Descripción: El pool de vesículas inmediatamente liberables (IRP) es un pequeño pool vesicular que corresponde aproximadamente al 25% del pool de vesículas preparadas para liberarse. Se piensa que el IRP, a diferencia del resto del pool de vesículas preparadas para ser liberadas (RRP), se libera frente a pulsos despolarizantes de corta duración debido a su proximidad a los canales de Ca^2+. Pusimos a prueba esta hipótesis utilizando buffers de Ca^2+ exógenos rápidos y lentos, y toxinas especificas que permitieron asociar específicamente a la exocitosis de IRP con los canales de Ca^2+ de tipo P/Q. Estos resultados son coherentes con lo observado previamente por nosotros en ratones KO de la subunidad α1A. Esto nos llevó a pensar en la posibilidad de que este acople funcional fuera generado a través de una interacción molecular específica. Evaluamos que dicha interacción estuviera mediada por la secuencia synprint (synaptic protein interaction site) ubicada en un loop intracelular de la subunidad α1A de los canales de Ca^2+ P/Q y N. Es conocido que el synprint puede interactuar con la maquinaria exocitótica, siendo esto determinante en el acople asociado a la exocitosis sincrónica en terminales nerviosas. De acuerdo con esta hipótesis, en diversos experimentos encontramos que las células de ratón en cultivo transfectadas con la secuencia del synprint (para interferir en la interacción canal / vesícula) presentan una exocitosis de IRP marcadamente disminuida, mientras que fases menos acopladas al estímulo no se hallar alteradas. La segunda parte de esta tesis está enfocada en analizar los límites funcionales del IRP frente a una estimulación que simule las condiciones fisiológicas de las células cromafines, como son los trenes de potenciales de acción a frecuencias en el rango 0.2-10 Hz. Descubrimos una fracción de IRP que se libera particularmente frente a potenciales de acción que es capaz de recuperarse velozmente (τ ~ 1 seg) luego de haber sido deprimida. Los resultados muestran que en nuestras condiciones experimentales dicho subpool de IRP le permite a las células cromafines mantener una liberación eficiente y sostenida a bajas frecuencias

Descripción: EI IRP (por Immediately Releasable Pool), es un grupo de vesículas secretorias cuya exocitosis está altamente acoplada al estímulo debido a su estrecha asociación con canales de Ca²+ voltaje dependientes (CCVD). Sabemos por resultados previos, que entre un 40 y un 50% de IRP es exocitado por la aplicación de un potencial de acción (PAs), y que dicha exocitosis es seguida por una endocitosis rápida dinamina-dependiente totalmente compensatoria, ligada a un proceso rápido de recuperación de este pool vesicular. Por otro lado, la exocitosis completa de IRP (inducida por un pulso cuadrado de voltaje de 50 ms), es seguida también por un proceso endocítico que solamente compensa un 50% de la exocitosis previa, pero no sabemos nada acerca del mecanismo subyacente. En una primera parte de este trabajo de tesis nos propusimos estudiar la participación de la GTPasa dinamina en la endocitosis, al liberar gradualmente IRP en células cromafines murinas. Para ello, estimulamos con un protocolo compuesto por pulsos despolarizantes de duración creciente: PAS (5 ms) y pulsos cuadrados (SQPS) de 5, 10, 25, y 50 ms (SQP5-50ms). Nuestros resultados mostraron que si bien la dinamina es esencial en la endocitosis evocada por PAs, a medida que la fracción exocitada aumenta, este proceso se vuelve insensible a diferentes inhibidores de la actividad de esta proteína. Esto indica que al liberar completamente IRP se activa un proceso endocítico dinamina-independiente. Observamos, además, que la velocidad de esta endocitosis independiente de dinamina se correlaciona con la entrada de Ca²+, estimada como la integral debajo de la curva de corriente de Ca2+. Por otro lado, la aplicación de distintos inhibidores de la proteína quinasa C (PKC) disminuyeron la magnitud y la velocidad de la endocitosis dinamina-independiente, y el tratamiento con PMA (un activador de PKC) aumentó significativamente la amplitud de este proceso endocítico. Por lo tanto concluimos que dicha endocitosis dinamina-independiente es un proceso Ca2+ dependiente regulado por PKC. En la segunda parte de la Tesis, evaluamos el efecto de dos mutaciones de la dinamina-2, A618T y S619L, relacionadas con el desarrollo de la miopatía centronuclear, cuyos efectos sobre la exocitosis y endocitosis en células cromafines son desconocidos. La expresión de estas mutantes no modificó la exocitosis de IRP para ninguno de los estímulos evaluados. Sin embargo, inhibió significativamente a la endocitosis evocada por PAs, sin afectar a aquella provocada por SQP50ms, lo cual es coherente con la predominancia de la endocitosis dinamino-dependiente en el primer tipo de estímulo. Finalmente, estímulos más potentes, que exocitan cantidades de vesículas marcadamente mayores que IRP, promueven una endocitosis lenta identificada previamente por otros autores como un mecanismo clatrina dependiente, que es a su vez dependiente de dinamina. Coherentemente, este proceso resultó muy sensible a ambas mutantes. Por otro lado, la exocitosis de cantidades grandes de vesículas, inducida por pulsos despolarizantes prolongados o la aplicación del agonista nicotínico DMPP por 10 s, resultó inhibida significativamente en presencia de A618T y S619L. Este resultado, sumado a la falta de efecto que se observó previamente para estímulos de corta duración, sugiere que estas mutantes podrían estar alterando la provisión de vesículas a la membrana. De hecho, al analizar la distribución de vesículas secretorias por medio de microscopía confocal, observamos que la recuperación de las vesículas en las proximidades de la membrana plasmática, luego de un estímulo que induce exocitosis, se vio afectada negativamente en presencia de A618T y S619L. Llamativamente, se observó una marcada disminución en la formación de novo de F-actina cortical en células expresando las mutaciones, pero no en la condición control. Es esperable que esta disrupción en la formación de F-actina cortical tenga un efecto directo en el tráfico de vesículas a la membrana y, por lo tanto, en la recuperación de la población vesicular liberable y en la exocitosis inducida por estímulos potentes. Por otro lado, está demostrado que la F-actina participa en prácticamente todos los mecanismos de endocitosis conocidos. Por lo tanto, la alteración de la dinámica del citoesqueleto de F-actina cortical puede ser un denominador común a todos los efectos causados por A618T y S619L. Sin embargo, el mecanismo por el cual A618T y S619L producen este efecto sobre la F-actina, aun es una interrogante que queda por ser elucidada.

Descripción: En las células cromafines se han descripto varios tipos de endocitosis (clatrinadependiente, kiss and run, bulk endocitosis), las cuales contribuyen a la recuperación y elreciclado de la membrana plasmática, de sus proteínas, y de las vesículas que se hanfusionado por exocitosis. En esta Tesis doctoral se ha medido electrofisiológicamente laendocitosis rápida en células cromafines de ratón, observándose dos modalidades. Por unlado, una endocitosis compensatoria que evoluciona con una única constante temporalrápida de ~8 seg, e internaliza aproximadamente la misma cantidad de membrana que fueexocitada durante la estimulación. Esta modalidad se dispara en respuesta a una entrada de Ca2+ menor a 79 pC (grupo LCG, por “low current group”). Por otro lado, se identificó unaendocitosis en exceso que internaliza una cantidad de membrana mayor a la exocitadapreviamente, evolucionando con dos constantes temporales, una rápida de cinética similara la del LCG y una ultra-rápida de ~0,6 seg. Esta última modalidad es disparada por unaentrada de Ca2+ mayor a 79 pC (grupo HCG, por “high current group”). Por medio de lautilización de fármacos específicos, se demuestra en esta Tesis que la endocitosis rápidadepende específicamente tanto de la entrada de Ca2+ a través de canales dependientesde voltaje (CCDV) de tipo L como del Ca2+ liberado desde el retículo endoplasmático. Además, la utilización de BAPTA demostró que la endocitosis rápida sería dependiente deuna señal de Ca2+ localizada. Por otro lado, dos inhibidores del reclutamiento de clatrinainhibieron totalmente la endocitosis en el grupo LCG, y parcialmente en el grupo HCG. Esto sugiere que en este último grupo, se activaría un mecanismo clatrino-independiente. En HCG ambos componentes cinéticos se vieron afectados por los inhibidores de clatrina,sugiriendo que cuando la entrada de Ca2+ es muy alta la endocitosis clatrina-dependientepuede evolucionar a velocidades aún no reportadas en la literatura. Finalmente,experimentos de imaging con FM1-43 mostraron que la endocitosis en exceso inducidapor una despolarización con alto K+ se compone de una fracción reciclable a vesículasliberables y de otra no reciclable en un período de 30 minutos, siendo la primera inhibidaparcialmente por un bloqueante del reclutamiento de clatrina. Estos resultados en suconjunto nos permiten sugerir un modelo en el cual: (a) la entrada localizada de Ca2+ por CCDV tipo L induce la liberación de más Ca2+ del retículo endoplásmico. (b) Elconsecuente aumento de este catión induce la activación de una endocitosis clatrinadependiente, que debido a su Ca2+ dependencia se muestra muy rápida al comienzomientras el Ca2+ alto persiste en el citosol, y más lenta luego de que la concentracióncitosólica del catión ha disminuido. Esto explicaría la clatrino dependencia de amboscomponentes. (c) Esta endocitosis clatrina dependiente resulta parcialmente en lageneración de nuevas vesículas liberables. (d) La gran entrada de Ca2+ en el grupo HCGinduciría además la activación de un proceso clatrina independiente, que no se recicla envesículas liberables en los tiempos del experimento.

Descripción: En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosisvesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimientofrente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias deestimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, seevidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial deacción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (porexocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en elpool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende enun 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismoindependiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s)luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia devesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápidadependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En lasegunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosisindependiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizandodespolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron lasiguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentesextracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNAREsinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) losresultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, yque interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuenciasynprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induceuna exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependienteen parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activadodirectamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, graciasa su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener lasecreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas.

Descripción: Los espermatozoides de mamífero adquieren su capacidad fecundante después de una serie de modificaciones bioquímicas en el tracto reproductor femenino, colectivamente llamadas capacitación. Estos cambios son esenciales para que los espermatozoides puedan realizarla exocitosis acrosomal (EA), un proceso que es fundamental para la fecundación. En este trabajo se estudiaron los cambios en el citoesqueleto de actina en la preparación para la ocurrencia de la EA así como también, los cambios en los niveles de calcio intracelular como evento fundamental para las etapas finales de la fusión de membranas. La dinámica del citoesqueleto de actina juega un rol central en controlar el proceso de exocitosis en células somáticas así como en los espermatozoides de varias especies demamíferos. A pesar de que en células somáticas, laspequeñas GTPasas de la familia Rho son ampliamente conocidas como reguladores principales de la dinámica dela actina, su función en espermatozoides es desconocida. En el presente trabajo se caracterizó la participación de las pequeñas GTPasas de la familia Rho en la vía de señalización que conduce a la polimerización de actina durante la capacitación del espermatozoide de ratón. Se observó que la mayoría de las proteínas de esta cascada de señalización y sus proteínas efectoras se expresan en el espermatozoide de ratón. La activación de las vías de señalización de AMPc/PKA, RhoA/C y Rac1 es esencial para la activación por fosforilación de LIMK1 en Treonina 508. Cofilin es fosforilada en Serina 3porLIMK1 durante la capacitación de manera transitoria. La inhibición de LIMK1 por un inhibidor específico (BMS-3) resultó en menores niveles de polimerización de actina durante la capacitación y una marcada disminución en el porcentaje de espermatozoides que realizan EA. Asimismo se sabe que es necesario un aumento en el Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) para que la EA se produzca. La progesterona producida por las células del cúmulus ha sido asociada con diversos procesos fisiológicos en los espermatozoides, incluyendo la estimulación de la EA. En este trabajo, investigamos la correlación espacio temporal entre los cambios en el [Ca2+]iy la EA en espermatozoidesindividuales de ratón en respuesta a la progesterona. Se encontró que la progesterona estimula un incremento en el [Ca2+]i encinco patrones diferentes: gradual,oscilatorio, transitorio tardío, transitorioinmediato, y sostenido.Tambiénse observó que el aumento en el [Ca2+]ipromovido por la progesterona puedecomenzar tanto en el flagelo como en la cabeza del espermatozoide. Se validó la utilización de FM4-64 como un indicador de la ocurrencia de la EA mediante la detección simultánea del aumento de su fluorescencia y la pérdida del EGFP en espermatozoides transgénicos EGFPAcr. Por primera vez, se logró visualizar simultáneamente el aumento en el [Ca2+]i y el proceso de exocitosis en respuesta a la progesterona, observándose que sólo un aumento transitorio específico en el [Ca2+]i originado en la cabeza del espermatozoide promueve la iniciación de la EA. En conclusión, en esta tesis se logró evidenciar la importanciade las pequeñas GTPasas de la familia Rho y sus efectores principales LIMK1 y Cofilin en la regulación de la dinámica del citoesqueleto de actina en la preparación del espermatozoide para poder realizar la EA. A su vez, se identificó el tipo de aumento de [Ca2+]i específico que es necesario para iniciar los eventos finales de la EA estimulada por progesterona.

Descripción: La fecundación involucra eventos de adhesión celular ovocitoespermatozoide dependientes de Ca2+. Cadherina epitelial (cadE) es una glicoproteína de membrana de 120 KDa, con 5 dominios extracelulares, 1 transmembrana y 1 citoplasmático. CadE se asocia al citoesqueleto de actina a través de moléculas adaptadoras como β-catenina y está involucrada en la adhesión celular dependiente de Ca2+. CadE participa en el desarrollo embrionario, la organogénesis y mantenimiento de tejidos y la tumorigénesis. El objetivo de este proyecto fue evaluar la expresión de cadE en tejidos reproductivos, su presencia y localización en ovocitos y espermatozoides y su participación en la fecundación. Se emplearon 2 modelos: humano y murino. Los estudios describen 1) la expresión del ARNm de cadE en testículo y epidídimo y 2) la presencia de la proteína en extractos de epidídimo y su localización en las células epiteliales 3) la presencia de cadE en estructuras membranosas del plasma seminal humano y del fluido epididimario murino 4) la presencia, formas proteicas y localización de cadE, β-catenina y actina en espermatozoides murinos epididimarios y humanos eyaculados 5) la localización de cadE en espermatozoides capacitados y reaccionados 6) la localización de cadE en ovocitos y formas proteicas en ovocitos murinos 7) la capacidad de anticuerpos bloqueantes de la función adhesiva de cadE de inhibir la interacción espermatozoide-ovocito 8) la evaluación de la presencia de cadE en pacientes en tratamiento por infertilidad e identificación de alteraciones en algunos casos. Este es el primer estudio que aborda de manera exhaustiva la detección de cadE en las gametas humanas y murinas y muestra evidencias de su rol en la fecundación.

Descripción: El proceso de reciclado de las vesículas sinápticas es una característica integral de la función presináptica y determina su habilidad para mantener la liberación del neurotransmisor durante una actividad repetitiva. En esta tesis, caracterizamos el reciclado de las vesículas sinápticas en el terminal neuromuscular de ratón y estudiamos su regulación por los canales de calcio dependiente de voltaje (CCDV), específicamente el canal de calcio tipo L, y por el neuromodulador adenosina. Para desarrollar este trabajo, utilizamos indicadores fluorescentes tipo FM para marcar la membrana de las vesículas sinápticas y técnicas electrofisiológicas para cuantificar la liberación de las vesículas sinápticas. En el terminal neuromuscular de ratón, determinamos que el reciclado vesicular es regulado por el nivel de actividad neuronal. La estimulación a alta frecuencia produce la movilización de dos pooles funcionales de vesículas sinápticas que difieren en su disponibilidad de liberación. En base a esta característica, definimos estos pooles como pooles vesiculares de liberación rápida o lenta. Por otro lado, evidenciamos que la duración de la estimulación a alta frecuencia determina un reciclado vesicular selectivo y secuencial hacia estos pooles vesiculares funcionales. El influjo de calcio a través de los CCDV tiene un papel clave en la señalización neuronal durante el proceso de la neurotransmisión, coordinando el reciclado de las vesículas sinápticas. En este trabajo presentamos evidencias directas que vinculan al CCDV tipo L con la regulación del reciclado vesicular. Hemos confirmado la funcionalidad de CCDV tipo L durante estadios plásticos del terminal neuromuscular. Es decir, observamos la participación de estos canales únicamente durante períodos de actividad neuronal sostenida e intensa. Se demostró que el influjo de calcio a través del CCDV tipo L promueve la endocitosis y la recuperación de las vesículas sinápticas hacia el pool vesicular de liberación rápida, regulando la eficiencia sináptica durante la actividad neuronal intensa. La adenosina es un neuromodulador bien establecido en la unión neuromuscular de ratón. En ausencia del efecto de la adenosina endógena sobre los receptores A1, evidenciamos un incremento en la exocitosis vesicular y en el tamaño del pool de reciclado vesicular, y un direccionamiento de reciclado vesicular hacia el pool de liberación rápida. Debido a que la adenosina y el bloqueo del CCDV tipo L presentaron un efecto similar sobre el reciclado vesicular, una hipótesis plausible fue que la adenosina a través de un efecto inhibitorio sobre el CCDV tipo L afectaría el reciclado vesicular. A través de evidencias experimentales esta hipótesis fue rechazada. En base a las similitudes observadas en el reciclado vesicular, es factible suponer que tanto la adenosina como el bloqueante del CCDV tipo L inhiben un mecanismo común.