Descripción: Fil: Vecchione, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Introducción. El HIV es el agente causal del SIDA. Entender las formas en las que evade la respuesta inmune del hospedador es crítico para el desarrollo racional de una vacuna efectiva. Aunque la amplia extensión del tratamiento antirretroviral es capaz de impactar significativamente en los procesos naturales de selección y escape, pocos trabajos han estudiado esta temática. El objetivo de esta tesis fue identificar aquellas regiones virales sometidas a presión de selección inmune y evaluar el impacto del tratamiento antirretroviral en su selección y persistencia. Metodología y resultados. Mediante análisis estadístico se identificaron 12 mutaciones virales asociadas a escape inmune, 6 de ellas en regiones no caracterizadas previamente como epítopes. El análisis de secuencias obtenidas en los últimos 20 años de epidemia sugirió que varias de ellas han incrementado su frecuencia hasta estar presentes en la mayoría de las cepas virales actuales. La evaluación de la respuesta inmune péptido específica mostró reconocimiento principalmente de dos péptidos con restricción para el alelo HLA A02 (A02P65 y A02P84), uno para el alelo HLA A03 (A03P28) y uno para el alelo HLA B07 (B07P357). Para los dos últimos y para A02P65 se demostró que la variante de escape disminuía el reconocimiento por la respuesta inmune mientras que, para todos los casos, se evidenció la capacidad de inducir una respuesta polifuncional secretora tanto de IFN como de IL 2 y MIP 1 . Se evaluó también el nivel de agotamiento inmune y, aunque la técnica de tetrámeros presentó varios inconvenientes, se detectó una mayoría de respuesta no exhausta en los casos exitosos. La secuenciación del gen viral gag mostró la presencia de escape viral en la mayoría de los epítopes analizados y sugirió que la positividad de la respuesta inmunológica estaba asociada a una mayor afinidad del epítope por el alelo HLA que lo presenta. Al mismo tiempo, el análisis de secuencia de dicho gen viral en muestras repetidas de 50 pacientes separadas por un promedio de 3 años, demostró la presencia de recambio activo de variantes virales hacia el estado de escape durante el período de muestreo. Se encontró también que la selección activa resulta menos frecuente en los pacientes bajo tratamiento y el análisis del virus en dichos pacientes sugirió que esto sería debido a una reducción significativa de la capacidad evolutiva del virus en el contexto del tratamiento altamente efectivo. Finalmente, un análisis filogenético más profundo de las secuencias estudiadas permitió datar el inicio de la epidemia del HIV 1 en Argentina en la primera mitad de la década de 1970. Conclusiones. El presente trabajo de tesis permitió caracterizar regiones de la proteína viral Gag de frecuente reconocimiento inmune sobre las cepas del HIV 1 circulantes en nuestra región y caracterizar su dinámica a nivel poblacional a lo largo de veinte años de epidemia. El conjunto de datos obtenido de los ensayos inmunológicos confirma la aproximación estadística para identificar sitios de reconocimiento inmune demostrando respuestas citotóxicas polifuncionales mientras que el estudio de muestras seriadas en pacientes, la mayoría de ellos en estados clínicos avanzados, sugiere que la selección del escape viral se extiende más allá de los primeros momentos de la infección. En este sentido, el inicio del tratamiento puede tener un beneficio adicional al prevenir dicho escape por reducción significativa de la evolución viral.

Descripción: El virus de la hepatitis C y el HIV comparten las mismas vías de transmisión, lo que conlleva a una elevada tasa de coinfección. En este escenario, la tasa de respuesta al peg-IFN+RBV es más baja que en pacientes monoinfectados con HCV. El objetivo central de este trabajo fue estudiar si diferentes proteínas del HCV, estructurales (E2) y no estructurales del HCV (NS5A), son capaces de interrumpir las acciones antivirales desencadenadas por el IFN, contribuyendo hacia una respuesta disminuida a la terapia. El genotipo de HCV implicado en la infección denotó una prevalencia elevada del 1a así como un crecimiento del 4. Ambos son conocidos por su baja tasa de respuesta al IFN. Se encontró una relación temporal en la introducción en Argentina del genotipo 1a del HCV y el subtipo BF de HIV. La glicoproteína E2 no dio evidencia de rol alguno en la respuesta al tratamiento. Dominios definidos de la proteína NS5A arrojaron resultados encontrados dependiendo de la población bajo estudio. La co-presencia de HIV no parece impactar en la génesis de variantes de escape de HCV, ni modificar la composición de cuasiespecies. No obstante el HCV tendría capacidad replicativa en sitios extrahepáticos aunque las variantes virales halladas en células mononucleares de sangre periférica no exhibieron diferencias con las presentes en plasma. La menor respuesta al tratamiento con peg-IFN+RBV en la coinfección guardaría relación con la mayor presencia de genotipos 1a y 4. La proteína NS5A podría contribuir en tal sentido. Es necesario analizar el rol que desempeñan factores inherentes al hospedador.

Descripción: Un desafío importante para el desarrollo de vacunas frente a infecciones adquiridas por víade mucosas es poder inducir una respuesta inmune local, con el fin de evitar la diseminación delpatógeno al resto del organismo. Actualmente, el esquema de inmunización utilizado ampliamenteen ensayos clínicos para HIV, y otros patógenos para los cuales se requiere inducir una respuestainmune celular específica, es el denominado “prime-boost” que consiste en la utilización de distintosvectores vacunales durante la inmunización tales como los vectores de ADN recombinantes yaquellos basados en el virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). En este trabajo de tesis doctoral se utilizó un esquema ADN-prime/MVA-boost por ruta demucosas, donde ambos vectores expresan la glicoproteína de envoltura de HIV y se analizó elefecto adyuvante de ADN-IL-12 con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) en ratones BALB/ccon el fin de potenciar la respuesta inmune específica frente al HIV a nivel sistémico y de la mucosadel tracto genital. Los resultados obtenidos demostraron que esta combinación de adyuvantesmejoró la respuesta inmune celular no sólo a nivel sistémico, sino también en ganglios drenantes dela mucosa genito-rectal, y más importante aún, en el tracto genital, observándose un incremento enla magnitud, amplitud y calidad de la respuesta. En conclusión, la combinación de los adyuvantes ADN-IL-12 + CTB podría serpotencialmente utilizada como adyuvantes de mucosas en vacunas ADN/MVA, no sólo paraantígenos de HIV sino también para otras enfermedades infecciosas con impacto en mucosas.

Descripción: El estudio de la variabilidad viral es importante para entender la patogenia, laevolución y la epidemiología del HIV. Esta tesis aborda la variabilidad del HIVdesde diversos ángulos. Uno de ellos fue la caracterización molecular del HIV-1 enciudades con corrientes migratorias importantes como Buenos Aires. San Petersburgo y Estocolmo. Se demostró que estas corrientes introdujeron subtiposdel HIV-1 que no circulaban previamente y la existencia de un nuevo subtipo del HIV-1, conocido actualmente como subtipo J. Se caracterizaron cadenasepidemiológicas de transmisión de la infección determinando que lasrecombinantes virales son frecuentes y transmisibles por vía horizontal y vertical,lo que constituye un hecho de importancia epidemiológica. La presencia derecombinantes virales motivó el desarrollo de un método para buscar posiblessitios de recombinación genómica y otro filogenético que toma en cuenta el eventode recombinación, importante en la evolución de HIV.Además se demostró que lahipermutación G—>A está restringida por la estabilidad del ARN viral. Además del HIV-1 se estudió el HIV-2 y se confirmó el predominio del subtipo A en Guinea Bissau. La carga proviral y el recuento de linfocitos T CD4+ resultaronmarcadores del estadio de la infección con HIV-2 similar a lo que ocurre con HIV-1. Existe relación entre el genotipo y el fenotipo viral ya que aislamientos "rapid/high" presentaron aminoácidos positivos con patrones similares al HIV-1. Por otra parte se estudió la contribución del ADN viral extracromosómica a lavariabilidad genética in vitro e in vivo resultando que una linea celularpersistentemente infectada con HIV-1 puede ser sobre infectada por otra variantecuyo ADN se localiza en la fracción extracromosómica y se dispersa sólo porcontacto célula a célula. In vivo el ADN viral extracromosómico contribuye a lavariabilidad genética en la población viral de individuos infectados con el HIV-1. En conclusión, aquí se discuten algunos aspectos acerca de la variabilidadgenética del HIV desde los puntos de vista molecular, evolutivo y epidemiológico. Además la tesis sugiere posteriores estudios particularmente en los temas derecombinación y sobreinfección para enriquecer el conocimiento sobre lavariabilidad del HIV.

Descripción: En los últimos años, se ha puesto especial énfasis en el estudio de la respuesta T CD8+ dadoel rol central que esta juega en el control de la replicación del virus de la inmunodeficienciahumana (HIV, human immunodeficiency virus). Sin embargo sigue siendo clave laidentificación y compresión de nuevos correlatos inmune de protección. Más aún, la etapade infección aguda representa un escenario propicio para el estudio de las funciones quemejor se correlacionan con control viral. El objetivo de esta tesis fue analizar laespecificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ HIV-específica en unacohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el control de lareplicación viral y de la progresión a la enfermedad (evaluado mediante la carga viral,recuento de células T CD4+ y activación inmune), durante la seroconversión y el primer añode infección. Se obtuvieron muestras de sangre de 51 individuos reclutados dentro de losprimeros 6 meses desde la fecha probable de infección (PHI, Primary HIV infection); 22sujetos crónicamente infectados (Crónicos) y 14 sujetos controladores elite (EC, Elite Controllers). Se observó que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV durante lainfección aguda/temprana, la aparición temprana de una alta proporción de células T anti- Gag se correlacionó con un retraso en la progresión. Las células T CD8+ HIV-específicaspolifuncionales fueron detectadas en tiempos tempranos post-infección pero no se asociaroncon control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos PHI que presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar actividad antiviral (VIA, viral inhibitory activity),en la muestra basal, presentaron set points inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, lascélulas T CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis de célulasinfectadas (lo cual se evidenció por una mayor capacidad de degranulación) y de producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja para ejercer su actividadantiviral. Por otro lado, se observó que la distribución de las subpoblaciones de memoria delas células T CD8+, tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en losindividuos PHI, pero no alcanza los niveles dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la expresión de PD-1 en los individuos PHI, tanto en las células T CD8+ totalescomo HIV-específicas, reveló no sólo una asociación con progresión a la enfermedad si notambién con el perfil de memoria de la población celular T CD8+. Notablemente, seobtuvieron correlaciones directas entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+con fenotipo terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección. Enconsecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la ruta de diferenciaciónde las células T CD8+ y la funcionalidad de las mismas. Esta tesis representa el primer trabajo donde se realizó una caracterización completa de larespuesta T CD8+ en una cohorte Argentina de individuos cursando la infecciónaguda/temprana por HIV. El poder descifrar la relación que existe entre la característicasque definen a las células T CD8+ con los niveles de activación inmune, el control viral y laprogresión a la enfermedad en los distintos estadíos de la infección (como son la infecciónprimaria, crónica o en EC), como ha sido llevado a cabo en esta tesis, es primordial paraprofundizar en el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus. Además,esta información es de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategiasterapéuticas frente al HIV así como en el diseño y posterior testeo de vacunas quepromuevan una respuesta beneficiosa.

Descripción: Las subpoblaciones de linfocitos Th17 y T regulatorios (Treg) han sido relacionados conla progresión a enfermedad en el contexto de la infección por HIV-1. Sin embargo, surelación con la respuesta adaptativa T CD8+ antiviral durante la infección aguda/tempranapor HIV (PHI, primary HIV infection) no ha sido aún estudiada. En este contexto, el primerobjetivo general de este trabajo de tesis consistió en analizar las subpoblaciones Th17 y Treg y su relación con la respuesta celular T CD8+ específica frente a HIV y parámetros deseguimiento de la infección durante la infección aguda/temprana y hasta un año postinfección (p.i). Para ello se utilizaron muestras de sangre de 14 dadores sanos (DSs), 40 PHI, 17 Crónicos y 13 controladores elite (ECs, Elite Controllers). Los porcentajes de células Th17 y Treg se encontraban severamente alterados en individuos Crónicos, mientras quetodos los pacientes infectados con HIV evidenciaron un desbalance Th17/Treg comparadoscon DSs (incluso ECs), en concordancia con sus mayores proporciones de células T CD8+activadas (HLA-DR+/CD38+). Un mejor estatus clínico (evidenciado por mayores recuentosde células T CD4+ y menores cargas virales y activación inmune) se asoció con mayoresniveles de Th17 y menores niveles de Treg. Notablemente, se encontraron correlacionespositivas entre los niveles basales de Th17 y la funcionalidad de la respuesta T CD8+específica frente a HIV: la capacidad de suprimir la replicación viral (VIA, viral inhibitoryactivity) y la proporción de células polifuncionales (IFN-γ+/CD107A/B +) tanto a tiempostempranos como tardíos p.i, resaltando el valor pronóstico de la subpoblación Th17 en lapreservación de una inmunidad celular antiviral más eficiente. La relación Th17/Treg y laintensidad media de fluorescencia relativa (IMFr) de IL-17 también se correlacionaronpositivamente con VIA. Debido a la importancia del tratamiento antirretroviral (TARV) en la reconstitucióninmune de individuos infectados, a continuación se decidió caracterizar las subpoblaciones Th17, Treg y su balance en sangre periférica y mucosa cervical y su implicancia en lainmunopatogénesis de HIV-1 en ausencia o presencia de TARV. Para ello se utilizaronmuestras de 19 individuos TARV+ (más de 2 años con supresión efectiva de la CV), 22pacientes crónicamente infectados naïve de tratamiento (TARV-) y 20 DSs. Tras eltratamiento, tanto la frecuencia de Th17 como la relación Th17/Treg en periferia alcanzaronvalores similares a los observados en DSs, en contraste a lo observado en células Tregcuyos niveles se mantuvieron altos. Asimismo, en individuos TARV+ se observó unadisminución de los niveles de activación inmune a pesar de lo cual no se alcanzaron valoresnormales, hallándose correlaciones negativas entre los niveles de activación celular y elbalance Th17/Treg. Por otro lado, mayores niveles de la citoquina proinflamatoria IL-1β enexocervix se correlacionaron positivamente con los niveles de activación celular periféricos,sugiriendo que existiría una relación entre los niveles de inflamación sistémicos y loobservado en sitios de mucosas. Es importante destacar que el tratamiento no indujo unincremento de los recuentos de células T CD4+ CD161+ (subpoblación de células precursorasde Th17 que migran a intestino) los cuales resultaron significativamente menores a losobservados en DSs. Asimismo, al estudiar el patrón de secreción de citoquinas por parte decélulas mononucleares de cérvix (CMCs) estimuladas, se observó que las CMCs provenientesde individuos TARV+ secretan menores niveles de IL-17A e IL-10 en relación a las de DSs. En conjunto, los resultados de la presente tesis sugieren, por un lado, la existencia deuna potencial relación entre la subpoblación Th17 y el balance Th17/Treg con respuestas T CD8+ HIV-específicas que juegan un rol clave en la contención de la infección. Por otro lado,aunque el tratamiento antirretroviral parece tener un impacto positivo sobre la restauraciónde las funciones inmunes a nivel sistémico, tanto los niveles de precursores de células Th17que migran a intestino como la secreción de IL-17A e IL-10 por CMCs no alcanzaron valoresnormales, sugiriendo que en sitios de mucosas la restauración inmune es incompleta.

Descripción: La Tuberculosis representa el principal agente de mortalidad a nivel mundial en pacientesinfectados con el HIV-1. Ambas infecciones conllevan a una desregulación de los ejesinmune y adrenal que influirán en el desarrollo de las correctas respuestas frente a lospatógenos. Así, investigamos la subpoblacion de LT CD4+CD25-FoxP3+ (uTreg, LTreg “noconvencionales”) en pacientes co infectados con tuberculosis activa (HIV-TB), en individuos HIV+ con TB latente (HIV-TBL), en individuos HIV+ sin TB y en dadores sanos (DS). Enprimer lugar se comparó la expresión de CD39, PD1, GITR y el estado de maduración (CD27/CD45RA) de las células uTreg entre los distintos grupos de estudio. Los pacientes HIV-TB mostraron menores niveles de expresión de CD39 y mayores de PD1 que los DS,así como un estado de maduración alterado con respecto a los demás grupos. Más aun, seobservaron menores niveles de CD39 y mayores de PD1 en células uTreg de pacientes HIV-TB y DS, al compararse con la expresión en LT CD4+CD25+FoxP3+ (cTreg). Ademásla población uTreg mostro mayores frecuencias de la subpoblacionTreg EM, así como unacapacidad de producción de IFN-γ incrementada respecto de cTreg, en ambos grupos epacientes. Luego, evaluamos una cohorte de pacientes HIV-TB durante el transcurso del tratamientoanti tuberculoso (TaT), analizando parámetros endocrinos e inmunológicos. De esta formase observaron valores disminuidos de DHEA-s al incio del TaT con respecto a lasconcentraciones presentadas por DS, que se normalizaron a través del tiempo. Además,esto se vio acompañado por un aumento en la frecuencia de células productoras de IFN-γ Mtb específicas, y por una disminución del número de células uTreg hasta alcanzar losvalores presentes en DS. Finalmente, al analizar citoquinas asociadas a inflamación, seobservaron niveles incrementados al inicio del TaT, que luego de seis meses retornaron avalores normales. Por último, se investigó la respuesta Mtb especifica de linfocitos T CD4+de pacientes HIV-TB y DS, caracterizando la producción de IFN-γ y TNF-α, su distribuciónmemoria/efectora, y la modulación por parte de DHEA sobre la respuesta y la maduraciónde LT. En principio se observó que el agregado de DHEA no logro modular la respuesta antígeno especifica ni en HIV-TB ni en DS. Por otro lado, se encontró una disminución decélulas Naive y un aumento de LT EM en el grupo HIV-TB. Además, al evaluar laproducción de citoquinas de cada subpoblacion de memoria, los DS presentaron mayoresniveles de IFN-γ/TNF-α en las LT EM, mientras en HIV-TB todas las poblacionespresentaron niveles similares de producción de dichas citoquinas. La adición de DHEAmoduló la producción de citoquinas en los LT CM de DS y logró disminuir las diferenciasexistentes en la distribución memoria/efectora observadas en los LT CD4 Mtbespecíficosentre los HIV-TB y DS. El conjunto de resultados demuestran que la población uTreg a pesar de presentardiferencias en el fenotipo, el grado de maduración y en su capacidad de producir IFN-γ,posee una acción supresora similar a la de las células cTreg. Además, el trabajo permiteevidenciar que el TaT logro normalizar parámetros endocrinos e inmunes a lo largo de 6meses de terapia. Por último, se consiguió discriminar la producción de citoquinas Th1 paradistintas subpoblaciones de Memoria en el contexto de la coinfeccion, y sugerir un rolmodulador de DHEA sobre la diferenciación de las células antígeno específicas.

Descripción: El objetivo general de esta tesis fue aportar conocimiento sobre las infecciones de transmisión sexual (ITS) en poblaciones de alta vulnerabilidad y en las que la información era casi inexistente como son los hombres trabajadores sexuales (HTS) y trans (travestis, transexuales o transgénero, hombre a mujer) trabajadoras sexuales (TTS). La incidencia de HIV fue mayor en TTS que en HTS (10,7 y 2,3 por 100 personas-año, respectivamente). Las TTS (N= 273) mostraron una prevalencia significativamente mayor que los HTS (N= 114) de HIV (34,1 vs. 11,4%), HBV (40,2 vs. 22,0%) y Treponema pallidum (50,4 vs. 20,4%). Las prevalencias de HCV y HTLV-1/2 no fueron significativamente diferentes entre TTS y HTS (HCV: 4,5 y 6,1%; HTLV-1/2: 1,8 y 1,0%, respectivamente). Las variantes de HIV más frecuentes fueron el subtipo B y la recombinante BF. En el caso de HBV, se detectó una muestra de genotipo F, dos muestras de genotipo A y una de genotipo C. Respecto al HCV, se detectaron cinco muestras con genotipo 1, tres con genotipo 3 y tres con genotipo 4. Además, en un grupo de TTS fue posible determinar la prevalencia de HPV y Chlamydia trachomatis y sus variantes. Las TTS resultaron positivas para HPV en 111/114 casos y para C. trachomatis en 5/113 casos. Los genotipos más frecuentes de HPV fueron el 16, 42, 81 y 58 (el primero y el último de alto riesgo oncogénico). En las muestras positivas para C. trachomatis se detectaron dos con genotipo D, una con genotipo E y una con genotipo L2 correspondiente a linfogranuloma venéreo. La alta prevalencia de ITS y la alta incidencia de HIV demuestran la gran vulnerabilidad de estas poblaciones e indican la urgente necesidad de implementar estrategias preventivas y de facilitar el acceso a programas de salud para las mismas