Descripción: La esclerosis múltiple (EM) es un desorden inflamatorio autoinmune del sistemanervioso central, caracterizado por desmielinización, inflamación y pérdida axonal. Laetiología de la enfermedad es aún desconocida, pero muchos trabajos en modelos animaleshan puesto en evidencia un rol importante de la neuroinflamación en su patogénesis yprogresión. La mayoría de los pacientes presentan episodios de recaídas y remisiones. Amedida que la enfermedad evoluciona el proceso de remielinización comienza a fallar, locual resulta en la eventual pérdida de funciones en los pacientes. El rol de la inflamación enla regeneración de la mielina es aún incierto. Considerando la heterogeneidad y complejidadque presenta la EM es importante generar modelos apropiados que recapitulen laenfermedad, pero también otros modelos de estudios más sencillos que faciliten lacomprensión de los mecanismos involucrados. En la presente tesis nos propusimos estudiar el efecto de estímulos inflamatoriosrepetidos mediante la reinyección de un estímulo pro-inflamatorio crónico, en eventossimilares a episodios de recaída. También nos propusimos estudiar la influencia deinflamaciones periféricas sobre las lesiones desmielinizantes en el SNC. Para ello utilizamosun adenovector que expresa interleuquina 1β en forma crónica. Hemos demostrado que la respuesta a un estímulo central secundario variadependiendo de si la lesión primaria está activa o no. Así, la presencia de una lesióninflamatoria central aún activa disminuye la respuesta a un estímulo pro-inflamatoriosecundario dentro del SNC. Sin embargo, esta repuesta secundaria disminuida no se observacuando el segundo estímulo se aplica con la lesión primaria completamente recuperada. Porotro lado, un estímulo pro-inflamatorio proveniente de la periferia recrudece la respuestainflamatoria central previa, incluso cuando la BHE se encuentra intacta. Los estímulos inflamatorios, tanto centrales como periféricos, deberían serconsiderados como factores de riesgo al momento de estudiar la etiología y progresión de la EM. Una mejor comprensión de los mecanismos que intervienen en la recaída/remisión, yde la influencia de infecciones periféricas sobre la misma colaboraría con la identificación yel desarrollo de nuevas terapias para un mejor tratamiento de la EM.

Descripción: Numerosos estudios epidemiológicos han descrito asociación entre aumentos de mortalidad y morbilidad humana con la existencia de niveles elevados de material particulado (MP) EN EL AIRE. El tamaño y las características físico-químicas del MP se encuentran intimamente relacionados con su origen y con los procesos que lo generaron. El MP proveniente de combustiones antropogénicas, como la generación de energía y la actividad industrial y urbana, presenta una gran proporción de partículas fine (dae < 2.5 μm) y ultrafine (dae 1 μm), mientras que el MP de origen natural presenta una mayor proporción de partículas coarse (dae <10μm). Si bien existen dispositivos de control para reducir las emiciones de MP, éstos son ineficientes para retener partículas mas pequeñas y no se encuentran disponibles en muchas partes de nuestro país. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que los factores pulmonares agudos del CFA (proveniente de la combustión del carbón para la generación de energía eléctrica, con bajo contenido de carbono), se encuentran inversamente relacionados con el tamaño de las partículas y están asociados a un incremento en el contenido de azufre, de cuarzo y de trazas de elementos. Por otra parte, MP obtenidoc luego de un episodio de emisión accidental industrial (coque, proveniente de la combustión de derivados del petróleo, con alto contenido de carbono) generó efectos pulmonares agudos considerables y disminución en las funciones de defensa de macrófagos alveolares. Los efectos del coque crudo son mas pronunciados que los del coque calcinado, indicando una posible participación de los compustos orgánicos adsorbidos en la matriz carbonosa en el primero. La muestra urbana (Ciudad de Buenos Aires) produjo efectos menores que las muestras de coque. Dado que las vías aéreas constituyen la ruta de entrada de los contaminantes del aire al organismo, el conocimiento de los posibles efectos nocivos de los mismos es muy importante para incrementar las medidas de control en ciertas áreas relacionadas con las actividades humanas

Descripción: La exposición prenatal a estímulos pro-inflamatorios influye sobre diversas funciones del cerebro adulto. Además, estímulos pro-inflamatorios han mostrado efectos adversos sobre la neurogénesis adulta. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo fue que un estímulo pro-inflamatorio durante el período prenatal provoca una disminución permanente de la neurogénesis adulta. Para testar esta hipótesis, ratas Wistar preñadas recibieron inyecciones subcutáneas de un estímulo pro-inflamatorio, el lipopolisacárido bacteriano (LPS), en sus días 14, 16, 18 y 20 de gestación. Las crías adultas prenatalmente tratadas con LPS mostraron una reducción en la cantidad total de células en proliferación y en la diferenciación neuronal en el giro dentado, que resultan en una menor neurogénesis total. Sin embargo la proliferación de progenitores neurales y la supervivencia celular se mantuvieron constantes. Además, el tratamiento prenatal con LPS provocó alteraciones en el desempeño de los animales en el test comportamental de Reconocimiento del Objeto Nuevo, un test que evalúa la memoria a corto plazo, y que ha sido previamente relacionado con la neurogénesis adulta. Evaluando cambios a nivel sistémico que expliquen la disminución de la neurogénesis adulta por el LPS prenatal, observamos que la exposición prenatal a LPS no afectó el funcionamiento basal del eje neuroendócrino Hipotalámico-Hipofisario-Adrenal. Por otra parte, el LPS administrado a las hembras en su preñez sí afectó los niveles de cuidado materno de las crías. Sin embargo, experimentos de adopción cruzada demostraron que los efectos del LPS prenatal sobre la neurogénesis adulta fueron independientes del cuidado materno recibido por las crías. El tratamiento prenatal con LPS provocó alteraciones permanentes en la composición del entorno o nicho neurogénico del GD adulto: a nivel celular, se observó una activación morfológica permanente de la microglía a estadíos intermedios. A nivel molecular, se observaron alteraciones agudas en la expresión de citoquinas en el cerebro fetal y una expresión disminuida del Factor Transformante de Crecimiento beta 1 (TGF-β1) específicamente en el GD de animales adultos. La sobreexpresión crónica de TGF-β1 en el GD adulto restauró los niveles disminuidos de neurogénesis a los niveles originales, equivalentes al grupo control, mientras que no aumentaron los niveles de neurogenesis en el grupo control. Además, la sobreexpresión bilateral de TGF-β1 restauró el desempeño en el test de Reconocimiento del Objeto Nuevo a los niveles del grupo control. La exposición adulta a LPS, al contrario de la exposición prenatal, provocó efectos transientes en la disminución de neurogénesis y la activación de microglía. Por otra parte, TGF-β1 mostró efectos pro-neurogénicos in vitro a través de la activación de su principal vía de señalización, la vía Smad 2/3. Estos resultados validan la hipótesis de trabajo. Además, destacan el período prenatal con una etapa de susceptibilidad a estímulos inflamatorios que ejercerán efectos a largo plazo sobre la neurogénesis adulta y comportamientos relacionados a través de alteraciones permanentes en la composición del nicho neurogénico, como la activación microglíal y la expresión disminuida de TGF-β1 en el GD. Por su parte, TGF-β1 resulta un modulador central de la disminución de los niveles de neurogénesis adulta y de comportamientos asociados a memoria por el LPS prenatal

Descripción: Previamente demostramos que el ADN bacteriano extracelular activa a los neutrófilos a través de un mecanismo diferente al canónico CpG-dependiente. El ADN extracelular es un componente central en la formación y estructura de los biofilms bacterianos, comunidades responsables de más del 60% de las infecciones ocasionadas por estos microorganismos. La presente tesis tuvo como objetivos centrales determinar el impacto del ADN de la matriz de los biofilms en la activación de los neutrófilos humanos y la identificaron del receptor involucrado en el reconocimiento de ADN. Los estudios realizados indicaron que la degradación con DNAsa I del ADN de la matriz extracelular de los biofilms de P. aeruginosa redujo marcadamente su capacidad de inducir la activación de los neutrófilos, determinada en función de su habilidad para producir citoquinas proinflamatorias, incrementar marcadores de activación fisiológicamente relevantes, de mediar la fagocitosis y de liberar trampas extracelulares de los neutrófilos (NET). La aplicación de técnicas de MALDI-TOF nos permitió identificar, en el neutrófilo, 16 proteínas con capacidad de unir ADN bacteriano. A pesar de que ninguna de ellas resultó ser el receptor de la superficie celular para ADN, es posible que dos de las proteínas encontradas constituyan sensores intracelulares de ADN, cuya relevancia queda por ser explorada. Los hallazgos realizados en la presente Tesis confirman la existencia de una proteína de la superficie del neutrófilo capaz de mediar el reconocimiento de ADN y la activación celular por esta molécula. Además, indican que el ADN de la matriz extracelular representa un componente proinflamatorio relevante de los biofilms de P. aeruginosa. Los mismos permiten especular que el reconocimiento del ADN de la matriz de biofilms podría representar un mecanismo seleccionado evolutivamente para permitir al huésped incrementar su capacidad de responder a este tipo de infecciones bacterianas persistentes

Descripción: Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista el cual posee múltiplesmecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y una variedad defactores de virulencia que contribuyen al desarrollo de infección en diversos sitios. Lasinfecciones por S. aureus se caracterizan por una fuerte respuesta inflamatoria mediada porla presencia de neutrófilos que son reclutados al sitio de la infección. Se ha demostrado el rolcrítico de la proteína A (SpA) en el desarrollo de neumonía mediante la inducción de lascascadas de señalización de TNF-α e IFN-β, las cuales conducen a la producción demediadores inflamatorios y al reclutamiento de neutrófilos. Asimismo SpA induce cascadasde señalización pro-inflamatorias en células mieloides y en células no inmunes. El objetivo general del presente trabajo fue determinar el rol de la proteína A de S. aureus en la activación y secreción de mediadores pro-inflamatorios en neutrófiloshumanos así como su capacidad de regular la sobrevida de los mismos. Se demostró que S. aureus y la proteína A contribuyen a modular el perfil inflamatorio de los neutrófilos enforma temprana mediante la inducción de citoquinas inflamatorias y quimioquinas. S. aureusindujo la activación de MAPKs contribuyendo a la producción de IL-8 y TNF-α por losneutrófilos. El estímulo con S. aureus provocó además la expresión sostenida de señalespro-inflamatorias hasta las 22 horas luego de la estimulación. La exposición prolongada delos neutrófilos a S. aureus indujo un aumento en los niveles de mortalidad y cambios en laproporción de neutrófilos apoptóticos/necróticos con un incremento de la proporción denecrosis. No obstante, la expresión de SpA resultó crítica para prevenir parcialmente lanecrosis masiva de los neutrófilos favoreciendo la muerte por apoptosis. Nuestros resultadossugieren que la proteína A de S. aureus desempeñaría un rol pro-inflamatorio durante elencuentro inicial con los neutrófilos lo cual contribuiría a la inducción de un microambientepro-inflamatorio incrementando la sobrevida de los neutrófilos. En estadios posteriores, laexpresión de proteína A desempeñaría un rol anti-inflamatorio ya que contribuiría a prevenirla necrosis masiva y disminuir los efectos deletéreos que la inflamación exacerbada podríatener sobre la bacteria.

Descripción: La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentrasólidamente establecida. En efecto, se sabe que ciertos tumores, tienen una mayorprobabilidad de originarse en sitios de inflamación crónica y que procesosinflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes enanimales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamaciónsistémica no ha sido particularmente estudiada. En esta tesis, demostramos quedurante el crecimiento de 4 tumores murinos, de diferente origen, estirpe histológicoe inmunogenicidad y de un tumor humano creciendo en ratones nude, se generaron 2 picos temporalmente separados de inflamación sistémica. El primer pico fuerelativamente pequeño y transitorio ya que fue detectado durante la primera semanaluego de la inoculación del tumor. Tal vez represente, en parte, una respuesta delorganismo al trauma mecánico de la inoculación de elementos extraños, ya que lainoculación de fibroblastos murinos normales también produjo una manifestación deinflamación sistémica, aunque menor, que la observada después de la inoculaciónde células tumorales. Por otro lado, el inicio del segundo pico de inflamaciónsistémica fue observado cuando el volumen tumoral fue mayor que 500 mm3 ycoincidente con el inicio del crecimiento exponencial de cada tumor. Este segundopico de inflamación sistémica fue significativamente más prominente que el primeroy su intensidad aumentó en relación directa con el incremento de la masa tumoral. Estos resultados sugieren que la inflamación sistémica podría ser un fenómenogeneral de la patología neoplásica y su importancia se puso de manifiesto en elhecho de que, en nuestra colección de tumores, se observó, sorpresivamente, unacorrelación directa entre la magnitud de la inflamación sistémica generada por cadatumor y su agresividad, correlación que no se observó con la capacidad de generarmetástasis. Esto indica, al menos en los tumores analizados por nosotros, que lacapacidad de generar una potente respuesta inflamatoria sistémica, produce másefectos deletéreos sobre el organismo que la propia capacidad metastásica,disminuyendo de este modo la sobrevida. En este sentido, se encontró graninfiltración de neutrófilos y alteraciones estructurales en diferentes órganos, que soncompatibles con disminución y aún pérdida de función, independiente de lacapacidad metastásica de cada tumor. La inflamación sistémica generada por eltumor exacerba el propio crecimiento tumoral estableciendo un circuito deretroalimentación positivo entre ambos, al menos en parte por la activación delreceptor TLR-4. Además, la disminución de las manifestaciones de inflamaciónsistémica mejoró los efectos anti-tumorales obtenidos con quimioterapia yradioterapia, aunque estos resultados fueron relativamente modestos. Esto se debea que el tumor cuando supera los 1500 mm3, comienza un crecimiento exponencial,generando un fenómeno de inflamación sistémica progresivo, a pesar de que secontinúan administrando las drogas antiinflamatorias, que hasta ese momentohabían sido bastante efectivas para limitar la naciente inflamación sistémica y pararetardar el crecimiento tumoral. En cambio, un excelente resultado terapéutico fuealcanzado cuando se realizó el tratamiento antiinflamatorio junto con la escisiónquirúrgica de tumores > 2000 mm3. En este caso, la eliminación quirúrgica de lafuente principal de inflamación sistémica y de posible refractariedad, permitió altratamiento antiinflamatorio tener muchas más chances de actuar, contra lainflamación sistémica residual, pero aún deletérea, que perdura al menos 2 semanasdespués de la extirpación del tumor. Si esta condición inflamatoria sistémica fuerauna característica distintiva de muchos canceres avanzados, un conocimiento máspreciso de los mecanismos por los cuales esta inflamación sistémica promueve elcrecimiento tumoral y produce múltiples daños en el organismo y la búsqueda desustancias antiinflamatorias más efectivas y con menores efectos adversos, seríanmuy importantes para complementar y mejorar las terapias actuales contra elcáncer.

Descripción: Alteraciones en la proliferación y diferenciación de células trofoblásticas (TB) en sus diversos fenotipos funcionales, defectos en la transformación vascular y un control deficiente de la respuesta inflamatoria materna en etapas tempranas de la gestación se asocian con complicaciones gestacionales como la preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino. Diversos factores solubles y de contacto participan en estos procesos durante la placentación. Proponemos la participación del péptido intestinal vasoactivo (VIP), ya que es sintetizado por TB y tiene actividad relajante muscular, vasodilatadora, e inmunomoduladora. El objetivo de esta tesis fue investigar la contribución del VIP y sus receptores VPAC en diversas funciones de TB, en particular en su capacidad de diferenciarse, migrar e invadir; su capacidad de interactuar con células inmunes deciduales favoreciendo la remodelación tisular en un microambiente anti-inflamatorio. Analizamos estos aspectos en diseños in vitro con líneas celulares trofoblásticas humanas de primer trimestre (Tb), la interacción de éstas con monocitos de voluntarios sanos o macrófagos derivados de ellos. En la segunda parte del trabajo evaluamos la expresión del VIP y los efectos del péptido en diseños ex vivo empleando explantos de placenta de primer trimestre obtenidas de abortos electivos en el marco de una colaboración con la Universidad de Manchester. Nuestros resultados demuestran que Tb tiene la capacidad de aumentar la migración de monocitos (Mo), que adquieran un perfil anti-inflamatorio con aumento en la producción de IL-10 y fagocitosis de cuerpos apoptóticos. Esos efectos fueron aún mayores si las Tb se incubaron previamente con VIP. Además, los medios condicionados de Tb tratadas con VIP disminuyeron la expresión de marcadores pro-inflamatorios, aumentaron los anti-inflamatorios y la fagocitosis de cuerpos apoptóticos en macrófagos (MA) diferenciados con GM-CSF. Cuando estudiamos placentas humanas de primer trimestre, detectamos que las TB extravellosas expresan VIP y este aumentó la migración por una vía dependiente de PKA. Cuando silenciamos el VIP en Tb, observamos una disminución en la expresión de genes de remodelación de la matriz extracelular, en especial las metaloproteasas (MMP) 2 y 9. Las TB VIP positivas se encontraron principalmente en la luz de las arterias espiraladas y glándulas maternas sugiriendo su función de remodelación. Además, VIP aumentó la secreción de IL-10 y varias quimioquinas y disminuyó la de G-CSF en TB. Cuando analizamos las células NK y MA deciduales en estas muestras de placenta detectamos que expresan VPAC1 y VPAC2 y que el VIP disminuyó la secreción de los marcadores pro-inflamatorios IL-1β, IL-8 e IL-12 y aumentó IL-10. Además, solo en los dMA el VIP aumentó la expresión y actividad de la MMP-2, consistente con un efecto sobre la transformación vascular. Estos resultados aportan evidencias acerca de la modulación por VIP de la función trofoblástica y su interacción con células inmunes en la interfase temprana y sugiere su papel como modulador endógeno a través de circuitos autocrinos y paracrinos. Las evidencias presentadas aquí sostienen un papel del VIP de origen trofoblástico durante la placentación. Su eventual potencial y validación como biomarcador requerirá abordajes en diseños clínicos de cohortes en pacientes con y sin complicaciones gestacionales.

Descripción: Los neutrófilos son leucocitos que cumplen un papel clave en la defensa antimicrobiana. Éstos constituyen las células más numerosas de la sangre periférica, con una producción que se incrementa dramáticamente durante la inflamación o infección sistémica. Tradicionalmente se les ha adjudicado un papel microbicida en la respuesta inmune, pero estudios recientes demostraron que pueden modular el curso de las mismas a través de la secreción de citoquinas, entre las cuales se encuentra la Interleuquina‐1β (IL‐1β). Ésta es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos tanto sobre el sistema inmune innato como el adaptativo. La IL‐1β es sintetizada como un precursor inactivo que requiere clivaje proteolítico para ser activado. En respuesta a la estimulación con LPS y ATP, los neutrófilos humanos sintetizan pro‐IL‐1β y median la generación de su forma activa a través de la caspasa‐1 tras la activación del inflamasoma. La IL‐1β carece de péptido señal, por lo que es sintetizada en el citoplasma y secretada por vías no convencionales de naturaleza controvertida, que son independientes de la vía canónica que involucra al retículo endoplásmico‐aparato de Golgi. En este trabajo de tesis aportamos evidencias que sustentan que un mecanismo de autofagia secretoria se encuentra involucrado en la exportación de IL‐1β en neutrófilos humanos, a través de estudios cinéticos cuantitativos que involucraron inmunomarcaciones, técnicas de microscopía confocal y cuantificación de las imágenes, así como ensayos de ELISA específicos y Western Blot. Estos estudios también indicaron que aun cuando los neutrófilos humanos liberan pro‐IL‐1β, su secreción no está mediada por autofagia. Además, los resultados evidenciaron que las serinproteasas neutrofílicas regulan la secreción de la IL‐1β. Nuestros hallazgos indicaron que la IL‐1β es secretada mayoritariamente en forma soluble, y sólo en una mínima proporción dentro de microvesículas y exosomas. Los resultados son compatibles con un modelo que involucra la participación de la chaperona HSP‐90 y de la Gasdermina D en la translocación de la IL‐1β a las vesículas. Nuestros hallazgos también sugirieron que la autofagia controla el destino de los inflamasomas. Teniendo en cuenta las diversas condiciones de naturaleza infecciosa e inflamatoria en las que los neutrófilos infiltran masivamente los tejidos, los resultados de esta tesis aportan blancos moleculares potenciales, que podrían ser sujeto de investigaciones en el futuro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para mitigar la inflamación en patologías en las cuales la IL‐1β neutrofílica cumpla un papel relevante en su patogénesis.

Descripción: La pancreatitis aguda constituye una entidad nosológica prevalente caracterizada por la autodigestión del páncreas exocrino provocada por la activación in situ de las mismas enzimas que el páncreas produce. Se expresa como una forma leve autolimitada, o bien como una forma severa con elevada mortalidad principalmente como resultado de falla multiorgánica. Las causas y/o mecanismos que llevan a una u otra expresión son desconocidos, por lo que debido a su curso incierto constituye una preocupación clínica. Los eventos tempranos que conducen a su desarrollo no se hayan aún esclarecidos, si bien la activación del tripsinógeno y de la respuesta inflamatoria constituyen dos mecanismos disparadores independientes. En este trabajo de tesis abordamos el estudio del posible papel protector del factor natriurético atrial (ANF) en los eventos temprano que disparan la patología, particularmente la respuesta inflamatoria que lleva a la muerte de las células acinares eventualmente por necrosis y apoptosis mediante la utilización de un modelo animal (rata) validado de pancreatitis aguda. Asimismo, evaluamos la posibilidad de que el páncreas exocrino constituya una fuente extracardíaca de ANF. El presente estudio se sustenta en trabajos previos en los que observamos que el ANF regula fisiológicamente la funcionalidad del páncreas exocrino y atenúa la pancreatitis aguda experimental al estimular la exclusión de AMPc a través de proteína asociada a resistencia a multidrogas tipo 4 (MRP4). No obstante, este mecanismo no explicaría en su totalidad el papel protector del ANF. Los resultados mostraron que el ANF disminuye la respuesta inflamatoria desencadenada durante la pancreatitis aguda al reducir la expresión de los principales mediadores inflamatorios. El ANF redujo la activación del factor de transcripción NF-κB, íntimamente relacionado con la activación de genes que codifican para citoquinas pro-inflamatorias. En estesentido, disminuyó asimismo los niveles intrapancreáticos del factor de necrosis tumoral α (TNF-α), citoquina que juega un papel clave en la propagación de la respuesta inflamatoria. Por otra parte, disminuyó la expresión de enzimas inducibles durante la inflamación como la enzima óxido nítrico sintasa (iNOS) y ciclo oxigenasa 2 (COX-2) así como también su principal producto, la prostaglandina E2 (PGE2). La atenuación de la respuesta inflamatoria se correlacionó con modificaciones de la ultraestructura de las células acinares observada mediante microscopía electrónica de transmisión. El ANF atenuó el daño generado en la ultraestructura celular ya que disminuyó el swelling del retículo endoplásmico, el edema intra e intercelular y la presencia de autofagolisosomas. El ANF asimismo estimula la muerte celular por apoptosis y disminuye la necrosis, lo que constituye un efecto beneficioso, ya que en la pancreatitis aguda la apoptosis se correlaciona inversamente con la necrosis y así con la severidad de la patología. El ANF incrementa las células TUNEL positivas y la activación de las caspasas, lo que se relaciona la morfología de los núcleos observados por microscopia electrónica. Se observó asimismo que el ANF se expresa en el páncreas exocrino tanto a nivel de su ARN mensajero como a nivel de proteína, lo que implica que el páncreas sintetiza y expresa ANF maduro. Mediante la técnica de inmuno-oro se observó que el ANF se localiza en el retículo endoplásmico, mitocondrias y gránulos de zimógeno. En resumen, en este trabajo de tesis demostramos que el ANF atenúa la respuesta inflamatoria y estimula la apoptosis en la pancreatitis aguda experimental lo sustenta su papel protector en el desarrollo de la patología. Asimismo, observamos que el páncreas exocrino sintetiza y expresa ANF maduro, sugiriendo que tendría funciones paracrinas y/o autocrinas a nivel de las células acinares pancreáticas, en las que hemos demostrado la presencia de sus receptores.

Descripción: En el cerebro de mamífero se ha descripto la existencia de dos zonas neurogénicas en donde las células stem o progenitores neurales (NSC) proliferan y se diferencian a los diferentes tipos celulares neurales. Encontrar factores que puedan modular su proliferación y diferenciación podría ser una herramienta muy útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Las citoquinas, estudiadas tradicionalmente en el sistema inmune, tienen numerosos efectos sobre las neuronas y las células gliales pero se conoce poco el efecto que podrían tener sobre la proliferación y la diferenciación de las NSC. La microglía es un tipo celular residente del cerebro y uno de los componentes celulares más importantes en la respuesta inmune en el cerebro. Puede activarse en respuesta a lesiones y secretar factores tanto citotóxicos como protectivos para las células neurales. Se ha estudiado poco el efecto que estos factores puedan tener en la proliferación y diferenciación de las NSC como componentes importantes del nicho en dónde dichas células residen. El objetivo del trabajo es caracterizar la población de progenitores del giro dentado de ratas adultas y estudiar el rol del sistema inmune en la proliferación y diferenciación de las NSC. Utilizamos un modelo de aumento de la proliferación celular en el giro dentado; la remoción de la glándula adrenal o adrenalectomía (ADX). En dichas circunstancias existe un aumento en los niveles de expresión de citoquinas periféricas y centrales debido a una disminución de los niveles de corticosterona en suero. Observamos un aumento significativo de la proliferación celular y la neurogénesis en el giro dentado de las ratas ADX. Caracterizamos, además, un subtipo de NSC en particular que proliferó diferencialmente con el tratamiento. Observamos una fuerte activación de la microglía en esa región que correlacionó positivamente con la neurogénesis y con los niveles de expresión del mensajero de TGF-ß. Parte del efecto de la ADX sobre la neurogénesis se encontró mediado por el TGF-ß y fue posterior a la activación de la microglía. Observamos, además, que la citoquina tuvo poder neurogénico sobre las NSC en cultivo. El efecto fue específico del TGF-ß ya que el tratamiento de las NSC en cultivo con otras citoquinas no tuvo efecto sobre las mismas. Además analizamos el efecto de la inyección de un adenovirus que expresa a la interleuquina-1ß humana (IL-1ß) en el giro dentado. Bajo estas condiciones experimentales observamos una fuerte activación de la microglía acompañada de una leve disminución en la neurogénesis. La vía de señalización del NFkB es una vía involucrada en numerosas respuestas del sistema inmune, funciona como integradora y mediadora de diferentes estímulos inflamatorios. Evaluamos el posible rol de dicha vía sobre la neurogénesis inducida con la ADX y sobre la neurogénesis endógena a través de la inyección de un adenovirus que expresa a un súper represor de NFkB. Observamos que la inhibición de la vía afectó diferencialmente la neurogénesis basal y la inducida con la ADX. Sin embargo, el resultado final para ambas circunstancias fue una menor cantidad de neuronas nuevas en el giro dentado. El poder neurogénico del TGF-ß fue evaluado en ensayos de transplante de NSC en el estriado de rata, sin embargo no observamos diferencias en la tasa de diferenciación de las células transplantadas tratadas con la citoquina respecto de las células control. Hemos caracterizado a la microglía como un componente importante del nicho en donde las NSC proliferan y se diferencian y hemos caracterizado a una citoquina anti-inflamatoria como el TGF-ß con poder neurogénico tanto in vivo como in vitro. Este trabajo introduce una nueva perspectiva en el estudio de las respuestas anti-inflamatorias en la biología de las NSC y su implicancia en la terapia regenerativa.

Descripción: La Enfermedad de Parkinson (EP) es una de las enfermedades neurodegenerativas de mayor incidencia en personas mayores de 65 años. Es de progresión lenta y su rasgo distintivo es la degeneración neuronal en la región de la sustancia nigra pars compacta (SN). Un hallazgo pato-fisiológico uniformemente observado tanto en modelos animales como en pacientes con EP es que la muerte de las neuronas de la SN se encuentra acompañada por activación de la microglía. Numerosa evidencia apunta a un efecto neurodegenerativo de la microglía activada, sin embargo, también se ha observado que la microglía podría tener efectos neuroprotectores, por ejemplo a través de la secreción de factores neurotróficos. Por lo tanto, el rol funcional de esta activación es aún un tema de amplio debate. En publicaciones previas de nuestro laboratorio hemos descripto una activación microglial atípica en la que la misma se encuentra parcialmente activada o “cebada” como consecuencia de la degeneración neuronal (Depino, Earl et al. 2003). En este estadío de activación atípica, las células son capaces de transcribir citoquinas proinflamatorias pero no de sintetizar la proteína en sí. Este concepto sugiere que una célula en estado cebado requeriría de un segundo estímulo menor al que requeriría una célula en reposo hasta quedar clásicamente activada. En esta tesis, hemos evaluado la hipótesis de que la inflamación pueda exacerbar la neurodegeneración en un modelo animal de EP (inyección de 6OHDA en el cuerpo estriado) con la consiguiente progresión de la enfermedad. Para ello, se procedió a la inyección endovenosa de un estímulo pro-inflamatorio periférico (Adenovector productor de interleuquina 1) a animales previamente denervados con la neurotoxina 6OHDA. El estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración en progreso en la SN. Los efectos exacerbantes del estímulo inflamatorio fueron asociados con un aumento en la activación morfológica microglial y expresión de MHC clase II en superficie. Debido a que la patología se presenta en pacientes añosos y a que los cerebros de personas ancianas presentan microglía cebada (Cunningham, Konsman et al. 2002) realizamos el mismo diseño experimental en ratas ancianas. En este modelo, también, el estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración presentando la microglía activación morfológica aumentada. Por otro lado, se estudiaron los mecanismos moleculares de la exacerbación de la neurodegeneración sobre un modelo de aumento de la inflamación con un estímulo pro inflamatorio en SN. Mediante la técnica de microarrays buscamos los genes candidatos a ser los responsables de estar participando en la exacerbación de muerte neuronal. Se encontraron genes diferencialmente expresados, cuatro de los cuales fueron validados técnicamente por RT-PCR en tiempo real. Esta tesis provee evidencia de los efectos perjudiciales de la inflamación en la progresión de la EP. Además, propone que las infecciones o inflamaciones podrían ser consideradas como un factor de riesgo en la exacerbación de la neurodegeneración en la EP. Así también, sugiere una asociación entre la activación de la microglía y los efectos neurotóxicos observados en la SN. Finalmente, propone candidatos a mediar estos efectos.

Descripción: Las células dendríticas son células altamente especializadas en captar, procesar y presentar antígenos a linfocitos T vírgenes a los fines de inducir una respuesta inmune específica. A pesar de su papel crítico en iniciar la inmunidad adaptativa, estas células pueden redireccionarse hacia un perfil tolerogénico. En el presente trabajo de tesis, determinamos el papel de galectina-1, una lectina endógena con propiedades antiinflamatorias, sobre la fisiología de células dendríticas humanas y de ratón. Células dendríticas diferenciadas en presencia de galectina-1 exhibieron un perfil regulatorio dependiente de la producción de IL-27 y de la activación del factor de transcripción STAT3, favorecieron la inducción de tolerancia en el microambiente tumoral y suprimieron las respuestas patogénicas Th1 y Th17 en un modelo de inflamación autoinmune desmielinizante. De acuerdo con su función regulatoria, la expresión endógena de galectina-1 fue elevada en células dendríticas expuestas a estímulos tolerogénicos y durante el pico y la resolución de la patología autoinmune, instancia en la cual contribuyó a la resolución de la enfermedad. Asimismo, células dendríticas deficientes en el gen de galectina-1 presentaron un mayor potencial inmunogénico y capacidad disminuida de suprimir fenómenos inflamatorios. Los resultados expuestos demuestran el papel crítico de galectina-1, tanto exógena como endógena, en la inducción de DC tolerogénicas productoras de IL-27 con profundas implicancias en el control de procesos inflamatorios y neoplásicos.

Descripción: El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por esta enfermedad entre los hombres occidentales. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son críticos para el desarrollo del PCa. El AR recluta varios co-activadores/co-represores y factores de transcripción modificando la expresión de genes blanco. Se han identificado varios mecanismos que activan al AR entre ellos la vía de señalización de STAT3. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la expresión nuclear de HO-1 en carcinomas primarios de próstata. In vitro la inducción de HO-1 disminuyó la proliferación, la invasión y la migración celular y retardó el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo. Nuestra hipótesis es que HO-1 podría actuar como un co-regulador de receptores nucleares o bien modificar el microambiente tumoral modulando la expresión de factores que actuarían como coreguladores. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si HO-1 afecta la actividad transcripcional del AR a través del eje STAT3. Demostramos que la inducción de HO-1 en las células de PCa reprime la activación del AR, disminuyendo la actividad del promotor y los niveles del ARNm del antígeno prostático específico (PSA). Comprobamos que la sobreexpresión de HO-1 induce arresto del ciclo celular en G2/M. Mediante inmunoprecipitación de la cromatina determinamos que HO-1 se asocia a promotores génicos, revelando una nueva función nuclear para esta proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación mostramos que HO-1 y STAT3 interaccionan directamente. Por medio de microscopía confocal demostramos que HO-1 provoca la retención citoplasmática de STAT3. El tratamiento con hemina (inductor específico de HO-1) impidió la inducción de la expresión de los genes targets de STAT3, coincidente con la disminución de los niveles de pSTAT3 en el núcleo. Estudios in vivo confirmaron la reducción de la localización nuclear de STAT3 en los xenotransplantes de células PC3 que sobre-expresan HO-1. Adicionalmente, NFκB, un factor relevante en la inflamación y que forma complejos con STAT3, también queda inactivo retenido en el citoplasma cuando se induce HO-1. Estos resultados proveen una función nueva para HO-1 reprimiendo la actividad transcripcional del AR en PCa e interfiriendo con la señalización de STAT3. Estos hallazgos sustentan nuestra proposición acerca del nuevo rol que posee HO-1, más allá de su actividad catalítica.

Descripción: Aunque los animales pueden ser inmunizados contra el crecimiento de algunostumores, la mayoría de los intentos por aplicar estas inmunoterapias paracausar la regresión en tumores humanos y de animales una vez que estos seencuentran establecidos no has sido exitosos, aun cuando los tumores sonfuertemente inmunogénicos. En esta tesis, nosotros demostramos que el iniciode la refractariedad a los tratamientos inmunológicos coincidió con el comienzode un estado de inmunosupresión conocido como “eclipse inmunológico”caracterizado por una pérdida o bloqueo de la respuesta inmune antitumoraldespués que el tumor ha superado cierto volumen crítico (500 mm3). A su vezel inicio del eclipse se correspondió con el comienzo de un proceso deinflamación sistémica progresiva caracterizado por un aumento en el númerode neutrófilos circulantes y en bazo, un alto número células mieloidesinmaduras (GR1/CD11b) y una elevada concentración sérica de citoquínasproinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6, proteína C reactiva y proteína A Amieloide. En ratones portadores de tumor, la aplicación de una sola dosis (0.75 mg/Kg) de un corticoide sintético como la dexametasona (DX) redujosignificativamente los parámetros de inflamación sistémica y revirtiósimultáneamente el eclipse inmunológico, lo cual fue demostrado por larecuperación de ciertos indicadores de respuesta inmune antitumoral. Otrosdos tratamientos anti-inflamatorios (inodmetacina o receptor para TNF-α)revirtieron parcialmente el eclipse inmunológico, aunque el efecto no fue tanefectivo que el observado con DX. La reversión del eclipse inmunológico no fuesuficiente por si solo para inhibir el crecimiento de un tumor primario. Sinembargo, cuando usamos la estrategia de dos pasos inoculando DX pararevertir el eclipse inmunológico y células dendríticas (CDs) estimuladas conantígeno tumoral, como un Booster de inmunización, se observó una inhibiciónsignificativa tanto en el crecimiento de tumores establecidos como en célulasremanentes luego de una operación de un tumor grande establecido, a pesarde que la vacunación con CDs solamente no tuvo efecto o incluso, a veces,produjo un aumento del crecimiento tumoral. Asimismo, cuando a la estrategiade dos pasos le adicionamos un tratamiento adicional (transferencia pasiva delinfocitos näive o administración de ATRA), si bien se observó una mayorinhibición del crecimiento de los tumores, la sobrevida de los animales no fuesignificativa. Por lo tanto, los datos presentes en esta tesis demuestran que es necesarioeliminar o mejorar el eclipse inmunológico como condición previa para permitirque una terapia inmunológica anti-tumoral pueda ser efectiva.

Descripción: La interleuquina-1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos, sintetizada como un precursor (proIL-1β) que debe ser procesado proteolíticamente para la generación de su forma activa. En esta Tesis determinamos que los neutrófilos humanos altamente purificados liberan IL-1β en respuesta a estímulos infecciosos como el lipopolisacárido (LPS) y estériles, como los cristales de urato monosódico (MSU), así como también frente al primado con LPS y posterior estimulación con ATP. Los efectos de inhibidores específicos y la capacidad de los agonistas de inducir la activación de la caspasa-1 sugirieron que la secreción de IL-1β es dependiente de caspasa-1 y de las serinproteasas elastasa y/o proteinasa 3. Nuestros hallazgos realizados con neutrófilos de pacientes incapaces de activar a la enzima generadora de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) NADPH oxidasa, con una línea celular neutrofílica carente de actividad de esta enzima, y con un inhibidor específico de la misma, sugirieron que el evento de secreción de IL-1β madura de la célula requiere de la actividad de la NADPH oxidasa. Sin embargo, el procesamiento de la proIL-1β es regulado negativamente por los IRO, los cuales ejercen un efecto inhibitorio sobre la caspasa-1. Esta compleja regulación de la secreción de IL-1β que depende del estado rédox celular podría constituir un mecanismo fisiológico de control de procesos inflamatorios dependientes de IL-1β donde el neutrófilo cumple un papel destacado.

Descripción: El óxido nítrico (NO) es un mediador clave de múltiples procesos biológicos. En la adenohipófisis, además de regular la secreción hormonal, el NO puede inducir apoptosis o bien tener un papel citoprotector. Esto muestra que esta molécula tiene un papel activo en la regulación de la vida y muerte celular adenohipofisaria. El objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar la participación del NO en los procesos de muerte celular en la adenohipófisis y sus mecanismos de acción, estableciéndose dos objetivos puntuales: 1. Investigar los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por altas concentraciones de NO, situación que puede presentarse durante procesos inflamatorias. 2. Investigar el proceso de regulación de la muerte celular luego de la ovariectomía y dilucidar el papel del NO en este proceso. Los resultados del primer objetivo han permitido identificar algunos de los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por concentraciones micromolares de NO en las células adenohipofisarias. Dentro de los mecanismos que caracterizan a la vía apoptótica mitocondrial, se pudo establecer la sobreproducción mitocondrial de especies reactivas del oxígeno (ROS) como uno de los eventos disparadores de esta cascada apoptótica. Este aumento de ROS indujo cambios en la expresión de Bax y Bcl-2 y la activación posterior de la caspasa 3, que llevó finalmente a la muerte celular. Paralelamente a esta secuencia de eventos, el NO modificó la actividad de las diferentes enzimas antioxidantes y alteró los niveles intracelulares de glutatión, lo cual demuestra un papel activo del sistema de defensa antioxidante celular durante el desarrollo de este proceso apoptótico. Los resultados del segundo objetivo mostraron, tanto in vivo como in vitro, que luego de la ovariectomía hay un aumento de la muerte celular en la glándula debido a la inducción de apoptosis. Paralelamente, se observó un incremento en los niveles adenohipofisarios de NO. Estos cambios pudieron ser prevenidos por el tratamiento con inhibidores de la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) demostrando, por primera vez, que el NO tiene un papel clave en la ejecución de la muerte celular desencadenada en la adenohipófisis luego de la ovariectomía.

Descripción: time-lapse' comprobamos que el tratamiento de PC3 con hemina disminuyó marcadamente la motilidad celular. Se generó la línea estable PC3HO-1, en la cual la sobre-expresión de HO-1 redujo significativamente la proliferación y migración celular respecto a la línea transfectada con el vector vacío. El silenciamiento de HO-1 mediado por siRNA en la línea con altos niveles endógenos de esta proteína (MDA PCa 2b) incrementó significativamente la proliferación y la invasión respecto a las células tratadas con un siRNA control. Mediante array de genes involucrados en inflamación y angiogénesis, identificamos a MMP9 como un nuevo blanco, cuya actividad y expresión fue modulada por manipulación genética y farmacológica de HO-1 en las líneas de PCa. Más aún, células de la línea PC3HO-1 y su respectivo control fueron injectadas s.c. en ratones atímicos nu/nu para el análisis in vivo de tumores creciendo como xenógrafos. El crecimiento tumoral y la expresión de MMP9 se redujeron significativamente en los tumores PC3HO-1 comparado con los xenógrafos controles. Estos resultados implican por primera vez a HO-1 en la proliferación, migración e invasión celular de cáncer de próstata sugiriendo su rol potencial como blanco terapéutico en ensayos clínicos.

Descripción: La melatonina, hormona secretada por la glándula pineal, regula la función testicular a través del eje hipotálamo-hipofisario y mediante acciones directas ejercidas en las células somáticas del testículo. En este trabajo de Tesis Doctoral hemos evaluado biopsias testiculares humanas con y sin alteraciones histológicas evidentes. En comparación con testículos sin cambios morfológicos significativos, las gónadas con alteraciones en la espermatogénesis presentaron un aumento en el número de macrófagos, en los niveles de marcadores inflamatorios, en el grado de peroxidación lipídica y en la expresión de enzimas anti-oxidantes, una mayor desorganización y densidad de las fibras de colágeno de la pared tubular y una menor concentración de melatonina. Al evaluar el impacto de la suplementación oral diaria con 3 mg de melatonina se observó un aumento en los niveles testiculares de esta indolamina, una disminución en la incidencia de procesos inflamatorios y de estrés oxidativo a nivel gonadal, y una mejora en el aspecto de la pared tubular. Se realizaron también estudios funcionales a fin de establecer los efectos de la melatonina sobre las células peritubulares de la pared de los túbulos seminíferos. Para ello, se aislaron y caracterizaron cultivos primarios de células peritubulares provenientes de testículos de hámsteres dorados inmaduros. En dichos cultivos, la melatonina disminuyó la expresión de marcadores inflamatorios y aumentó la expresión del factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), de la enzima ciclooxigenasa 2 (COX2), de componentes de la matriz extracelular y mejoró su capacidad contráctil. En resumen, la melatonina ejercería acciones beneficiosas sobre el estado inflamatorio y oxidativo testicular a través, entre otros, de la modulación de la actividad de las células peritubulares.

Descripción: Las células mieloides supresoras (CMS) constituyen una población de células con actividad regulatoria que controla las respuestas inflamatorias crónicas y promueve el escape tumoral. En este proyecto de tesis mostramos que el efecto del antiinflamatorio no esteroide indometacina (Indo) sobre las CMS es dependiente del contexto en el que se diferencie esta población celular. Ratones BALB/c inoculados con el adenocarcinoma de pulmón singeneico LP07 (3x105 células) se trataron in vivo con una dosis de 10 μM de Indo en el agua de beber. El tratamiento inhibió la acumulación de CMS en el tumor y en órganos linfáticos secundarios producida durante la progresión tumoral, inhibió la actividad supresora de las CMS esplénicas sobre la respuesta linfocitaria a un aloantígeno e inhibió el crecimiento tumoral en un ensayo de transferencia adoptiva, p<0.001. En línea con estos resultados, observamos la misma actividad en las CMS cuando se trataron in vitro con Indo (10 μM) en presencia de medio condicionado de células LP07, simulando el microambiente tumoral. Sin embargo, en ausencia del microambiente tumoral, la administración de Indo generó un aumento en la capacidad supresora (MLR; p< 0.05) y pro-tumoral (transferencia adoptiva, p<0.01) de las CMS. Además, las CMS de ratones normales tratadas con Indo en ausencia del microambiente tumoral suprimieron el desarrollo de la encefalomielitis aguda experimental (EAE), un modelo de esclerosis múltiple en ratones C57BL/6, mientras que las CMS tumorales tratadas con Indo aumentaron la severidad de los síntomas e impidieron su resolución (p<0.05). Analizando los mecanismos de inmunosupresión, Indo redujo la actividad arginasa (4,794 vs 2,077 μg urea/ mg total proteína, p<0.001) y la producción de óxido nítrico (9.2 vs 4.4 μM; P<0,05) y de especies reactivas de oxígeno (124 vs 87 MFI P<0.05) en CMS tumorales pero no en CMS normales. Este estudio revela el rol dual de un agente antiinflamatorio en el control de una población celular regulatoria con implicancias críticas en cáncer y en desórdenes autoinmunes.