Descripción: En este trabajo se presenta una nueva técnica para la determinación de tiempos de difusión rotacional en moléculas fluorescentes, a través del estudio de la fluorescencia producida después de la excitación con dos pulsos láser ultracortos. La técnica presenta la posibilidad de medir con resolución temporal limitada sólo por el ancho del pulso, sin necesidad de detectores rápidos. La idea central, es obtener los tiempos de difusión midiendo la energía total de fluorescencia en función del retardo entre pulsos. Partiendo de un modelo de molécula esférica o elipsoidal, se propuso una ecuación de difusión para describir la evolución de la población de moléculas excitadas. Como consecuencia, se obtuvieron expresiones para la energía de fluorescencia total, y se estudió su dependencia con los tiempos de difusión y los distintos parámetros del sistema (energía de excitación, orientación de los dipolos de absorción y emisión, retardo entre pulsos, etc.) Se muestra también, en este trabajo, los distintos esquemas experimentales montados para realizar mediciones de energía de fluorescencia en función del retardo entre pulsos. Finalmente, se muestran los valores para los tiempos de difusión rotacional obtenidos, a partir de estas mediciones en algunas muestras testigo.

Descripción: El objetivo de este trabajo de tesis es estudiar la dinámica de los entornos sonda-cajade polímero en películas nanométricas de polímeros amorfos. Para ello se utilizaron sondasfluorescentes, altamente sensibles a las propiedades fisicoquímicas de su entorno (Rojo Nilo)embebidas en polimetacrilatos de alquilo. La emisión de la sonda se estudió a escalamacroscópica (ensamble de moléculas de colorante) y a nivel de moléculas individuales. Enambos casos se analizaron las propiedades espectrales y rotacionales de la sonda en la caja depolímero. La espectroscopía de emisión de fluorescencia de moléculas individuales de Rojo Nilo mostró fluctuaciones espectrales cuya frecuencia y amplitud son independientes delespesor y tipo de polímero, mientras que las reorientaciones de la sonda dependen delespesor de la película, que esta asociado a cambios en el valor de la temperatura de transiciónvítrea por efecto del confinamiento. El fotoblanqueo se encuentra siempre presente enexperimentos de este tipo, y con esta motivación, se propuso una solución al estudio de ladinámica rotacional del ensamble en presencia de fotoblanqueo bajo excitación linealmentepolarizada. Se obtuvo así el coeficiente de difusión rotacional de la sonda en los polímeros,que explica la tendencia observada para la movilidad de moléculas individuales. Las medidasse realizaron con dos configuraciones de microscopio de fluorescencia: confocal condetección espectrográfica y de campo amplio con detección polarizada. Este último, se montóíntegramente en uno de los laboratorios de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.

Descripción: Las galectinas constituyen una familia de proteínas altamente conservadas a través de la evolución con capacidad de unir carbohidratos presentes en diferentesglicoproteínas de la membrana plasmática y la matriz extracelular. Estas proteínasreconocen en forma específica unidades repetidas de N-acetil lactosamina [LacNac, Galβ1-4-NAcGlc] presentes en N- y O-glicanos. El énfasis del trabajo se centró en determinar los detalles estructurales que diferencian a cada una de estas proteínas,buscando correlaciones entre la dinámica molecular, la estabilidad y la selectividad deunión a glicanos para desencadenar la función celular para la que han sido evolutivamente selecccionadas. A través de una aproximación multidisciplinaria, se empleó una variedad de técnicas de simulación computacional y diversas estrategias experimentales paraestudiar los mecanismos y determinantes moleculares de regulación de la unión aglicanos en galectinas y posterior activación de su función en diversos cultivoscelulares. Las metodologías empleadas consistieron desde simulaciones de dinámicamolecular clásica hasta la expresión y purificación de proteínas recombinantes yensayos de unión al ligando, cinéticas de oxidación y apoptosis in vitro mediantescitometría de flujo y diversas técnicas de microscopía óptica y electrónica. En primer lugar, este estudio se ha centrado en la caracterización y comparacion estructural y dinámica de cada galectina y su especificidad por diversosglicanos fisiológicamente relevantes. En segundo lugar, se ha estudiado el mecanismode oxidación y función de enlaces disulfuro en galectina-1, proponiendo la existenciade un interruptor molecular presente sólo en este miembro de la familia. El mismoexplicaría el cambio de función al cambiar de estado redox. Por último, se estudió elimpacto de la estructura cuaternaria en la unión a glicanos específicos en glicoproteínasy la formación de redes supramoleculares de glicanos en la superficie de la célula.

Descripción: Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límitefundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Lasnanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución,han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resoluciónespacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En lapráctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto devariables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de losmarcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienenlas ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso pocoinvasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numéricopor el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición desu patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculasindividuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico delos fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patronesde emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del númerode fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posicionesde cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen desuperresolución es necesario que los marcadores estén separados por distanciasmenores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedanobservarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite elencendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales dela nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones dela microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía porlocalización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización conposibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construidocomo parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 sedescriben aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica:el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina yla distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosomacruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.

Descripción: El objetivo general de este trabajo de tesis fue obtener sondas fluorescentes adecuadas para el marcado de biomoléculas y para su uso en técnicas de microscopía de fluorescencia de súper-resolución. Por un lado, se estudió el comportamiento de una serie de 3-hidroxicromonas (3-HC), sustituidas en dos posiciones clave de la estructura principal con grupos dadores y aceptores de electrones. Estos compuestos presentan una reacción de transferencia de protón en estado excitado (ESIPT, por sus siglas en inglés) que da lugar a una emisión dual proveniente de los dos tautómeros. La posición espectral y la relación de intensidades de las bandas N* (forma normal en estado excitado) y T* (forma tautomérica) dependen de las propiedades del entorno. Por tal motivo, con frecuencia las 3-HC se utilizan para estudiar cambios estructurales en sistemas celulares. El entendimiento del origen de su emisión dual, la evaluación de la magnitud de los corrimientos espectrales y el conocimiento de los tiempos característicos de estado excitado en relación a la estructura resulta de especial interés. En este trabajo se caracterizó la dependencia de la intensidad de las bandas N* y T* con las propiedades del solvente y la temperatura. En base a estos resultados y a cálculos de estructura electrónica se interpretó la influencia de los sustituyentes aceptores y dadores de electrones en las posiciones clave estudiadas. También se realizaron estudios resueltos en el tiempo que permitieron arrojar luz sobre el mecanismo por el cual se forman ambas especies N* y T*, determinando experimentalmente el valor de las constantes cinéticas involucradas, cuyos valores varían entre 10 picosegundos y unos pocos nanosegundos. Por otro lado, se estudió la marcación de un receptor de membrana, el receptor de la hormona liberadora de corticotropina de tipo 1 (CRHR1), un GPCR de clase B. Como marcador se utilizó un antagonista que se propuso en base a estudios de docking que predijeron una interacción favorable con el receptor. El compuesto sintetizado, ABP-09, es un aza-BODIPY y posee propiedades adecuadas para microscopías de super-resolución, debido a su estabilidad fotofísica y fotoquímica, su elevado rendimiento cuántico de fluorescencia y su capacidad de pasar a estados oscuros en forma intermitente. Su desempeño para la técnica de Microscopía Óptica de Reconstrucción Estocástica (STORM, por sus siglas en inglés) es comparable al de las sondas mayormente utilizadas en dicha técnica. Por estudios en células hipocampales se pudo verificar que ABP-09 presenta una actividad como antagonista de CRHR1 comparable a la de CP-376395, un antagonista comercial que fue co-cristalizado con el receptor. A su vez, por estudios de nanoscopía de fluorescencia en células que expresan el receptor se pudo evaluar la constante de asociación del colorante al receptor en el entorno celular. Para evaluar dicha asociación, se desarrollaron dos métodos cuantitativos. La metodología utilizada en el estudio de CRHR1 es aplicable a cualquier receptor cuya estructura cristalográfica se encuentre disponible. Por otro lado, el estudio de afinidad es extrapolable al análisis de cualquier experimento de doble marcación de nanoscopía basada en la localización de moléculas únicas.

Descripción: Las células de levadura, Saccharomyces cerevisiae, constituyen un sistema ideal donde estudiar los mecanismos de señalización celular. En este sentido, las células haploides de S. cerevisiae son un sistema de particular interés ya que responden a la feromona sexual secretada por las células del tipo sexual opuesto generando una secuencia de eventos, algunos de los cuales son observables a simple vista. Entre otros, se detiene el ciclo celular y se inicia un crecimiento polarizado hacia la célula secretora que lleva, eventualmente, a la fusión de las células y a la generación de un cigoto. Estudios previos habían demostrado que la incorporación de calcio durante la respuesta a la feromona era necesaria para coordinar los genes involucrados en la transducción de señales y la supervivencia celular. En esta Tesis se estudió la dinámica del calcio durante la respuesta a la feromona con una aproximación inédita: a través del estudio de células únicas. Con este fin se introdujo, desarrolló y validó el sensor fluorescente de calcio GCaMP6f en S. cerevisiae. Mediante experimentos de microscopía de fluorescencia in vivo, identificación y seguimiento de células únicas se mostró que la feromona no genera, como estaba reportado, un aumento continuo en los niveles citosólicos de calcio sino aumentos transitorios en forma de ráfagas de corta duración. Más importante aún, la presencia de la feromona parece traducirse en un aumento en la frecuencia de aparición de estas ráfagas de calcio sugiriendo que la información transmitida por el calcio está codificada en la distribución temporal de estas ráfagas. En levaduras existen al menos dos vías de incorporación de calcio del medio extracelular, un sistema denominado HACS formado por el complejo Mid1-Cch1 y un sistema llamado LACS regulado por la proteína Fig1. Analizando cepas carentes de las proteínas Fig1 y Mid1, se demostró en esta Tesis que las mismas son necesarias para el aumento en la frecuencia de aparición de las ráfagas de calcio feromona-dependiente. Con el fin de analizar el efecto de las diferentes vías de flujo de calcio hacia y desde cada uno de los reservorios internos sobre la dinámica de calcio citosólico durante la respuesta a la feromona construimos y analizamos de manera sistemática un conjunto de cepas mutantes afectadas en todos los transportadores de calcio conocidos en S. cerevisiae: las proteínas importadoras de Ca2+ vacuolar Pmc1 y Vcx1, la exportadora vacuolar Yvc1 y Pmr1, la ATPasa importadora de Ca2+ del aparato de Golgi. Los resultados obtenidos sugieren que la proteína Fig1 es responsable de gran parte de la dinámica de calcio durante la respuesta a la feromona. Inesperadamente observamos que Yvc1 también tiene un papel importante durante esta respuesta. A partir del modelado y la simulación de la dinámica del calcio citosólico y de la vacuola logramos asignar características diferenciales a las distintas vías de calcio las cuales explican parte de los resultados obtenidos.

Descripción: En las últimas décadas, la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) seconvirtió en un grupo de técnicas ampliamente usadas para estudiar la dinámica demoléculas en sistemas de diversa complejidad. Estas técnicas son mínimamenteinvasivas y permiten determinar con alta resolución espacio-temporal coeficientes dedifusión, constantes cinéticas e interacciones moleculares tanto in vivo como in vitro. Eneste trabajo de tesis, desarrollamos una combinación de métodos de FCS y simulacionescomputacionales para comprender procesos difusivos en sistemas complejos. Lasherramientas y conocimientos obtenidos fueron aplicados al estudio de la dinámica defactores de transcripción en embriones tempranos de ratón y al estudio de la difusiónen sistemas porosos ordenados. Una pregunta muy importante en el campo de desarrollo embrionario es en quémomento del desarrollo las células que componen el embrión de mamíferos comienzana ser diferentes entre sí y cómo estas diferencias influencian el destino de las célulashijas. Para responder esta pregunta, utilizamos FCS y caracterizamos la dinámica deciertos factores de transcripción (i.e. Sox2, Oct4 y Cdx2) en el núcleo de las células deembriones tempranos de ratón. Además, para interpretar los resultados obtenidosdesarrollamos FERNET (Fluorescence Emission Recipes and NumErical routines Toolkit),una herramienta que permite simular experimentos de FCS en escenarios máscomplejos y realistas. Nuestro análisis permitió determinar que los datos de FCS pueden ser interpretados porun modelo que considera que los factores de transcripción difunden en el núcleo celulare interactúan con dos poblaciones de sitios en la cromatina, con distintos tiempos deinteracción. Estos estudios permitieron determinar que cuando el embrión estáformado por tan sólo por cuatro células ya existen diferencias en la interacción de Sox2con el ADN, las cuales se correlacionarían con el linaje final de la progenie celular. En una segunda etapa, exploramos la difusión de sondas fluorescentes en films deóxidos mesoporosos, materiales sumamente relevantes por sus posibles aplicacionescomo sensores, catalizadores, y para la adsorción de gases. A diferencia del escenarioanterior, en este caso el sistema es altamente restringido y la geometría es estática. Nuestros estudios permitieron caracterizar la influencia de ciertas propiedades del film (i.e. tamaño de poros y cuellos) en la difusión de una sonda fluorescente. Con el fin decomprender las tendencias observadas en los experimentos realizamos simulacionesestocásticas en sistemas periódicos con potenciales simples.

Descripción: Las redes de señalización biológicas presentan módulos complejos e interconectados que producen una plétora de respuestas posibles a diversos estímulos. Debido a la variabilidad intrínseca a estos sistemas, se torna necesario multiplexar el estado de varios nodos simultáneamente para comprender su dinámica e interacción. En esta tesis se eligió estudiar la cascada apoptótica como sistema modelo de este tipo de redes. La apoptosis es un proceso de muerte celular programada crucial en organismos multicelulares y cuya disfunción puede resultar en el desarrollo de cáncer, entre otras patologías. Considerando que dicha cascada tiene una elevada variabilidad en su inicio, del orden de horas, mientras que el tiempo de activación entre sus nodos esta mejor conservado, del orden de minutos, resulta necesario implementar técnicas correlativas y resueltas en el tiempo. Con el objetivo de generar un mejor entendimiento de dicha red, se la modeló utilizando ecuaciones diferenciales ordinarias para describir su comportamiento ante ligandos extracelulares así como estrés intracelular. Se modificaron los biosensores utilizados para controlar mejor la perturbación introducida al sistema. Finalmente, la sinergia entre experimentos, análisis de datos y modelado que hizo posible el diseño, de forma constructiva, de un único modelo integrado capaz de predecir resultados experimentales propios y ajenos podría extrapolarse al estudio de otras redes.

Descripción: El desarrollo de métodos ópticos analíticos para monitoreo de salud vegetal ha crecido notablemente debido a que estas técnicas permiten ahorrar mucho tiempo y trabajo en el laboratorio. Actualmente, es relevante la posible aplicación de estas metodologías en el monitoreo a distancia de la vegetación. Esta tesis propone un acercamiento al monitoreo de la salud vegetal desde la óptica química-física. El objetivo principal del presente trabajo es la interpretación de la interacción de la luz con el material vegetal en forma rigurosa desde el punto de vista físico y matemático para desarrollar procedimientos de diagnóstico. En particular, se exploraron en profundidad los métodos ópticos basados en determinaciones de reflectancia y en la espectroscopía de fluorescencia. Se encontraron correlaciones entre los espectros de reflectancia con el contenido de pigmentos presentes en las hojas y con el contenido de agua de las mismas. Además, se demostró la aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y del modelo de Pila de Placas en hojas. Se efectuó un estudio exhaustivo de la emisión de fluorescencia de clorofila-a presente en el tejido foliar, prestando especial atención al desarrollo y aplicación de modelos adecuados para efectuar correcciones por procesos de reabsorción de luz. Las características morfológicas y fisiológicas de las hojas se ven reflejadas en sus propiedades ópticas; por lo tanto se evaluaron los parámetros fotofísicos de hojas expuestas a diversas condiciones naturales a fin de ahondar los conocimientos existentes al respecto. Adicionalmente, se estudió la variación de los parámetros fotofísicos de las hojas frente a situaciones de tensión tales como: senescencia, carencia de nutrientes y presencia de herbicidas. Finalmente, se desarrolló un método para obtener la distribución espacial de los pigmentos foliares dentro de las hojas. Las imágenes utilizadas se obtuvieron a partir de un escáner comercial lo que facilita la implementación de esta metodología con un bajo costo de operación.

Descripción: La microscopia de fluorescencia de campo lejano reviste gran importancia en el campo de las ciencias aplicadas. Su utilidad en la obtención de imágenes es gracias a su alta especificidad, sensibilidad y su carácter no invasivo. Pero su aplicación se encuentra aún limitada por el límite de difracción. La forma de superar este límite es mediante la utilización de los estados de la sonda utilizada, en lugar del instrumental óptico. El requisito principal es que la sonda sea fotoactivable, es decir que pueda “encenderse” y “apagarse” en forma inducida o aleatoria. El objetivo del trabajo de tesis es el de desarrollar sondas moleculares para microscopia de fluorescencia de campo lejano con resolución por debajo del límite de difracción. En este contexto se tomaron como partida rodaminas no fotoactivables, de la familia de los colorantes xanténicos, en particular la rodamina B y rodamina 6G. Estas fueron modificadas con una variedad de sustituyentes que permiten que sean fotoactivables (derivados espirorodaminas) y a su vez presenten reactividad frente a distintos analitos y/o contengan un grupos funcional de anclaje para la marcación de estructuras a observar. Los compuestos preparados responden a distintos estímulos (luz, pH, etc.) Posteriormente, se estudiaron distintas macroestructuras inorgánicas y orgánicas como vía de incorporación de estos marcadores. En primer lugar se utilizaron para la marcación de polímeros cargados (polielectrolitos), con el fin de estudiar con alta resolución la estructura espacial que adoptan las cadenas en distintos medios (polaridad del solvente, pH, fuerza iónica) y entornos (sobre distintas superficies, autoensamblados). En segundo lugar se prepararon co-polímeros en bloque formados por un monómero hidrofílico y uno hidrofóbico, los cuales le confieren propiedades anfifílicas. Esto provoca la formación de estructuras micelares en soluciones acuosas, las cuales por ejemplo pueden ser incorporadas dentro de organismos celulares. Finalmente se utilizaron nanopartículas (NP ́s) de sílice, poniendo particular énfasis en el estudio de los diferentes entornos y posiciones del colorante dentro de las NP ́s. Todas las estructuras preparadas fueron caracterizadas por métodos espectroscópicos (absorción y emisión), RMN1H, RMN13C, COSY. Se caracterizó además la respuesta de las mismas (cinética de aparición de fluorescencia) frente a cambios de pH, tanto de las sondas libres como dentro de las macroestructuras (NP ́s de sílice, polímeros, micelas). Finalmente, se estudió su respuesta a la fotoactivación por técnicas de microscopías a nivel de moléculas únicas. Cuando fue pertinente, se utilizaron las mismas para la adquisición de imágenes de súper-resolución en muestras y sistemas modelos.

Descripción: La interacción de la luz con organismos fotosintéticos produce señales que pueden ser detectadas mediante métodos no destructivos y en variedad de escalas, lo que resulta sumamente conveniente para el monitoreo ambiental y agronómico. No obstante, la complejidad estructural del material biológico introduce distorsiones de origen fotofísico en la información detectada, y la complejidad ecofisiológica dificulta su interpretación. El presente trabajo de tesis ha tenido por objetivo aportar al esclarecimiento de estos procesos desde una perspectiva fotofísica y fotoquímica, prestando particular atención a la fluorescencia de clorofila estacionaria y variable. Una parte importante del trabajo realizado consistió en la modelización de los procesos de emisión, reabsorción y dispersión de fluorescencia estacionaria en hojas y coberturas vegetales. Desarrollamos un modelo fotofísico de una cobertura vegetal genérica que fue validado en plantas ornamentales y cultivos de interés agronómico. Se diseñó y construyó una novedosa metodología de medición con la cual se registró, por primera vez en literatura, el espectro de fluorescencia de una cobertura vegetal de manera activa. A pesar de gozar de gran popularidad, el monitoreo de fluorescencia variable no suele ser abordado con la profundidad y rigurosidad requeridas para comprender y controlar todas las variables subyacentes a los procesos estudiados. En esta tesis hemos concebido un enfoque amplio pero a la vez detallado, utilizando equipos de fluorescencia modulada y detección rápida. Este abordaje nos permitió estudiar plantas C3, C4 y CAM en diferentes ambientes lumínicos y algas en diversas condiciones de salinidad, proponiendo también nuevas consideraciones para la utilización de estas técnicas. A través de una colaboración con el INIA (Uruguay) estudiamos la fluorescencia estacionaria y variable de tres cultivares de soja con diferentes tratamientos de irrigación en condiciones de campo. Un hallazgo prometedor ha sido la correlación entre el cociente de picos de fluorescencia y la productividad primaria, que a futuro permitiría evaluar la producción de biomasa de una cobertura vegetal desde aviones o satélites. Finalmente, a partir de la comparación entre la teoría de la representación y la teoría de la observación, presentamos un análisis epistemológico retrospectivo del trabajo realizado y destacamos la necesidad de problematizar las concepciones subyacentes al momento de hacer ciencia.

Descripción: El citoesqueleto es una red auto-organizada y dinámica presente en las célulaseucariotas. Está compuesto por tres tipos de biopolímeros: filamentos de actina,filamentos intermedios y microtúbulos. Estos filamentos se constituyen a partir dela polimerización de proteínas más simples y forman estructuras con diámetros de ~6nm para los filamentos de actina y ~10nm para los filamentos intermedios. Losmicrotúbulos son los elementos más rígidos del citoesqueleto, con una estructuratubular de diámetro externo de ~25nm. Estos biopolímeros, en conjunto con proteínas motoras, componen un entramado con propiedades mecánicas que permite alas células generar y reaccionar ante la acción de fuerzas. El citoesqueleto está involucrado en numerosos procesos celulares tales como lamigración, división, contracción y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento mecánico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organización y mecánica celular. La microscopía de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del citoesqueleto, permitiendo su visualización en células vivas. El análisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estudiar las propiedades mecánicas relevantes a su función biológica. Este tipo de análisis requiere la identificación de las posiciones de filamentos individuales con alta precisión. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas es extremadamente complejo. Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmode tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtúbulosfluorescentes con precisión subdifracción. Evaluamos el rendimiento de esta rutinamediante simulaciones numéricas de imágenes confocales y experimentos in vitro yobtuvimos una precisión de ~9nm para filamentos in vitro y ~20nm para filamentosen células fijadas. Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis vivas. Mediante un análisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equilibrio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento térmico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados para calcular la longitud de persistencia de los microtúbulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un parámetro ampliamente utilizado para describir las propiedades mecánicas de filamentos, y se define como la razón entre la rigidez exural del filamento y las fuerzas térmicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtúbulos en células vivas fue ~20 nm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este parámetro no se vio modificado en presencia de la proteína asociada a microtúbulos XTP o la depolimerización de actina. En contraste, la depolimerización de la red de filamentos intermedios disminuyó significativamente el valor de este parámetro. Por otra parte, exploramos si la inhibición de los eventos de polimerización y depolimerización de los microtúbulos podría afectar su rigidez exural efectiva. En este caso, la distribución de formas de los filamentos no se ajustó a un comportamiento térmico, como el observado en células control, indicando que el comportamiento mecánico de los microtúbulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la célula. Observamos que la depolimerización de filamentos de actina e intermedios aumentasignificativamente las fluctuaciones laterales de los microtúbulos, sugiriendoque estos filamentos contribuyen a la organización global de dicha red. Por otra parte, verificamos que la producción de fuerzas no es homogénea dentro de las células ya que los microtúbulos presentaban un movimiento más lento, pero más direccionado en la región cortical en comparación con la región perinuclear. En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dinámicos de loseventos de buckling de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis. Éstosson eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en células, y secaracteriza por una rápida exión del filamento seguida de su relajación. Se hapropuesto que estos eventos de rápida deformación dependen de fuerzas localizadasespacio-temporalmente resultantes de la acción de motores moleculares. Para comprender este fenómeno, caracterizamos los eventos de buckling medianteel tracking de microtúbulos fluorescentes individuales en combinación con simulaciones numéricas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podrían producir la exión de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron muchas de las características observadas en microtúbulos en células vivas, sugiriendo que el modelo mecánico implementado representaba los procesos esenciales del buckling de microtúbulos. Luego analizamos la interacción entre vesículas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtúbulos pudiendo así observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las vesículas. Los resultados obtenidos de este análisis sugieren que los microtúbulos podríanafectar el transporte indirectamente, aparte de servir como vías para las organelastransportadas. Con el fin de extender nuestro análisis del citoesqueleto a otros sistemas biológicos, estudiamos células de cáncer de próstata, que muestran una expresión anormal de proteínas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y capacidad de colonizar órganos lejanos. Desarrollamos técnicas computacionales para analizar imágenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas células y, en particular, cuantificar la acción de una droga que induce la expresión de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulación de la morfología celular. Nuestros resultados mostraron que la células bajo la inducción de HO-1 presentaban menos migración y una proporción significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las células control, los que indicaría una mayor comunicación entre células vecinas. En síntesis, llevamos a cabo experimentos biológicos para observar el citoesqueletoy desarrollamos técnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en célulasvivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balancey dinámica de fuerzas activas en células para la organización de la red de microtúbulos. Estos conocimientos también fueron de utilidad para analizar los cambios en elcitoesqueleto de células de cáncer de próstata.

Descripción: Fil: Villaruel, Cecilia Liliana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesosfisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedadde comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calciointracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a travésde receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de losmecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirsepor lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura deotros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida porcalcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulossobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, lasseñales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse enondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esasseñales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un graninterés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista dela actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señalesde calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos,el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentraciónde Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modosdependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrandoque son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta dela dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de ondavisible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transportey propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar losartefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados encúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señalespropagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimentalventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución delos RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de lasseñales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricaspara evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina conalguno de los otros aspectos que inuyen sobre la distribución de calcio libre para determinarlas características de las señales. El primer aporte fue introducir un métodoque permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenesrealizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relaciónseñal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cadaarreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintascondiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular,analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo lasdistintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observadosy la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observablesdel experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. Elestudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienende cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar enmás detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos,se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distintacinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusiónprevia sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de bufferslentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberacionesde Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen elacoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal,aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribuciónespacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3sen el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitandoasí la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostradotambién resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas,cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distintade RIP3s.

Descripción: Los polímeros conjugados (PC) son materiales orgánicos semiconductores de gran relevancia debido a su aplicación en dispositivos electrónicos orgánicos tales como celdas solares, diodos emisores de luz, transistores de efecto campo, memorias moleculares. El modelo típico de la estructura electrónica de los PC considera que las excitaciones electrónicas (excitones tipo Frenkel) en cada cadena polimérica se localizan en segmentos relativamente cortos (de 5 a 15 monómeros) denominados cromóforos. Estos cromóforos actúan en gran medida de forma independiente (el acoplamiento electrónico entre los mismos es débil) de manera tal que una cadena de PC es vista como un sistema multi-cromofórico. Consecuentemente, el funcionamiento y desempeño de dispositivos electrónicos orgánicos basados en estos materiales depende en gran medida de procesos fotofísicos elementales de transferencia de energía (TE) que ocurren entre cromóforos y dopantes o impurezas presentes en la matriz polimérica. Asimismo, las nanopartículas de polímero conjugado (NPC) dopadas con colorantes son sistemas nanoestructurados de interés académico y tecnológico. El interés académico reside en que pueden fabricarse con parámetros controlados, como el tamaño, la cantidad y distribución de dopantes, lo cual habilita su uso como sistemas modelo para el estudio de procesos de TE confinados. El interés tecnológico se debe a que las NPC pueden ser utilizadas como: fotosensibiladores de especies reactivas de oxígeno (ERO) para fototerapias anticancerígenas y antimicrobianas; sensores fluorescentes de parámetros de interés biológico (por ej. concentración de oxígeno, pH, iones, temperatura, etc.) y dispositivos de marcación celular fluorescentes. En estas aplicaciones, la eficiencia y direccionalidad de la TE desde la nanopartícula hacia el dopante es un factor crítico que determina el desempeño del material. En esta tesis se desarrollaron NPC (dopadas y sin dopar) y se caracterizaron los procesos de TE intrapartícula utilizando técnicas espectroscopicas convencionales, mediciones de fluorescencia de partícula unica, y modelado computacional. El modelo desarrollado simula procesos de TE utilizando el método Monte Carlo y considerando: difusión de la energía en la NPC, transferencia de energía a defectos ("trampas") y transferencia de energía a dopantes. Mediante el modelado de mediciones experimentales, se determinó la influencia de diversos parámetros en el proceso de TE, tales como: la cantidad y ubicación de los dopantes y trampas, distancia de difusión del excitón, tamaño de partícula, etc.; El conocimiento adquirido puede ser utilizado para la optimización de NPC con aplicaciones específicas en fototerapias y sensado fluorescente. Como parte del trabajo de tesis, se construyó un microscopio óptico ultrasensible modular capaz de implementar alternadamente las siguientes técnicas de molécula/ partícula individual: imágenes de fluorescencia de campo amplio, microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM, por sus siglas en inglés) y confocal; microscopía de fluorescencia de imagen espectral; imágenes de campo oscuro; medición de espectros de dispersión por campo oscuro; y determinación de distribuciones de diámetros hidrodinámicos por medición y análisis de trayectorias de partículas individuales (fluorescencia o campo oscuro). Por último, a partir de colaboraciones interdisciplinarias se evaluó la efectividad de NPCs desarrolladas para fotosensibilización de ERO en protocolos de terapia fotodinámica contra el cáncer.

Descripción: En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicasópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de losobjetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraerinformación cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenosobservados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadasdifunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizadoslas fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que seusan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudiode las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanzatambién sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica comoes el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración deun ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En losexperimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen apartir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuacionesde la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación quela caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámicode los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetrosde ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlaciónpueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de lospesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadasque reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros delsistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen deobservación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente porlos coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientesefectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variaciónde la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles oinmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyopeso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentracionesa partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión esposible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenosque involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posteriorgeneración de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, enparticular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada comofunción del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno delos mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudiosanteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango detiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora unacorreción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempostempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En eltrabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducciónen las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantáneade mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. Apartir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligaduraconsecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentalesde la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponenque la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es engran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio paraque expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite,por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínasinvolucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrolloembrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular,el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. Enmuchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de unmodelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde dondedifunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicarcuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 seanaliza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al teneren cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que lafluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para talfin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interaccióncon sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de laconcentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. Elmodelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicosrazonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd yla proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo quedescribe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribuciónde Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a esteión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permitecomparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados endistintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetrosexperimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadasaunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros. Palabras claves: Modelado de técnicas ópticas, análisis fluctuaciones, sistemas dereacción-difusión, fluorescencia, correlación

Descripción: La atmósfera terrestre está siendo continuamente bombardeada por partículas que viajan a gran velocidad, las cuales contribuyen a la radiactividad observada en la superficie terrestre. A principios del siglo pasado, se pensó que esta radiación era originada por rayos gamma, ya que éstos constituían la radiación extraterrestre más energética y penetrante conocida en aquella época. Es por ello que los entes responsables de generar esta radiación fueron bautizados como “Rayos Cósmicos”. Hoy en día se sabe que la mayoría de estos rayos, son núcleos de átomos y sólo una pequeña porción son rayos gamma y electrones. Su espectro de energía se extiende a lo largo de once décadas desde 10 E9 eV hasta energías del orden de 10 E20 eV, energías mucho mayores a las alcanzadas por partículas en cualquier acelerador creado por el hombre. La zona de los rayos cósmicos con energías mayores a ~ 10 E 17 eV es objeto de estudio en la actualidad, debido a que todavía existen muchas preguntas sin responder acerca de su naturaleza, su composición química y espectro, los mecanismos que les permiten alcanzar energías macroscópicas, la ubicación y característica de los objetos astrofísicos donde se generan, su propagación a través del espacio, e inclusive cuestiones más trascendentales para la física, como su sección eficaz con nucléolos y fotones, temas aún cuestionados para estas energías tan elevadas. El Observatorio Pierre Auger es un experimento actualmente activo dedicado al estudio de los rayos cósmicos altamente energéticos, cuyo objetivo es brindar información destinada a responder los enigmas aún vigentes para estas energías. El observatorio fue originalmente diseñado para detectar rayos cósmicos aproximadamente mayores a 10 E18 eV. El flujo de los rayos cósmicos en este rango de energías es muy bajo (aproximadamente menor a una partícula/Km2 /sr/año). Es por ello que se planificó que el área de colección del Observatorio Pierre Auger alcance los 6000 Km2, para poder disponer de una cantidad de eventos con una estadística sin precedentes en este rango de energías. La característica distintiva de este observatorio es la de ser híbrido, disponiendo de dos tipos de detectores: el detector de telescopios de Fluorescencia y el arreglo de estaciones Cherenkov de Superficie, que le permite registrar el desarrollo longitudinal y las partículas al nivel de la superficie terrestre respectivamente, pertenecientes a la lluvia de partículas generadas por los rayos cósmicos en la atmósfera terrestre. El Observatorio Pierre Auger consta de un sitio en el hemisferio sur y otro en el norte. El Observatorio norte está en la fase de investigación y desarrollo y será construido en Larmar en el estado de Colorado en Estados Unidos. El observatorio sur se ubica en el departamento de Malargüe en la provincia de Mendoza y está formado por un arreglo triangular de 1600 estaciones Cherenkov de superficies espaciadas a 1500 metros, cubriendo un área de 3000 Km2, y por 24 telescopios de fluorescencia apuntando hacia el interior del arreglo de superficie distribuidos en cuatro emplazamientos en su perisferia. La etapa de construcción del Observatorio sur ha finalizado y ahora se encuentra en una etapa de incorporación de extensiones para bajar el umbral de detección a energías del orden del ~ 10 E17 eV, con el fin de poder estudiar la zona del espectro de energía donde existe una gran riqueza física, ya que se supone se encuentra la transición galáctica-extragaláctica del origen de los rayos cósmicos. Las extensiones mencionadas son dos, AMIGA y HEAT. La primera consiste en agregar dos nuevos arreglos más pequeños de estaciones de superficie con espaciamientos de 433 metros y 750 metros. La segunda de las extensiones ya está en funcionamiento y consiste en el agregado de tres telescopios de fluorescencia apuntando a la parte más alta del desarrollo de las lluvias atmosféricas. Las estaciones Cherenkov de los nuevos arreglos estarán acompañadas por contadores de muones que serán enterrados a sus lados. Esto permitirá medir directamente la componente muónica de las lluvias, información que será destinada a realizar estudios de composición del rayo cósmico primario. La calibración del Observatorio es fundamental para obtener el espectro de energía de los rayos cósmicos detectados. Durante mi tesis doctoral he trabajado en la calibración tanto de los detectores de fluorescencia como así también de las estaciones Cherenkov de superficie. La calibración absoluta del detector de fluorescencia consiste en excitar cada uno de los telescopios mediante una fuente de luz artificial extensa que se coloca sobre su apertura. He caracterizado esta fuente determinando el grado de uniformidad de su emisión de luz. Mediante el desarrollo de una simulación de trazado de rayos he estudiado los efectos de la desviación respecto de la emisión perfectamente uniforme y he desarrollado un método para corregir estos efectos. La calibración del detector de superficie se realiza utilizando la información de las señales generadas por los muones atmosféricos de fondo. Para ello he participado en estudios que utilizan cálculos de Monte Carlo y semi-analíticos para reproducir y entender estas señales. Explotando la característica híbrida del Observatorio Pierre Auger he desarrollado un método para obtener la aceptancia del detector de superficie a través de la utilización de datos reales del detector de fluorescencia, como alternativa a los métodos tradicionales que se basan en resultados obtenidos a través de simulaciones numéricas, las cuales dependen de los modelos de interacción hadrónica adoptados. Las simulaciones del proceso de adquisición y reconstrucción de los eventos producidos por los rayos cósmicos involucran: la generación de la lluvia, la respuesta de los instrumentos del observatorio, y la reconstrucción de los parámetros del evento. Disponer de una cadena de simulación y reconstrucción de los eventos es fundamental para entender y evaluar el comportamiento del Observatorio. Por ello implementé una simulación completa del Observatorio, que contempla los telescopios de HEAT, las estaciones del nuevo arreglo AMIGA, y la propagación de las partículas a través de la tierra hasta llegar a la profundidad de los contadores de muones. Los estudios realizados con este programa de simulación han contribuido con la etapa de investigación y desarrollo de los contadores de muones de la extensión AMIGA, proporcionando información para la determinación del lugar óptimo para la instalación de los nuevos arreglos de superficie, como así también para determinar a que profundidad deben ser enterrados los contadores de muones. Finalmente he realizado un estudio para determinar los observables más relevantes para la discriminación de la composición de los rayos cósmicos, basados en técnicas del análisis estadístico multivariado y del ámbito de la inteligencia artificial, hasta ahora no muy difundidos en el campo de la astrofísica. Con este análisis pude evaluar la importancia de los observables aportados por distintos tipos de detectores, el de fluorescencia, el de superficie y los contadores de muones, a la hora de distinguir la composición química del rayo cósmico primario.

Descripción: Las reacciones de pardeamiento no enzimático (reacción de Maillard) y enzimático (polimerización de polifenoles oxidados) generan productos fluorescentes y pigmentos pardos que contribuyen a las características físico-químicas de materiales orgánicos (biomoléculas, alimentos, fármacos). El objetivo de esta tesis fue analizar las características cromáticas y de fluorescencia y la fotoestabilidad de los compuestos generados por la reacción de Maillard y de pigmentos polifenólicos, para dilucidar mecanismos de deterioro y control. Se estudiaron sistemas modelo susceptibles de desarrollar productos pardos: pigmentos de Maillard (aminoácidos ó proteínas con azúcares) y polifenólicos (extraídos de té) y semillas sometidas a envejecimiento acelerado. Los distintos tipos de pigmentos pardos tienen similares características cromáticas y fluorescentes. La observación más notable es la elevada fotoestabilidad de compuestos fluorescentes y pigmentos generados en la reacción de Maillard comparada con los polifenólicos. La irradiación en presencia del sensibilizante rosa de bengala produjo degradación tanto del colorante como de los pigmentos y permitió establecer diferencias en el mecanismo de fotodegradación de ambos tipos de pigmentos. El agregado de MgCl2 afectó la cinética de desarrollo de pigmentos de Maillard pero no tuvo efecto sobre sus características espectroscópicas ni sobre su fotoestabilidad. El conocimiento del efecto de la luz y de la interacción de los pigmentos con distintos agentes es relevante para controlar y predecir la estabilidad de diferentes materiales orgánicos y ofrecer alternativas para modular la cinética de su generación.

Descripción: El citoesqueleto es una red compleja y dinámica, formada por biopolímeros interconectados - microtúbulos, actina y filamentos intermedios (IFS)- que, entre otras funciones, están involucrados en la determinación de la morfología celular y la generación y transmisión de fuerzas. Tradicionalmente, se ha considerado que los IFs sólo contribuyen pasivamente a la viscoelasticidad celular; sin embargo, en los últimos años, diversos trabajos han mostrado que estos filamentos presentan roles muy activos en una gran variedad de procesos biológicos. El objetivo central de esta tesis fue estudiar, en células vivas, ciertas propiedades mecánicas de los filamentos intermedios de vimentina relevantes a su función biológica. Para ello combinamos microscopías confocal y de superresolución con una rutina que permite recuperar las coordenadas espaciales de filamentos individuales con precisión nanométrica. El análisis de las formas de los filamentos, basado en la descomposición en modos de Fourier, muestra que las curvaturas de los IFS en células vivas presentan un comportamiento símil térmico caracterizado por una longitud de persistencia aparente (Ip*) similar a las reportadas en experimentos in vitro. Adicionalmente, hemos determinado que perturbaciones a las redes de actina o microtúbulos alteran la lp* y la movilidad de los IFs. Estos resultados aportan datos relevantes sobre el acoplamiento mecánico entre los IFs con las otras redes del citoesqueleto. Trabajos recientes han planteado diferencias funcionales entre la red de vimentina perinuclear y la red periférica. Mientras la primera conforma una jaula que protegería mecánicamente al núcleo, la segunda estaría principalmente asociada a la integridad mecánica del citoesqueleto. En este contexto evaluamos propiedades biofísicas en ambas poblaciones de filamentos utilizando la novedosa técnica de superresolución MoNaLISA. Observamos que los filamentos periféricos están caracterizados por una mayor Ip*, y por ende una mayor rigidez flexural, y que su movilidad se encuentra restringida en mayor proporción que los perinucleares, apoyando la hipótesis de una asociación diferencial con microtúbulos y filamentos de actina en sendas regiones celulares. Los resultados obtenidos en esta tesis apoyan la existencia de un acoplamiento mecánico entre la red de vimentina y las redes de actina y microtúbulos que le permite responder activamente para compensar, de forma parcial, las perturbaciones mecánicas generadas en el citoesqueleto o transmitidas desde el exterior celular.