Descripción: Los estudios de secuenciación de alto rendimiento están abriendo nuevos caminos para investigarlas respuestas adaptativas que los organismos despliegan en entornos alternativos. Sin embargo,mucho queda por entender sobre las bases genéticas de la adaptación a las plantas hospedadoras. La especies cactófilas de Drosophila que se encuentran en América del Sur tienen distinto grado dedivergencia y especialización en la explotación de los cactus que habitan. La utilización de tejidosnecróticos como hospedadores ha ligado su historia evolutiva a la expansión, retracción ydiversificación de las cactáceas durante los cambios climáticos promovidos por los periodosglaciales del cuaternario. Las especies hermanas D. buzzatii y D. koepferae divergieron hace unoscinco millones de años y actualmente muestran una marcada diferenciación en caracteres de historiade vida, morfología y hábito, que aparentemente habrían evolucionado como adaptaciones a lasdistintas plantas hospedadoras. En su región simpátrica, ubicada en el noroeste Argentino, utilizanalternativamente cardones (Trichocereus terscheckii) y tunas (Opuntia sulphurea) como recursos decría, donde el hospedador primario de una resulta en el secundario de la otra. Sin embargo, elcambio de hospedador afecta seriamente los componentes del fitness cuando ambas especies soncriadas en el recurso secundario, lo que sugiere un importante papel de los metabolitos secundariosen el proceso de especialización ecológica. En la presente tesis, se estudiaron las particularidades genómicas de estas especies hermanas, asícomo la expresión génica en diferentes aproximaciones a las condiciones naturales de cría. A partirde los resultados, se desprenden diferencias entre ambas especies, tanto en su arquitectura genéticacomo en su modulación transcripcional. Precisamente la mayor diferencia se encontró en lamodulación transcripcional que llevan a cabo en los diferentes recursos de cría, aunque en amboscasos los genes diferencialmente expresados estuvieron principalmente relacionados condetoxificación, óxido-reducción y respuesta a estrés, pero también con desarrollo y procesosneurobiológicos. Esta trabajo aporta nuevos datos sobre el rol de la plasticidad transcripcional y lasbases genómicas de estrategias adaptativas a ambientes de cría alternativos.

Descripción: Mediante la aplicación de diferentes enfoques de Biología Computacional, en esta Tesis se abordaron tres proyectos genoma de tomate: i) el genoma mitocondrialdel cultivar élite Heinz se secuenció, ensambló y anotó; ii) se ancló la secuenciacompleta del genoma de la especie silvestre de tomate Solanum pennellii, el padredonante de la conocida población de líneas de introgresión (IL), al mapa genéticoy iii) mediante genómica comparativa y análisis de QTL (loci de caracterescuantitativos) se identificaron genes candidatos asociados a variaciones en lafotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de las plantas. Losresultados del ensamblado del genoma mitocondrial del tomate mostraron que lasinserciones nucleares de origen mitocondrial (del inglés, numts: nuclearmitochondrial DNA segments) están presentes aún en los tomatescontemporáneos. Este hallazgo fue validado por hibridación fluorescente in situ lacual mostró un número particularmente elevado de numts en el cromosoma 11 delcultivar Heinz. En la segunda parte de esta Tesis se presenta la secuencia completadel genoma de S. pennellii la cual fue ensamblada de novo en 4.591 scaffolds, de loscuales, el 97,1% fueron anclados (mediante una base de datos interna de 16.940marcadores moleculares) al mapa genético del tomate. Por último, en el capítulofinal de esta Tesis, el potencial como herramientas para la investigación y elmejoramiento de cultivos de las secuencias genómicas aquí presentadas, sedemostró por el genoma del cultivar S. lycopersicum M82, ensamblado porreferencia. En esta parte, se identificaron 87 genes candidatos involucrados en ladeterminación de loci de caracteres cuantitativos responsables de variaciones en lafotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de la planta presentesen 11 regiones (BINs) de las líneas de introgresión de tomate.

Descripción: La tuberculosis (TB) es una enfermedad crónica causada por la bacteria intracelular facultativa Mycobacterium tuberculosis (Mtb), un patógeno altamente exitoso. A pesar de contar con más de 100 años de investigación, la TB actualmente es la enfermedad infecciosa más mortífera por detrás del COVID-19. Se calcula que un cuarto de la población mundial se encuentra infectada latentemente con este patógeno. Los últimos reportes de la organización Mundial de la Salud (OMS) estimaron que alrededor 1.6 millones de personas murieron durante 2021 a causa de esta enfermedad. En particular, las cepas multirresistentes (MDR, resistentes a isoniacida y rifampicina) y extremadamente resistentes (Mtb XDR, resistente a isoniacida, rifampicina, una fluoroquinolona y un aminoglucósido inyectable de segunda línea), representan un problema serio para los sistemas de salud. Argentina, en relación a otros países, tiene una carga media de esta enfermedad. Alrededor de 10500 nuevos casos de TB son notificados anualmente, con cerca de 1000 decesos anuales. Aunque las mismas suelen tratarse y resolverse con una terapia estándar con al menos 3 antibióticos diferentes durante 6-9 meses, no es el caso con las infecciones con Mtb XDR, que requiere un tratamiento más costoso y extendido en el tiempo y muchas veces es de pronóstico reservado. En este trabajo se desarrolló un flujo de trabajo bioinformático (pipeline) con el objetivo de analizar las bases moleculares de resistencia a antibióticos de M. tuberculosis y se aplicó al estudio de los aislamientos XDR circulantes en Argentina entre los años 2008-2016, cuyos genomas fueron obtenidos por técnicas de secuenciación masiva. Las variantes genotípicas obtenidas para cada aislamiento fueron contrastadas contra bases de datos de variantes asociadas a resistencia y se realizó una análisis filogenético sobre las mismas. Con los datos procesados, no se observaron orígenes comunes para las mutaciones de resistencia más frecuentes, pero sí dentro de determinados grupos monofiléticos para algunas drogas. Dentro de las variantes màs frecuentes para las drogas de primera línea se pueden mencionar katG Ser315Thr y fabG1 C-15T para INH, rpoB Ser450Trp y Asp435Val para RIF, embB Gly406Asp y Met306Ile para EMB y variantes en el gen de pncA para PZA. En el marco de la emergencia provocada por las cepas resistentes, multirresistentes y extremadamente resistentes, se requiere con urgencia el desarrollo de nuevos antimicrobianos. A pesar de esta situación crítica, el diseño y la producción de nuevas drogas ha resultado ineficaz por diferentes razones que incluyen el elevado costo asociado al desarrollo de las mismas y una tasa de éxito relativamente baja. El desarrollo de drogas es un proceso complejo que requiere entre 10 y 20 años para atravesar las distintas etapas de investigación y una inversión aproximada de 1500 millones de dólares. En esta situación resulta esencial la adecuada selección inicial del blanco molecular a ser inhibido por el antibiótico en desarrollo. En este sentido, los métodos de secuenciación masiva han sido una enorme fuente de datos, creando nuevas oportunidades para el diseño y desarrollo de drogas para combatir a los agentes infecciosos, incluyendo a los resistentes y multirresistentes. En la presente tesis se ha desarrollado Target-Pathogen, una aplicación web diseñada y desarrollada específicamente como un recurso online que permite la integración y valoración de diferentes características de todas las proteínas de un genoma (función, rol metabólico, homología con proteínas humanas, drogabilidad estructural, esencialidad, expresión) para facilitar la identificación y priorización de proteínas como blancos adecuados. En la base de datos se incluyen los genomas de 25 de los microorganismos más relevantes para la salud humana en continua expansión y actualización. Utilizando Target-Pathogen se seleccionaron y priorizaron una serie de blancos moleculares prometedores para el desarrollo de drogas para Mycobacterium tuberculosis en la fase latente, entre los que se destaca ino1, una proteìna que participa de vìa de la síntesis de micotiol.

Descripción: Fil: Maldonado, Lucas Luciano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El ensamblado y la anotación de genomas es un área de particular interés en genómica, que ha abierto un horizonte de posibilidades impensadas en la época de los primeros avances de la genómica preinformática. Desde las primeras secuenciaciones de genomas completos, se han desarrollado diferentes métodos y herramientas para el procesamiento y anotación de datos genómicos. La aparición de las tecnologías de secuenciación de nueva generación ha significado una verdadera revolución en la biología y, sobre todo, en las denominadas ciencias ómicas. Sin embargo, los enormes volúmenes de datos generados representan nuevos desafíos, tanto a nivel técnico como de análisis. Se genera mucha más datos de los que pueden procesarse para posibilitar la extracción de información en forma confiable, con lo que la cantidad de datos no curados en diferentes repositorios es cada vez mayor. La velocidad con la que crecen las bases de datos y la dificultad de garantizar la calidad de las mismas, hacen que las anotaciones, principalmente automáticas, requieran siempre un gran esfuerzo posterior de curado manual. Asimismo, la disparidad en los formatos y fuentes de datos y la falta de estandarización en las metodologías dificulta la integración entre diferentes análisis, lo que suele requerir también un gran insumo de tiempo para poder extraer información a partir de datos obtenidos por medios diversos. El presente trabajo de tesis tuvo como principal objetivo el diseño, programación, testeo y aplicación de protocolos de trabajo (pipelines) para ensamblado y anotación de genomas y transcriptomas de organismos con diversos niveles de complejidad. Se programaron pipelines para ensamblar y anotar organismos desde virus y bacterias a eucariotas superiores. Cada pipeline fue organizado en forma modular, permitiendo iniciar el proceso desde los primeros pasos de secuenciación hasta las etapas más avanzadas, con la posibilidad de incorporar información procedente de fuentes diversas, tanto internas como externas y de combinar los diferentes pipelines entre sí, según el nivel de análisis que se necesite y la información de que se disponga. A su vez, las anotaciones finales son incorporadas a la plataforma web de BIA (Plataforma de Bioinformática Argentina), interrelacionándose y enriqueciéndose con otros módulos y pudiendo visualizarse y filtrarse en forma flexible. Paralelamente al proceso de desarrollo de los pipelines, los mismos fueron aplicándose a diversos organismos, en un proceso iterativo de testeo y mejoramiento. De esta forma, se ensamblaron y anotaron diversas especies de bacterias, arqueas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores, entre ellos: anotación de la arquea extremófila Halorubrum sp. AJ67 y de la bacteria probiótica Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, ensamblado y anotación de las cepas M y B del complejo Mycobacterium Tuberculosis; ensamblado y anotación de un hongo no caracterizado del género Trichoderma, ensamblado, anotación y estudio comparativo del patógeno de maíz Puccinia sorghi race RO10H11247; ensamblado y anotación de Ilex Paraguariensis A. St.-Hil., en el marco del Proyecto de Secuenciación del Genoma de Yerba Mate (PRO.MATE.AR).

Descripción: En el presente trabajo encaramos la construcción de vectores destino Gateway®, pTREX-GW y pTREX-HGX-GW. Mediante el sistema de detecciones rápidas con fusiones a GFP exploramos una serie de mutantes Tcp14 para definir con exactitud las señales involucradas en su localización nuclear. De esta forma, pudimos determinar que Tcp14 no depende de su unión al factorSF3b155 para ingresar al núcleo, sino que posee una señal propia no descripta hasta ahora, que podría ser explotada como posible blanco de drogas. Otro modelo ambicioso de blanco de drogas son los dominios WW, módulos proteicos que median interacciones proteína-proteína reconociendo motivos peptídicos ricos en prolina. Un ejemplo promisorio entre las proteínas con WW son las TcZFPs. Se utilizó un vector inducible por tetraciclina para sobreexpresar TcZFP1b en las formas epimastigotes. Tras la inducción, los parásitos dejaron de dividirse después de 60 hs de la adición de tetraciclina y una extensa muerte celular se produjo después de 5 días. Las células se observaron como “monstruos” con múltiples flagelos y el contenido de ADN bloqueado en la citocinesis, provocando la muerte celular. Para analizar los cambios globales en la expresión génica, se llevo a cabo una pirosecuenciación de los ARNm en un Genome Sequencer FLX 454-Roche. Un grupo de 70 genes mostraron una regulación positiva mayor a 3 veces respecto al control, mientras que 35 genes mostraron una regulación negativa menor a 3 veces respecto el control. En general, se observó que varios ARNm de funciones relacionadas cambiaron de manera concertada como un patrón en respuesta post-transcripcional a la sobreexpresión de TcZFP1b, que parecería activar parte de un programa para diferenciar a los epimastigotes en tripomastigotes.

Descripción: El splicing se encuentra presente a lo largo de las distintas especies de organismos eucariotas, representando una pieza clave en la inmensa mayoría de los procesos de regulación. Para que el mismo pueda llevarse a cabo, debe darse el reconocimiento de una serie de señales. En particular, los sitios donores y aceptores de splicing definen los límites del intrón y su reconocimiento constituye uno de los primeros pasos dentro del ciclo de splicing. A lo largo del genoma, estos sitios presentan una cierta variabilidad en su secuencia, la cual se encuentra relacionada con la posibilidad de regular su reconocimiento y establecer diversos patrones de splicing alternativo. Por otro lado, este reconocimiento se encuentra influido por la acción de una gran variedad de factores en trans que son reclutados al lugar donde se está llevando a cabo el splicing. En la primera parte de esta tesis, buscamos analizar la variabilidad de secuencia que presentan los sitios donores a lo largo de diversas especies eucariotas. Para esto construimos un modelo estadístico de máxima entropía para determinar patrones de correlación no triviales entre los distintos pares de posiciones que constituyen los sitios donores de splicing, en busca de determinar cuáles de éstos son comunes entre las 30 especies analizadas, y cuáles son característicos de solo algunos grupos. Si bien el proceso de splicing conserva un gran número de elementos en común en los organismos eucariotas, en los últimos años múltiples estudios han destacado la posible relevancia funcional de pequeñas diferencias entre las especies. Así logramos establecer patrones de correlación característicos en los sitios donores de splicing que distinguen a las especies vegetales de los metazoos y los hongos. En la segunda parte, nos abocamos al estudio del efecto sobre el splicing de PRMT5, un factor que, mediante la metilación de proteínas, participa de la regulación de múltiples procesos moleculares. Se ha propuesto que la acción de PRMT5 podría favorecer el reconocimiento de sitios donores débiles. Con el objetivo de determinar en qué medida el efecto que tiene PRMT5 sobre los patrones de splicing se encuentra influído por señales en cis, se realizaron experimentos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) en plantas de Arabidopsis thaliana mutantes de PRMT5, pertenecientes a dos ecotipos distintos: Columbia (Col-0) y Landsberg erecta (Ler). De esta manera se buscó analizar el efecto que tiene la mutación ante la variabilidad genética que presentan estos ecotipos. Para poder discriminar los cambios relacionados con variaciones de las secuencias en cis, se analizó también híbridos F1 Col-0 X Ler y Ler X Col-0. Mediante estos análisis se llegó a la conclusión de que una parte importante de los patrones de splicing afectados por la mutación de PRMT5 dependen de señales en cis, teniendo una particular relevancia la fortaleza del sitio donor.

Descripción: En este trabajo se presentan los resultados de la secuenciación, ensamblado, anotación estructural, anotación funcional y análisis comparativo de los genomas de especies cactofílicas que conforman el cluster Drosophila buzzatii: D. antonietae, D. borborema, D. koepferae (dos cepas) y D. buzzatii. Este es un grupo de siete especies cercanamente emparentadas del grupo repleta. Todas viven en ambientes áridos, desérticos y semidesérticos de América del Sur, y son capaces de alimentarse de una variada dieta consistente en microorganismos, mayormente levaduras y bacterias, asociados a los tejidos de cactus en descomposición. Entre las cactáceas que explotan como sitios de cría se pueden reconocer dos tipos principales: los cactus columnares de la subfamilia Cactoideae (por ejemplo, los géneros Cereus Trichocereus) y las tunas o peras espinosas de la subfamilia Opuntioidea (principalmente del género Opuntia). Los primeros son los hospedadores primarios de D. antonietae, D. borborema y D. koepferae, en tanto que las tunas son los hospedadores primarios de D. buzzatii, condición considerada como ancestral. Estos dos tipos de cactus difieren notablemente en varios aspectos de su biología, ecología y, particularmente, en su composición química. En este contexto se enmarca el objetivo general de este trabajo, que se propone identificar, desde una perspectiva genómico-comparativa, factores genéticos asociados a la utilización diferencial de recursos naturales química y nutricionalmente diferentes en el sistema modelo Drosophila-cactus. Esta tesis comienza con una introducción a los antecedentes de la genómica y ecología de este grupo de especies que motivaron la realización de misma, junto con los objetivos propuestos y una breve descripción de los restantes capítulos. Posteriormente, se desarrollan dos enfoques analíticos realizados a partir de la secuenciación de cuatro genomas de novo y el re-análisis del genoma disponible de D. buzzatii. Por un lado, se presenta un estudio mitogenómico comparativo, donde se reportan los mitogenomas de estas especies y el de una especie adicional, D. seriema, también miembro del cluster buzzatii, en conjunto con los resultados de la evolución molecular y las relaciones filogenéticas inferidas a partir de los mitogenomas. Por otro lado, se expone un enfoque combinado de estudios filogenómicos y de genómica comparativa, que se dividió en tres partes. Primero, se reportan las métricas y estadísticas estándares de contigüidad y completitud de los ensamblados generados con una metodología de novo: la longitud total, el número de contigs/scaffolds, el valor de N50 y los porcentajes de completitud de distintos conjuntos de genes ortólogos de copia única que se encuentran conservados en diferentes linajes (grupos BUSCO). En segundo lugar, se muestran los resultados de la anotación estructural y funcional, tales como el número de repeticiones, genes, transcriptos y proteínas anotadas, y se compara la calidad de las mismas con las anotaciones disponibles para otras especies. En tercer lugar, se presenta la filogenia más completa reconstruida hasta el momento para este grupo de especies, la cual obtuvo valores de soporte máximos para todos los nodos y que es contradictoria con la hipótesis filogenética generada con los mitogenomas. A continuación, se reporta el conjunto de genes ortólogos exclusivos del grupo de especies cactófilas, que se obtuvieron a partir de un análisis comparativo que incluyó a las especies del cluster buzzatii, a D. mojavensis (que forma parte del complejo mulleri, que es el grupo hermano del complejo buzatii) y a especies externas no cactofílicas, del mismo subgénero Drosophila y del subgénero Sophophora. Otras comparaciones permitieron identificar, además, conjuntos de genes exclusivos del cluster buzzatii y de las especies que explotan cactus columnares. Las funciones asociadas a estos dos conjuntos de genes fueron coherentes con las supuestas características necesarias para la utilización de recursos naturales química y nutricionalmente diferentes, y que podrían estar asociadas a la preferencia de distintas plantas hospedadoras. Adicionalmente, se presenta un estudio de evolución molecular de la familia de proteínas citocromo P450 (CYP450), conocida por estar relacionada con mecanismos de detoxificación, donde se muestra la expansión y contracción de la misma en relación con el cluster mojavensis. Por último, en base a todos los resultados obtenidos, en las conclusiones generales se destacan los principales aportes de este trabajo.

Descripción: El mecanismo de splicing alternativo es un mecanismo de regulación post-transcipcional presenteen los organismos eucariotas que amplía las capacidades regulatorias y funcionales de los genesmediante la generación de múltiples isoformas. Las consecuencias de este proceso son proteínasfuncional y estructuralmente diferentes como así también productos no traducibles con funcionesregulatorias en sí mismos. El advenimiento de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva,incluyendo las que se utilizan para ARN (RNA-Seq) permiten estudiar cambios transcripcionalesincluyendo splicing alternativo de una manera inusitada. Sin embargo, la descripción de los cambiosen los patrones de splicing bajo diferentes condiciones no es trivial y ha dado lugar durante losúltimos años al desarrollo de múltiples herramientas bioinformáticas. En este trabajo de tesis, se describe ASpli, un paquete de R integrativo y fácil de usar quefacilita el análisis de los cambios en el splicing alternativo tanto en eventos anotados como nuevosa partir de datos de RNA-Seq. Nuestra propuesta es combinar la información estadística del usodiferencial de exones, intrones y junturas junto con las métricas de inclusión (PSI) y retención deintrón (PIR) que se obtienen por el análisis de las junturas sobre cada región genómica en estudio. La utilización de este abordaje integral intenta cuantificar de manera más exacta la ocurrenciade eventos de splicing alternativo. El desarrollo del paquete fue fundamental para el análisis dela remodelación del transcriptoma ante numerosos tratamientos en la planta modelo Arabidopsisthaliana así como en otros organismos. Como parte de los resultados, se describen los análisis delefecto de un pulso de luz en plantas y sus consecuencias globales en la regulación del splicingalternativo.

Descripción: La Enfermedad de Parkinson (EP) es una de las enfermedades neurodegenerativas de mayor incidencia en personas mayores de 65 años. Es de progresión lenta y su rasgo distintivo es la degeneración neuronal en la región de la sustancia nigra pars compacta (SN). Un hallazgo pato-fisiológico uniformemente observado tanto en modelos animales como en pacientes con EP es que la muerte de las neuronas de la SN se encuentra acompañada por activación de la microglía. Numerosa evidencia apunta a un efecto neurodegenerativo de la microglía activada, sin embargo, también se ha observado que la microglía podría tener efectos neuroprotectores, por ejemplo a través de la secreción de factores neurotróficos. Por lo tanto, el rol funcional de esta activación es aún un tema de amplio debate. En publicaciones previas de nuestro laboratorio hemos descripto una activación microglial atípica en la que la misma se encuentra parcialmente activada o “cebada” como consecuencia de la degeneración neuronal (Depino, Earl et al. 2003). En este estadío de activación atípica, las células son capaces de transcribir citoquinas proinflamatorias pero no de sintetizar la proteína en sí. Este concepto sugiere que una célula en estado cebado requeriría de un segundo estímulo menor al que requeriría una célula en reposo hasta quedar clásicamente activada. En esta tesis, hemos evaluado la hipótesis de que la inflamación pueda exacerbar la neurodegeneración en un modelo animal de EP (inyección de 6OHDA en el cuerpo estriado) con la consiguiente progresión de la enfermedad. Para ello, se procedió a la inyección endovenosa de un estímulo pro-inflamatorio periférico (Adenovector productor de interleuquina 1) a animales previamente denervados con la neurotoxina 6OHDA. El estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración en progreso en la SN. Los efectos exacerbantes del estímulo inflamatorio fueron asociados con un aumento en la activación morfológica microglial y expresión de MHC clase II en superficie. Debido a que la patología se presenta en pacientes añosos y a que los cerebros de personas ancianas presentan microglía cebada (Cunningham, Konsman et al. 2002) realizamos el mismo diseño experimental en ratas ancianas. En este modelo, también, el estímulo pro-inflamatorio fue capaz de exacerbar la neurodegeneración presentando la microglía activación morfológica aumentada. Por otro lado, se estudiaron los mecanismos moleculares de la exacerbación de la neurodegeneración sobre un modelo de aumento de la inflamación con un estímulo pro inflamatorio en SN. Mediante la técnica de microarrays buscamos los genes candidatos a ser los responsables de estar participando en la exacerbación de muerte neuronal. Se encontraron genes diferencialmente expresados, cuatro de los cuales fueron validados técnicamente por RT-PCR en tiempo real. Esta tesis provee evidencia de los efectos perjudiciales de la inflamación en la progresión de la EP. Además, propone que las infecciones o inflamaciones podrían ser consideradas como un factor de riesgo en la exacerbación de la neurodegeneración en la EP. Así también, sugiere una asociación entre la activación de la microglía y los efectos neurotóxicos observados en la SN. Finalmente, propone candidatos a mediar estos efectos.

Descripción: Las proyecciones para el Cambio Climático Global (CCG) en Patagonia norte indican un aumento de la temperatura y disminución de las precipitaciones, así como también un incremento en la ocurrencia de fenómenos extremos. En este contexto, un interrogante abierto es qué capacidad poseen las especies vegetales para subsistir en condiciones climáticas diferentes, como las predichas por el CCG. Esto es de especial relevancia para los árboles, cuyos largos tiempos generacionales se asocian a un bajo recambio poblacional. El estudio de caracteres adaptativos bajo diferentes escenarios climáticos, como los existentes a lo largo de gradientes ambientales, constituye un abordaje particularmente útil, ya que permite evaluar las potenciales respuestas de poblaciones actuales frente a diversas condiciones. El género Nothofagus comprende especies forestales dominantes del bosque andino-patagónico, las cuales cubren gran parte del gradiente pluviométrico y todo el gradiente altitudinal de la Patagonia andina argentina. En particular, hacia los 40o S, Nothofagus obliqua, N. alpina y N. pumilio se distribuyen marcadamente a lo largo de un gradiente altitudinal. Mientras que N. obliqua domina los pisos altitudinales entre 600 y 900 msnm, N. alpina se distribuye desde los 800 hasta los 1000 msnm y N. pumilio desde los 1000 msnm y hasta el límite altitudinal del bosque. En este gradiente, el factor ambiental que presenta la mayor variación con la altitud es la temperatura. Es por ello que la distribución en estratos altitudinales sugiere una preferencia diferencial de nichos térmicos por parte de las especies. En esta tesis, mediante la articulación de experimentos en el bosque en combinación con abordajes ecofisiológicos y genómicos, se estudió el comportamiento de plantas de especies del género Nothofagus en distintos ambientes naturales, establecidos a lo largo de un gradiente altitudinal. En el capítulo 2, se estudió el comportamiento de regeneración de N. obliqua, N. alpina y N. pumilio, mediante la instalación de transplantes recíprocos en un bosque ubicado en Patagonia norte. En forma general, los resultados indican que el ambiente local, es decir el embiente que experimentan los individuos, influye sobre la emergencia y la supervivencia de las plántulas. También aportan evidenciasfavor de que, en N. pumilio y en cierta medida en N. obliqua, la fenología de la germinación es un carácter plástico, que se ajusta a las ventanas climáticas de mayor supervivencia de las plántulas. Por otro lado, el análisis de las dinámicas de mortalidad de plántulas con respecto a variables térmicas e hídricas de los distintos ambientes estudiados indicaron que la mortalidad de plántulas de N. obliqua y N. alpina mostró una mayor influencia por factores relacionados con la temperatura y la sequía, mientras que para N. pumilio solamente los factores térmicos resultaron más adecuados para explicar este comportamiento, sugiriendo la existencia de diferencias inter-específicas en la respuesta de la regeneración al ambiente natural. Para todas las especies, la supervivencia estuvo fuertemente influenciada por la etapa ontogenética de la plántula, con mayores porcentajes de mortalidad durante los primeros meses de vida. En el capítulo 3, se estudió la variación fenotípica de caracteres de importancia adaptativa en individuos de N. pumilio y N. obliqua en un estadio posterior (plantas de 3 años de edad) dentro y fuera de sus áreas de distribución. Se midió el diámetro a la altura del cuello, el contenido foliar de clorofilas a y b, carotenoides y antocianinas y la fluorescencia de la clorofila, ya que, como se explica en esta tesis, estos caracteres se consideran adaptativos, de acuerdo a diversos estudios de fisiología y ecología vegetal. Se encontró que, tanto los individuos de N. pumilio como los de N. obliqua mostraron una variación en los caracteres, relacionada con los diferentes ambientes en los que se evaluaron las plantas. Por último, en el capítulo 4 se realizó una caracterización genética de los individuos correspondientes a este ensayo, utilizando datos de secuenciación del genoma reducido (ddRAD-seq). Se identificaron 202702 y 216749 polimorfismos en las lecturas R1 y R2 de N. obliqua, respectivamente, de los cuales 6114 y 7601 superaron los filtros para ser utilizados en los análisis de asociación subsiguientes. En el caso de N. pumilio, el número de polimorfismos identificados en las lecturas R1 y R2 fue de 190126 y 198391, respectivamente, de los cuales 1644 y 1670 superaron los filtros. Se detectaron niveles de variabilidad moderados a altos y similares para ambas especies. Finalmente, en base a la información genética y fenotípica relevada en el ensayo presentado en el capítulo 3, se realizó una prueba de concepto para establecer relaciones entre polimorfismos nucleotídicos y variaciones en caracteres de importancia adaptativa. Mediante la utilización de modelos de asociación genómica, se identificaron 5 SNPs de N. obliqua y 7 de N. pumilio asociados significativamente a rasgos de interés. El análisis del contexto genómico de este conjunto de marcadores reveló que, 7 de ellos, se encuentran en regiones vinculadas con funciones de respuesta frente a ciertas condiciones de estrés abiótico o comunicación celular Estos resultados representan los primeros análisis genómicos de N. obliqua y N. pumilio, contribuyen a la ampliación de los escasos recursos genéticos de estas especies emblemáticas del bosque andinopatagónico y proveen una estrategia robusta para futuros estudios de mapeo por asociación.

Descripción: Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros de reserva bacterianos que poseen propiedades termoplásticas y son biodegradables. P. extremaustralis acumula polihidroxibutirato (PHB), formado por monómeros de longitud de cadena corta. Esta es una característica poco común en bacterias del género Pseudomonas, que normalmente acumulan PHA de longitud de cadena media (PHAmcl). Trabajos previos demostraron que los genes PHB se encuentran en una isla genómica. El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda y análisis de genes relacionados con la producción de distintos tipos de PHA en P. extremaustralis. También se realizaron análisis bioinformáticos del genoma de esta bacteria para identificar los genes involucrados en vías metabólicas centrales y los relacionados con la producción de alginato, de interés para comprender el metabolismo de compuestos carbonados que podrían estar relacionados con la producción de PHA. Se identificaron los genes de producción de PHAmcl, phaC1ZC2D y phaFI, además de los genes, phbFPX, asociados a la síntesis de PHB. Los análisis filogenéticos realizados permitieron inferir que estos genes poseen diverso origen. En base a estudios de complementación, de expresión génica y de proteómica de los gránulos del polímero se determinó la funcionalidad de las polimerasas de PHAmcl (PhaC1 y PhaC2) y se comprobó que la diferencia en la expresión de las 3 polimerasas, encontradas en el genoma de esta bacteria, podía explicar la alta producción de PHB en comparación con otros PHA. Los resultados en conjunto ponen de manifiesto la importante capacidad de adaptación al metabolismo de esta bacteria de genes probablemente adquiridos por transferencia horizontal, como los genes PHB. La capacidad de producción de PHA con distintas propiedades en P. extremaustralis resulta de interés biotecnológico dado que a través de manipulaciones genéticas sería posible lograr la producción de diferentes bioplásticos, utilizando la misma bacteria.

Descripción: Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. Las leptospiras patógenas se clasifican en serovares (sv) con diferente seroprevalencias de acuerdo al hospedador y la localización geográfica. A diferencia de lo que ocurre en otros países, en Argentina el serovar mayoritario en bovinos es Pomona. Esta serovariedad produce una infección severa siendo frecuente la mortalidad en terneros. Resultados previos de nuestro grupo, permitieron identificar al serovar Pomona y genotipos asociados, como mayoritarios entre aislamientos provenientes de bovinos, pero también de humanos. Estos resultados son de suma importancia epidemiológica, pero no permiten explicar los atributos patogénicos y de virulencia de este clon. El objetivo de este trabajo fue entonces, estudiar e identificar las bases moleculares y celulares de la virulencia de L. interrogans sv Pomona y establecer cómo contribuyen en su patogénesis. Para ello, se logró la atenuación de la cepa AKRFB Pasaje 1 (P1), perteneciente a dicho clon mayoritario, mediante subcultivos en medio líquido obteniéndose su contraparte atenuada en el Pasaje 19 (P19). La atenuación se confirmó inoculando hámsters (modelo de enfermedad aguda). Los animales infectados con P19 presentaron una sobrevida del 100% a los 21 días post infección (dpi), mientras que los infectados con P1 murieron entre a los 5 y 7 dpi. Los análisis histopatológicos confirmaron lo observado a nivel macroscópico, observándose infiltraciones alveolares e inflamación en tejido pulmonar de animales infectados con P1 y no así en P19. Estos resultados indican la rápida diseminación y colonización de diferentes tejidos por P1, confirmando así su virulencia y su posible transmisión luego de ser eliminada en la orina de los animales. Por otra parte, se observaron tasas diferenciales de crecimiento in vitro entre ambas cepas a favor de P1. Ésta alcanza rápidamente la fase exponencial (7-10 días) entrando en fase estacionaria pasados los 20 días de cultivo. Por el contrario, P19 entra rápidamente en fase estacionaria a los 7 días de iniciado el cultivo. Esto sugiere una mejor adaptación al crecimiento in vitro por parte de P1, en cambio las modificaciones en el genoma de P19 podrían haber impactado en el fitness de dicha cepa a las condiciones cambiantes del medio a través del tiempo. A fin de identificar dichos cambios genéticos se compararon los genomas y transcriptomas in vitro de P1 y P19 utilizando plataformas de secuenciación masiva. Si bien no se identificaron modificaciones de tipo estructural o INDELS (inserciones/deleciones), mediante el análisis de polimorfismos de nucléotido único (SNPs), se identificaron en P19 cambios no sinónimos de aminoácidos en proteínas correspondientes a superfamilias de catalasas (katE), y transportadores de lipoproteínas de membrana externa (lolA), entre otros. El análisis de expresión (RNAseq) identificó 328 transcriptos diferenciales entre P1 y P19, de los cuales 180 corresponden a P1 (54,88 %) y 148 a P19 (45,12 %). Entre los transcriptos sobreexpresados en P1 se identificaron reguladores transcripcionales, reguladores de sistemas de dos componentes, transportadores de membrana, etc. Contrariamente, la mayoría de los transcriptos sobreexpresados en P19 corresponden a genes que codifican para transposasas. Si bien la atenuación de P19 no puede atribuirse a un cambio puntual o a los genes diferencialmente expresados, el conjunto de los mismos podría ser la causa del fenotipo atenuado. Finalmente, y con el objetivo de evaluar la respuesta ante la infección con L. interrogans sv Pomona en un modelo que se aproxime al hospedador último de este patógeno, se utilizaron macrófagos bovinos derivados de monocitos (BMDMs). Las células infectadas con ambas cepas presentaron sobreexpresión de distintos inmunomoduladores, IL-1β, IL-6, IL-10 y TNFα respecto de las células sin infectar, pero cabe destacar que P1 indujo niveles de expresión de IL-10 mayores que P19, lo que estaría relacionado con la persistencia del patógeno como estrategia evasiva del sistema inmune del hospedador. Asimismo, en este trabajo se describieron por primera vez trampas extracelulares de macrófagos bovinos (bMETs) generadas por la infección de leptospiras y se observó que estas estructuras fueron inducidas de manera similar por ambas cepas. Por otro lado, P1 presentó mayor grado de internalización co-localizando con compartimentos endosomales ácidicos tardíos encomparación con P19. Esto también se observó cuando se inhibió la fagocitosis, lo que sugiere un ingreso a las células también por una vía independiente de fagocitosis. En suma, los resultados obtenidos indican una posible subversión de la respuesta inmune innata por parte de P1, y exponen la necesidad de profundizar en los mecanismos de invasión a macrófagos bovinos subrayando la importancia de estudiar al hospedador primario. Además, la identificación de mutaciones puntales y factores de virulencia diferencialmente expresados constituye un punto de partida clave para la generación de diagnósticos diferenciales y nuevas vacunas específicas contra la leptospirosis tanto bovina como humana. Este trabajo permitió entonces, profundizar en el conocimiento de la virulencia de Leptospira interrogans y su patogénesis en el modelo bovino, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país.

Descripción: Este trabajo aborda el análisis de estructura genética espacial (EGE) en especies arbóreas nativas de importancia para Argentina, y su asociación a otras variables, desde un enfoque interdisciplinar que incluye perspectivas biológicas y metodológicas. Mediante la revisión y comparación del desempeño de métodos estadísticos para detectar y caracterizar EGE, según distintos escenarios biológicos, se recomiendan estrategias analíticas para el estudio espacial de la variabilidad genética y su asociación con variables ambientales y fenotípicas. Se analizó la EGE a escala fina en un enjambre híbrido de Prosopis spp., encontrando significativa asociación de ésta con la variabilidad morfológica; información relevante para el ordenamiento del recurso genético algarrobo. También se analizó la correspondencia entre la variación espacial de la diversidad genética de poblaciones de Polylepis australis, a lo largo de su rango de distribución, y la inestabilidad del ambiente usando nuevos índices de heterogeneidad temporal del paisaje derivados de imágenes satelitales. Se concluye, que sitios ambientalmente más estables albergan mayores niveles de diversidad genética para esta especie. El estudio de EGE en árboles, y su asociación con variabilidad fenotípica y ambiental, permite inferir procesos evolutivos-ecológicos, que aportan conocimiento para mejorar el manejo y conservación de los bosques.

Descripción: La capacidad de los organismos psicrófilos para sobrevivir y proliferar a bajas temperaturas implica la superación de grandes obstáculos inherentes a los ambientes permanentemente fríos. Desafíos impuestos por las bajas temperaturas tales como la reducción de la actividad enzimática, alteración de la fluidez de la membrana, bajo transporte de nutrientes y productos de desecho, disminución de las tasas de transcripción, traducción y división celular, muestran que uno de los determinantes claves de la adaptación de la vida al frío yace indudablemente en la función de las proteínas que conducen el metabolismo y el ciclo celular de los organismos. En este escenario, la bacteria marina Bizionia argentinensis, aislada en el Territorio Antártico Nacional, constituye un modelo interesante para el estudio de nuevas proteínas que posean actividad biológica en condiciones de bajas temperaturas. La caracterización bioquímica y estructural de estas biomoléculas es un punto de partida para la comprensión general de los mecanismos que permiten a las bacterias marinas adaptarse a estas condiciones de vida extremas. En esta tesis se presenta un estudio de genómica estructural de proteínas de función desconocida de la bacteria B. argentinensis. En este contexto, se describe la caracterización bioquímica y estructural de dos blancos seleccionados: las proteínas BA42 y BA40. En particular, la estructura tridimensional de la proteína BA42 fue resuelta mediante RMN y Cristalografía de Rayos X. Estudios bioquímicos y biofísicos determinaron que BA42 es una fosfatasa la cual depende estrictamente de metales para su función y que la flexibilidad de la región comprendida por el sitio de unión a metales está asociada a la actividad de la proteína. Un análisis del contexto genómico de BA42 mostró que la proteína integra un operón constituido por algunas proteínas de función desconocida y otras asociadas a diversos roles celulares. Una de ellas, denominada BA40, pertenece a la superfamilia de factores de transcripción MerR. En este contexto, se comenzó el estudio de esta proteína con el fin de indagar sobre el rol biológico del operón y en particular de BA42. Los resultados confirmaron la actividad de unión al ADN de BA40 y se logró elucidar una secuencia consenso de ADN a la cual BA40 se une de forma específica. Así mismo, se observó que la región C-terminal de la proteína podría participar en la estabilización de la unión con el ADN, revelándose que la probable actividad transcripcional de BA40 podría encontrarse modulada mediante una interacción proteína-proteína, como ya ha sido descripto para proteínas con la misma arquitectura. Por último, el estudio in vivo de BA40 mostró que este factor de trascripción podría estar asociado a la respuesta a condiciones oligotróficas. De esta forma, los resultados y análisis que se detallan en esta tesis contribuyen al entendimiento de la relación entre la estructura y la función de proteínas de organismos psicrotolerantes, aportando valiosa información para la discusión de los mecanismos moleculares y estrategias relevantes de adaptación a bajas temperaturas de la vida en los océanos.

Descripción: Fil: Carreira, Valeria Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cul Consulte el resumen completo en el documento.

Descripción: Comprender la relación entre la variación fenotípica y la genotípica ha sido y sigue siendo unode los mayores desafíos de la biología moderna, ya que implica alcanzar una interpretación holísticade la descripción de caracteres complejos y sus relaciones evolutivas utilizando de manera conjuntaherramientas de la genómica funcional, la genética cuantitativa, la bioinformática y la genéticaecológica. En insectos fitófagos el comportamiento de oviposición constituye un componente importante dela elección de hábitat. Dada la multiplicidad de factores genéticos y ambientales que parecen afectarsu expresión fenotípica, el mismo puede definirse como un carácter complejo resultante de laparticipación de varios caracteres interdependientes. En esta tesis nos proponemos contribuir alconocimiento de la arquitectura genética del comportamiento de oviposición por medio del estudiogenómico poblacional de dos caracteres complejos relacionados, la preferencia por el sitio deoviposición (PO) y la aceptación de recursos de oviposición (AO) en la especie modelo Drosophilamelanogaster. Para cumplir con nuestros objetivos, cuantificamos la PO y la AO utilizando recursosque las moscas explotan como sustratos de cría en su hábitat natural: uva, tomate y naranja. Losresultados mostraron amplia variación fenotípica tanto de la AO como de la PO en todos losrecursos y combinaciones de recursos ofrecidos. Para ambos caracteres, encontramos que lavariación tiene una base genética y que su expresión depende del recurso (o combinación derecursos) ofrecido. En otras palabras se trata de caracteres cuya expresión depende del ambiente (plasticidad fenotípica). Posteriormente, realizamos análisis de asociación entre la variaciónfenotípica y la variación genética con el objetivo de establecer la arquitectura genética de la AO y la PO. Encontramos que la arquitectura genética de ambos caracteres es poligénica y que los genesque participan de su expresión se encuentran interactuando en redes génicas relacionadas con eldesarrollo del sistema nervioso y del sistema visual. Finalmente, identificamos genes que actúan através de los distintos niveles que conforman el mapa genotipo – fenotipo, presentando evidencia desu accionar en cada nivel por medio de los análisis de asociación entre la variación fenotípica y lavariación a nivel transcriptómico. Podemos concluir, que a lo largo de la presente tesis hemos contribuido al estudio delcomportamiento de oviposición, aportando evidencia de cómo se compone la arquitectura genéticadel mismo a través de los distintos niveles del mapa fenotipo-genotipo e infiriendo la importanciadel comportamiento de oviposición en la historia evolutiva de D. melanogaster.

Descripción: La neuroinflamación es considerada una característica neuropatológica de la enfermedad de Parkinson. Se ha observado activación de microglía y niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias, entre las que se encuentra el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), en la substantia nigra, una de las principales regiones del cerebro afectadas en esta enfermedad. Sin embargo, el rol funcional de la activación microglial y la sobre-expresión de TNF-α no es claro en la enfermedad de Parkinson. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la sobre-expresión crónica de TNF-α en la substantia nigra, e identificar moléculas candidatas a mediar ese efecto. Para ello, se inyectó en la substantia nigra de ratas adultas un adenovector que expresa TNF-α (AdTNFα), pudiendo detectarse la citoquina recombinante hasta 14 días p.i. La expresión crónica de TNF-α indujo una pérdida progresiva de neuronas en la substantia nigra, que comenzó el día 14 y se acentuó a los 21 y 28 días p.i., comparado con animales controles inyectados con un adenovector que expresa β- galactosidasa (Adβgal). La sobre-expresión de TNF-α produjo la aparición de síntomas motores a los 14 días p.i.; y la activación de la microglía y/o reclutamiento de macrófagos de la periferia desde el día 7 luego de la inoculación. No se pudo detectar inducción de IL-1β ni evidencias de apoptosis. En cambio, se observó un aumento en los niveles de ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2) y en la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS) en los animales que sobre-expresan TNF-α, por lo que dichas moléculas podrían estar participando de la muerte neuronal inducida por la citoquina. Por otro lado, se llevó a cabo un estudio de los genes regulados por TNF-α utilizando la técnica de microarrays. Entre los genes que se encontraron diferencialmente expresados entre los animales tratados con AdTNFα y Adβgal, estaban significativamente representados procesos relacionados con la respuesta inmune y el metabolismo. Se validó por RT- PCR en tiempo real la expresión disminuida de la proteína quinasa C tipo delta (nPKC- delta) y el regulador de la señalización por proteína G 3 (RGS3) en los animales que sobre-expresan TNF-α con respecto a los controles. En conclusión, podemos decir que la expresión prolongada de niveles pro- inflamatorios de TNF-α es suficiente para producir un efecto tóxico en las neuronas de la substantia nigra, con la aparición de síntomas motores y una respuesta glial característica. Los niveles y la duración de la expresión de esta citoquina son variables importantes para que ejerza un efecto neurodegenerativo. Se generó un modelo animal que permite estudiar los mediadores del efecto tóxico de TNF-α como lo demuestran los resultados de genómica funcional, sentando las bases para estudios futuros que puedan identificar blancos para una posible terapia contra la enfermedad de Parkinson.