Descripción: Fil: Kauffman, Marcelo Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La habilidad para recordar eventos pasados es esencial para numerosos comportamientos adaptativos. La evocación de la memoria es un proceso complejo que involucra la reactivación de la información previamente adquirida desde un estado latente a un estado que permite su expresión. Entender cómo la información guardada en el cerebro se expresa es una pregunta central de la neurobiología de la memoria. Sin embargo, la información sobre mecanismos moleculares que subyacen la evocación, incluyendo el requerimiento de síntesis proteica, es escasa y fragmentaria. El complejo mTORC1, un regulador clave de la síntesis proteica, ha sido implicado en procesos de plasticidad sináptica y su requerimiento ha sido reportado para la formación de la memoria. Utilizando la tarea de evitación inhibitoria (EI), evaluamos el rol de mTORC1 en la evocación de la memoria de largo término. La infusión de rapamicina, un inhibidor selectivo de mTORC1, en el hipocampo dorsal 15 o 40 minutos, pero no 3 horas antes del testeo realizado a 24 horas bloqueó reversiblemente la expresión de la memoria incluso en animales que previamente habían expresado memoria. La infusión de emetina, un inhibidor general de la síntesis proteica, provocó un bloqueo similar de la expresión de la memoria. La inhibición de mTORC1 no interfirió con la expresión de una memoria de corto término y en cambio, sí afectó una memoria de largo término testeada a los 7 o 14 días, pero no a los 28 días. El bloqueo de la vía de mTORC1 en la corteza retrosplenial, otra estructura involucrada en la memoria de la tarea de EI también bloqueó la retención de la memoria. Además, la infusión de rapamicina afectó la evocación de una memoria asociada a una tarea con distinta valencia, como el reconocimiento espacial de objetos. Luego, teniendo en cuenta estos resultados, decidimos evaluar los potenciales mecanismos a través de los cuales la vía de mTORC1 participa en la evocación de la memoria. Considerando que mTORC1 es necesario durante la consolidación para incrementar los niveles de la subunidad GluA1 de los receptores AMPA en la sinapsis, primero evaluamos si existían mecanismos similares subyacentes a la evocación de la memoria. La infusión intrahipocampal de oligonucleoótidos antisentido para GluA1, pero no de oligonucleótidos sin sentido para GluA1 3 horas del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento de la tarea de EI bloqueó la expresión de la memoria. El mismo resultado fue obtenido luego de la infusión de oligonucleótidos antisentido para GluA2 3 horas antes del testeo, evidenciando el requerimiento tanto de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA para la evocación de la memoria. Este bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la infusión de los oligonucleótidos antisentido para GluA2 pudo ser revertido por la infusión de GluA23ɣ, un péptido que interfiere selectivamente con la endocitosis de los receptores AMPA, 1 hora antes del testeo llevado a cabo a las 48 horas posteriores al entrenamiento. Luego repetimos este experimento de doble infusión para GluA1(infusión de los oligonucleótidos antisentido de GluA1 3 horas previas al testeo seguido por infusión del péptido 1 hora antes del testeo llevado a cabo 48 horas luego del entrenamiento) pero esta vez el bloqueo de la endocitosis no fue suficiente para compensar la inhibición de la síntesis de GluA1. Después decidimos estudiar el rol del tráfico de las subunidades GluA de los receptores AMPA durante la evocación de la memoria y su relación con la vía de mTORC1.Para ello realizamos un experimento de doble infusión intrahipocampal en el cual primero realizamos una infusión del péptido GluA23ɣ 1 hora antes del testeo en la tarea de EI, seguida por una infusión de rapamicina 30 minutos antes del testeo que se llevó a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento. Observamos que en este caso GluA23ɣ previno el bloqueo de la expresión de la memoria inducido por la inactivación de la vía de mTORC1. En resumen, nuestro trabajo indica que tanto la síntesis de novo de la subunidad GluA1 como de la subunidad GluA2 de los receptores AMPA es requerida para la evocación de la memoria y sugiere que la vía de mTORC1 podría regular el tráfico de los receptores AMPA durante la evocación. Finalmente, testeamos si la inactivación de la vía de mTORC1 afecta los niveles de las subunidades GluA1 y GluA2 de los receptores AMPA usando Western Blot. Realizamos experimentos en lo que infundimos vehículo o rapamicina a los animales 30 minutos antes del testeo llevado a cabo 48 horas posteriores al entrenamiento en la tarea de EI y se extrajo el hipocampo inmediatamente después de la evocación. Evaluando la fracción de densidad postsinátptica, enriquecida en membrana postsináptica, encontramos un aumento en los niveles de GluA2 y una caída de GluA1. En la fracción correspondiente a los sitios extrasinápticos (SPM) no encontramos cambios para GluA2 mientras que la caída en los niveles de GluA1 se mantuvo. Para el homogenato total no encontramos cambios en los niveles de expresión de ninguna de estas subunidades. Nuestros resultados apoyan la idea de que la síntesis proteica mediada por la activación de la vía de mTORC1 es necesaria para la evocación de la memoria de largo término. Además, nuestros hallazgos apuntan a mTORC1 como un regulador clave de la evocación de la memoria que impacta en la expresión de diferentes subunidades de los receptores AMPA.

Descripción: Modificaciones dependientes de actividad en los circuitos neurales han sidoampliamente reportadas. En particular, la experiencia modifica la sobrevida, eldesarrollo y la conectividad de las células granulares (CGs) nacidas en el hipocampoadulto; sin embargo, los mecanismos que median este fenómeno son poco conocidos. En esta tesis investigamos el remodelado de los microcircuitos del giro dentado (GD)en ratones expuestos a un ambiente enriquecido (AE). Una breve exposición a un AEen una ventana de tiempo restringida durante el desarrollo de la nuevas CGs acelerósu integración funcional, y este efecto correlacionó con un GD mas activo. Esaintegración funcional incrementada fue mimetizada por una activación quimiogenéticain vivo de un pool de CGs maduras. Por técnicas de optogenética y electrofisiología ex vivo encontramos que las CGs maduras reclutan a las interneuronas parvalbumina (INs-PV), que a su vez contactan a las CGs en desarrollo. En concordancia, la estimulación quimiogenética de INs-PV o la despolarización directa de las CGs en desarrollo aceleró la integración funcional, mientras que la inactivación de las INs-PV previno los efectos del AE. Nuestros resultados revelan un mecanismo de remodelado dinámico por el cual la experiencia activa el circuito del GD, lo que determina una maduración acelerada de las CGs jóvenes a través un loop disináptico de feedback mediado por las INs-PV.

Descripción: El objetivo general de la tesis es estudiar cómo las células granulares (GC) del giro dentado (DG) del hipocampo procesan la información aferente y cómo cambia el procesamiento en presencia de neuromoduladores, enfocándonos particularmente en la neuromodulación colinérgica. Las GC comprenden una población heterogénea de neuronas, debido a la existencia de neurogénesis adulta. Las neuronas inmaduras que nacen en el hipocampo adulto procesan los estímulos aferentes de manera diferencial, siendo más excitables, más susceptibles a producir plasticidad a largo plazo (LTP) y capaces de responder a un rango más alto de frecuencias en comparación con las neuronas maduras. Ambas poblaciones de neuronas podrían entonces codificar distintos aspectos de la información aferente. Sin embargo, estas diferencias en el procesamiento podrían no ser fijas sino adaptarse ante distintos requerimientos comportamentales o estados del circuito. El hipocampo recibe, además de las aferencias provenientes de la corteza entorhinal (EC) que conforman el circuito canónico del hipocampo, proyecciones neuromodulatorias. En particular, la neuromodulación colinérgica está implicada en la navegación espacial, el aprendizaje de nuevas memorias episódicas y la atención. Nuestra hipótesis es que las capacidades de procesamiento pueden adaptarse según distintos estados neuromodulatorios. Empleando técnicas tanto farmacológicas como optogenéticas combinadas con electrofisiología demostramos que la Ach es capaz de reconfigurar las propiedades de procesamiento de información aferente en el DG, en particular actuando fuertemente sobre la población de neuronas maduras. El estado neuromodulatorio colinérgico favorece la activación de las GC frente a estímulos aferentes y permite la codificación de frecuencias más altas. El mecanismo circuital involucra la reconfiguración de los circuitos inhibitorios, modificando la contribución relativa de distintas subpoblaciones de neuronas inhibitorias que da como resultado la desinhibición de las GC. Como consecuencia de esta desinhibición, la activación coincidente de la vía aferente proveniente de la EC y la vía colinérgica proveniente del septum produce una potenciación a largo término. Estos fenómenos podrían ser cruciales para la formación de nuevas memorias. Los resultados de esta tesis aportan al entendimiento de los mecanismos que utiliza el sistema nervioso para reconfigurar los circuitos y puede contribuir a comprender cómo los animales adaptan el procesamiento cerebral según el estado comportamental en el que se encuentran.

Descripción: El hipocampo es una estructura del cerebro mamífero que juega un rol clave en la formación de memorias nuevas y mapas cognitivos. Recibe aferencias provenientes de la corteza entorrinal que llegan al giro dentado, la región de entrada al hipocampo, y contactan con las neuronas principales, las células granulares (GCs, del inglés Granule Cells). El giro dentado es una de las dos áreas del cerebro en donde ocurre la neurogénesis adulta. Las GCs que nacen en el adulto atraviesan un proceso de maduración de alrededor de 8 semanas en donde gradualmente cambian sus propiedades eléctricas intrínsecas y de conectividad. De este modo, el agregado continuo de neuronas en el giro dentado incrementa y estructura la variabilidad en la población. Una de las funciones asociadas al giro dentado del hipocampo, en la cual las GCs inmaduras tienen un rol, es la de separación de patrones, un procesamiento que involucra incrementar las diferencias entre patrones de actividad aferente similares. Nuestra hipótesis es que la heterogeneidad en las propiedades intrínsecas de las GCs de distintas edades que introduce la neurogénesis, resulta beneficiosa para la codificación y discriminación de estímulos realizada por la población, contribuyendo de esta manera a la función del giro dentado. Para explorar esta hipótesis, en esta tesis nos planteamos los siguiente objetivos: Estudiar la influencia de las propiedades intrínsecas de las GCs de distintas edades madurativas en la codificación de estímulos. Caracterizar la transformación estímulo-respuesta que realizan las GCs de distintas edades mediante modelos estadísticos. Decodificar estímulos empleando estos modelos estadísticos para revelar el impacto de la edad de las GCs en la representación de los mismos. Determinar cómo la heterogeneidad en una población de GCs contribuye a una tarea de discriminacion de estímulos. Para esto, empleamos un abordaje multidisciplinario combinando experimentos de electrofisiología en rodajas de hipocampo, herramientas de análisis de series temporales, conceptos de teoría de la información y modelos estadísticos. Con el fin de estudiar diferencias en la codificación de estímulos, realizamos experimentos de patch-clamp en GCs de distintas edades marcadas fluorescentemente en ratones transgénicos. Inyectamos corrientes de estimulación fluctuantes, al mismo tiempo que registramos la respuesta de voltaje y potenciales de acción. Este tipo de estímulos fluctuantes que producen respuestas fiables y con una estructura temporal rica, permitieron un análisis profundo de la estructura de las respuestas y la influencia de las propiedades intrínsecas. Hallamos que las GCs inmaduras producen respuestas más variables que las maduras, exhibiendo tiempos de disparo imprecisos y menos alineados con los estímulos. Luego, ajustamos modelos estadísticos que capturan el potencial de membrana subumbral y las respuestas de disparos de las GCs, obteniendo parámetros que reflejan las diferencias madurativas y sugieren que las GCs inmaduras realizan una codificación de estímulos diferente. Nuestro análisis indica que las GCs inmaduras tienen constantes temporales más largas, que contribuyen a hacer su respuesta más variable, y efectos refractarios de menor magnitud. A continuación, utilizamos los modelos de las GCs obtenidos para realizar la decodificación de estímulos y evaluar la influencia de la edad en su codificación. Reconstruyendo estímulos a partir de un conjunto dado de respuestas de GCs, evaluamos la calidad de las representaciones estimando el error en la reconstrucción y la información mútua. Realizando la decodificación con GCs individuales, encontramos que tanto la reconstrucción del estímulo como la información mútua mejoran con la edad madurativa de la GC. Estudiamos también la codificación realizada por poblaciones de GCs y la influencia de la heterogeneidad en las edades de la población. Inesperadamente, a pesar de la calidad inferior de las representaciones de las GCs inmaduras estudiadas individualmente, encontramos que la presencia de GCs inmaduras en una población mejora la fidelidad de la señal codificada. Por último, dado el rol del giro dentado en la separación de patrones, nos preguntamos si esta mejora en la representación podría contribuir a la discriminacion de estímulos similares. Entonces, dise~namos una tarea que consistió en discriminar entre estímulos correlacionados fluctuantes en el tiempo y encontramos que la heterogeneidad de edades madurativas en las poblaciones ayudan a esta discriminación. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan al entendimiento de posibles mecanismos por los cuales las GCs del giro dentado contribuyen al procesamiento de información. Encontramos que las GCs inmaduras introducen un grado de heterogeneidad en la población que puede ser aprovechado para realizar una mejor representación de los estímulos aferentes y, a la vez, discriminarlos mejor. En un contexto más general, los resultados de esta tesis muestran que la heterogeneidad en las propiedades intrínsecas de las neuronas de una población puede cumplir un rol importante en la plasticidad de la representación de estímulos asociados a la función cerebral.

Descripción: Durante el desarrollo prenatal los organismos son vulnerables a factores que puedenafectar su homeostasis. Ha sido demostrado que el estrés durante la preñez tieneefectos en la descendencia que pueden perdurar hasta la adultez, afectandonumerosos procesos fisiológicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún nohan sido completamente dilucidados. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación del óxido nítrico (NO) en lasalteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal (EP). Se observó un incremento en el comportamiento de tipo ansiogénico y un peordesempeño en una tarea de aprendizaje asociativo en machos EP que revirtióparcialmente con un dador de NO. Se detectó una disminución de la óxido nítrico sintasa (NOS) en el hipocampo demachos adultos, mientras que en las hembras no se encontraron cambios. En elhipotálamo se observó un incremento en nNOS en hembras EP, mientras que en losmachos no se observaron cambios. La exposición a estrés agudo en la adultez estimulóel incremento de corticosterona en plasma, que revirtió más lentamente en losmachos EP que en los controles. En las hembras, la recuperación fue más rápida en las EP que en controles. El tratamiento con un dador de NO atenuó la respuesta al estrésen ambos grupos de hembras y en los machos EP, pero no en los controles, en los quefacilitó la reversión. El tratamiento con un inhibidor de nNOS anuló en todos los gruposla reversión de la corticosterona a niveles basales luego del estrés agudo. Por lo tanto,la señalización mediada por NO estaría involucrada en las alteraciones conductuales yneuroendócrinas descriptas en este modelo.

Descripción: El aprendizaje y la memoria espacial son factores claves para la adaptación y supervivencia de los animales en el ambiente. A pesar de que en los últimos años se ha avanzado mucho en el estudio de las bases neurales que sustentan la navegación espacial en mamíferos, poco se sabe acerca de estas capacidades y sus circuitos asociados en otros vertebrados. El estudio comparado de las bases neurales del comportamiento de percepción y orientación espacial pueden ayudar en la comprensión de la evolución de estos mecanismos básicos compartidos. En esta tesis se presentan algunos de los primeros datos obtenidos acerca de las habilidades de navegación espacial usando la geometría del ambiente, claves visuales y de sonido en una especie de anfibio anuro, el sapo terrestre sudamericano Rhinella arenarum. Estos resultados se acompañan de un análisis anatómico-descriptivo de las áreas paliales y subpaliales del telencéfalo en esta especie, así como de los efectos de lesiones cerebrales en la formación hipocampal y la activación cerebral de genes tempranos asociada al comportamiento de navegación. Los estudios de navegación por geometría en sapos se complementan con un estudio en otra especie de vertebrado, la paloma Columba livia, con el objeto de analizar el comportamiento en forma comparada.

Descripción: Conocer los mecanismos que subyacen a la memoria se ha vuelto un tema central de estudio en las neurociencias de las últimas décadas. En todo momento adquirimos información proveniente de distintas experiencias y nuestros recuerdos pueden ser influenciados por los eventos que experimentamos. Es necesario identificar qué fenómenos, y de qué manera, colaboran o interfieren con la adquisición, el guardado y la evocación de la información. Para que una información sea guardada por largo término, requiere de un proceso de estabilización denominado consolidación. Este proceso depende de la síntesis de proteínas necesarias para el refuerzo de la traza mnésica, y la hipótesis del etiquetado conductual (EC) postula que también es necesario el establecimiento de una marca en el sustrato neuronal activado por el aprendizaje, a dónde las proteínas puedan ser selectivamente utilizadas para mantener la plasticidad que subyace a la memoria (Moncada y Viola, 2007). Partiendo de una vasta literatura acerca de los efectos modulatorios del estrés sobre los procesos de memoria, este trabajo contribuye al conocimiento sobre cómo un evento de estrés agudo, asociado temporalmente a una tarea de aprendizaje, influye en la consolidación de memorias dependientes de hipocampo. Los resultados revelan que los efectos pueden ser tanto beneficiosos como perjudiciales y apoyan la hipótesis del EC como mecanismo subyacente a la formación de memorias de largo plazo (MLT). De acuerdo con la EC, algunos eventos pueden tener influencia sobre memorias asociadas al proveer proteínas relacionadas con la plasticidad (PRPs) o al competir por ellas. La asociación de estas PRPs con la marca neuronal o “etiqueta” inducida por el aprendizaje es un factor decisivo en la consolidación de la MLT. Inicialmente, estudiamos la interacción entre una situación de estrés agudo y una tarea de reconocimiento espacial de objetos (REO) en roedores. Demostramos que un entrenamiento débil en este paradigma, capaz de inducir memoria de corto término (MCT) pero no de largo plazo, puede dar origen a una MLT si una situación de estrés (plataforma elevada, PE) ocurre dentro de unaventana de tiempo crítica posterior al aprendizaje de REO. Este fenómeno depende de síntesis de proteínas inducidas por el estrés, de BDNF y de la activación de los receptores de gluco y mineralocorticoides. En las ocasiones en que la situación de estrés fue anterior al aprendizaje, ni la formación ni la promoción de la MLT fue observada, por lo cual sugerimos que el estrés podría estar afectando el establecimiento de la etiqueta inducida por el aprendizaje de REO. También demostramos que cuando el entrenamiento de REO es lo suficientemente fuerte como para generar per se MLT, un evento de estrés post‐ aprendizaje perjudica la memoria. Nuestros experimentos apoyan que este efecto podría ser debido a una competencia por las proteínas disponibles. Luego evaluamos en roedores si el estrés tiene efectos sobre la memoria de otra tarea, como parte de nuestro objetivo de investigar si existen reglas generales que rijan la formación de MLTs. Para ello utilizamos el paradigma de evitación inhibitoria (EI) y demostramos que el estrés tiene un efecto promnésico dentro de una ventana de tiempo acotada (en este caso cuando es previo a la tarea), que es dependiente de la síntesis de proteínas y de la activación de los receptores de glucocorticoides. A su vez, el estrés tiene efectos perjudiciales sobre la MLT de EI inducida por un aprendizaje fuerte. Por último, planteamos una transferencia del modelo al estudio de la memoria en humanos. Nos preguntamos si un fenómeno similar a lo observado en roedores ocurre en el ámbito escolar, es decir si una situación de estrés es relevante para el aprendizaje y la memoria dentro del aula. Utilizamos la Figura de Rey‐Osterrieth como protocolo para evaluar una memoria grafica y demostramos, nuevamente, que los efectos de un evento de estrés (examen curricular) cercano en el tiempo pueden ser tanto benéficos como perjudiciales. Cuando los estudiantes expresaron una memoria más débil de la figura, observamos que un examen dentro de una ventana de tiempo especifica luego del mismo, mejora la memoria gráfica evaluada. En cambio, cuando los estudiantes expresaron una memoria más fuerte, un examen tanto antes como después, tuvo efectos perjudiciales sobre la MLT de la figura. Nuestros hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre el impacto del estrés en la formación de una MLT, tanto en roedores como en seres humanos, y apoyan la hipótesis del EC como mecanismo subyacente a la formación de MLTs. Los resultados en el ámbito escolar, además, alertan a los educadores a considerar los efectos de un examen en el aprendizaje de otros contenidos dictados el mismo día dentro del aula.

Descripción: La neurogénesis adulta en mamíferos produce continuamente células granulares (GC) que se integran a los circuitos del giro dentado del hipocampo. Si bien se ha demostrado la importancia de la neurogénesis adulta en procesos de aprendizaje y memoria espacial, la función de las GC nuevas es aún incierta. El objetivo de esta tesis es comprender cómo las GC generadas en el adulto contribuyen con la función del hipocampo, analizando qué capacidades de procesamiento le proveen al circuito. Las GC nacidas en el adulto maduran sus propiedades intrínsecas y sus conexiones sinápticas, alcanzando características indistinguibles de las de las GC nacidas durante el desarrollo. Por lo tanto, proponemos que es durante el proceso de maduración que las GC generadas en el adulto le proveen capacidades de procesamiento particulares al hipocampo, aportando a su función. Para poner a prueba nuestra hipótesis, estudiamos cómo los inputs provenientes de la corteza entorrinal son procesados por GC nuevas inmaduras de cuatro semanas de edad (4wpiGC) y las GC maduras generadas en el desarrollo (matGC). Se utilizó la inyección hipocampal de retrovirus para expresar proteínas fluorescentes en las GC generadas en el adulto y, luego de cuatro semanas, se obtuvieron rodajas agudas del hipocampo de los ratones inyectados. Mediante imágenes de calcio y electrofisiología, analizamos tres aspectos de la capacidad de procesamiento de información: En primer lugar, estudiamos el reclutamiento de las 4wpiGC y las matGC frente a la estimulación de la vía perforante medial (MPP), la principal aferencia al giro dentado. Observamos que las 4wpiGC se activan con estímulos más débiles que las matGC, constituyendo una población de neuronas con mayor excitabilidad. Estas diferencias están generadas por un mayor balance excitación/inhibición de las corrientes evocadas en las 4wpiGC, dado por una inhibición menor y más lenta en comparación con las matGC. En segundo lugar, analizamos la habilidad de las GC de integrar o separar dos inputs de la MPP. Los resultados muestran que hay un mayor porcentaje de 4wpiGC que de matGC que responde frente a la estimulación de dos inputs independientes, lo cual sugiere que las 4wpiGC son más integradoras y las matGC, más selectivas. Esta característica de las 4wpiGC es transitoria, dado que cuando las GC nacidas en el adulto maduran se comportan como las matGC, nacidas durante el desarrollo. Por último, estudiamos la capacidad de las GC de decodificar información temporal. Estimulando la MPP con trenes de pulsos a distintas frecuencias, observamos una mayor activación de las 4wpiGC a todas las frecuencias estudiadas, si bien tanto las 4wpiGC como las matGC se comportan como filtros pasa bajos. Los circuitos inhibitorios son los principales responsables de las diferencias observadas en la activación, tanto entre 4wpiGC y matGC, como entre las frecuencias. Concluimos que la neurogénesis adulta le provee al hipocampo de poblaciones de GC inmaduras que presentan capacidades de procesamiento únicas. La inhibición surge como un mecanismo que genera heterogeneidad de respuestas en las poblaciones de GC del giro dentado.

Descripción: La presente tesis es un estudio de las estrategias, los fenómenos y las bases neurales del aprendizaje espacial en el sapo común Bufo arenarum. El análisis de las estrategias de aprendizaje espacial demuestra que estos animales son capaces de orientarse utilizando tanto una estrategia de guía (mediante el uso de claves visuales ambientales) como una estrategia de giro (tomando como referencia su propio cuerpo). Además, que esta última estrategia es la predominante si las claves ambientales brindan información contradictoria. También se pudo determinar la presencia de cuatro fenómenos del aprendizaje: el efecto de la distancia de la clave visual al refuerzo, el bloqueo y el ensombrecimiento entre claves y la inhibición latente. Estos fenómenos fueron ampliamente descriptos en otras clases de vertebrados, y por primera vez observados en anfibios en este trabajo. Al explorar las bases neurales de este tipo de aprendizaje, se pudo establecer el papel fundamental del pallium medial (área homóloga al hipocampo) para la orientación en el espacio, tanto mediante el uso de claves visuales como mediante el uso de la estrategia de giro. Estos resultados revelan que el hipocampo de los mamíferos y el pallium medial de los anfibios no tienen una equivalencia funcional completa.

Descripción: En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

Descripción: La radioterapia es un tratamiento utilizado en humanos como herramientapara eliminar células tumorales mediante el uso de radiaciones ionizantes; sinembargo, éstas también puede dañar tejidos sanos debido a la inducción de estrésoxidativo. Dada la alta radiosensibilidad del Sistema Nervioso Central en desarrollo, elobjetivo del presente trabajo fue profundizar en el estudio de sus efectos sobre elhipocampo de animales jóvenes expuestos en el período neonatal. Más aún, el esclarecimiento del mecanismo de acción de la radiaciónionizante podría permitir proponer intervenciones terapéuticas que prevengan susefectos, siendo el 17β-estradiol una herramienta ideal por poseer múltiplesmecanismos de acción neuroprotectora. Los resultados encontrados sugieren que los cambios observados en lamemoria asociativa a P30 se deberían a modificaciones en el hipocampo a nivelmolecular e histológico, siendo el sistema GABAérgico uno de los componentesafectados. Asimismo, la expresión de estas alteraciones en el animal joven ocurriríadebido a cambios en la PKCβ1 a P15. Por otro lado, el tratamiento con estradiol fue capaz de prevenir la mayoríade los cambios inducidos por la radiación, permitiendo postular que ejercería suacción neuroprotectora tanto a través de un mecanismo antioxidante como de unomediado por receptor. Por consiguiente, la vulnerabilidad del hipocampo frente alas radiaciones ionizantes podría prevenirse mediante el uso de fármacos queactúen mediante mecanismos semejantes al estradiol.

Descripción: El NO es una molécula altamente difusible y reactiva producida en el sistema nerviosoque actúa como mensajero neuronal y participa en procesos fisiológicos y patológicos. El NOmodula la actividad de numerosos receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Enparticular, los GABAARs pueden ser modulados por agentes rédox y por NO, aunque los efectosy mecanismos de este último no están claros. En esta tesis, caracterizamos los efectos del NO sobre GABAρ1Rs expresados de formaheteróloga y estudiamos la actividad de los GABAARs fásicos y tónicos de células piramidalesen rebanadas de hipocampo con distintos niveles de NO. Los receptores homoméricos GABAρ1 se expresaron en ovocitos de Xenopus laevis, ylas respuestas evocadas por GABA se registraron electrofisiológicamente, en presencia yausencia de donantes de NO. Las respuestas se potenciaron significativamente por el NO deforma rápida, reversible y dosis-dependiente. El bloqueo químico de las cisteínas mediantereactivos selectivos para sulfhidrilos previno la potenciación por NO, indicando que lascisteínas participan de la modulación. Cada subunidad ρ1 tiene solo tres cisteínas, las dosextracelulares que forman el cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364). El reemplazopor alanina de la C364 no modificó los efectos del NO sobre el receptor, lo que sugiere que el NO potencia los GABAρ1Rs a través de una interacción con el cys-loop extracelular. Por otra parte, en rebanadas de hipocampo, se realizaron registros con la técnica depatch-clamp en configuración célula entera, y se estudiaron los efectos del NO sobre los GABAARs. Las corrientes fásicas se registraron aplicando puffs de GABA y, las corrientestónicas se midieron analizando la IH antes y después de la aplicación de bicuculina (BIM). Elnivel de NO se incrementó por la aplicación de donantes de NO y se disminuyó bloqueando laproducción de la NOS. El incremento en los niveles de NO no modificó significativamente laactividad de los GABAARs. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de NO endógeno potenció lacorriente GABAérgica tónica y la evocada por puffs de GABA. Estos resultados indican que los efectos del NO sobre los GABAARs son dependientesde la subunidad y sugieren que las acciones del NO en el hipocampo estarían en parte mediadaspor la modulación de la actividad inhibitoria.

Descripción: Un punto de vista predominante en la ciencia moderna de la memoria es que los recuerdos son inicialmente frágiles, pero se vuelven más estables con el tiempo. A pesar de que la persistencia es una característica fundamental en el almacenamiento de la memoria, su mecanismo se encuentra escasamente caracterizado. Para comprender los procesos que subyacen a la memoria de largo término (MLT) debemos entender cómo es que las trazas de memoria persisten a lo largo del tiempo, a pesar de la vida media corta y de la alta velocidad de recambio de sus sustratos moleculares. En este trabajo, mostramos que la MLT de evitación inhibitoria duradera pero no la que dura más allá de 2-3 días, depende de la expresión tardía de c-Fos en el hipocampo y en la corteza retrosplenial. Por otra parte, la inhibición de la transcripción en el hipocampo 24 h luego del entrenamiento afecta la persistencia, pero no la formación de la MLT. No obstante, la inhibición de la transcripción en la corteza retrosplenial impide la formación de la memoria. Además, mostramos que los requerimientos de traducción en la corteza retrosplenial alrededor del entrenamiento, en la formación de la memoria, y tardíamente luego del entrenamiento, en la persistencia de la memoria, son similares a los vistos en el hipocampo. Estos hallazgos indican que una fase de transcripción y traducción tardía son esencial para el mantenimiento de una traza de memoria inducida por miedo. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de la existencia de rondas recurrentes de eventos como la consolidación, que ocurren luego del aprendizaje en el hipocampo y corteza retrosplenial para mantener las memorias.

Descripción: Resumen PARTE I - En la primera parte de esta Tesis se investigaron los efectos de ciertos factores biológicos y experimentales sobre la formación de memorias en la rata, analizando su desempeño en la evitación inhibitoria (IA) y en un campo abierto (OF). La tarea de IA de un choque eléctrico en un paso, involucra aprendizaje asociativo y es uno de los paradigmas con componentes aversivos más utilizados en estudios sobre memoria y aprendizaje, especialmente en roedores; es dependiente de hipocampo y otras estructuras. Se investigaron los efectos de la intensidad del estímulo, de la manipulación sistemática desde el destete, del ciclo luz/oscuridad, posibles diferencias entre machos y hembras, así como la influencia de una experiencia previa de exposición y habituación a otro ambiente, sobre el desempeño de ratas en IA. - No hubo diferencias significativas en el desempeño entre hembras y machos. Los animales con manipulación sistemática, entrenados en IA con estimulación “fuerte”, tuvieron mejor desempeño que aquellos sin manipulación; hubo correlación entre la intensidad del estímulo durante el entrenamiento en IA y la expresión de la memoria de larga duración (LTM), mientras que no la hubo en los grupos sin manipulación sistemática. El estímulo para evidenciar aprendizaje fue menor para hembras que para machos de la misma edad, y permitió la expresión tanto de LTM como de una memoria de corta duración (STM) de IA. - Una exposición al OF de 3 o 5 min, no modificó el desempeño en IA cuando el entrenamiento fue suave. Los animales expuestos 2 veces al OF en días consecutivos, mostraron habituación. La exposición a 1 o 2 OF – es decir, con o sin habituación - no produjo cambios en la LTM de la IA con entrenamiento suave. En cambio, 2 OF facilitaron la memoria de IA con entrenamiento fuerte. - El efecto del OF sobre la IA parece depender del nivel de entrenamiento, lo que sugiere que la relevancia comportamental del estímulo podría ser determinante. Se puede especular que un choque más intenso - más doloroso y, en consecuencia, más aversivo -, sería muy relevante para el comportamiento ya que produciría una estimulación sensorial mayor, con la posibilidad de establecer más asociaciones y más fuertes; se reclutarían más circuitos neurales de la misma región en el substrato previamente “sembrado” por el OF, y tal vez de otras áreas cerebrales, induciendo cambios plásticos en más sinapsis, dando lugar a un registro robusto de esa memoria. Desde un enfoque evolutivo, podría representar menos costo el que una experiencia poco o nada aversiva (OF) se asociara fuertemente con una aversiva (IA/choque), sólo cuando esta última fuera comportamentalmente relevante (por ej., produciendo fuerte dolor o daño). Resumen PARTE II - La transmisión muscarínica es requerida tanto durante la adquisición como durante la consolidación temprana para la formación de una LTM de IA, ya que el bloqueo de los receptores muscarínicos (RAChM) extendido o restringido al hipocampo dorsal produce amnesia. El bloqueo de los receptores de glutamato NMDA (RNMDA) del hipocampo durante la consolidación también produce amnesia. - Se analizó el efecto del bloqueo de receptores RNMDA y RAChM en la memoria de la IA luego de: 1) exposición única al OF - novedad - y 2) exploración de un ambiente familiar - 2 OF - ; ambas condiciones posibilitaron la formación de una LTM a pesar del bloqueo extendido de RAChM o de RAChM del hipocampo. La doble exposición al OF también permitió prevenir o superar la amnesia por bloqueo de los RNMDA del hipocampo así como por la inhibición de la síntesis proteica. Durante y luego de la exploración y reexposición al OF se produce un incremento sostenido en la liberación de acetilcolina en hipocampo y corteza, lo que podría contribuir a “preparar el substrato” (aumento de excitabilidad?) para la necesaria plasticidad sináptica que daría lugar a la LTM. Por este y otros mecanismos podría haber disminución del umbral para la inducción de cambios plásticos subyacentes a la formación de la traza, su codificación y consolidación en una LTM. En el marco de la hipótesis de “Etiquetado sináptico y captura de proteínas de plasticidad”, se puede interpretar que dichas proteínas sintetizadas durante el OF previo a la IA facilitarían la plasticidad sináptica en la misma estructura; sin embargo, la inhibición de la síntesis proteica por administración de anisomicina en hipocampo, antes o después del OF previo, que produjo amnesia anterógrada en IA aún cuando se administró 2 horas antes del entrenamiento, también fue superada por la previa exposición al OF, lo que sugiere fuertemente que otra región o estructura debería estar involucrada en este efecto. - También se analizó el rol de subtipos de RNMDA del hipocampo en la consolidación temprana de la memoria de IA. Se ha propuesto que los RNMDA que contienen la subunidad NR2B tiene un papel crítico en determinar el umbral de la plasticidad en el establecimiento de una memoria. El bloqueo selectivo de estos receptores ejerció un efecto promotor en la consolidación de LTM de la IA con entrenamiento subumbral, y facilitador cuando el entrenamiento fue suave. Los resultados corroboran que los RNMDA del hipocampo dorsal son requeridos durante la consolidación de IA, aunque aquellos conteniendo NR2B se comportan como inhibidores durante la consolidación, al menos en etapas tempranas.

Descripción: La permanencia de la mayoría de las neuronas durante toda la vida del organismo necesaria para mantener sus funciones, y el hecho de que estas células no se dividan luego del desarrollo sugieren que, durante la evolución, se ha ejercido una fuerte presión sobre el sistema nervioso de modo de desarrollar diversos mecanismos que lo protejan contra la muerte celular. Las dramáticas consecuencias de la neurodegeneración enfatizan la importancia de estos mecanismos que promueven la supervivencia y plasticidad neuronal. Por lo tanto, la identificación de los factores implicados en la regulación de la homeostasis y supervivencia neuronal es imprescindible para comprender el desarrollo y establecimiento de las enfermedades neurodegenerativas y para el diseño de una terapia racional para su tratamiento. La expresión temprana y extensa de p19INK4d, un miembro de la familia INK4 de inhibidores del ciclo celular, en el cerebro y su participación en la reparación del DNA y en la apoptosis sostienen la hipótesis de que esta proteína participaría en mecanismos de protección de las neuronas frente a la muerte celular. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar el potencial rol de p19 en este sentido, así como también su mecanismo de activación. Se utilizaron células SH-SY5Y diferenciadas con ácido trans-retinoico como modelo neuronal y cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata. Los tratamientos con genotóxicos como el péptido β-amiloide o neocarzinostatina indujeron la expresión y fosforilación de la proteína de p19. Ambos efectos fueron dependientes de la movilización de calcio intracelular, ya que la incubación con el ionóforo de calcio A23187 o con una concentración aumentada de potasio, recapitularon la acción de los genotóxicos sobre p19. La inhibición de la actividad de CDK5 o la incubación con calpeptina, un inhibidor de la calpaína, responsable de la proteólisis de p35, subunidad regulatoria de CDK5, a p25, su forma más activa, causaron la inhibición de la fosforilación de p19 en respuesta a genotóxicos, demostrando que la quinasa CDK5 es la enzima efectora de dicha fosforilación. Se establecería un balance entre la síntesis y degradación de la proteína p19, ya que la misma parecería ser un sustrato de la calpaína, proteasa que se activa en presencia de los genotóxicos mencionados. Por otro lado, el factor de transcripción E2F1 participaría en la inducción de la expresión de p19 frente al péptido β-amiloide. Las células neuronales con sobrexpresión inducida de p19 repararon más eficientemente el DNA dañado y mostraron niveles reducidos de muerte celular en respuesta al tratamiento con el péptido β-amiloide o neocarzinostatina. Resultados opuestos se obtuvieron en células deficientes en esta proteína. La presencia de los genotóxicos también produjo la inducción del gen de p19 en neuronas de hipocampo. Estas células con niveles disminuidos de p19 presentaron una menor eficiencia en la reparación del DNA y un mayor grado de apoptosis luego del tratamiento con los genotóxicos. La presencia de p19 influenció la sensibilidad neuronal a largo plazo y confirió resistencia al estrés neurotóxico. Ensayos in vivo llevados a cabo en el hipocampo del ratón mostraron que en ausencia de p19 existía un mayor porcentaje de células dañadas luego de la inyección de neocarzinostatina. De esta forma, los resultados obtenidos en esta tesis nos permiten hablar de p19 como un factor neuroprotector, implicado no sólo en los mecanismos de reparación del DNA en respuesta al estrés genotóxico exógeno, sino también en la resistencia y en la supervivencia de las neuronas en respuesta a procesos endógenos que conducen a la neurodegeneración.

Descripción: Este trabajo se centró en estudiar la participación del receptor NMDA del hipocampo dorsal en la formación de memorias de larga duración en la rata. Para ello se intentó modificar la expresión de la subunidad esencial NR1 del receptor NMDA, construyendo vectores amplicón portadores de la secuencia NR1, en dirección sentido o antisentido. Los vectores fueron competentes, tanto in vitro como in vivo, para transducir y expresar los transgenes. La inyección de vectores portadores del transgén NR1 antisentido en hipocampo dorsal de ratas adultas, produjo disminución de la proteína NR1 y déficits en aprendizaje/memoria en dos paradigmas comportamentales: habituación a un ambiente y evitación inhibitoria. Se caracterizó tipo y número de células infectadas por los vectores en el cerebro. La disminución de NR1 en neuronas piramidales de CA1, con la consecuente disminución del receptor, sería responsable del déficit comportamental. Se concluye que la subunidad NR1 del hipocampo dorsal estaría implicada directamente en el registro de eventos necesarios para ambas tareas y que la alteración del receptor NMDA en una pequeña fracción de neuronas piramidales de CA1, sería suficiente para producir las alteraciones cognitivas observadas. Podría ser que las neuronas implicadas en plasticidad sináptica fuesen más susceptibles a la disminución del receptor, o que no existiera el alto nivel de redundancia postulado para los circuitos hipocampales; entonces, se requeriría cierto nivel de expresión/disponibilidad de NR1 en la mayoría de las neuronas de CA1, para formar memorias duraderas. En relación con la técnica de RT-PCR, se encontró un fenómeno de síntesis basal de ADNc en la reacción de RT, a partir del ARNm de un gen, y que no requiere del agregado de primers.

Descripción: NF-kappa B es un factor de transcripción cuya activación es necesaria para laconsolidación de la memoria a largo plazo en varias especies. Este factor de transcripciónse activa y se transloca al núcleo de las células en una ventana temporal específica durantela consolidación. NF-kappa B tiene una amplia distribución en el sistema nervioso, con unafuerte presencia en dendritas y terminales sinápticas. Esta tesis se centra en la activación,localización y dinámica de NF-kappa B en tareas de aprendizaje que se adquieren con unsolo ensayo, la evitación inhibitoria (IA) y una tarea adquirida en el mismo contexto pero designo opuesto. Los ratones son entrenados de dos modos diferentes; ya sea recibiendo o no unestímulo eléctrico al entrar en un compartimiento oscuro (aversivo con choque eléctrico vs.apetitivo sin choque). Cuarenta y ocho horas después el desempeño de los animales esevaluado. Durante la sesión de evaluación, las latencias de entrada al compartimientooscuro (independientemente del tipo de entrenamiento) fueron significativamente diferentesal día de entrenamiento y a las latencias de un grupo control que en el día delentrenamiento recibe un choque no relacionado con el contexto. Además, la actividadnuclear de NF-kappa B se vió aumentada durante la consolidación de ambas tareascomparando con animales control y naïve. La inhibición de NF-kappa B con sulfasalazinainyectada en el hipocampo, amígdala o el núcleo accumbens inmediatamente luego delentrenamiento produjo un deterioro en la retención de la memoria en ambas versiones de latarea. Los resultados sugieren que en ratón, NF-kappa B es un paso molecular crítico endiferentes áreas del cerebro para la consolidación de la memoria de largo término en unatarea de evitación inhibitoria y en una versión “apetitiva” de la misma. La activación de este factor de transcripción en el núcleo de las células delhipocampo ha sido descrita a exhaustivamente. La presencia del factor de transcripción enla sinapsis nos llevó a investigar un posible rol local en la sinapsis, activación y dinámica eneste sitio. En este trabajo se describen los cambios en la localización sináptica de NF-kappa B y de su actividad, durante la consolidación de la memoria a largo plazo, tanto de la tareaaversiva como apetitiva asociada al IA. La comparación de la actividad sinaptosomal ynuclear de NF-kappa B indican diferentes dinámicas para ambas localizaciones. Además,se identifican dos fracciones de NF-kappa B sinaptosomal, una que se obtiene soluble en elcontenido sinaptosomal (fracción libre) y la otra se encuentra fuertemente unida a lasmembranas sinaptosomales. Durante las primeras etapas de la consolidación la fracciónlibre se activa, la fracción asociada a membrana aumenta mientras que la cantidad de lafracción libre disminuye. Estos resultados sugieren que la activación sináptica de NF-kappa B y su translocación a membranas son parte de la consolidación de la memoria a largoplazo en ratones. Existen evidencias que demuestran que NF-kappa B se activa a través de laactividad del receptor de NMDA. Tomando en cuenta este dato se apuntó a disociar la señaleléctrica que llega al núcleo de la señal de transducción molecular local en la sinapsis paraestudiar la función sináptica local del NF-kappa B. Para abordar este objetivo se trabajó conpéptidos que impiden la interacción de PSD-95 (proteína de andamiaje postsináptico) con elreceptor de NMDA. En este trabajo se muestra que la inyección intra-hipocampo de estepéptido interfiere de forma reversible con la consolidación de la memoria de Evitación Inhibitoria (IA). Los resultados presentados en esta tesis aportan datos cruciales para entender lafunción sináptica local del NF-kappa B durante la consolidación de la memoria, tanto paralas tareas de aprendizaje aversivas como apetitivas.

Descripción: La atenuación en la señalización del sistema endocannabinoide está correlacionada con el desarrollo de trastornos psiquiátricos. En el presente trabajo se evaluó el comportamiento relacionado con la ansiedad y depresión en ratones con deficiencia del receptor cannabinoide tipo 1 (CB1R) y se analizo en el hipocampo componentes del sistema serotoninergico, la morfología neuronal y la proliferación celular adulta. Asimismo, se estudió el efecto de la modulación farmacológica aguda del CB1R y del CB2R sobre el comportamiento de ratones wild type. Los ratones heterocigotas tienen un comportamiento normal; mientras que los ratones knock-out para el CB1R (CB1R-/-) presentan un fenotipo ansioso y características asociadas a la depresión. El hipocampo de ratones CB1R-/- presenta menor inervación serotoninergica, aumento del receptor 5-HT1A, menor arborización dendritica, cambios en la estructura sináptica y reducción en la proliferación celular; registrándose además una menor síntesis de serotonina en los núcleos del rafe. La inactivación aguda del CB1R produce un efecto ansiolítico y antidepresivo y la modulación del CB2R produce un efecto ansiolítico cuando es activado y un efecto depresor cuando es bloqueado. El conocimiento de los efectos que produce la deficiencia del CB1R permiten comprender mejor el rol modulador de este receptor y plantear posibles acciones terapéuticas [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].