Descripción: Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) se producen en distintas condiciones fisiológicas y ambientales en estrecha relación con las condiciones de aireación. Los mecanismos de defensa contra estas moléculas resultan cruciales para la supervivencia. Pseudomonas extremaustralis es una bacteria antártica con alta resistencia al estrés por lo que es un modelo de interés para el estudio de la adaptabilidad ambiental. Este trabajo explora las respuestas al estrés oxidativo y nitrosativo en distintas condiciones de aireación utilizando enfoques globales y fisiológicos en P. extremaustralis. En aerobiosis se observó la activación de las defensas antioxidantes y poco efecto del estrés generado por el H2O2 en comparación con microaerobiosis. En contraste, el estrés oxidativo en microaerobiosis provocó mayor daño a macromoléculas y menor supervivencia. Los análisis globales realizados (transcriptómica y proteómica) mostraron no solo el despliegue de respuestas a estrés tradicionales sino también la sobreexpresión de genes relacionados con otros mecanismos entre ellos la formación de biofilms, flagelos y quimiotaxis. P. extremaustralis presentó un fenotipo de hiperflagelación y mayor formación de biofilms en condiciones de estrés oxidativo en concordancia con lo observado en los análisis globales. El análisis transcriptómico también permitió identificar y clasificar posibles pequeños RNA (sRNA) con expresión diferencial entre condiciones, que podrían tener funciones regulatorias relacionadas con la disponibilidad de O2 y el estrés oxidativo. Se validaron experimentalmente 8 de estos sRNA y uno de ellos, denominado sRNA40, fue analizado mediante experimentos de expresión pulsada seguidos de análisis transcriptómicos. Estos análisis permitieron identificar 19 genes con expresión diferencial en respuesta a la sobreexpresión de sRNA40 en microaerobiosis, relacionados con sistemas de transporte o de secreción que constituirían su blanco de acción. Por último, se analizó la respuesta a estrés nitrosativo inducido por nitrosoglutatión (GSNO) en microaerobiosis, donde la supervivencia luego de la exposición a GSNO fue menor que en aerobiosis. El análisis transcriptómico mostró incremento en la expresión de diversos genes como los relacionados con la producción y el transporte de pioverdinas, el metabolismo del hierro y la síntesis de proteínas, sugiriendo un alto turnover proteico probablemente relacionado con el efecto deletéreo del GSNO principalmente sobre proteínas que contienen hierro. También se verificó la activación del catabolismo del inositol, una vía poco estudiada en Pseudomonas, que aparece como una alternativa novedosa involucrada en la respuesta en presencia de estos compuestos. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que en condiciones microaeróbicas P. extremaustralis despliega un conjunto de mecanismos fisiológicos, adicionales a enzimas detoxificantes, frente a agentes estresantes. Estos resultados contribuyen al conocimiento de la fisiología de P. extremaustralis frente al estrés oxidativo/nitrosativo en distintas condiciones de aireación. Algunos de los resultados obtenidos pueden extenderse a otras bacterias relacionadas y pueden ser de utilidad para aplicaciones biotecnológicas por su relevancia para la supervivencia de los organismos utilizados.

Descripción: La respuesta celular a estrés incluye mecanismos como el arresto traduccional y la relocalización de mRNAs no traducidos a ribonucleopartículas, como gránulos de estrés (SGs) y cuerpos de procesamiento (PBs). La Proteína Quinasa dependiente de cAMP (PKA) participa en una amplia variedad de procesos fisiológicos. En Saccharomyces cerevisiae un único gen codifica para la subunidad regulatoria (BCY1) y tres genes para las subunidades catalíticas (TPK1, TPK2 y TPK3). Examinamos el rol de la PKA en S. cerevisiae en la respuesta a estrés térmico. Luego de someterse a estrés térmico moderado, Tpk3 se agrega y promueve la agregación de eIF4G, Pab1 y eIF4E. En cambio, el estrés térmico severo lleva a la formación de PBs y SGs que contienen tanto Tpk2 como Tpk3 y el complejo de inicio de la traducción 48S. La deleción de TPK2 lleva a un arresto traduccional robusto, un incremento en la agregación de SGs/PBs y una hipersensibilidad traduccional al estrés térmico; por otro lado, la deleción de TPK3 reprime la formación de SGs/PBs, el arresto traduccional y la respuesta de varios mRNAs analizados. Nuestras evidencias sugieren que Tpk2 y Tpk3 tendrían roles opuestos en la respuesta traduccional generada por estrés térmico y muestran cómo una misma vía de señalización puede generar respuestas fisiológicas diferentes. Analizamos complejos proteicos formados bajo estrés térmico, utilizando proteómica libre de marcación. El análisis de Gene Ontology Enrichment muestra que las proteínas enriquecidas en la fracción granular que fueron identificadas exclusivamente a 37°C, en su mayoría pertenecen a proteínas vesiculares de la familia COPI, componentes de gránulos de estrés citoplasmáticos y de subunidad ribosomal. En contraste, las proteínas enriquecidas exclusivamente en la fracción granular a 46°C 10 minutos corresponden en su mayoría a componentes de gránulos citoplasmáticos de estrés y de complejo de inicio de la traducción. Mediante microscopía de fluorescencia pudimos validar los cambios en localización sub-celular de varias proteínas candidatas obtenidas por el análisis proteómico. Para analizar la composición proteica de gránulos que contenían Tpk2 o Tpk3 evocados por estrés térmico se realizó un análisis de co-localización subcelular en colecciones de cepas que co-expresan Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry y ORFx-GFP. Mediante esta técnica se pudieron identificar proteínas no descritas anteriormente como componentes de gránulos evocados por estrés, y además caracterizar sus niveles de co-localización en gránulos que contienen Tpk2-mCherry o Tpk3-mCherry. En conjunto, el desarrollo de esta tesis permitió analizar cómo el estrés térmico moderado o severo genera una respuesta diferencial que se traduce en composición específica de gránulos.

Descripción: La desertificación es un problema global ante el que la revegetación cobra relevancia. Su éxito depende principalmente del establecimiento de los plantines que, en ambientes áridos, deben sortear la marcada escasez de agua. Investigamos la plasticidad de la morfología y fisiología de especies leñosas de ambientes áridos en respuesta a la disponibilidad de agua, para determinar si el régimen de cultivo en vivero modifica los caracteres morfo-fisiológicos de resistencia a la sequía, y si esto impacta en la supervivencia y crecimiento de los plantines en planes de revegetación. Para ello caracterizamos ambientes del Monte Central (Argentina) degradados y en buen estado de conservación. En cuatro especies leñosas nativas, Bulnesia retama, Prosopis argentina, Prosopis flexuosa y Prosopis alpataco, evaluamos la plasticidad de caracteres de resistencia a la sequía ante dos regímenes de riego contrastantes. Finalmente, implementamos un plan de revegetación piloto en un área degradada. Los sitios degradados presentaron diferencias en la cobertura y composición vegetal, el ambiente edáfico y superficial con respecto a sitios bien conservados, presentando características más estresantes para el desarrollo de la vida vegetal. Las especies mostraron plasticidad de caracteres morfológicos, fisiológicos y bioquímicos. Cada especie presentó respuestas particulares, independientemente del grupo funcional al que pertenecía (xerófitas o freatófitas). No observamos diferencias en su supervivencia a campo, sin embargo, aquellas cultivadas con estrés hídrico presentaron mayor crecimiento relativo a su tamaño inicial. Concluimos que la disponibilidad hídrica modela el desarrollo de los individuos, aunque no de la misma manera en todas las especies. Estas diferencias se ven reflejadas a campo en mayor crecimiento relativo, pero no en una mayor supervivencia de individuos. Estos resultados podrían conducir a optimizar los procesos de revegetación de zonas áridas a partir de la elección del régimen de cultivo más adecuado según la especie.

Descripción: Aunque está clínicamente aceptado que la diabetes predispone a sufrir infecciones severas y los estudios sugieren una asociación entre esta patología y las infecciones, no se conocen los mecanismos que median entre la diabetes y la inmunosupresión. A su vez, el estrés tiene un significativo reconocimiento en el desarrollo y la evolución de la diabetes. Es así que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta inmune en la diabetes mellitus tipo 1, ampliando el conocimiento acerca de los factores genéticos y no genéticos que participan en la evolución del estado diabético y en la alteración de la respuesta inmune. Para esto, se utilizó un modelo experimental murino de diabetes mellitus tipo 1 en dos cepas de ratones: BALB/cByJ y C57Bl/6J y se analizó la respuesta inmune encontrándose que, en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ, la repuesta inmune determinada in vivo e in vitro se encontraba afectada, mientras que en los ratones de la cepa C57Bl/6J no lo estaba. A continuación se investigó el efecto del estrés sobre la respuesta inmune en la diabetes. Para esto se utilizó el modelo de estrés crónico moderado (CMS) aplicado luego de la instauración de la diabetes. Los resultados mostraron que en los ratones diabéticos de la cepa BALB/cByJ el CMS provocó alteraciones más tempranas sobre la proliferación linfocitaria probablemente mediadas por el aumento en la glucemia. En estos ratones se observó una correlación positiva entre la glucemia y catecolaminas. En cuanto al efecto sobre la cepa C57Bl/6J, sólo se encontró un aumento en las glucemias sin estar presente la alteración inmune. Dado que la hiperglucemia es el principal factor involucrado en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, se evaluó su participación en los efectos observados. Para esto, se analizó el efecto de la alta glucosa sobre la actividad linfocitaria normal. Las altas concentraciones de glucosa sobre linfocitos provenientes de la cepa BALB/cByJ afectaron directamente la proliferación y condujeron a la muerte de las células, alteración que no se observó en los linfocitos provenientes de la cepa C57Bl/6J. Entre los mecanismos que estarían implicados en los efectos deletéreos de la alta glucosa se destacó el aumento en el estrés oxidativo. Estos resultados señalan la influencia del condicionamiento genético y del estrés en el deterioro de la respuesta inmune en el estado diabético. Si bien la extrapolación de estos resultados a pacientes con diabetes debe ser tomada con precaución, puntualizan la importancia de un temprano y adecuado control de la glucemia como así también de los factores ambientales que puedan alterarla.

Descripción: En el presente trabajo estudiamos el efecto del estrés prenatal (EP) en la respuestaneuroinmune en animales adultos. Observamos que machos y hembras respondierondiferente ante el EP, tanto a nivel inmunológico como comportamental. Los machospresentan una mayor respuesta inmune innata en relación a una mayor secreción de IFN-γ. Las hembras presentan algunos trastornos conductuales asociadosposiblemente a una disminución de BDNF así como también a un aumento central yperiférico de IL-4 y a una disminución periférica de IFN-γ. Ante nuevas situaciones deestrés en la adultez observamos que, las hembras EP tienen una respuesta inmunedesmejorada ante situaciones de estrés agudo y un peor desempeño en aquellaspruebas que evalúan la memoria espacial al ser expuestas a estrés crónico. Lasalteraciones inmunológicas podrían estar relacionadas con una disminución delbalance Th1/Th2 y un mayor efecto inhibitorio de los glucocorticoides. Los trastornosconductuales podrían estar asociados a una disminución del BNDF y a un aumento delos receptores a GC en hipocampo inducidos por EP. Los machos EP expuestos aestrés en la adultez presentan un aumento en la respuesta inmune innata que estaríarelacionado con un aumento en los niveles de IFN-γ. Sin embargo, tienen unadisminución en la inmunidad adaptativa, que al igual que las hembras, tendría relacióncon el mayor efecto inhibitorio ejercido por la corticosterona. Por otro lado, en losmachos tanto controles como EP, la exposición a estrés agudo o crónico no indujoalteraciones importantes en las pruebas comportamentales realizadas. Los resultados encontrados nos permiten concluir que el estrés materno inducecambios neuroinmunes en las crías que se pondrían especialmente en evidenciacuando estos individuos deben enfrentarse a nuevas situaciones de estrés en laadultez, siendo las hembras más sensibles que los machos. Además, hallamos que loscambios inducidos por exposición a EP se dan paralelamente en el hipocampo y en lascélulas del sistema inmune. Podría entonces sugerirse que estas células pueden serindicadores periféricos de una mayor susceptibilidad a padecer trastornos al serexpuestos a nuevas situaciones de estrés en la adultez.

Descripción: Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas (ca. 12 KDa) y ubicuas que en los cloroplastos de las plantas exhiben dos isoformas, Trx-m y Trx-f, implicadas en la regulación lumínica de las enzimas. Aunque la mayoría de los trabajos realizados analizaron bioquímicamente las Trxs cloroplásticas, las técnicas de proteómica y genómica asociaron recientemente estas proteínas con una variedad de procesos novedosos. Sobre estas bases, estudiamos in vivo la vinculación de las Trx-m y Trx-f con las funciones biológicas. Para ello, construímos 4 y 6 líneas transgénicas que sobre-expresaban la Trx-m y la Trx-f de colza (Brassica napus), respectivamente, en Arabidopsis. Aunque los niveles de proteínas recombinantes en estas líneas independientes y homocigotas fueron de 2 a 10 veces superiores a la variedad nativa, no observamos características fenotípicas distintivas, ni variaciones significativas en la biomasa y el tenor de clorofilas. Sin embargo, cuanto mayor el nivel de Trxs, mayor era el contenido de almidón y azúcares solubles. Por otra parte, las respuestas a las condiciones ambientales adversas variaron con los perturbantes utilizados. Mayores niveles de Trx-m y Trx-f incrementaron la respuesta antioxidante cuando el estrés oxidativo era generado por H2O2 mientras que, ante el metil viológeno, la tolerancia fue (i) persistente en todas las líneas sobre-expresantes de Trx-m y (ii) ambigua para las contrapartes de Trx-f. Las plantas transgénicas exhibieron un comportamiento similar a la variedad nativa frente a otros inductores del estrés oxidativo (e.g. Rosa de Bengala). Los resultados obtenidos muestran in vivo que el incremento de las Trxs cloroplásticas capacitó a las plantas para una mayor asimilación fotosintética de CO2 y tolerancia a los perturbantes asociados al estrés oxidativo.

Descripción: El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), enfermedad caracterizada por anemia hemolítica,trombocitopenia y falla renal aguda, está asociado a infecciones enterohemorrágicas con Escherichia coli productores de toxina Shiga (Stx) (STEC). Si bien el daño endotelial, generado por Stx, ha sido reconocido como el principal eventoque conduce al estado protrombótico en el SUH, existen otros mecanismos que todavíano han sido completamente identificados. La interacción entre la respuesta trombótica einflamatoria ha sido recientemente reportada en diversas patologías y dada la importanciade ambas en el SUH, hipotetizamos que podría tener un rol destacable en su desarrollo. En efecto, nuestro objetivo fue evaluar los mecanismos de activación de la respuestatrombótica y su interacción con la respuesta inflamatoria en el SUH. Utilizando un modelomurino de SUH, detectamos que Stx2 indujo directa o indirectamente una marcadaactivación plaquetaria que contribuyó con la respuesta inflamatoria a través de laactivación del sistema de complemento y la formación de complejos entre Plaquetas yleucocitos polimorfonucleares (PMN). Por otro lado, en un sistema in vitro, se vió que Stx2 indujo un daño endotelial que derivó en la activación y adhesión plaquetaria. Porúltimo, en ambos modelos, se observó la capacidad del antioxidante N-acetil-L-Cisteína (NAC) de prevenir los efectos protrombóticos de Stx2. En conclusión, en esta tesis hemosdescripto como Stx2, mediante el daño endotelial, activa la respuesta trombótica y comoel estrés oxidativo contribuye a este proceso. Asimismo hemos probado la participaciónde las plaquetas en la activación de la respuesta inflamatoria. Finalmente, dados losefectos preventivos de la NAC proponemos su uso en la etapa prodrómica de la diarrea.

Descripción: Las S-layers son estructuras externas de una sola especie de (glico) proteína, Se calcula que aproximadamente 5×105 monómeros de la proteína S-layers son necesarios cubrir una célula bacilar procariótica. Las funciones biológicas que se han sugerido para las S-layer son aún hipotéticas y requieren de mayor comprobación experimental. Se las asocia con roles de protección contra enzimas hidrolíticas, cambios de pH y estrés, la captación de moléculas y iones. Otra posible función que cumplirían sería la de adhesina, facilitando que la bacteria se adhiera a distintas superficies y ayudar a mantener la forma y rigidez de la célula. Durante el transcurso de mi tesis de Doctorado, he elegido a la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus, la opción de este microorganismo se debió a las características probióticas y la importancia del mismo en la industria alimentaria. Se caracterizó una nueva función biológica para la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC4356 que no había sido descripta previamente. La capacidad de murein-hidrolasa es una característica nueva que cumpliría un rol adaptativo en esta bacteria. La actividad lítica de la proteína S-layer de demostró sobre la pared celular y células enteras de Salmonella entérica serovar Newport el cual fue usada como patógeno modelo. Esta actividad respaldaría la característica probiótica de la cepa de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Prado Acosta et al. 2008). También se utilizó a la S-layer como compuesto sinérgico con el antibiótico nisina, esto sirvió para disminuir la concentración inhibitoria minima casi un 50 % en organismos patógenos del tracto intestinal como Bacillus cereus y Staphylococcus aureus (Prado Acosta et al. 2009). Nuestros resultados también mostraron una variación de la expresión de S-layer en Lactobacillus acidophilus creciendo en condiciones de alta salinidad y se mostró que son de gran importancia para la supervivencia de la célula en estas condiciones.

Descripción: Los predadores tope de la península Antártica son indicadores muy sensibles a las variaciones del ecosistema que habitan. Los pingüinos reflejan mejor que otras aves marinas las variaciones ambientales oceánicas regionales naturales (variaciones climáticas) e inducidas por el hombre (presión por pesca y contaminación). Esto se debe a que son aves longevas, sus poblaciones son muy numerosas, están distribuidas ampliamente, son especialistas en la natación y el buceo y, fundamentalmente, son especies clave en la trama trófica antártica. Pygoscelis antarctica (Barbijo), P. papua (Papúa) y P. adeliae (Adelia) son pingüinos que comparten el mismo género, pero poseen diferentes historias de vida y preferencias de hábitat. Mientras Adelia es una especie netamente antártica, las otras dos tienden a evitar zonas con hielo marino persistente, pues evolucionaron en hábitats sub-antárticos donde las condiciones son de mar abierto con escaso hielo. Los pingüinos, al igual que la mayoría de los organismos, basan su metabolismo en la reducción de la molécula de oxígeno para obtener la energía necesaria para su mantenimiento. Las especies reactivas del oxígeno (ERO) se generan naturalmente durante los procesos metabólicos y las defensas antioxidantes presentes las eliminan o mantienen sus niveles en concentraciones no perjudiciales. Las alteraciones del balance en el estado estacionario entre las ERO y las defensas antioxidantes darán lugar a estrés oxidativo (EO). Los niveles de EO en los organismos no son constantes porque están influidos por la acción de varios factores como: el desarrollo, la reproducción, las condiciones ambientales, la disponibilidad de componentes esenciales en la dieta, así como los niveles de actividad física. Estos mismos factores también alteran los niveles de los componentes de la bioquímica sanguínea como glucosa, fósforo inorgánico, calcio, triglicéridos, hierro, proteínas plasmáticas, etc., que permiten conocer el estado nutricional y el de salud de los individuos. Durante seis años consecutivos se tomaron muestras de sangre a adultos y pichones de tres especies de pingüinos, para determinar distintos indicadores de la bioquímica sanguínea, las defensas antioxidantes y el daño oxidativo. De esta manera, se pudo establecer el estado fisiológico de referencia de las aves y su variación con: la ontogenia, las distintas etapas del ciclo de vida, la perturbación antrópica y las condiciones ambientales. Los parámetros medidos mostraron ser biomarcadores fiables para definir el estado fisiológico natural o sus alteraciones en cada especie. Además, aportan datos de referencia para continuar con las investigaciones y programas de monitoreo que contribuyan a la conservación en un escenario climático cambiante.

Descripción: En esta tesis estudiamos la respuesta fisiológica de individuos de C. quadricarinatus, una langosta de agua dulce originaria de los ríos del norte de Australia, expuestos a condiciones de estrés térmico, salino, o a la combinación de ambos factores. Demostramos que la combinación de ambos tratamientos produjo una inhibición en la ganancia de peso de los juveniles avanzados expuestos. El efecto de la temperatura sobre la fisiología del animal fue notable; la disminución de la temperatura impidió, en los juveniles expuestos, la eficiente regulación de los niveles de Na+ y K+ y generó incrementos superiores al 100 % en los niveles de glucosa, en hemolinfa. A su vez, la tasa metabólica varió levemente ante las diferentes condiciones ensayadas. Con el objetivo de estudiar la participación de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (CHH) en este tipo de estrés, medimos sus niveles de expresión por RT-PCR. Con ello demostramos que CHH se induce, bajo condiciones de estrés, en el tejido nervioso del pedúnculo ocular, sitio en el cual CHH es sintetizada, almacenada y secretada. Luego de producir CHH recombinante (rCqCHH) en bacterias, demostramos que la administración prolongada de esta hormona condujo a una disminución en los niveles de glucógeno en el hepatopáncreas y a un aumento de glucosa en la hemolinfa. Contrariamente, los niveles de glucógeno se mantuvieron estables en el músculo abdominal, luego de la administración de rCqCHH. Demostramos también que el aumento de los iones Na+ y K+ inducido por condiciones de alta salinidad, disminuyó por la administración de rCqCHH. Finalmente, las condiciones de estrés utilizadas en este trabajo condujeron a una desregulación en la expresión de PEPCK, enzima fundamental de la gluconeogénesis. En su conjunto, estos resultados sugieren una participación directa de la hormona CHH en el metabolismo energético asociado al mantenimiento de la homeostasis bajo condiciones de estrés térmico y salino. En línea con esta hipótesis, demostramos que bajo las condiciones de estrés mencionadas, los animales inyectados con rCqCHH poseen un significativo incremento en la ganancia de peso (200-300 %). El descubrimiento de la función de CHH como modulador del metabolismo energético en condiciones de estrés térmico y salino puede contribuir al desarrollo de nuevas tecnologías que puedan ser utilizadas para estimular el crecimiento de C. quadricarinatus en condiciones subóptimas, favoreciendo así la producción de la especie con fines comerciales.

Descripción: El sistema productivo moderno basado en una agricultura altamente tecnificada ha fallado en su objetivo de garantizar la soberanía alimentaria. Si bien ha posibilitado generar un aumento en la producción mundial de alimentos ha traído, entre otras consecuencias, el aumento en forma exponencial de la carga de sustancias químicas que se vuelcan sobre el medio ambiente. En nuestro país este incremento se ha dado de la mano de la introducción de la soja genéticamente modificada. Dos de los formulados mayormente utilizados en los campos sojeros son los compuestos por el herbicida glifosato y el insecticida cipermetrina. Si bien la investigación en relación a la toxicidad de ambos compuestos es amplia, existen pocos trabajos que estudien la toxicidad conjunta de las mezclas de agroquímicos. Por lo tanto el objetivo de este trabajo de tesis es evaluar el impacto individual y conjunto de formulados comerciales de glifosato y cipermetrina sobre las líneas celulares humanas, HEp-2 y A549 (de laringe y pulmón respectivamente). Se expusieron ambas líneas celulares a diferentes concentraciones de una formulación de glifosato (MARCH®), una formulación de cipermetrina (SUPERFINA®), una mezcla de ambas formulaciones, blanco de formulación de glifosato y glifosato como sal de monoisopropilamina. Se realizaron curvas concentración-respuesta, usando un modelo robusto y se estimaron parámetros como la concentración letal cincuenta, el NOAEL y el LOAEL. Se estimaron parámetros de la toxicidad conjunta usando diversas estrategias gráficas y numéricas. Se determinaron parámetros de estrés oxidativo en ambas líneas celulares tratadas con la concentración letal 30 y el NOAEL de los formulados por separado y la mezcla respectivamente. Se realizaron ensayos para evaluar la muerte celular programada y, por último, se evaluó el potencial genotóxico de los pesticidas utilizando el ensayo de micronúcleos en la línea celular HEp-2. Los resultados muestran que el compuesto más tóxico es el formulado de cipermetrina seguido del blanco de formulación de MARCH®, luego el formulado MARCH y por último la sal de monoisopropilamida, en ambas líneas celulares. Encontramos que la toxicidad conjunta depende de la mezcla a evaluar tanto como de la línea celular analizada. Se demostró la participación del estrés oxidativo en la toxicidad de los formulados. Se encontró además que se induce la muerte celular programada en la línea Hep-2 mientras que el efecto letal en la línea A549 ocurriría por otra vía de muerte celular. Por último, se demostró el efecto genotóxico de la mezcla sobre los cultivos de la línea HEp-2. Se encontraron efectos conjuntos (sinergia) en varios de los parámetros analizados, tanto de estrés oxidativo como de muerte celular programada y genotoxicidad, demostrando la necesidad de realizar trabajos que evalúen el efecto que los compuestos tienen cuando se aplican en conjunto. Los resultados encontrados demuestran que los efectos tóxicos que estas sustancias pueden provocar dependen de las interacciones entre sí, de los modelos de estudios, las concentraciones y los tiempos de exposición. Este trabajo proporciona nueva evidencia de la necesidad de introducir nuevas formas sustentables de producción de alimentos con el fin de minimizar los efectos adversos que los sistemas actuales de producción tienen sobre la biota y el ser humano.

Descripción: El poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en un polímero biodegradable de gran interés biotecnológico, debido a que presenta propiedades físicas similares a las de los plásticos derivados del petróleo. Con el fin de optimizar su producción, se construyó una cepa recombinante de Escherichia coli que expresa los genes responsables de la síntesis de PHB de Azotobacter sp. FA 8. Esta cepa recombinante también expresa la proteína PhaP, la cual se asocia a los gránulos de PHB y afecta positivamente la síntesis del polímero. Se estudió la acumulación de biomasa y PHB, y las propiedades físicas del polímero, en esta cepa y en la cepa sin PhaP, observándose que la cepa que expresa PhaP produce más PHB y biomasa que la cepa isogénica. En estudios realizados en biorreactor se observaron variaciones en la síntesis de PHB y de diferentes productos metabólicos, al utilizar distintas fuentes de carbono y niveles de aireación, lo que le permitiría a las bacterias adaptar los flujos de carbono y energía a las diferentes condiciones ensayadas. Con el fin de determinar las modificaciones en E. coli cuando acumula PHB, y los posibles efectos de PhaP, se estudió la expresión de diferentes genes mediante qRT-PCR y arrays de DNA en cepas productoras y no productoras de PHB. Se observaron grandes diferencias en la expresión de genes relacionados con el hambreado en nitrógeno, cuya expresión fue mayor en las cepas productoras. Esto podría deberse a la competencia por los metabolitos precursores, acetil-CoA y poder reductor. Inesperadamente, se encontró una menor expresión de genes de estrés al comparar la cepa de E. coli que acumula el polímero y expresa PhaP con la cepa control (que no acumula el polímero ni expresa PhaP). A raíz de estos resultados, se estudió el efecto de PhaP sobre la fisiología de E. coli, en ausencia de PHB. Se observó que PhaP promueve el crecimiento de E. coli, y que además la protege contra estrés térmico. Estos resultados sugieren que PhaP tendría un efecto protector en E. coli, el cuál podría ser de gran utilidad en la producción de compuestos heterólogos.

Descripción: La obesidad es una patología que tiene asociados trastornos metabólicos como el síndrome metabólico y la diabetes tipo 2. Además, estudios clínicos la han señalado como un factor de riesgo para el desarrollo de demencias, entre ellas el mal de Alzheimer. Por otro lado, está documentado que el estrés crónico puede inducir trastornos conductuales y de memoria y desarrollar alteraciones metabólicas. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de una dieta hipercalórica sobre la conducta, el metabolismo y mediadores neuroinmunes (neurotrofinas y citoquinas). Además, evaluar si el estrés crónico tiene influencia en el desarrollo de estas alteraciones y si existen diferencias entre sexos. Asimismo, estudiar el efecto del tratamiento con fluoxetina (FLX) - fármaco utilizado para tratar síntomas asociados al estrés- y el tratamiento con metformina (MET), un antihiperglucemiante utilizado a nivel mundial para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Para tal fin, se utilizaron ratones C57Bl/6J. Éstos fueron distribuidos aleatoriamente en dos dietas: una dieta comercial estándar y una dieta hipercalórica de alta energía (DAE). Después de 8 semanas de dieta, los animales fueron subdivididos en dos grupos: unos fueron expuestos a estrés crónico moderado (CMS) y los otros dejados en condiciones normales. Todos los tratamientos se extendieron hasta las 28 semanas de dieta. En estos animales se estudió el metabolismo glucídico y lipídico, se realizaron estudios conductuales y se estudiaron los mediadores neuroinmunes a nivel central y periférico. En los machos la DAE produjo un incremento de peso acompañado de una desregulación del metabolismo glucídico y lipídico. Adicionalmente, se observó una menor capacidad de memoria de trabajo y espacial, asociado a una disminución en la expresión de BDNF tanto a nivel central como periférico. La suma de DAE y CMS produjo una normalización del peso, sin embargo, agravó los efectos de la DAE tanto a nivel metabólico como conductual y cognitivo. En las hembras la DAE incrementó el peso de los animales. Mientras que, a nivel metabólico, no se observaron cambios en la glucemia, pero si una mayor insulinemia. Conductualmente, la dieta produjo un peor desempeño en memoria espacial. La suma de DAE y CMS disminuyó el peso, pero a nivel metabólico llevó al desarrollo de intolerancia a la glucosa y colesterolemia incrementada. A nivel conductual, el CMS no produjo alteraciones mayores a las observadas con la DAE sola. Cuando se evaluaron los mismos parámetros a las 18 semanas de dieta, se observó que los machos desarrollaron alteraciones metabólicas y cognitivas mientras que las hembras no. También se encontró que, previo al inicio del CMS, la DAE indujo en los machos una disminución de la memoria de trabajo sin observarse cambios metabólicos. Debido al mayor impacto que tuvieron la DAE y el CMS sobre los parámetros estudiados en los animales machos, se decidió enfocar el estudio de los tratamientos farmacológicos únicamente sobre los animales de este sexo. El tratamiento con fluoxetina no corrigió las alteraciones inducidas por el CMS sobre el metabolismo de la glucosa y no protegió de los efectos de la DAE. En animales con DAE+CMS la FLX evitó las alteraciones en el metabolismo glucídico y sobre la función cognitiva. Adicionalmente, la droga tuvo un efecto positivo en el perfil lipídico en todos los grupos. Por otro lado, el tratamiento con metformina corrigió parcialmente las alteraciones metabólicas inducidas por DAE y DAE+CMS. A nivel conductual, en cambio, evitó los efectos de la DAE sobre la memoria de trabajo y mejoró considerablemente la memoria espacial. Sin embargo, estos efectos no se observaron en la memoria de largo plazo. En base a estos resultados podemos concluir que los ratones machos son más susceptibles a desarrollar trastornos cognitivos y alteraciones metabólicas al ser expuestos a una dieta hipercalórica y/o al estrés, siendo mayores estas alteraciones al combinar ambos factores. El tratamiento del estrés y de la hiperglucemia, podrían ser beneficiosos para evitar o revertir la evolución hacia una patología de mayor gravedad. Estudios combinando ambas drogas en conjunto, así como también eliminando la dieta hipercalórica son necesarios para acercarnos a un abordaje terapéutico racional para el tratamiento de la obesidad y sus comorbilidades.

Descripción: Durante el desarrollo prenatal los organismos son vulnerables a factores que puedenafectar su homeostasis. Ha sido demostrado que el estrés durante la preñez tieneefectos en la descendencia que pueden perdurar hasta la adultez, afectandonumerosos procesos fisiológicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún nohan sido completamente dilucidados. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación del óxido nítrico (NO) en lasalteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal (EP). Se observó un incremento en el comportamiento de tipo ansiogénico y un peordesempeño en una tarea de aprendizaje asociativo en machos EP que revirtióparcialmente con un dador de NO. Se detectó una disminución de la óxido nítrico sintasa (NOS) en el hipocampo demachos adultos, mientras que en las hembras no se encontraron cambios. En elhipotálamo se observó un incremento en nNOS en hembras EP, mientras que en losmachos no se observaron cambios. La exposición a estrés agudo en la adultez estimulóel incremento de corticosterona en plasma, que revirtió más lentamente en losmachos EP que en los controles. En las hembras, la recuperación fue más rápida en las EP que en controles. El tratamiento con un dador de NO atenuó la respuesta al estrésen ambos grupos de hembras y en los machos EP, pero no en los controles, en los quefacilitó la reversión. El tratamiento con un inhibidor de nNOS anuló en todos los gruposla reversión de la corticosterona a niveles basales luego del estrés agudo. Por lo tanto,la señalización mediada por NO estaría involucrada en las alteraciones conductuales yneuroendócrinas descriptas en este modelo.

Descripción: Mallophora ruficauda es un ectoparasitoide solitario de larvas de coleópteros Scarabaeidae, con una altapreferencia por Cyclocephala signaticollis. La hembra ovipone fuera del hospedador y la larva busca,encuentra y parasita al hospedador actuando como el equivalente ecológico de la hembra adulta de losparasitoides tradicionales. En un contexto de forrajeo, las larvas pueden reconocer y orientarse a C.signaticollis frente a otras especies potenciales, y poseen la capacidad de discriminar a los hospedadoresparasitados, sin embargo en la naturaleza el superparasitismo es frecuente. Al tener una únicaoportunidad de parasitismo, el fitness del parasitoide dependerá completamente de este evento, por loque el costo de elegir un hospedador de baja calidad (pequeño, parasitado o estresado) es alto. Sedesconoce si las larvas pueden evaluar parámetros del hospedador indicadores de su condición corporal,así como la influencia que tiene la toma de decisiones de las larvas sobre la condición o desempeño deladulto que emerge. En esta Tesis se estudió la influencia de la calidad del hospedador seleccionado y dela competencia intraespecífica de las larvas sobre el éxito reproductivo del parasitoide adulto. Seencontró que la probabilidad de ganar la competencia en larvas que están superparasitando a unhospedador son independientes del orden de llegada en que las larvas atacaron al hospedador y deltiempo transcurrido entre el aferramiento de la primera larva y la siguiente, lo que explica en parte laocurrencia natural del superparasitismo. Al evaluar la orientación de las larvas en parches dehospedadores sanos o parasitados que diferían en tamaño y número se observó que la distribución delarvas entre hospedadores no presentó un patrón definido, a pesar que las larvas detectaron a suscoespecíficos en el parche, sugiriendo que elegir un hospedador de alta calidad en recursos energéticoscarecería de importancia en interacciones prolongadas en el tiempo. Por otro lado, se encontró que laslarvas pueden discriminar y seleccionar a los hospedadores en función del grado de estrés, utilizandouna clave de naturaleza química, y que eligen parasitar al menos perturbado o de mejor calidad. Finalmente, el peso del hospedador y el superparasitismo serían factores importantes que tieneninfluencia sobre la condición corporal de los parasitoides adultos de la nueva generación.

Descripción: Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Descripción: Trypanosoma cruzi es un protozoo unicelular kinetoplástido de vida parasitaria y agente causal de la enfermedad de Chagas. La misma es endémica en Latinoamérica, aunque su contagio se ha expandido a otras regiones, y continúa siendo al día de hoy y desde su descubrimiento en 1909 una enfermedad desatendida. No existen vacunas que protejan de esta enfermedad ni ninguna otra causada por los tripanosomátidos patógenos relacionados (Trypanosoma brucei y Leishmania sp.). Las drogas terapéuticas usadas son las mismas desde hace 50 años, presentando una moderada eficacia en la mejora de la calidad de vida debido a los diversos efectos secundarios del tratamiento. Por lo tanto, es de vital importancia la continua búsqueda de blancos terapéuticos entre las vías celulares esenciales para la supervivencia y desarrollo del ciclo de vida de estos parásitos. T. cruzi posee un ciclo de vida digenético, atravesando dos estadíos proliferativos y dos infectivos, con morfologías y metabolismos muy diferentes. En su pasaje del insecto vector al hospedador mamífero, y viceversa, debe capacitarse para enfrentar cambios abruptos en las condiciones ambientales y sobrevivir. Estas adaptaciones se dan a través de las vías de respuesta a estrés. Es por la complejidad de este ciclo de vida que las vías de sensado y señalización que le permiten al parásito adaptarse presentan características únicas y divergentes con respecto a sus hospedadores y otros organismos de vida libre. Este trabajo inicia con la hipótesis que sugiere que el bloqueo de las vías de señalización mediadas por segundos mensajeros en el parásito llevaría a su inhabilitación para adaptarse y proseguir con su ciclo de vida. Una de las moléculas mensajeras más importantes en distintos tipos celulares son los nucleótidos de adenosina. En tripanosomátidos se han estudiado de manera exponencial y se vio que están involucrados en procesos esenciales como la diferenciación, la infección, la proliferación, el comportamiento social, entre otros. Sin embargo, muchas de las proteínas canónicas involucradas en estas vías no se pudieron hallar en los genomas de estos organismos. Y muchas veces, aquellas que sí se encuentran presentan características funcionales, estructurales y/o de secuencia divergentes y novedosas. Todo esto las vuelve prometedores blancos de drogas terapéuticas. En el primer capítulo evaluamos el rol del AMPc en la respuesta a estrés oxidativo en T. cruzi. Encontramos que un aumento de la concentración intracelular de AMPc por tratamientos con análogos permite que los epimastigotes sean más resistentes ante estrés oxidativo producido por tratamientos con peróxido de hidrógeno. Mientras que la sobre-expresión de la fosfodiesterasa citoplasmática TcrPDEA1, lo cual reduce los niveles de AMPc intracelular, los vuelve más sensibles. En el estadío de tripomastigote, sin embargo, los resultados fueron más complejos en su interpretación. El tratamiento solamente con el análogo de AMPc sobre los parásitos produjo una mayor infección luego de 48 hs. Sin embargo, el agregado de peróxido produjo una caída en la infección indistintamente de la presencia del análogo. Además, resultados obtenidos con dosis bajas de peróxido presentan la posibilidad de que las vías de señalización por AMPc y los procesos desencadenados por el estrés estén interactuando. En el segundo capítulo identificamos y caracterizamos la quinasa de proteínas activada por AMP en T. cruzi. Esta enzima heterotrimérica es central en la regulación de la homeostásis energética de las células, en especial en respuesta a diferentes tipos de estrés por variaciones en la disponibilidad de nutrientes o que alteran los balances AMP:ATP intracelulares. En este trabajo confirmamos por primera vez la presencia de genes que codifican para los ortólogos de las subunidades de AMPK en T. cruzi. Estos ortólogos presentan una alta conservación de los dominios proteicos esperados, aunque sus secuencias codificantes divergen de sus ortólogos en otros organismos. Así mismo, se encontraron dos isoformas de la subunidad catalítica, con divergencia en sus secuencias y funcionalidades diferentes. Estudios filogenéticos confirman que existieron procesos de selección positiva que llevaron a una posible neofuncionalización de estas subunidades. Mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo confirmamos su funcionalidad, actividad y algunos de sus posibles roles en epimastigotes. Particularmente mostramos que la fosforilación necesaria para su activación es modulada ante la presencia o ausencia de glucosa o aminoácidos como fuentes de carbono. También encontramos por ensayos con inhibidores y líneas de epimastigotes sobre-expresantes, que esta enzima juega un rol en la autofagia durante el hambreado de los parásitos y en su proliferación. En conclusión, estos estudios revelan nuevos roles de los nucléotidos de adenosina y las proteínas que responden a estos mensajeros en procesos fisiológicos del parásito T. cruzi. También amplían el repertorio de vías de señalización por AMP conocidas en estos parásitos y los procesos en los que se encuentran involucradas.

Descripción: Este trabajo de Tesis se estructura en seis capítulos que tienen como objetivos estudiar los cambios a nivel de envoltura de Lactobacillus casei BL23, una bacteria Gram positiva, a través del análisis bioquímico y genético, cuando las células son sometidas a estrés osmótico empleando alta concentración de NaCl. Se verificó una diferencia en la sensibilidad a la lisis enzimática en la condición de crecimiento en alta sal (N), y se muestra que dos factores contribuyen a este efecto dado por una mayor permeabilidad de la enzima facilitando su acceso a su sustrato, asociado con un menor nivel de polímeros aniónicos (WTA y LTA) y una diferencia en los niveles de D- alanilación de estos y una disminución en el grado de entrecruzamiento del PG en las paredes de las células asociado a una actividad diferencial de HMW y LMW PBP. El estudio genético avala los resultados bioquímicos que demostraron una disminución tanto en el contenido de polímeros aniónicos como en el grado de D-alanilación de los mismos. La expresión génica de los genes responsables de la D-alanilación de los ácidos teicoicos (dltA y dltC) demostró una disminución de la actividad transcripcional durante el crecimiento en alta sal. La expresión del gen de síntesis de LTA (yfnI) también marcó una disminución durante el crecimiento en esta condición. Los cambios en el contenido como así también en el nivel de sustitución por ésteres de D- Alanina de ácidos teicoicos durante el crecimiento en estrés osmótico conducen a efectos pleiotrópicos que incluyen: 1) Mayor sensibilidad frente a antimicrobianos de naturaleza catiónica (Nisina) y glicopéptidos con blanco de acción la pared celular (Vancomicina) 2) Mayor capacidad de formación de Biofilm sobre superficies artificiales 3) Aumento en el pegado o “ binding” de cationes bivalentes La construcción y análisis de una mutante dltA que muestra una disminuida capacidad de crecimiento en alta sal, confirma la sospecha del rol de la D-alanilación en la capacidad de respuesta frente al estrés omótico. De los resultados obtenidos se desprende una aplicación, un nuevo método para la electroporación de las especies de Lactobacillus que consiste esencialmente en el debilitamiento de la pared celular a partir del crecimiento en condiciones de alta sal. 5 Con este nuevo método se obtienen mayores eficiencias comparadas con los métodos convencionales de electroporación y puede ser extensivo a otras especies del género Lactobacillus que muestren una fragilización de la pared como consecuencia del estrés osmótico.

Descripción: Las proteínas ASR, exclusivas del reino vegetal, se encuentran relacionadas con la respuesta al estrés por falta de agua y otros estreses. ASR1 tiene funciones de chaperona y factor de transcripción. Esta función dual de ASR1 se condice con su presencia en extractos citosólicos y nucleares. Hemos corroborado in planta esta localización dual y demostrando que la misma ocurre por difusión y no mediante transporte activo. Además demostramos que dicha proteína puede homodimerizar en el citosol y se encuentra como dímero en el núcleo. Por otra parte, hemos adaptado exitosamente una metodología de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) para tomate. Este protocolo fue utilizado para realizar un ChIP “semi-nativo” y detectar marcas de histonas relacionadas a represión y activación de genes en todo el genoma de tomate a lo largo de diferentes estadíos de maduración del fruto. Además, experimentos de ChIP sobre hojas de plantas de tomate estresadas, usando un anticuerpo anti-ASR1, mostraron que la mayoría de las regiones genómicas se ubicaron cerca de genes. Los grupos de genes hallados, y por lo tanto posiblemente regulados por ASR1, están relacionados a la síntesis y remodelación de la pared celular, y al transporte de agua y solutos. Finalmente, encontramos una robusta secuencia de ADN consenso de "binding" para ASR1.