Descripción: El Cofactor II de la Heparina (HCII) es un inhibidor fisiológico del sistema de coagulación,miembro de la familia de serpinas. Inhibe específicamente trombina, una enzima clave del sistemahemostático. La capacidad del HCII de inhibir trombina es potenciada mas de 1000 veces por lapresencia de glicosaminoglicano el Dermatán Sulfato (DS),. Aún no está claramente definido el papel que desempeña el HCII en la fisiología de la Hemostasia, postulándose su deficiencia corno leve factor de riesgo de trombosis. Los objetivos de este trabajo fueron: a) Identificar y caracterizar el HCII plasmático. b) Investigar in vitro la interacción HCII - trombina - Dermatán Sulfato, así como la posibleacción de proteínas moduladoras de esta interacción. C) Estudiar la respuesta fisiopatológica de este inhibidor, ante estímulos de distinta magnitudde activación del sistema de coagulación. (Sépsis, injuria térmica, hemodiálisis, etc.). Los estudios electroforéticos (SDS-PAGE / Western Blot) del HCII revelaron quefisiológicamente un porcentaje de este inhibidor circula unido a una proteína plasmática, elfibrinógeno. La investigación in vitro de la interacción HCII-trombina-DS en concentraciones plasmáticasreveló que el HCII inhibe más eficazmente pequeñas (hasta 30 nM) que grandes concentracionesde trombina humana. La presencia de fibrinógeno en los ensayos in vitro, disminuye en un 45% la capacidadantitrombínica del HCII, sugiriendo la existencia de una interacción HCII-fibrinógeno observada enlos estudios electroforéticos de plasmas. La modulación del fibrinógeno sería tiempo, concentración y temperatura dependientes. Lo cualconcuerda con los estudios electroforéticos. La determinación de los valores de referencia de actividad y antigenicidad del HCII establecióun rango de : actividad 75 - 120% ; antigenicidad: 70 - 130%. El nivel de actividad de HCII de embarazadas con más de 30 semanas de gestación fue de 108 (88 - 160)%, presentando niveles de actividad de Dermatán Sulfato en circulación 1,15 (0 - 3,7)µg/ml. En pacientes quemados se determinó niveles de actividad de HCII ligeramente disminuídos 81 (75-95)%, que se mantuvieron durante los siete días estudiados. La actividad de DS fue 0,5 (0-1,3)µg/ml. Pacientes en hemodiálisis presentaron leve disminución en los niveles de actividad de HCII 83,0 (60 - 105) %, detectándose actividad de DS en circulación 0,31 (0 - 1,5) µg/ml. El descenso de la actividad de HCII en pacientes sépticos fue marcado 29 (15-120) %. Losniveles elevados de DS alcanzaron valores de hasta 3,4 µg/ml [1,9 (0,004 - 3,4) µg/ml]. La anticoagulación con dicumarínicos y heparina no fraccionada no modificansignificativamente los niveles de HCII (91 ± 6,9 % y 94,8 ± 6,5 % respectivamente). Pacientes con hiperhomocisteinemia niveles de HCII dentro del rango de referencia 95 (60 - 115)% y niveles de actividad de Dermatán Sulfato 1.8 (0-2,9) µg/ml, que si bien son elevados nodifieren significativamente del grupo control de edad.

Descripción: El aborto espontáneo es una de las complicaciones más frecuentes durante el embarazo, siendo las infecciones bacterianas una de sus principales causas. Se ha postulado además, una estrecha asociación entre el aborto y el sistema endocannabinoide (SEC). En un modelo murino estudiamos la participación del SEC en los mecanismos involucrados en la reabsorción embrionaria (RE) inducida por el lipopolisacárido bacteriano (LPS). Demostramos, utilizando explantos uterinos de ratones preñados, que LPS induce apoptosis, mediado en parte por el SEC y el sistema nitrérgico. En tal sentido, LPS induce un aumento en la nitración de las proteínas y la co-incubación con un secuestrador de peroxinitritos disminuye los niveles de apoptosis. Mediante la utilización de herramientas farmacológicas y ratones transgénicos (CB1-/-), demostramos que el tratamiento con LPS disminuye los niveles intracelulares de AMPc y este efecto estaría mediado por el SEC. Más aun, el LPS estimula la síntesis de la prostaglandina implicada en las contracciones uterinas (PGF2α), y el aumento del AMPc inducido por el tratamiento con Forskolina previno este efecto. Por último, con el fin de brindar mayores herramientas farmacológicas para el tratamiento del aborto temprano inducido por infecciones, se probó si la heparina es capaz de revertir los efectos del LPS, demostrándose una disminución de la apoptosis inducida. La heparina se encontraría modulando indirectamente los efectos de LPS sobre el SEC, al inducir un aumento en la actividad de la enzima FAAH, principal enzima del catabolismo de la anandamida, el endocannabinoide más abundante en el útero. Este trabajo postula las bases moleculares involucradas en la reabsorción embrionaria inducida por el LPS y la participación del SEC en dicho proceso.

Descripción: Se estudió el efecto de los mastocitos (MC), la heparina y heparinas sin actividadanticoagulante sobre el desarrollo tumoral. Empleando el fluorocromo tris (2,2’-bipiridina)rutenio (II), que se une a los grupos sulfatos de la heparina, se realizó la identificacióncitoquímica de MC de cavidad peritoneal y se cuantificó comparativamente el contenido deheparina de los gránulos de MC de ratones portadores de tumor (MCP) y de ratones normales (MCN) mediante análisis de imagen. Los MCN que poseen el doble de heparina que los MCPinhibieron la proliferación in vitro y la incidencia tumoral in vivo de un adenocarcinomamamario murino de moderada capacidad metastásica en pulmón (M3). Observamos que las células M3 poseen receptores para heparina de alta afinidad, a los quepueden también unirse una heparina parcialmente N-desulfatada N-Acetilada (N-des N-Ac). Ambas heparinas inhibieron la proliferación de las células tumorales in vitro e incrementaron laadhesión celular mientras que otras heparinas modificadas (parcialmente O-desulfatada (Odes), N-desulfatada (N-des), O/N-desulfatada N-Acetilada (O/N-des N-Ac)) no se unen a losreceptores y no tuvieron efecto sobre la proliferación y la adhesión. Estos resultados muestranque la unión de la heparina a los receptores se correlaciona con el efecto antiproliferativo y elaumento de la adhesión celular. Solamente la heparina inhibió la formación de metástasisexperimentales en pulmón, siendo el efecto revertido por un inhibidor selectivo del activadorde plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) (el compuesto B623). Para determinar elmecanismo por el cual la heparina posee efecto antimetastásico se estudió: a) el efectofibrinolítico de las heparinas mediado por uPA; b) la actividad procoagulante de ratonesportadores de tumor y el efecto de las heparinas en la coagulación y c) la producción deactividad heparinasa por parte de las células tumorales M3 y la susceptibilidad de las heparinasa ser degradadas por esta enzima. El análisis global de los resultados sugiere que el efectoantimetastásico se asocia a la actividad anticoagulante.

Descripción: A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetadaprincipalmente por protaminas en lugar de histonas. Las cisteínas presentes en las protaminas formanpuentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad yresistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta elsitio de fecundación. Luego que el espermatozoide penetra el oocito es imprescindible que se produzcala descondensación de su cromatina para que se reemplacen las protaminas espermáticas por histonasoocitarias. La descondensación de la cromatina involucra dos eventos: se deben reducir los puentesdisulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesosserían el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) oocitarios. Cuando este proceso decondensación de la cromatina, que ocurre durante la espermatogénesis para mantener la integridad delespermatozoide, se ve afectado por diversas causas, puede resultar en fallas de la descondensación quese evidencian una vez que el oocito es penetrado. Por otro lado, es sabido que la exposición a tóxicosambientales puede provocar efectos deletéreos sobre la calidad de los espermatozoides y la fertilidadmasculina. Las técnicas de reproducción asistida han podido resolver problemas de motilidad, defectosespermáticos, concentración de gametas muy reducida en el fluido seminal (oligozoospermia) perotodavía no pueden solucionar los defectos de la descondensación del núcleo espermático dentro deloocito. Esto pone en evidencia la importancia del proceso de descondensación, que no puede serreemplazado por las técnicas de reproducción asistida, y permite pensar en utilizarlo como un posibleindicador del efecto de disruptores endocrinos, tanto in vivo como in vitro. Los objetivos de esta tesisfueron (1) avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina deespermatozoides, así como también en su (2) rol como posible bioindicador de efectos deletéreoscausados por tóxicos ambientales o ingeridos, tales como el alcohol y el plaguicida endosulfán. Enprimer lugar, fue posible caracterizar el sistema de descondensación in vitro en el modelo de ratón alcoincubar los espermatozoides con distintos glicosaminoglicanos y GSH, determinándose de estamanera las moléculas candidatas a ser posibles agentes descondensantes, las concentraciones y tiemposóptimos de incubación. Como consecuencia de esto, fue posible detectar un efecto sinérgico existenteentre la heparina (utilizada como equivalente molecular del heparán sulfato) y el dermatán sulfato, losúnicos glicosaminoglicanos estudiados con potencial capacidad descondensante. El efecto de estos dosglicosaminoglicanos también fue evaluado mediante la técnica de microscopia electrónica detransmisión, la cual puso en evidencia los cambios sufridos por los espermatozoides durante el procesode descondensación. Una vez caracterizado el sistema, se logró evidenciar el aumento de ladescondensación in vitro que ocurre cuando se incuban los espermatozoides con endosulfán o etanol,como también luego de la ingesta de etanol. Además, fue posible evaluar el efecto del plaguicida sobrela fragmentación del ADN, así como también si existe alguna correlación entre la misma y ladescondensación de la cromatina. Los efectos del etanol observados in vitro fueron confirmados enexperimentos in vivo, en los cuales se intoxicaron ratones macho para realizar experimentos defecundación in vitro. Estos son los primeros resultados obtenidos descondensando in vitro en presenciade heparina y GSH, espermatozoides previamente incubados con endosulfán o etanol, que ponen demanifiesto que este ensayo podría utilizarse como centinela para evaluar posibles efectos de tóxicosambientales o ingeridos.

Descripción: Nuestro laboratorio estudia la descondensación nuclear del espermatozoide humano in vitro, intentando ahondar en la comprensión de las etapas del proceso y las moléculas involucradas en el mismo. La descondensación requiere la reducción de puentes disulfuro en las protaminas y la remoción de las mismas para ser reemplazadas por histonas ovocitarias. Los espermatozoides humanos pueden descondensarse in vitro con heparina y glutatión. Observamos en estudios previos que el heparán sulfato (HS), análogo estructural de la heparina, pero no así otros glicosaminoglicanos, presenta actividad descondensante in vitro similar a la heparina y propusimos que HS actuaría in vivo como aceptor de protaminas. El presente trabajo tuvo como objetivos (1) acercarse a las condiciones in vivo analizando el comportamiento de núcleos aislados frente a la descondensación con heparina y glutatión in vitro y (2) demostrar que HS está presente en el ovocito y podría funcionar como agente descondensante. Se utilizaron espermatozoides de donantes normospérmicos (OMS) y ovocitos de ratón. Los núcleos espermáticos aislados descondensaron con glutatión y heparán sulfato o heparina pero no con otros glicosaminoglicanos. El análisis por microscopía confocal reveló localización de HS en el citoplasma y el espacio perivitelino del ovocito. La utilización de enzimas específicas indicó que la capacidad descondensante del ovocito podía atribuirse a la presencia de HS. Estas son las primeras evidencias de la presencia de HS en el ovocito y de su posible rol como aceptor de protaminas durante la descondensación del espermatozoide humano in vivo.

Descripción: El espermatozoide humano transita por diferentes estadios desde que es formado en el testículo: madura en el epidídimo, es eyaculado e ingresa dentro del tracto reproductor femenino donde ocurrirá el proceso de capacitación espermática. El Heparán Sulfato (HS) es una molécula que se encuentra presente en el humano tanto en el complejo cumulus-oocito(COC) como en el espermatozoide y, por su parte, el espermatozoide contiene receptores para heparina (análogo funcional y estructural del HS). También está presente en el fluido folicular y en el fluido oviductal/trompas de Falopio, donde podría participar en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto/trompas de Falopio. Esta distribución ubicua del HS plantea, por un lado, la posible colaboración de ambos gametos en el proceso de descondensación espermática in vivo y, por otro, la posible participación del HS en otras etapas del proceso reproductivo. Varios glicosaminoglicanos fueron encontrados como mediadores de la interacción entre el espermatozoide y las células oviductales/tracto reproductor femenino en la formación del “reservorio funcional”; la unión de espermatozoides al epitelio oviductal o del tracto reproductor femenino, es mediada por reconocimiento de carbohidratos en numerosas especies. Por esto, nos pareció interesante explorar el rol que cumple el HS y sus receptores en el espermatozoide o en las células del tracto reproductor femenino en la funcionalidad espermática a lo largo de su pasaje por el mismo. Teniendo en cuenta los cambios que suceden en el espermatozoide a lo largo de su vida post-eyaculación, nos planteamos los siguientes objetivos para esta tesis doctoral: (1)Evaluar la localización del HS en la superficie de espermatozoides lavados, incubados en condiciones capacitantes o habiendo sufrido reacción acrosomal inducida; (2) caracterizar la interacción entre las célulasepiteliales del tracto reproductor femenino humano y espermatozoides humanos, mediada por HS y sus receptores; (3) evaluar el posible rol biológico del HS espermático en el proceso de descondensación nuclear in vitro; (4) correlacionar el proceso de descondensación nuclear del espermatozoide humano in vitro con lo observado en la clínica a través de los procedimientos de fecundación asistida. A la luz de los resultados obtenidos, podemos concluir que (1)el porcentaje de espermatozoides humanos que poseen HS en su membrana plasmática disminuye a medida que el mismo transita por los diferentes estadios post-eyaculación. Esto podría estar reflejando que el HS es una molécula fundamental en el proceso de selección de espermatozoides a lo largo del tracto reproductivo femenino. Sin embargo, la presencia de HS en la superficie del espermatozoide humano no está relacionada con el estado de reacción (o exocitosis) acrosomal. Por otra parte, observamos que el HS se encuentra también en la superficie de los espermatozoides de ratón, precisamente en el segmento ecuatorial, independientemente del estado de exocitosis acrosomal en que se encuentre el mismo. Al analizar la interacción entre el espermatozoide humano y diferentes tipos celulares provenientes del tracto reproductor femenino humano in vitro, podemos decir que (2)tanto elHS como su receptor, presentes en el espermatozoide y en las células del endometrio y de la trompa de Falopio, estarían involucrados en la interacción entre estos tipos celulares. Además, confirmamos (3)que el HS del espermatozoide humano no está implicado en la descondensación nuclear y que podría estar involucrado en otros procesos como la fusión con el oocito, siendo el HS oocitario el único responsable de la descondensación. A lo largo de la remodelación de la cromatina espermática, diferentes factores pueden inducir daño en su DNA, como así también alteraciones en la condensación de la cromatina, que han sido asociados a infertilidad masculina. Utilizando dos técnicas que evalúan la funcionalidad del núcleo espermático, como lo son el TUNEL y el ensayo de descondensación fisiológica in vitro, descripto en el laboratorio, (4)pudimos clasificar a los pacientes infértiles como descondensadores rápidos o lentos y concluimos que los descondensadores lentos tendrían mayor posibilidad de éxito en fecundación asistida (ICSI) si son TUNEL negativos o si utilizan ovodonación. De este modo, la evaluación de la velocidad de descondensación, sumada a otros parámetros de funcionalidad espermática, podría ser una herramienta útil en la toma de decisiones terapéuticas en fecundación asistida.