Descripción: Durante el desarrollo postnatal de mamíferos altriciales, las células ciliadas internas (CCIs) cocleares disparan potenciales de acción espontáneos independientes del sonido. Esto produce la entrada de Ca2+ a través de canales dependientes de voltaje y da lugar a la liberación del neurotransmisor glutamato hacia las dendritas aferentes del nervio auditivo. De esta manera, la actividad iniciada en la cóclea es transmitida a lo largo de toda la vía auditiva cumpliendo un rol fundamental para el normal desarrollo del sistema. Durante este periodo, las CCIs también reciben innervación eferente colinérgica proveniente del tallo cerebral. La liberación de ACh activa los receptores postsinápticos α9α10, altamente permeables al Ca2+, y acoplados a canales de potasio dependientes de Ca2+, de tipo SK2. En consecuencia, el influjo de Ca2+ a través de la vía eferente hiperpolariza la CCI y previene la activación de los canales de Ca2+ voltaje dependientes y la liberación del neurotransmisor glutamato. El objetivo de nuestro trabajo fue investigar los mecanismos celulares de compartimentalización de los efectos antagónicos del Ca2+ en las CCIs durante el desarrollo. Se realizaron experimentos de imágenes de Ca2+ funcionales, acopladas a registros electrofisiológicos sobre las CCIs para caracterizar la dinámica y distribución del Ca2+ durante la actividad sináptica eferente. A través de reconstrucciones funcionales y morfológicas de las CCIs, utilizando microscopía confocal de barrido, mostramos una estrecha localización de sinapsis eferentes y aferentes, sugiriendo que la entrada de Ca2+ eferente podría disparar la liberación de glutamato, activando la vía aferente. Sin embargo, registros electrofisiológicos en los terminales aferentes permitieron concluir que los mecanismos celulares de compartimentalización de Ca2+ de la CCI, en conjunto con una baja tasa de actividad eferente, asegurarían un fino control de la difusión del Ca2+ en la CCI manteniendo la segregación de la señales de Ca2+. Consecuentemente, el sistema eferente tendría un rol inhibitorio sobre la actividad de las CCIs y contribuiría a modular el patrón de disparo específico requerido para el correcto desarrollo del sistema auditivo.

Descripción: El receptor colinérgico nicotínico (nAChR) compuesto por la subunidades α9 y α10 y acoplado al canal de potasio dependiente de Ca2+ SK2, media la transmisión sináptica inhibitoria entre la inervación eferente medial (MOC) y las células ciliadas de la cóclea. En este trabajo hemos generado dos animales geneticamente modificados con alteraciones en el funcionamiento del receptor α9α10. Con el objetivo de estudiar el papel del sistema eferente olivococlear en el funcionamiento del oído interno generamos un ratón knock in que alberga una sustitución de una leucina (L) por una treonina (T) en la posición 9’ de la región transmembrana 2 de la subunidad α9 del receptor colinérgico nicotínico. Esta mutación le confiere al receptor una menor tasa de desensibilización y una mayor afinidad aparente para la ACh, la cual se refleja en un marcado aumento de la actividad del sistema eferente olivococlear in vivo. Es así que los animales mutados presentaron un aumento en los umbrales de las respuestas eléctricas evocadas del tronco encefálico (BERA) y en los productos de distorsión de emisiones otoacústicas (PD- EOAs). Más aún, la estimulación eléctrica del sistema eferente en la base del IV ventrículo, produjo un dramático aumento de la supresión de los PD-EOAs. Todos estos efectos fueron bloqueados por estricnina, un bloqueante de receptores α9α10. Finalmente, los animales mutados presentaron una mayor resistencia al trauma producido por sonidos intensos. Estos resultados demuestran que el sistema olivococlear es un sistema inhibitorio que protege al oído del trauma acústico. En la segunda parte del presente trabajo generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 de receptores nicotínicos en forma constitutiva. Las células ciliadas internas (CCIs) de la cóclea reciben una inervación eferente colinérgica antes del comienzo de la audición (P12 en roedores). Luego del comienzo de la audición, estas fibras se retraen, y esto se correlaciona con el cese de la transcripción del gen que codifica para la subunidad α10 (Chrna10) y la ausencia de receptores colinérgicos funcionales. Para evaluar si estos cambios durante el desarrollo se deben en parte al cese de la transcripción de Chrna10, generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 en forma constitutiva. A tal fin, el ADNc que codifica para la subunidad α10 fue introducido rio abajo del promotor del Pou4f3, factor de transcripción que se expresa en las CCIs y CCEs desde estadios embrionarios. Este transgén se expresó correctamente en las CCIs y codificó para una subunidad α10 funcional. Sin embargo, a pesar de la presencia de la subunidad α10, no se detectaron corrientes colinérgicas luego del comienzo de la audición. Por lo tanto, la desaparición de las respuestas colínergicas que acompañan al desarrollo de las CCIs no es consecuencia del cese de la transcripción de Chrna10.

Descripción: La hipótesis que se evaluó en el presente trabajo es que el receptor colinérgico que media la sinapsis entre las fibras eferentes olivococleares mediales y las células ciliadas internas de la cóclea de mamíferos está compuesto por las subunidades nicotínicas α9 y α10. En la primera parte, estudiamos las propiedades biofísicas y farmacológicas del receptor colinérgico nicotínico (nAChR) nativo presente en las células ciliadas internas (CCIs) de la cóclea antes del comienzo de la audición. Para ello, realizamos registros de patch-clamp en la configuración whole-cell en una preparación aguda del órgano de Corti de ratas de 9 a 11 días postnatal (P9-P11). La caracterización del nAChR nativo de las CCIs fue realizada aislándolo del canal SK2, para poder luego comparar sus propiedades con aquellas obtenidas para los receptores recombinantes α9 y α9α10 expresados en oocitos de Xenopus laevis. El perfil farmacológico y la permeabilidad al calcio del receptor nativo fueron idénticos a los descriptos para los receptores recombinantes tanto α9 como α9α10. Sin embargo, cuando se compararon otras características biofísicas se observó que el receptor nativo de las CCIs es similar al nAChR recombinante heteromérico α9α10. Los resultados obtenidos en este apartado sugieren que el receptor de las CCIs es un heterómero compuesto por las subunidades α9 y α10 y no un homómero compuesto sólo por la subunidad α9. La subunidad nicotínica α9 se expresa en las CCIs de la cóclea desde estadios embrionarios hasta la adultez. En cambio, la subunidad α10 deja de expresarse en estas células luego del comienzo de la audición. En la segunda parte, analizamos la ontogenia de las respuestas colinérgicas en las CCIs desde la llegada de las fibras olivococleares mediales (P1-P3) hasta el comienzo de la audición (P12-P13) y en días posteriores al mismo (P14-P22), para analizar si existía una correlación directa entre la expresión de la subunidad α10 y la sensibilidad colinérgica de las CCIs. Los registros electrofisiológicos mostraron que la sinapsis entre las fibras eferentes olivococleares y las CCIs es funcional a partir de P3 y continúa transmitiendo señales hasta P13-P14. Luego de P14, las CCIs no responden a la acetilcolina liberada de los terminales pre-sinápticos ni a la aplicada de manera exógena. Nuestros resultados muestran que luego del comienzo de la audición, las CCIs carecen de nAChR funcionales y que esto se correlaciona con la disminución en la expresión de la subunidad α10. El estudio de las respuestas electrofisiológicas de las células ciliadas externas (CCEs) de la cóclea resulta dificultoso por la presencia de una corriente de potasio (IK,n) que impide fijar el voltaje de estas células a potenciales hiperpolarizados. Esta corriente es bloqueada por la linopiridina y se ha utilizado esta droga para estudiar las respuestas colinérgicas de las CCEs. En la tercer parte, reportamos el efecto de la linopiridina sobre el nAChR nativo de las células ciliadas y sobre el receptor recombinante α9α10 expresado en oocitos de Xenopus laevis. Demostramos que la linopiridina bloquea a los nAChRs de las células ciliadas y al receptor recombinante α9α10 con la misma potencia. Estos resultados, además de contribuir a la caracterización farmacológica del receptor, indican que la linopiridina tiene un efecto directo sobre el nAChR α9α10 y que por lo tanto no debería utilizarse para estudiar las respuestas colinérgicas de las CCEs.

Descripción: En el periodo previo al comienzo de la audición, alrededor del día postnatal (P) 12, las células ciliadas internas (CCIs) disparan espontáneamente potenciales de acción dependientes de Ca2+ , promoviendo la liberación de glutamato en la primera sinapsis del sistema auditivo. Esta actividad contribuiría a establecer y refinar las conexiones sinápticas en la vía auditiva. Durante este periodo, las CCIs son inervadas transitoriamente por fibras del sistema olivococlear medial (MOC). Esta inervación es colinérgica e inhibitoria, y actúa sobre las CCIs disminuyendo la frecuencia de disparo de potenciales de acción. La naturaleza transitoria de la sinapsis MOCCCI sugiere que podría haber cambios en las propiedades de la transmisión sináptica y en las moléculas involucradas en este proceso. En un trabajo previo, se observó que en P9-11 la liberación de acetilcolina (ACh) es mediada por los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CCDVs) de tipo P/Q y N, mientras que los CCDVs de tipo L modulan negativamente la liberación mediante la activación de canales de K+ dependientes de Ca2+ y de voltaje de tipo BK. Resultados preliminares de nuestro laboratorio indicaban que en P6-7 la liberación estaría mediada parcialmente por los CCDVs de tipo P/Q, mientras que los CCDVs de tipo N no estarían involucrados. El principal objetivo de esta tesis fue caracterizar las propiedades de la liberación del neurotransmisor en la sinapsis MOC-CCI del ratón en distintos estadios del desarrollo. Además fue de interés estudiar las propiedades de la liberación de ACh en la sinapsis MOC-CCI en ratones con una ablación genética de los canales BK (ratones Slo-/- ) en el estadio P9-11. Para abordar estos objetivos se realizaron registros electrofisiológicos en el modo "whole-cell" en las CCIs presentes en preparaciones de cóclea aisladas de forma aguda, mientras se evocaba la liberación de ACh de los terminales MOC eléctricamente o mediante una solución extracelular con alto contenido de K+ , en ratones Balb/C en edades P4, P6-7 y P9-11 y en ratones Slo+/+ y Slo-/- en P9-11. Los resultados de este trabajo muestran que la fuerza sináptica aumenta significativamente entre los estadios P4 y P9-11. Este fenómeno está acompañado por cambios en el patrón de plasticidad de corto término (STP), en la cantidad de vesículas sinápticas disponibles para ser liberadas o RRP (por sus siglas en inglés) y en su tasa de reciclado, y en los tipos de CCDVs que median y/o modulan la liberación de ACh. En resumen, se han encontrado cambios significativos en las propiedades de la transmisión sináptica en la sinapsis MOC-CCI durante el desarrollo postnatal, lo cuál podría ser consecuencia del cambio de identidad y localización de los CCDVs que participan en este proceso. En la sinapsis MOC-CCI de ratones Slo-/- en el estadio P9-11, no se observaron diferencias en la fuerza sináptica, en el patrón de STP, ni en la modulación de la liberación de ACh por los receptores mGluR1. Tampoco se detectaron alteraciones en la maduración eléctrica de las CCIs, ni en la pérdida de las conexiones MOC-CCI que normalmente ocurre luego del comienzo de la audición. Estos resultados sugieren que la carencia de canales BK en los terminales eferentes podría estar compensada por un aumento en la expresión de otros canales de K+ presentes en los terminales sinápticos MOC y/o por mecanismos regulatorios que eviten que estos procesos se vean afectados.

Descripción: La pérdida de audición debida al envejecimiento (presbiacusia), o bien a la exposición a sonidos de alta intensidad, constituyen dos de las formas más comunes de pérdida de audición en humanos. Si bien se pensaba que el rasgo común a ambas patologías era la pérdida de sensibilidad auditiva, recientemente se ha descrito que la aparición de alteraciones estructurales en las sinapsis que transmiten la información auditiva desde la cóclea al Sistema Nervioso Central (SNC) podrían producirse, en ambos casos, sin afectar los umbrales de audición, lo que se conoce como Pérdida de Audición Oculta (HHL, por sus siglas en inglés). Las células ciliadas internas (CCIs) ejecutan la mecanotransducción de los estímulos auditivos y luego transmiten la información sensorial hacia el SNC mediante sinapsis en cinta que forman con terminales dendríticos de neuronas del ganglio espiral (NGEs). Si bien se ha descrito que luego de la exposición a ruido se produce una reducción en el número de sinapsis CCI-NGE, se desconoce cuál es la integridad funcional de las sinapsis sobrevivientes para codificar la información auditiva. Con el propósito de estudiar los efectos de la exposición a ruido sobre la capacidad de la CCI para liberar neurotransmisor, se registraron los cambios en la capacitancia de membrana de las CCIs. Así, se vio que los ratones expuestos mostraron una mayor liberación vesicular que los controles a pesar de que el influjo de Ca2+ a la CCI fuera similar. Finalmente, se identificaron efectos dependientes e independientes de la liberación de glutamato sobre la dinámica de liberación vesicular y sobre la morfología sináptica. Las células ciliadas externas (CCEs) cuentan con un mecanismo electromótil mediante el cual contribuyen a la amplificación y sintonización fina de los estímulos auditivos. A su vez, dicho mecanismo puede ser inhibido por terminales eferentes colinérgicos de neuronas del complejo olivococlear medial (MOC, por sus siglas en inglés), ubicado en el tallo cerebral. Se ha establecido que la activación del reflejo MOC puede prevenir o reducir el impacto de la exposición a ruido. Sin embargo, el rol de las neuronas MOC en la prevención de la HHL o la presbiacusia no ha sido explorado. Con tal fin, distintas líneas de ratones genéticamente modificados con diferentes niveles de actividad del reflejo MOC fueron expuestas a ruido o criadas hasta el envejecimiento y mediante pruebas de fisiología auditiva y ensayos inmunohistoquímicos se analizó el nivel de daño post-exposición. En animales con actividad normal de las neuronas MOC se observó el desarrollo de un fenotipo de HHL luego de la exposición a ruido. Asimismo, al año de edad estos animales presentaban déficits funcionales y alteraciones estructurales compatibles con un fenotipo de presbiacusia. En cambio, animales con actividad MOC potenciada demostraron estar completamente protegidos del trauma acústico en términos funcionales y estructurales e igualmente tampoco presentaron signos de pérdida de audición al año de edad. El presente trabajo da cuenta, entonces, de nuevas evidencias relacionadas con los efectos de la exposición a ruido sobre la transmisión sináptica en la vía auditiva, a la vez que aporta evidencias sobre la potenciación de la vía eferente MOC como un mecanismo eficiente para la prevención de la presbiacusia y la pérdida de audición debida al envejecimiento.

Descripción: En el órgano de Corti, el epitelio sensorial del sistema auditivo de los mamíferos ubicado dentro de la cóclea, se encuentran las células ciliadas internas y externas (CCIs y CCEs, respectivamente). Ambos tipos celulares se despolarizan en respuesta a la llegada de estímulos sonoros, pero sus funciones están claramente diferenciadas. Las CCIs, los fonorreceptores propiamente dichos, transducen los estímulos sonoros en señales eléctricas que son enviadas al sistema nervioso central (SNC) mientras que las CCEs, debido a su propiedad electromótil dependiente del voltaje, están principalmente involucradas en la amplificación y la sintonización fina de estos estímulos. La actividad de las CCEs es modulada a través del sistema olivococlear medial (MOC, por sus siglas en inglés), una inervación eferente que se origina en el sistema nervioso central (SNC), a nivel del tallo cerebral. La sinapsis entre las fibras MOC y las CCEs (sinapsis MOC-CCE) es colinérgica e inhibitoria, ya que está mediada por el receptor colinérgico nicotínico α9α10 que se encuentra funcionalmente acoplado a canales de K+ dependientes de Ca2+ del tipo SK2, resultando en la hiperpolarización y consecuente disminución de la actividad de las CCEs. En el presente trabajo se estudiaron las características moleculares y funcionales de la sinapsis MOC-CCE a través de la realización de registros electrofisiológicos en configuración whole-cell en las CCEs presentes en preparaciones del órgano de Corti del ratón, en respuesta a la estimulación eléctrica de las fibras MOC. En primer lugar, mediante un abordaje experimental farmacológico, se estudiaron las propiedades funcionales y moleculares de la sinapsis MOC-CCE durante el desarrollo postnatal. Más precisamente, en los días postnatales (P)11-13, coincidente con el comienzo de la audición en roedores altriciales, y en P20-22, edad en la cual el sistema auditivo de estos animales ha madurado. Se demostró que tanto la composición molecular de los canales iónicos que sostienen o modulan la liberación de acetilcolina en la sinapsis MOC-CCE así como las propiedades de la transmisión sináptica sufren cambios entre dichos períodos. También se encontraron evidencias de que hay cambios en el grado de compartimentalización de las proteínas presinápticas involucradas en la liberación del neurotransmisor entre ambos períodos, lo que sugiere una maduración sináptica incompleta al momento del comienzo de la audición. En segundo lugar, se estudiaron las implicancias sobre la transmisión sináptica de una mutación puntual en la subunidad α9 del receptor colinérgico que media la sinapsis eferente MOC-CCE y que le confiere a la misma una ganancia de función. Para ello se utilizó una línea de ratones transgénicos (L9’T) desarrollada previamente en nuestro laboratorio, en la que se observó una mayor protección ante el trauma acústico en respuesta a intensidades elevadas de sonido. Valiéndonos de evidencias previas de nuestro laboratorio que indican que la sinapsis MOC-CCE presenta facilitación de corto término en respuesta a altas frecuencias de estimulación, se analizó el patrón de actividad sináptica en respuesta a trenes de estimulación de distinta duración y frecuencia, dentro del rango fisiológico de disparo de las fibras MOC. Se demostró que la plasticidad de corto término en los ratones L9’T se encuentra alterada, en consistencia con el fenómeno global de respuestas aumentadas en la vía eferente relacionada a la mayor protección ante el trauma acústico previamente descripta.