Descripción: La endometriosis se caracteriza por la presencia de focos de tejido endometrial por fuera de la cavidad uterina confiriéndole, a las mujeres que la padecen, fuertes dolores pélvicos e infertilidad. Basándonos en trabajos previos realizados en cáncer, evaluamos la aplicación de los inhibidores de aromatasa, los inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2 y los agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR)γ como posibles alternativas terapéuticas para la endometriosis. Específicamente evaluamos los efectos del inhibidor de aromatasa, anastrozole, del inhibidor selectivo de COX-2, celecoxib y del ligando de PPARγ, rosiglitazona sobre el crecimiento de células endometriales in vitro y sobre la implantación y crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Los resultados obtenidos son promisorios ya que todos los tratamientos provocaron efectos inhibitorios del desarrollo de la endometriosis así como efectos antiproliferativos, proapoptóticos y antiangiogénicos tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, luego de administrar anastrozole y celecoxib en forma conjunta, no pudimos demostrar una mejora del tratamiento combinado por sobre la aplicación de cada una de las terapéuticas de manera individual. Nuestros resultados avalan al inhibidor de COX-2 como una alternativa terapéutica concreta para la endometriosis y, sugieren que la combinación de celecoxib con una glitazona podría mejorar la involución de la endometriosis, aunque aún se requiere profundizar los estudios para confirmar estos últimos datos.

Descripción: En nuestro laboratorio nos encontramos investigando la utilidad de la porción proteicade la lipoproteína de membrana externa de 19 kiloDalton de Brucella abortus (U-Omp19) comoadyuvante vacunal. Resultados previos proponían a U-Omp19 como un inhibidor de serinproteasas de estómago e intestino. En esta tesis hemos comprobado que U-Omp19 poseeactividad de inhibidor de cisteín proteasas lisosomales y que la co-administración de U-Omp19inhibe parcialmente la degradación del antígeno (Ag) dentro de las células presentadoras de Agincrementando su vida media y promoviendo su presentación cruzada a las células T CD8+. UOmp19también es capaz de activar células dendríticas (DCs) induciendo un aumento en laexpresión de moléculas co-estimulatorias y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Porúltimo, estudiamos la respuesta inmune inducida en ratones luego de la co-administración de OVA y U-Omp19 por vía subcutánea. Observamos que U-Omp19 como adyuvante de OVAinduce una eficiente respuesta inmune celular de tipo T CD8+ y citotóxica con producción de IFN-γ. Los resultados obtenidos indican que la actividad adyuvante de U-Omp19 está dada, porun lado, por su capacidad de activar DCs y por otro lado, por promover la estabilidad y lapresentación de Ags a través de su acción como inhibidor de proteasas, éste último representaun novedoso mecanismo aún no descripto para un adyuvante vacunal.

Descripción: La serina hidroximetiltransferasa (SHMT) cataliza la interconversión deserina y glicina transfiriendo una unidad carbonada al tetrahidrofolato requeridapara la síntesis de purinas, timidilato, metionina y colina. La mayor parte de las SHMTs estudiadas son dependientes de piridoxal-5'-fosfato(PLP). La SHMT eneucariontes existe como isoformas mitocondrial y citosólica, codificadas porgenes diferentes. También ha sido demostrada una tercera SHMT, presente encloroplastos. El presente trabajo es el primero que informa la purificación ycaracterización de una SHMT a partir de tripanosomátidos y en particular, sedemuestra la presencia de tres formas moleculares de la enzima (las cuales sedesignaron SHMT I, II y III) en Crithidia fasciculata. Las isoformas fueronpurificadas a homogeneidad de acuerdo al análisis por SDS-PAGE. Los pesosmoleculares nativos de las SHMTs I, II y III, calculados por el método de Andrews, dieron valores de 226, 173 y 211 kDa, respectivamente. Los pesosmoleculares de sus subunidades fueron: 53,8, 50,7 y 51,7 kDa respectivamente,sugiriendo una estructura homotetramérica de las proteínas, coincidente con las SHMTs de hongos, plantas y mamíferos. Las tres isoformas fuerondependientes de PLP, aunque presentaron diferentes comportamientoscinéticos. También fue parcialmente purificada y caracterizada la SHMT de Trypanosoma cruzi. Se ha detectado una sola forma de la enzima en esteparásito, utilizando la misma metodología. La SHMT, de 69 kDa, fue altamenteinestable, aunque presentó,en algunos casos, similares propiedades a lasestudiadas en C.fasciculata. Por otra parte, fue parcialmente purificado ycaracterizado un inhibidor endógeno de la SHMT a partir de T.cruzi, similar alaislado de semillas de Vigna radiata.

Descripción: La tuberculosis (TB) sigue siendo un problema de salud a nivel global, con aproximadamente 1.4 millones de muertes en 2019. La TB puede ser generalmente tratada, pero cada vez más aparecen cepas resistentes, por lo cual es menester desarrollar nuevas terapias anti-TB. En este sentido, la serina/treonina quinasa PknG juega un rol clave en el proceso infectivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de TB. En la primera parte de esta Tesis se detalla el descubrimiento de un inhibidor contra PknG mediante la combinación de cribados virtuales y ensayos de actividad. Dicho compuesto fue utilizado como punto de partida para obtener derivados y comprender la relación estructura-actividad. A su vez, obtuvimos la estructura del complejo PknG-inhibidor mediante cristalografía de rayos-X. PknG es además una proteína quinasa única, ya que posee mecanismos de regulación desconocidos. Varios estudios han demostrado que existe una relación entre el dominio rubredoxina, capaz de alternar entre distintos estados redox, y la actividad de PknG, pero no han profundizado en los mecanismos involucrados. Consecuentemente, ese ha sido el objetivo de la segunda parte de esta Tesis, donde se presentan resultados de dinámicas moleculares, espectrometría UV-VIS y small angle x-ray scattering (SAXS) que sugieren que el dominio rubredoxina es una de las regiones más flexibles, y que PknG se despliega al oxidarse.

Descripción: Las invertasas son β-D-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26) que hidrolizan la sacarosa irreversiblemente a glucosa y fructosa. Hasta la fecha, se han identificado diferentes isoformas de invertasas que se clasificaron según su localización sub-celular en: a) solubles, las cuales se encuentran en citosol o vacuola, o b) insolubles, las cuales están unidas a componentes de la pared celular. En el marco de esta tesis doctoral se analizó el papel de dos enzimas invertasas, una vacuolar (At1g12240-Inv-vac) y una citosólica (Solyc04g081440-Slalk/ne-INV) en la acumulación de biomasa y distribución y composición del carbono en plantas superiores utilizando como modelo Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum, respectivamente. A través de mapeo de QTLs se demostró que una invertasa vacuolar (Inv-vac) juega un rol determinante en el largo radicular en Arabidopsis. El objetivo del presente trabajo en entender el mecanismo fundamental de este QTL a través del análisis de las diferencias estructurales y funcionales de Inv-vac en dos genotipos parentales (Ler y CVI) y dos líneas introgresadas (N-14 y N-15) portando segmentos genómicos individuales de CVI, conteniendo al locus At1g12240, en el fondo genético de Ler. Se analizó la abundancia relativa de los transcriptos por qRT-PCR la cual mostro patrones de expresión similares entre ambos ecotipos. Sin embargo, el análisis de secuencia de ADN revelo varios polimorfismos que provocan cambios en la secuencia de la proteína correspondiente entre ellos. A su vez, ensayos de actividad en extractos de proteínas totales mostraron mayor actividad invertasa en los genotipos conteniendo el alelo de CVI mientras que los ensayos cinéticos utilizando proteínas recombinantes purificadas revelaron Km similares para ambos alelos y una Vmax ligeramente mayor para el alelo Ler. Tratamientos de extractos de plántulas con agitación y temperatura para minimizar la actividad de posibles inhibidores de invertasa provocaron un aumento importante en la actividad de Ler sin modificar la actividad de los genotipos conteniendo el alelo CVI. Análisis de qRT-PCR de dos inhibidores de invertasa vacuolar en plántulas de los 4 genotipos revelo patrones de expresión diferencial entre ellos. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que el QTL de invertasa vacuolar afecta la acumulación de biomasa radicular y la partición de carbono a través de una regulación diferencial de los inhibidores a nivel ARNm. Para el caso de Solanum lycopersicum, se obtuvieron plantas transgénicas silenciadas por ARNi para el gen que codifica para una invertasa alcalina neutra (Slalk/ne-INV) y se realizó una fenotipificación de las plantas que mostraron diferencias contrastantes con respecto al wild type, mayormente en la aparición de flores y seteo de frutos. A su vez, a través del análisis de acumulación de mensajero por qRT-PCR se observó un aumento de los niveles de expresión de LIN4 durante el desarrollo de los frutos que da cuenta de la importancia de esta enzima en los órganos destino. Los niveles de los principales carbohidratos solubles se midieron a lo largo de un periodo diurno en hojas fuente y la actividad de enzimas centrales del metabolismo de carbono fueron medidas en hojas y frutos rojos de las líneas transgénicas. Por otra parte, se obtuvieron perfiles metabólicos de hojas y frutos de las plantas transgénicas aplicando GC-MS y se realizaron experimentos de acumulación de ARNm por secuenciación masiva (RNAseq). El análisis conjunto de los datos de RNAseq y metabolómica muestran que el silenciamiento de la enzima Slalk/ne-INV genera un aumento de la expresión de genes involucrados principalmente en respuesta a estrés, defensa y muerte celular programada apoyando la idea de un papel principal de esta enzima sobre el metabolismo global de la planta, el crecimiento y la reproducción vinculando la adaptación al estrés, con los azucares y las señales del desarrollo.

Descripción: Mammalian cell division, is a highly complex process, regulated and coordinated bymechanisms that are conserved through most species. The physiological control of eucarioticcell proliferation initiation is external, and it is excerted by humoral factors, made by the same orother cells, under certain requirements of the organism. Progression through the differentphases of the cell cycle, is governed by a regulatory machinery conserved through mostspecies, that not only coordinates the various events that made up the cell cycle, but alsoconnects the cell cycle with extracellular signals, that regulates cell proliferation. Beginning witha given mitogenic stimulus acting through a specific receptor in a target cell, signallingmechanisms cascades are generated in the membrane and in the citosol of that cell. Theseearly events, act on the cell cycle machinery, finally leading to cell division. The expression ofproteins that regulate the cell cycle is in part induced by mitogen-stimulated signallingmechanisms. The passage from G0 to S phase, depends on the activity of cyclin-dependent kinases (CDKs). These kinases are CDK4 and CDK6, and they are activated when they form complexes withcyclins D (D1, D2 and D3), induced in the G1 phase. Cyclins D are considered as "sensors" ofthe extracellular medium, since their induction is triggered by mitogenic stimuli. The activatedcomplexes cyclin D-CDK4 and cyclin D-CDKG catalyse the phosphorilation of the Rb protein. In Swiss 3T3 cells, PGF2α is capable of inducing DNA synthesis, by means of multiple signallingmechanisms, in the absence of other factors. However its mitogenic effect is potentiated by TGFβ1 addition. We have shown that PGF2α triggers cyclin D1 mRNA/protein expression prior tocellular entry into the S phase, but fails to raise CDK4 or cyclin D3 levels, while 1-oleoyl-2acetyllglycerol (OAG), a protein kinase C (PKC) and tyrosine kinase (TK) activator, induces onlycyclin D1 expression with no mitogenic response. In contrast, in PKC-depleted or -inhibited cells, PGF2α, but not OAG, increases cyclin D1 expression with no mitogenic response. Finally, OAG,in the presence of orthovanadate (Na3VO4)or TGFβ1, induces DNA synthesis. Thus, it appearsthat PGF2α triggers cyclin D1 expression via two independent signalling events that complementwith TGFβ1-triggered events to induce DNA synthesis. TGFβ1 cannot trigger cyclin D1expression, but, stabilise cyclin D1 mRNA, after PGF2α-triggered its expression. Leukaemia inhibitory factor (LIF) was originally described on the basis of its ability to stimulatethe differentiation of murine M1 leukemic cells into granulocytes and macrophages. In Swiss 3T3cells, both LIF and prostaglandin F2α (PGF2α) trigger initiation of DNA synthesis and cellproliferation. LIF appears to exert its action through signals and processes markedly differentfrom those elicited by PGF2α. While pre-treatment the cell culture with either GF 109203 (bysoindolmalemide), a specific PKC inhibitor, or 12-tetradecanoyl-13-phorbolacetate, whichcauses PKC down modulation, or lovastatin, known to block mevalonic acid synthesis andprotein isoprenylation, totally impairs PGF2α mitogenic action. None of these treatments inhibited LIF-induced DNA replication. Agents capable of rising intracellular cAMP, enhanced both LIFand PGF2α ability to cause cellular entry into the S phase. However, H89 and PKI, both PKAinhibitors, prevented cAMP-mediated potentiation, but did not affect LIF induction of cellularentry into S phase. PD98059, a MEK (MAPKK)inhibitor, prevents PGF2α-mitogenic responsebut does not block LIF-induced initiation of DNA synthesis. Immunofluorescence studiesrevealed that LIF and PGF2α responses exhibit marked differences in STAT cytoplasmic-nucleartranslocation. After 15 to 30 min, LIF causes STAT1 but not STAT3 or STAT5 translocation. Incontrast, PGF2α failed to induce translocation of any of those transcriptional factors. Thus, it appears that LIF triggers mitogenic action through independent signalling events suchas those involving PKC, PKA, MEK, p38MAPK and protein isoprenilation. In addition, its mitogeniceffect is markedly potentiated by PKC, PKA, and probably PTK mediated signallingmechanisms. Western blot analyses of cyclin D1, D2 and D3 expression (implicated in most mitogen actions),revealed that PGF2α, after 7-9 h, caused an increase in cyclin D1 protein levels, and a laterincrease in cyclin D2 levels. In contrast, LIF failed to increase either cyclin D1, D2, D3, CDK4 or CDK6 protein levels. Finally, oncostatin M(OSM), a cytokine closely related to LIF, exerts its action through signalsand processes markedly similar to those elicited by LIF. This conclusion is based in the followingfacts: both cytokines causes STAT1 tranlocation; the effect of Prostaglandin E1 and insulin,when added separately or in combination, enhances the effect of either LIF or OSM; PGF2αenhances the effect of LIF or OSM on DNA synthesis, both at subsaturant or saturantconcentration. Moreover, LIF and OSM added together at subsaturating concentrations had anadditive effect on DNA synthesis. LIF and OSM added together at saturating concentration hadan similar effect to that of these same cytokines when added separately. Interleukin -6 and CNTF, fail to cause either cyclin D expression or mitogenic response. The results obtained suggest that the PGF2α-stimulated mitogenesis would occur through cyclin D1 expression, mediated by DAG/PKC and TK dependent mechanisms, while calciumdependent mechanisms would be involved in other processes. Finally, the LlF stimulatedmitogenesis is not depend on signalling mechanisms such as those that act through PKC, PKA, MEK, p38MAPK and isoprenilated proteins, and also independently of the expression of cyclins D, CDK4 and CDK6.