.

Descripción: Fil: Vacca Campos, Néstor Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.