Descripción: Fil: Taira, María Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: De Las Heras, Marcelo Antonio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La obesidad y otras disfunciones asociadas al síndrome metabólico tienen unaprevalencia creciente en la actualidad. El aumento de tejido adiposo resulta principalmentede una combinación del aumento del número de adipocitos y el tamaño de los mismos. Enconsecuencia, comprender los mecanismos moleculares que regulan la formación del tejidoadiposo resulta de gran utilidad para detener el avance de dichas patologías. La adipogénesis es el proceso durante el cual un fibroblasto comprometido, o preadipocito,se diferencia a adipocito maduro. En este trabajo nos propusimos estudiar elpapel que cumple el receptor de insulina (IR) en esta diferenciación. Tomamos como modelo la línea celular 3T3-L1, formada por preadipocitos que, enlas condiciones adecuadas y bajo el estímulo hormonal correcto, son capaces de diferenciara adipocitos. Demostramos que la correcta modulación de las isoformas de IR (IR-A e IR-B)resulta clave para el desarrollo exitoso de este proceso. Realizamos ensayos de silenciamiento y sobre-expresión de las distintas isoformasde IR. Utilizando la técnica de CRISPR/Cas9, generamos líneas estables deletéreas para IR,las cuales perdieron su capacidad de diferenciar terminalmente. Encontramos que la reexpresióndel receptor en este contexto permite recuperar algunas características clavesque poseen las células diferenciadas. Por otro lado, efectuamos diversos ensayos de manipulación génica con el fin deestudiar la regulación de la localización subcelular de IR. Demostramos que IR puede serdetectado en la fracción nuclear, tanto de células indiferenciadas como terminalmentediferenciadas. Estos resultados refuerzan la importancia de IR en el proceso de diferenciaciónadipocitario y contribuyen a la comprensión de los procesos que llevan a trastornosmetabólicos relacionados con la falla de la acción de dicho receptor.

Descripción: orsai (osi), un gen hasta ahora no caracterizado de Drosophila melanogaster, codifica una pequeña proteína con un solo dominio reconocible, el LYR. Las proteínas que poseen un dominio LYR se caracterizan por ser parte estructural de los complejos mitocondriales o reguladores del funcionamiento de dichas organelas. En humanos, el mal funcionamiento de estas proteínas provoca serios problemas metabólicos con consecuencias que van desde retraso en el crecimiento e incapacidad de procesar lípidos hasta la muerte prematura. Esta tesis está enfocada en caracterizar la función de orsai, cuyo mutante posee menor tamaño que un individuo control, sufre arresto en el desarrollo y muerte en etapas tempranas del desarrollo larval. La disfunción de orsai provoca defectos estructurales mitocondriales y metabólicos diversos, que culminan en células incapaces de crecer apropiadamente. OSI posee una localización nuclear en la mayor parte de los tejidos analizados, y su disfunción no afecta el ensamblado de los complejos mitocondriales, por lo que proponemos que la función de orsai está asociada a la regulación del funcionamiento de la cadena respiratoria. A través de experimentos de complementación génica, se ha logrado rescatar parte de los fenotipos provocados por la falta de orsai tanto a nivel celular como del organismo mediante la sobreexpresión de la proteína humana ETFRF1 (LYR5m). Proponemos así que la deficiencia de orsai en Drosophila melanogaster sería un buen modelo de estudio para las enfermedades asociadas a la desregulación de proteínas LYR en humanos.

Descripción: El objetivo de esta tesis es dilucidar los determinantes genéticos de los contenidos de vitamina E (VTE) en tomate y su relación con el ambiente. Por un lado, se analizaron los contenidos de VTE en frutos de 150 entradas provenientes de distintos bancos de germoplasma y de 126 líneas recombinantes derivadas de un cruzamiento multiparental cultivados en ambientes contrastantes. Mediante estudios de asociación para el genoma completo (GWAS por sus siglas en inglés) y mapeo de QTLs, se identificaron numerosos loci potencialmente involucrados en la determinación de este carácter. Por otro lado, resultados previos del laboratorio indican que la expresión de los genes duplicados VTE3(1) y VTE3(2), cuyos productos son responsables de los últimos pasos de la biosíntesis de VTE, son capaces de modular la acumulación de VTE en hojas y frutos de tomate. En particular, la expresión de VTE3(1) es regulada epigenéticamente debido a la metilación variable del ADN de la secuencia promotora. Con el objetivo de caracterizar las bases moleculares de esta regulación, como así también la co-regulación transcripcional de ambos parálogos, se generó y caracterizó molecularmente una población de 80 líneas recombinantes derivada del cruzamiento de líneas de introgresión portando los alelos silvestres (S. pennellii) y domesticados (S. lycopersicum) de dichos genes. Adicionalmente, se caracterizó la variación natural de expresión y metilación del ADN de VTE3(1) y VTE3(2) en una población de variedades andinas de tomate. Estos experimentos revelaron que la modulación transcripcional de VTE3(1) y VTE3(2), mediada en parte por la variación en los niveles de metilación de sus promotores, es en efecto, un blanco importante para el mejoramiento de este carácter nutricional. En conjunto, esta tesis pone en evidencia la importancia de explorar tanto la variación intraespecífica como interespecífica para caracterizar las bases genéticas de fenotipos metabólicos y la necesidad de incluir la variación epigenética como un factor determinante de caracteres de interés agronómico.

Descripción: El conocimiento acerca de los mecanismos fisiológicos y moleculares que determinan la calidad nutricional de los vegetales es de fundamental importancia tanto para el diseño de estrategias de mejoramiento vegetal como para ganar conocimiento en los mecanismos regulatorios del metabolismo secundario. La presente Tesis se focaliza en el estudio de los mecanismos que determinan los contenidos de Vitamina E de los frutos de tomate. Para ello caracterizamos estructuralmente y localizamos en el mapa genético todos los genes involucrados en la biosíntesis de vitamina E e identificamos QTLs para los contenidos de esta vitamina en los frutos de tomate. Así mismo identificamos los principales componentes de la red de regulación a nivel de la expresión génica que opera en la síntesis de vitamina E en tomate a partir del desarrollo de una plataforma de RT-qPCR capaz de evaluar la acumulación de RNA mensajeros para todos los genes de esta ruta biosintética. Adicionalmente y con el objetivo de estudiar funcionalmente genes involucrados en el metabolismo de vitamina E, desarrollamos un sistema de silenciamiento transiente mediado por virus basado en la expresión constitutiva de la proteína verde fluorescente para su silenciamiento como reportero. Por último, nos centramos en la identificación los determinantes genéticos del mayor QTL de vitamina E de tomate localizado durante la primera parte de esta Tesis.

Descripción: Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas ahomogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación delas isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevadaa homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio espurificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa,filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose.la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas enpresencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformasfrente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzarel clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreóuna biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar,en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteínarecombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para laenzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparadacinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.

Descripción: La obesidad es una patología que tiene asociados trastornos metabólicos como el síndrome metabólico y la diabetes tipo 2. Además, estudios clínicos la han señalado como un factor de riesgo para el desarrollo de demencias, entre ellas el mal de Alzheimer. Por otro lado, está documentado que el estrés crónico puede inducir trastornos conductuales y de memoria y desarrollar alteraciones metabólicas. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de una dieta hipercalórica sobre la conducta, el metabolismo y mediadores neuroinmunes (neurotrofinas y citoquinas). Además, evaluar si el estrés crónico tiene influencia en el desarrollo de estas alteraciones y si existen diferencias entre sexos. Asimismo, estudiar el efecto del tratamiento con fluoxetina (FLX) - fármaco utilizado para tratar síntomas asociados al estrés- y el tratamiento con metformina (MET), un antihiperglucemiante utilizado a nivel mundial para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Para tal fin, se utilizaron ratones C57Bl/6J. Éstos fueron distribuidos aleatoriamente en dos dietas: una dieta comercial estándar y una dieta hipercalórica de alta energía (DAE). Después de 8 semanas de dieta, los animales fueron subdivididos en dos grupos: unos fueron expuestos a estrés crónico moderado (CMS) y los otros dejados en condiciones normales. Todos los tratamientos se extendieron hasta las 28 semanas de dieta. En estos animales se estudió el metabolismo glucídico y lipídico, se realizaron estudios conductuales y se estudiaron los mediadores neuroinmunes a nivel central y periférico. En los machos la DAE produjo un incremento de peso acompañado de una desregulación del metabolismo glucídico y lipídico. Adicionalmente, se observó una menor capacidad de memoria de trabajo y espacial, asociado a una disminución en la expresión de BDNF tanto a nivel central como periférico. La suma de DAE y CMS produjo una normalización del peso, sin embargo, agravó los efectos de la DAE tanto a nivel metabólico como conductual y cognitivo. En las hembras la DAE incrementó el peso de los animales. Mientras que, a nivel metabólico, no se observaron cambios en la glucemia, pero si una mayor insulinemia. Conductualmente, la dieta produjo un peor desempeño en memoria espacial. La suma de DAE y CMS disminuyó el peso, pero a nivel metabólico llevó al desarrollo de intolerancia a la glucosa y colesterolemia incrementada. A nivel conductual, el CMS no produjo alteraciones mayores a las observadas con la DAE sola. Cuando se evaluaron los mismos parámetros a las 18 semanas de dieta, se observó que los machos desarrollaron alteraciones metabólicas y cognitivas mientras que las hembras no. También se encontró que, previo al inicio del CMS, la DAE indujo en los machos una disminución de la memoria de trabajo sin observarse cambios metabólicos. Debido al mayor impacto que tuvieron la DAE y el CMS sobre los parámetros estudiados en los animales machos, se decidió enfocar el estudio de los tratamientos farmacológicos únicamente sobre los animales de este sexo. El tratamiento con fluoxetina no corrigió las alteraciones inducidas por el CMS sobre el metabolismo de la glucosa y no protegió de los efectos de la DAE. En animales con DAE+CMS la FLX evitó las alteraciones en el metabolismo glucídico y sobre la función cognitiva. Adicionalmente, la droga tuvo un efecto positivo en el perfil lipídico en todos los grupos. Por otro lado, el tratamiento con metformina corrigió parcialmente las alteraciones metabólicas inducidas por DAE y DAE+CMS. A nivel conductual, en cambio, evitó los efectos de la DAE sobre la memoria de trabajo y mejoró considerablemente la memoria espacial. Sin embargo, estos efectos no se observaron en la memoria de largo plazo. En base a estos resultados podemos concluir que los ratones machos son más susceptibles a desarrollar trastornos cognitivos y alteraciones metabólicas al ser expuestos a una dieta hipercalórica y/o al estrés, siendo mayores estas alteraciones al combinar ambos factores. El tratamiento del estrés y de la hiperglucemia, podrían ser beneficiosos para evitar o revertir la evolución hacia una patología de mayor gravedad. Estudios combinando ambas drogas en conjunto, así como también eliminando la dieta hipercalórica son necesarios para acercarnos a un abordaje terapéutico racional para el tratamiento de la obesidad y sus comorbilidades.

Descripción: El objetivo principal de esta tesis es evaluar la distribución, el proceso de expansión y aspectos poco conocidos de la biología del género Corbicula para conocer la magnitud de esta invasión, las rutas y los vectores probables de dispersión y los mecanismos de adaptación de los linajes existentes en Argentina. Mediante la revisión de colecciones y muestreos propios estudiamos la distribución geográfica e identificamos los linajes presentes mediante caracteres morfológicos y marcadores moleculares. Además, estudiamos variaciones morfológicas y sus implicancias en el metabolismo para entender cuáles son los posibles factores que influyen en el éxito invasor. Los patrones de distribución en el centro y noroeste argentino, en estrecha asociación a ambientes modificados, y el análisis de progresión temporal incluyendo todo el rango de distribución en el país permiten sostener la hipótesis de que el principal vector de dispersión de ambos linajes son las actividades humanas, especialmente el transporte a larga distancia asociado a embarcaciones. Pese a las similitudes en cuanto a los vectores probables, zonas de origen e ingreso y a la coincidencia temporal de las etapas de invasión, los distintos linajes presentan distribuciones diferentes: mientras C. fluminea se estableció en el Litoral y se dispersó hacia el sur llegando a la cuenca del río Negro, C. largillierti consolidó poblaciones en embalses, ríos de menor orden y arroyos en el Centro y Noroeste del país. La mayoría de estas poblaciones estudiadas en el presente trabajo pudieron ser asignadas morfológicamente a uno de los dos linajes, sin embargo, hubo casos en los que la identificación mediante los caracteres descriptos en la literatura no fue posible. Los marcadores moleculares corroboraron estas determinaciones, sin embargo, poblaciones de morfología dudosa y simpatría de linajes mitocondriales, principalmente el noreste (Formosa y Misiones) revelaron que es probable que existan híbridos entre linajes. En ambos linajes la tasa metabólica estuvo fuertemente influenciada por el tamaño de las branquias y la edad de las almejas, pero C. fluminea mostró consistentemente una mayor tasa metabólica que C. largillierti (143,08 ± 3,89 y 108,32 ± 2,41 μmolO2 gPS^–1 h^ –1, respectivamente). Además, C. fluminea mostró valvas más grandes y duras que C. largillierti, en tanto que este último linaje presentó mayores áreas branquiales y número de filamentos. Nuestros resultados muestran que la identificación mediante la combinación de información morfológica y molecular es importante. Dado que los linajes no están aislados reproductivamente, puede existir, mediante intercambio genético, el surgimiento de híbridos caracterizados por morfometría intermedia, y esto probablemente ocurra en el Noreste argentino. Los patrones de reemplazo geográfico entre los linajes pueden estar relacionados a diferencias metabólicas y morfológicas. Es probable que la mayor tasa metabólica de C. fluminea, asociada a un mayor grosor de valvas le confiera una ventaja competitiva en ambientes ricos en nutrientes como los del Río de la Plata. En cambio, el menor metabolismo, la mayor superficie branquial y las valvas comprimidas lateralmente podrían ser adaptaciones de C. largillierti que favorezcan la colonización de embalses y cabeceras de los ríos. Si bien el presente estudio supuso un aporte sustancial al conocimiento de las poblaciones de Corbicula spp. en nuestro país, este conocimiento probablemente es aún incompleto y nuevos estudios probablemente resultaran en la ampliación del rango conocido del grupo.

Descripción: Esta tesis estudia el funcionamiento de las lagunas pampeanas sometidas a procesos de eutrofización, usando como caso de estudio la laguna de Lobos, laguna turbia orgánica perteneciente a la cuenca del Río Salado. Analizamos ingresos y egresos de nutrientes, metabolismo (procesos de producción y respiración) y parámetros físicos, químicos y biológicos durante 21 meses. Estimamos ingresos difusos por escorrentía superficial de agua de lluvia. Con esa información analizamos cuáles son las fuentes difusas y directas de fósforo. También realizamos experimentos con microcosmos simulando distintas concentraciones de fósforo en la columna de agua, aplicamos distintos tratamientos con macrófitas acuáticas y Ca(OH)2 para evaluar su capacidad de extraer o reducir su concentración. Observamos niveles de hipereutrofia. El metabolismo fue mayormente positivo, indicando autotrofia predominante. En el fitoplancton dominaron las cianobacterias filamentosas. El balance de nutrientes indica que la laguna funciona como sumidero en la mayoría del tiempo estudiado. Concluimos que acumula el fósforo que recibe de su principal afluente y dicha acumulación favorece floraciones algales, principalmente cianobacterias, haciendo que el sistema tenga alta producción pero también alto consumo. Consideramos algunos aspectos que podrían contribuir a una mayor estabilidad de la laguna, logrando tanto una conservación y un aprovechamiento adecuado de sus recursos.

Descripción: La célula de Sertoli (CS), componente somático del tubo seminífero, provee elsoporte estructural y nutricional para el desarrollo de las células germinales. La CSmetaboliza glucosa a lactato, principal sustrato energético para las células germinales, por loque se ha postulado que utiliza ácidos grasos (AG) como fuente energética propia. Losfactores de transcripción de la familia de los PPARs son receptores activados por ligandoque participan en la regulación del metabolismo de AG en diversos tejidos. El objetivogeneral del presente trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos moleculares queintervienen en la regulación del metabolismo energético en el túbulo seminífero. Para ello seutilizó como modelo experimental el cultivo de CS de rata de 20 días de edad. Se observóque la activación farmacológica de PPAR α y PPAR β/δ produce un aumento en la oxidaciónde AG y en la expresión de genes vinculados con su transporte y metabolismo (FAT/CD36, CPT1, LCAD y MCAD). Además, se observó que sólo la activación de PPAR β/δ regula demanera simultánea la oxidación de AG y la producción de lactato. Asimismo, se evaluaronposibles mecanismos fisiológicos que podrían conducir a la activación de los PPARs en eltúbulo seminífero. Se observó que las células germinales apoptóticas (CGA) y el ácidopalmítico, AG que podría provenir de la hidrólisis de las gotas de lípidos –generadas por lafagocitosis de CGA– o del exterior de la célula, regulan la expresión de genes vinculadoscon el transporte y metabolismo de AG y por otra parte, que en dicha regulación participa laactivación del PPAR β/δ. Por último, se evaluó la posible regulación hormonal de laoxidación de AG en CS y la participación del PPAR β/δ en dicha regulación. Se demostróque existe una modulación diferencial del metabolismo de AG por FSH y bFGF en CS. Seobservó que FSH –hormona anabólica de la CS– disminuye la oxidación de AG y aumentala expresión génica sin participación de PPAR β/δ, mientras que bFGF regula positivamenteel catabolismo de AG y la producción de lactato de manera PPAR β/δ dependiente. En suconjunto, estos resultados revelan la existencia de una compleja regulación de losmecanismos moleculares que participan en la oxidación de ácidos grasos y la producción delactato en CS que refleja el ajuste fino del metabolismo energético en el túbulo seminíferonecesario para una adecuada espermatogénesis.

Descripción: Pensar en las problemáticas presentes hoy en la Región Chaqueña argentinaacerca del manejo de los recursos naturales y de la conservación de la biodiversidad,requiere conocer y comprender las modalidades de uso de la tierra y susconsecuencias sobre el paisaje. El concepto “apropiación de la naturaleza” refiere a laacción por la cual los seres humanos extraen elementos o se benefician de algúnservicio de la naturaleza para volverlos un elemento social. El objetivo de esta tesis fueanalizar este proceso de articulación sociedad-naturaleza en 4 comunidades ruralesdel departamento Figueroa, Santiago del Estero, ubicadas en zonas con o sin accesoa riego. Para esto identificamos los principales factores históricos, sociales y naturales,que estructuraron la situación socioecológica actual. Comparamos con datos cuali ycuantitativos las comunidades en cuanto a las formas actuales de apropiación de lanaturaleza y estudiamos la distribución espacial del proceso, a escala comunitaria y dela totalidad del área de estudio mediante imágenes satelitales. Describimos, mediantecensos de vegetación, las características de los ambientes y agroecosistemas queforman parte del proceso de apropiación. A partir de la utilización de indicadoressocioecológicos vimos que las estrategias de apropiación de la naturaleza variaronentre las comunidades locales estudiadas. Si bien las cuatro comunidades presentaronestrategias diversificadas, la presencia, en tres de ellas, de bosques bajo propiedadcomunitaria brindó servicios ecosistémicos adicionales. Esto caracteriza a lasestrategias como de “uso múltiple de los recursos naturales”, articuladas másfuertemente con los ecosistemas y el paisaje local. Por su parte, los agroecosistemaslocales se caracterizaron por sus parcelas agrícolas pequeñas de bordes vegetadosarbóreos, arbustivos o herbáceos, generando en algunos casos una red de bordesvivos. A escala de paisaje, el área de estudio se caracteriza por una amplia y continuacobertura boscosa que casi no ha cambiado en el periodo analizado (1992-2011). Lapresencia de población campesina estrechamente vinculada al paisaje local, comoelemento de producción y reproducción de sus condiciones de vida, refuerza lanecesidad de considerar explícitamente la dimensión espacial del proceso deapropiación de la naturaleza, para colaborar en el diseño de paisajes multifuncionalesque permitan mantener la capacidad de estos de proveer servicios ecosistémicos ymantener la biodiversidad a largo plazo.

Descripción: Las condiciones adversas sufridas en periodos tempranos de la vida pueden producir alteraciones perdurables en la fisiología y el metabolismo, modificando el riesgo de desarrollar diversas enfermedades en la adultez. Dado el importante impacto que tiene el ambiente intrauterino en la vida de un individuo, se ha postulado que el estrés prenatal tendría un efecto negativo sobre el desarrollo de las crías, en parte como resultado de la exposición del feto a altos niveles de glucocorticoides. En el presente trabajo nos propusimos estudiar en dos cepas de ratones, C57BL/6J y BALB/c, si la exposición a estrés prenatal (por restricción del movimiento) y el posterior desafío de la ingesta de una dieta rica en grasas modifica la fisiología de las crías aumentando su susceptibilidad a desarrollar alteraciones metabólicas. Encontramos que la exposición a estrés prenatal, ya sea conjuntamente con la ingesta de dieta grasa o no, produjo el desarrollo de sobrepeso, alteraciones en las curvas de respuesta a la glucosa e insulina, niveles de colesterol y triglicéridos plasmáticos más elevados y cambios en la expresión de genes relacionados con la inflamación y la insulino-resistencia. En conclusión, observamos efectos metabólicos deletéreos causados por el estrés prenatal sobre la salud de las crías adultas. Algunos de los cuales fueron puestos en evidencia o exacerbados con la ingesta de una dieta rica en grasa.

Descripción: La contaminación con As (As) en el agua de bebida se considera una amenaza parala salud en todo el mundo, ya que está asociado a un mayor riesgo de contraerenfermedades como cáncer de piel y pulmón, provocar efectos indeseables sobre eldesarrollo, la reproducción las secreciones internas y alteraciones cardiovasculares. Debido a que el As puede actuar como un disruptor endócrino aquí investigamos elefecto de la exposición a As, durante períodos críticos del desarrollo neuroendócrinocomo es la gestación y las semanas postparto, sobre el eje reproductivo y elmetabolismo de la glucosa, en las madres y sus crías. Se administraron 5 (A5) o 50 ppm (A50) de arsenito de sodio en el agua de bebida aratas Sprague Dawley preñadas, desde el día 1 de gestación hasta el sacrificio (2 mesespostparto). Al destete, se dividieron las crías en dos grupos: uno continuó recibiendo elmismo tratamiento que la madre y el otro recibió agua destilada hasta el día delsacrificio (4 meses). En las madres, la exposición a As produjo alteraciones en la homeostasis de laglucosa durante la preñez, probablemente alterando la funcionalidad de las células β,incrementando el riesgo de desarrollar diabetes gestacional. Además, alteró lafisiología reproductiva, sugiriendo el desarrollo de una falla ovárica prematura. Lascrías expuestas a As durante el desarrollo presentaron alteraciones en la fisiologíareproductiva, principalmente las hembras, mientras que el metabolismo de la glucosano se vio afectado.

Descripción: Asociado al incremento en el uso de fertilizantes y plaguicidas, los arroyos de laregión pampeana están sufriendo las consecuencias del proceso de intensificación de laagricultura sin que se conozca, en detalle, su capacidad natural para procesar los nutrientesque pueden ingresar en exceso. Los objetivos de la presente tesis fueron: estimar la retención de fosfato y amonioen dos arroyos pampeanos; analizar la influencia de la producción primaria, la biomasa delas comunidades autotróficas, el caudal y el área relativa de la zona de retención transitoriasobre la retención de nutrientes; y evaluar la importancia relativa de los procesos decaptación autotrófica y heterotrófica del epipelon y la captación abiótica en los sedimentossobre la retención de nutrientes. El estudio se llevó a cabo mediante dos aproximaciones: adiciones estacionales denutrientes en dos arroyos a lo largo de un ciclo anual y experimentos de laboratorio enarroyos artificiales. Los resultados de campo indican que tanto la retención de fosfato comola de amonio son elevadas en ambos arroyos y que, a pesar de los altos niveles basales denutrientes que poseen, no se observa saturación en la retención. El análisis de los factoresque influyen en las métricas de retención sugiere que la captación de fosfato se basaríaprincipalmente en la demanda heterotrófica mientras que la captación de amonio se acentúabajo condiciones más autotróficas. Los experimentos de laboratorio señalan que la actividad autotrófica y heterotróficapor parte del epipelon representa un efecto significativo en la captación de fosfato y deamonio. Por otro lado, la captación abiótica de fosfato en los sedimentos es otro mecanismode retención que opera al mismo tiempo que la captación biótica; pero es un proceso, en sumayor parte, reversible. Por su parte, la captación abiótica de amonio en el sedimentoresultó ser un proceso de menor importancia. Dada su capacidad para disminuir las exportaciones de nutrientes generadas por losingresos terrestres, los resultados obtenidos en la presente tesis ponen de manifiesto laimportancia de los arroyos de cabecera de la región pampeana en los procesos deautodepuración, tanto del fosfato como del amonio y la función clave de este servicioecosistémico para el mantenimiento de una buena calidad ecológica de los ambienteslóticos.

Descripción: La levadura Saccharomyces cerevisiae puede utilizar una gran variedad de compuestos como fuente de nitrógeno. En presencia de fuentes ricas de nitrógeno los genes de las vías de utilización de las fuentes pobres no se expresan. Dicho mecanismo es conocido como Nitrogen Catabolite Repression (NCR). Últimamente se han obtenido evidencias de que también hay una jerarquía dentro del uso de las fuentes pobres. El factor de transcripción Dal81 participa en la regulación de genes involucrados en varias vías de utilización de fuentes pobres de nitrógeno. Para activar la transcripción dependiente del factor Dal81 de cada gen (o grupo de genes), también es necesaria la participación de otro factor (específico de inductor) que sería el responsable de la especificidad de la respuesta. Así, para el catabolismo de fuentes pobres de nitrógeno, como alantoína y leucina, son necesarios el factor de transcripción pleiotrópico Dal81 y otro factor específico de cada fuente (Dal82 y Stp1/Stp2) para que se produzca la activación transcripcional de los genes que codifican para permeasas tales como Dur3, Agp1, Bap2 y Bap3. Por otra parte, para que ocurra la inducción de los genes de la utilización del GABA en respuesta a este compuesto, Dal81 actúa en conjunto con el factor de transcripción específico Uga3. La existencia de un factor de transcripción compartido entre estas vías inducibles, podría permitir una activación jerarquizada de las mismas y la regulación de otros procesos biológicos sincrónicos, cuando varias de las fuentes de nitrógeno antes mencionadas se encuentran disponibles simultáneamente. El objetivo general de este trabajo fue estudiar los mecanismos moleculares a través de los cuales se determina la regulación coordinada de genes involucrados en el uso de fuentes de nitrógeno pobres. En este trabajo, demostramos que Uga3, conocido hasta ahora como un factor específico de la vía del GABA, regula al gen BAP2, responsable de la incorporación de aminoácidos ramificados a las células. Encontramos también que Uga3, además de afectar la utilización de GABA y leucina, promueve la tolerancia a estrés térmico y oxidativo. Además, mediante co-inmunoprecipitación de diferentes factores de transcripción, encontramos que Dal81 se encuentra unido al factor de transcripción Uga3 aún en ausencia de GABA y de manera independiente de la secuencia UASGABA de los genes UGA. Por otra parte, también detectamos una interacción independiente de inductor entre Leu3 y Uga3. Mediante el análisis global del proteoma de células deficientes en UGA3, identificamos 17 proteínas sobre-representadas en esta mutante, mientras que otras 50 se encuentran sub-representadas. A través de análisis in sílico de las 67 proteínas expresadas diferencialmente, encontramos que 8 de ellas participan del metabolismo de fuentes pobres de nitrógeno o son permeasas de aminoácidos. Demostramos que Arg5,6, está regulado por Uga3 a nivel de su transcripción, y que la represión por arginina de este gen depende de Uga3. Sin embargo, no detectamos interacción entre Uga3 y la región regulatoria de ARG5,6. Por último, demostramos que la ausencia de Uga3, así como también la de Dal81, también produce cambios significativos en el contenido de varios aminoácidos. Encontramos correlaciones entre estas modificaciones y la expresión diferencial de proteínas asociadas al metabolismo de fuentes de nitrógeno y permeasas. La mutante uga3 tiene un alto contenido de arginina intracelular. Se sabe que la acumulación intracelular de arginina promueve la tolerancia a estrés por etanol, por lo que podría relacionarse al menos parcialmente, con los efectos de tolerancia a estrés observados. Sin embargo, en nuestras condiciones de trabajo, no encontramos cambios significativos en la tolerancia a etanol entre esta mutante y la cepa wild type [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].

Descripción: La citocromo P450 reductasa (CPR) es una flavoproteína que coordina latransferencia de electrones desde el NADPH hacia distintas hemoproteínas, como loscitocromo P450 (CYPs), el citocromo b5, y la hemooxigenasa. Los CYPs seencuentran involucrados tanto en la síntesis de compuestos endógenos, tales comoesteroles y ácidos grasos, como en la activación y detoxificación de compuestosexógenos. Pese a que existen numerosos genes CYP funcionales en mamíferos,existe sólo una CPR en cada especie. La producción de una clase especial deesteroles, entre los que se incluyen el ergosterol y otros metil-esteroles, es unaimportante vía metabólica involucrada en el crecimiento y la viabilidad celular demicroorganismos eucarióticos, como protozoos u hongos, que se encuentra ausenteen mamíferos. En T. cruzi se han identificado y caracterizado bioquímicamente unafamilia de genes integrada por tres putativas CPRs, llamadas TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C, cuyas secuencias poseen los dominios conservados para FMN, FAD y NADPH. TcCPR-A carece del domino hidrofóbico amino terminal. Lasobreexpresión de TcCPR-B en epimastigotes incrementa su resistencia a drogas,sugiriendo su participación en el metabolismo de detoxificación del parásito. En labúsqueda de un rol fisiológico para las TcCPRs, en el presente trabajo se analizó elefecto de la sobreexpresión de las mismas, centrándose principalmente en su posibleparticipación en la biosíntesis de esteroles. Una cepa de Saccharomyces cerevisiaedeficiente para CPR fue utilizada en ensayos de complementación con las TcCPRsrecombinantes de T. cruzi. La baja tasa de crecimiento y la disminución de laresistencia al ketoconazole de la levadura mutante, lograron revertirse parcialmentesólo con TcCPR-B y -C. La sobreexpresión de TcCPR-A en células de epimastigotesresulta letal, produciendo un aumento del contenido de ADN, una morfologíaaberrante y numerosas alteraciones ultraestructurales. La sobreexpresión de TcCPRBy -C incrementó la biosíntesis de ergosterol y la relación NADP+/NADPH. Losparásitos transgénicos con mayor contenido de ergosterol presentaron un aumento enel orden de membrana, con la respectiva disminución de la endocitosis. Notablemente, TcCPR-B se ha encontrado en reservosomas mientras que TcCPR-Cse ha localizado en el retículo endoplasmático. Los resultados obtenidos en esta Tesisjunto al correspondiente análisis bibliográfico permiten proponer un rol para las TcCPRs en mecanismos de estrés (TcCPR-A), en reacciones de detoxificación (TcCPR-B) y en la biosíntesis de esteroles (TcCPR-C).

Descripción: La pesca de la centolla Lithodes santolla se desarrolla en la región sur de Sudamérica entre los 45° y 55°. En la localidad de Ushuaia es el principal recurso proveniente de la pesca artesanal al ser un importante atractivo gastronómico. El transporte y venta en vivo en grandes mercados distantes de su lugar de extracción, aportaría un valor agregado a la especie. Por lo tanto, conocer los efectos deletéreos del transporte en semi-seco sobre la fisiología y el comportamiento de la especie, nos permitirá generar información biológica necesaria para promover el traslado en vivo (fuera del agua). Se determinaron parámetros fisiológicos subjetivos, como el vigor de los animales, y objetivos como concentración de proteínas, oxy-hemocianina, glucosa, lactato, hemocitos totales y pH en hemolinfa. Además se midieron parámetros fisiológicos no invasivos como el consumo de oxígeno, la tasa cardíaca y ventilatoria, e invasivos como la composición química proximal, el nitrógeno básico volátil total y la peroxidación de lípidos en la carne de centolla. Primeramente se analizó el efecto del enfriamiento de Lithodes santolla previo a la simulación de transporte en semi-seco. El estrés producido por la exposición aérea, se vio disminuido en los animales con un enfriamiento previo, así como también la recuperación de estos cangrejos sucedió más prontamente que en las centollas sin enfriamiento previo. En segundo lugar se analizó la tolerancia térmica de centollas variando la disponibilidad de oxígeno del medio. La reducción en los niveles de oxígeno reduce los límites de tolerancia térmica, en las temperaturas críticas superiores, provocando un comienzo anticipado del metabolismo anaeróbico. En una tercera instancia se estudió el efecto del transporte en vivo de centolla desde dos aproximaciones: el efecto del transporte postpesca (una vez que los animales se pescan y se transportan hacia la costa); y el efecto de distintos métodos de empaquetamiento (utilizados para la exportación de otros crustáceos a lugares distantes). Las centollas necesitan al menos 48 horas para recuperarse del estrés producto de la pesca. A su vez, la utilización de bolsas de arpillera como material de empaquetamiento ayudó a disminuir el estrés metabólico de la exposición aérea comparado con el uso de las frondes del alga Macrocystis pyrifera. En la última instancia se buscó conocer el efecto del transporte en semi-seco sobre la bioquímica y calidad de la carne de centolla. Los resultados indicaron que una exposición aérea de 24 horas a 8 °C no impactaría en la calidad de la carne de centolla y, además, luego de 24 h de recuperación en acuario, los parámetros bioquímicos medidos fueron similares a los encontrados en la carne de centollas que no sufrieron exposición aérea. Estos resultados demuestran que bajo ciertas condiciones el transporte en semi-seco de centollas por 24 h a 8 °C es factible; y luego se pueden mantener vivas en acuarios (a la misma temperatura del transporte), para restablecer su metabolismo y revertir el estrés provocado por el transporte. Predecir las alteraciones fisiológicas que dicho organismo sufre fuera del agua nos permite establecer lineamientos para su transporte, como duración y temperatura del mismo; y además favorecer y promover el uso de buenas prácticas para mejorar las condiciones de vida de crustáceos transportados.

Descripción: En la actualidad es sabido que los lípidos son biomoléculas que están involucradas en vías de transducción de señales, y que los desequilibrios en su metabolismo causan múltiples trastornos de alta prevalencia. Dentro de los lípidos más estudiados en la actualidad, se encuentra el ácido araquidónico (AA), debido a las funciones que cumple tanto esta molécula como sus metabolitos, los eicosanoides, en el control de la homeostasis celular. Previamente, en nuestro laboratorio se ha descripto el rol de la enzima Acil- CoA sintetasa 4 (ACSL4) en la regulación de los niveles del AA intracelular en la esteroidogénesis y en células tumorales. ACSL4 participa en la fisiopatología del cáncer de mama, y, la desregulación de los niveles de expresión de esta esta enzima se vincula con la agresividad tumoral. Recientemente, se demostró la existencia de una regulación diferencial en los mecanismos de transcripción de ACSL4, en líneas celulares de cáncer de mama humano de diferente agresividad. Sin embargo, se sabe que existen otros mecanismos regulatorios post-traduccionales, tales como la fosforilación y la ubiquitinación, que podrían estar involucrados en la regulación de la expresión de la ACSL4 y por ende, en la tumorigénesis. Por lo tanto, en esta tesis doctoral, se propone profundizar en el estudio de los mecanismos post-traduccionales que podrían afectar la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama de distinta agresividad. Utilizando líneas celulares de cáncer de mama de distinta agresividad, MCF7 (menos agresiva), y MDA-MB-231(más agresiva) se observó que la estabilidad de la proteína es menor en la línea menos agresiva. A través de ensayos con MG-132, reconocido inhibidor proteasomal, determinamos también que el proteasoma está involucrado en la degradación de ACSL4 y por lo tanto, en los niveles de expresión y estabilidad de la enzima. Mediante la búsqueda en bases de datos y ensayos de mutagénesis sitio dirigida, pudimos identificar a las lisinas 621 y 702 de ACSL4 como posibles blancos de ubiquitinación. Además, identificamos a la enzima E3- ligasa Parkina como una de las candidatas a realizar esta modificación post-traduccional y, demostramos que efectivamente, existe una interacción entre ACSL4 y Parkina. Por otro lado, a través de estudios in sílico, observamos que ACSL4 regula la expresión de genes relacionados con el metabolismo y la función mitocondrial, en células de cáncer de mama. Actualmente, se sabe que las mitocondrias juegan un papel clave en la oncogénesis, es por eso que, en este trabajo, decidimos profundizar sobre el rol de ACSL4 en el metabolismo mitocondrial en células tumorales mamarias de distinto nivel de agresividad. Utilizamos células MCF-7 que sobreexpresan ACSL4 de manera estable (MCF-7 tet-off/ACSL4) y células MDA-MB-231 silenciadas para la expresión de ACSL4 (shACSL4). Evaluamos si ACSL4 regula la expresión de distintos marcadores mitocondriales. Realizamos ensayos con el objetivo de medir la masa, la actividad y la bioenergética mitocondrial que nos permitieron determinar cómo la expresión y/o ausencia de ACSL4 afecta estos parámetros. Logramos determinar que ACSL4 regula positivamente la expresión de marcadores mitocondriales tales como NRF1, VDAC1 y el Complejo III de la cadena respiratoria. Además, en los estudios de bioenergética medimos la tasa de consumo de oxígeno, y en base a los resultados obtenidos, analizamos distintos parámetros respiratorios. Demostramos que la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama produce cambios significativos en la tasa de respiración máxima, la capacidad de reserva respiratoria y la fuga de protones. Estos resultados indican que las células que sobreexpresan ACSL4 poseen una mejor capacidad de respuesta frente a situaciones de demanda energética. Además, en células MCF-7 tet-off/ACSL4 observamos mayor actividad mitocondrial y una disminución en la masa mitocondrial con respecto al control, lo cual sugiere una compensación del genoma mitocondrial ante la disminución en su cantidad. Por otro lado, los resultados obtenidos con la línea MDA-MB- 231 shACSL4 son opuestos a lo observado en células MCF-7 tet-off/ACSL4, lo cual valida el rol de ACSL4 en células de cáncer de mama sobre diversos parámetros mitocondriales. Los resultados del siguiente trabajo contribuyen a ampliar los conocimientos sobre la regulación de ACSL4 y el rol que ejerce en el metabolismo mitocondrial, permitiendo profundizar en el conocimiento de la fisiopatología de la célula tumoral y los mecanismos moleculares involucrados.