Descripción: Los prolactinomas son tumores benignos que en general responden bien al tratamiento con agentes dopaminérgicos. Sin embargo alrededor del 15% de estos tumores son resistentes y aún no existen terapias médicas alternativas. TGF-β1 es un inhibidor de las funciones del lactotropo, y un intermediario de la inhibición que ejerce la dopamina, por lo tanto, resulta un candidato atractivo como blanco terapéutico para prolactinomas resistentes. El objetivo de la presente tesis fue caracterizar el sistema TGF-β1 hipofisario y la regulación de sus componentes, incluyendo los niveles de citoquina total y activa, sus proteínas de latencia (LTBPs) y activadores locales, para evaluar su posible utilidad para el desarrollo de nuevas terapias. Utilizamos dos modelos experimentales de prolactinomas: 1) ratones hembra con mutación nula del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y 2) ratas tratadas crónicamente con estrógenos. Nuestros resultados demuestran que el sistema TGF-β1 se encuentra inhibido en las hipófisis tumorales de ambos modelos. Describimos por primera vez en la literatura una regulación diferencial de los niveles de TGF-β1 activo hipofisario por dopamina y estrógenos que podría explicar en parte las diferencias sexuales en la formación de prolactinomas. Determinamos la expresión de las tres isoformas de LTBPs capaces de unir TGF-β1, y su regulación frente a estímulos con estrógenos y agentes dopaminérgicos. Por último, identificamos a trombospondina 1 (TSP1) y calicreína 1 (KLK1) como posibles activadores de TGF-β1 a nivel local. Asimismo, ensayamos la eficacia de un tratamiento con péptidos análogos de TSP1 (ABT-510 y ABT-898) en el modelo de ratas estrogenizadas. Este tratamiento logró disminuir los niveles de prolactina sérica y el tamaño hipofisario incrementados por los estrógenos. Nuestro estudio contribuye al conocimiento del sistema TGF-β1 hipofisario y su regulación local. Siendo TGF-β1 un inhibidor de la función del lactotropo, proponemos que la restauración de su actividad local podría ser efectiva para frenar el crecimiento de prolactinomas resistentes a los tratamientos clásicos.

Descripción: El órgano de Bidder (BO) es una estructura característica de los bufónidos,entre ellos, Rhinella arenarum. Este órgano expresa varias enzimasesteroidogénicas, incluyendo la aromatasa, responsable de la síntesis deestrógenos. En algunos anfibios se propuso que el estradiol (E2) tiene unefecto negativo directo sobre la función testicular, más allá de la regulaciónde las gonadotrofinas hipofisarias. En este marco, y utilizando como modeloexperimental machos de R. arenarum, los objetivos de esta tesis fueron:analizar la capacidad del BO de producir E2 a partir de sustratos endógenos,medir las variaciones estacionales en la concentración plasmática de E2,determinar la presencia del receptor testicular de estrógenos (ER) y analizarel efecto del E2, a lo largo del año, sobre las enzimas esteroidogénicascitocromo P450 17α-hidroxilasa-C17–20 liasa (CypP450c17) y 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa/ isomerasa (3β-HSD/I), sobre la apoptosisy la proliferación. Los resultados obtenidos muestran que los niveles de E2plasmático son significativamente menores durante el período prereproductivo (PreR) y que el BO es una de las principales fuentes de E2. Además, se determinó la presencia de ER en testículo. El tratamiento con E2no modificó ni la actividad ni la expresión del CypP450c17, mientras que sedetectó una inhibición significativa de la actividad de 3β-HSD/I durante elperíodo post reproductivo (PostR). Por otra parte, se observó una elevadatasa de proliferación espermatogonial durante el período reproductivo (R) yuna marcada apoptosis durante el PostR. El tratamiento con E2 estimuló laapoptosis solo durante el período R y no se observó efecto en laproliferación de la línea espermatogénica. En conclusión, esta tesis describelas variaciones estacionales en el E2 plasmático, la apoptosis y laproliferación testicular, y demuestra que el E2 regula la esteroidogénesistesticular y la espermatogénesis.

Descripción: El VWF es una glicoproteína adhesiva, sintetizada en las CE y megacariocitos. Se sintetiza en forma monomérica, luego se organiza en dímeros y se multimeriza. El VWF media la adhesión de plaquetas al subendotelio vascular dañado y lel transporte del factor FVIII. La ADAMTS13, proteasa que cliva al VWF, pertenece a la familia de metaloproteasas ADAMTS, llamadas así por la combinación característica de una desintegrina y una metaloproteasa con motivos trombospondina tipo 1. La ADAMTS13 es sintetizada en el hígado. Además, se ha demostrado que se sintetiza y almacena en las CE, y que tiene actividad en los lisados celulares en condiciones estáticas y de flujo. La ADAMTS13 está involucrada en el proceso fisiológico de clivar a los multímeros extragrandes altamente trombogénicos, que cuando están presentes en el plasma o en la superficie de las CE llevan a una agregación intravascular y a la formación de un trombo plaquetario. Hemos observado que los niveles de ADAMTS13 descienden, mientras que los del VWF aumentan a medida que progresa el embarazo. En 1972, varios autores han descripto el aumento del 17β estradiol. También se ha observado que la administración de estradiol a las CE en dosis no fisiológicas produce un aumento de VWF. Hay antecedentes acerca de la acción de las hormonas determinantes del sexo en la muerte o proliferación celular en distintas líneas celulares y cultivos primarios. Se demostró la existencia de un factor embrionario liberador de histamina y una alta expresión de receptores para histamina durante la gestación en humanos. Además, se observó un aumento en los niveles de histamina en las últimas semanas de gestación en modelos de ratas y hamsters dorados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1- analizar si los cambios hormonales que inducen o inhiben la síntesis o liberación de VWF y ADAMTS13 tienen influencia en la muerte o proliferación celular y 2- qué modificaciones producen las hormonas y concentraciones altas de histamina en la producción de VWF y ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de HUVEC. Se analizaron los efectos de las hormonas, a distintas dosis, en la proliferación o apoptosis, mediante el uso de técnicas de citometría de flujo y ensayo por colorimetría (MTS). Para evaluar el mecanismo de señalización se analizó la fosforilación de MAPK utilizando la técnica de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se observó que el efecto proliferativo del estradiol en HUVEC, ocurre a través de un aumento de la fosforilación de ERK2, inducido por el estímulo de la deprivación del suero. La progesterona y testosterona en dosis suprafisiológicas promovieron la apoptosis de HUVEC vía activación de p38 y JNK. Además se analizaron los niveles de mRNA (por Real Time PCR) y proteína intracelular y liberada (por SDS-PAGE e inmunotransferencia y ELISA) de VWF y ADAMTS13, en respuesta a los distintos tratamientos hormonales y con histamina. El estradiol, la progesterona y testosterona, no produjeron ningun cambio en la liberacion de VWF en las HUVEC, sin embargo combinadas con histamina, agonista de la liberación de VWF, produjeron inhibición de la actividad de la histamina. Por otra parte el estradiol, la progesterona y la testosterona no produjeron cambios significativos en la liberación de ADAMTS13, sin embargo el tratamiento con histamina indujo una disminución en los niveles de ADAMTS13, que fue revertida en la combinación con estradiol y progesterona. Finalmente, el estradiol, produjo un aumento en los niveles de mRNA de VWF y ADAMTS13. En la síntesis de ambos mRNA, el estradiol y la histamina presentan un efecto antagónico y la combinación de la progesterona y la histamina presentarían un efecto sinérgico.

Descripción: La radioterapia es un tratamiento utilizado en humanos como herramientapara eliminar células tumorales mediante el uso de radiaciones ionizantes; sinembargo, éstas también puede dañar tejidos sanos debido a la inducción de estrésoxidativo. Dada la alta radiosensibilidad del Sistema Nervioso Central en desarrollo, elobjetivo del presente trabajo fue profundizar en el estudio de sus efectos sobre elhipocampo de animales jóvenes expuestos en el período neonatal. Más aún, el esclarecimiento del mecanismo de acción de la radiaciónionizante podría permitir proponer intervenciones terapéuticas que prevengan susefectos, siendo el 17β-estradiol una herramienta ideal por poseer múltiplesmecanismos de acción neuroprotectora. Los resultados encontrados sugieren que los cambios observados en lamemoria asociativa a P30 se deberían a modificaciones en el hipocampo a nivelmolecular e histológico, siendo el sistema GABAérgico uno de los componentesafectados. Asimismo, la expresión de estas alteraciones en el animal joven ocurriríadebido a cambios en la PKCβ1 a P15. Por otro lado, el tratamiento con estradiol fue capaz de prevenir la mayoríade los cambios inducidos por la radiación, permitiendo postular que ejercería suacción neuroprotectora tanto a través de un mecanismo antioxidante como de unomediado por receptor. Por consiguiente, la vulnerabilidad del hipocampo frente alas radiaciones ionizantes podría prevenirse mediante el uso de fármacos queactúen mediante mecanismos semejantes al estradiol.

Descripción: El objetivo del presente trabajo de tesis es estudiar el rol del receptor de aril hidrocarburos (AHR) en la función de las células ováricas. En particular, la investigación se centró en evaluar la acción de la activación del AHR sobre la proliferación de células de la granulosa y establecer a su vez la regulación de la expresión del propio receptor. El modelo utilizado consistió en células de la granulosa inmaduras de rata cultivadas en condiciones definidas. Se pudo establecer que distintos ligandos del AHR son capaces de regular la proliferación de células de la granulosa a través de modulaciones en las acciones de las hormonas clásicas. Se determinó la existencia de un novedoso sinergismo entre el AHR y el receptor de estrógenos activados por sus agonistas, el cual impacta sobre la respuesta proliferativa de las células de la granulosa pero no se verifica a nivel de la transcripción inducida por ninguno de los receptores. Por otro lado, se estableció que FSH y estradiol son importantes moduladores de la expresión del AHR en células de la granulosa, obteniéndose evidencia de que podrían ser factores endógenos claves asociados al ciclo reproductivo que regulan la expresión del receptor in vivo. Además, mientras los ligandos del AHR inducen rápidamente degradación proteasomal del receptor, atenuando la señal, promueven a la vez un aumento en sus transcriptos a tiempos prolongados de exposición. Los resultados tomados en conjunto indican que el AHR jugaría un papel clave en la regulación del crecimiento de las células ováricas y que su expresión es modulada por hormonas clásicas y por sus propios ligandos, lo cual constituye una forma de regular su función.

Descripción: El estroma uterino experimenta cambios morfológicos y funcionales que dan lugar a ladecidua, un tejido compacto cuya función es el correcto progreso de la preñez. Elreceptor de progesterona (RP) y el receptor de estradiol (RE) participan en elcrecimiento y la diferenciación de las distintas áreas deciduales del endometrio de larata. En esta tesis se estudia el papel de estos receptores, sus vías de señalización yla participación de nuevas moléculas involucradas en las etapas iniciales de ladecidualización. Caracterizamos, mediante el uso de ARN pequeño de interferenciaespecífico, el papel de una nueva proteína regulada en la decidualización, la proteínade unión a ARN CSD-C2. Encontramos que el bloqueo del RP, mediante suantagonista onapristona, produjo la reabsorción de los sitios de implantación (SIs) y ladisminución en la expresión proteica del RP, RE, PCNA, DESMINA y CCND3, en losniveles de ARNm de Prl8a2, y de Hand2 y Bmp2, y en la activación de ERK. El efectodeletéreo de onapristona fue parcialmente contrarrestado por el antagonista del REfaslodex, restituyendo los niveles de los receptores de hormonas, de los marcadoresde proliferación y diferenciación analizados, y aumentando compensatoriamente losniveles de Hand2 y Bmp2, y pERK. El tratamiento de ratas preñadas con el inhibidorde pERK, evidenció su importancia en la formación de la decidua, manteniendo lacapacidad proliferativa de las células estromales y limitando su diferenciación en lasdistintas áreas deciduales. Estos hallazgos muestran la importancia del balance deseñalización de los receptores hormonales, a la vez que describen nuevas moléculasresponsables de la decidualización endometrial durante la preñez temprana.

Descripción: La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo. Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β‐estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término. Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre ‐1951 y ­‐1887pb que contiene al “enhancer” placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria. Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria. El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780. Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-­‐A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-­‐A en las células BeWo-­‐Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα. Se ha evaluado también la presencia y localización de ERy la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ER, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ER y el NFκB. Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC­‐1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas. Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.

Descripción: En el presente trabajo abordamos la implantación embrionaria en ratas controles ydiabéticas desde el punto de vista del fenómeno vasoactivo que conlleva. Las prostaglandinas son necesarias para permitir la implantación de losembriones en el lumen, ya sea incrementando el flujo sanguíneo y lavasodilatación del útero durante la decidualización endometrial, como regulando Ia actividad contráctil del tejido miometrial. El óxido nítrico ha sido reconocido como agente vasodilatador y miorrelajante, yparte de su efecto es mediado a través de la regulación de la síntesis deprostaglandinas en diversos procesos fisiológicos. Se ha determinado variaciones en la síntesis uterina de prostaglandinas y deóxido nítrico en la preñez temprana en la rata, y se ha establecido una relacióncausal entre ambos mecanismos fisiológicos durante la implantación embrionaria. En el útero dichos agentes vasoactivos aumentan durante los días peri-implantatoriosde la preñez, como resultado de la combinación de la acción de losesteroides ováricos y de agentes locales derivados del embrión o de la madre. Las isoformas Cab-dependiente y Cap-independiente de la enzima sintetizadorade óxido nítrico son las responsables del incremento en la actividad enzimática enel día de la implantación. La inhibición de la síntesis intraluminal de óxido nítricoreduce el número de embriones implantados en un 50%, probablemente alterandola adecuada irrigación sanguínea al sitio de implantación. También se determinóque la producción uterina de prostaglandina E y qu depende tanto de laproducción de óxido nítrico como de señales embrionarias tempranas. Nuestros resultados indican además, que la acción vasoactiva del óxido nítrico yde las prostaglandinas puede modularse de manera tal de compensaralteraciones metabólicas en la rata diabética de tipo no-insulino-dependiente, ypermitir que el proceso implantatorio ocurra eficientemente en esta patología.

Descripción: Se desarrolló una ruta eficiente para la preparación a gran escala de cloruro del lapirio, un surfactante antimicrobiano de amplio-espectro. Tres de los pasos que conforman esta síntesis fueron enzimáticos. Debido al comportamiento quimioselectivo de los biocatalizadores, el cloruro del lapirio fue obtenido con un alto grado de pureza y un alto rendimiento, bajo condiciones suaves de reacción. La metodología enzimática diseñada disminuyó las consecuencias sobre el medio ambiente en comparación con la metodología clásica de obtención de cloruro de lapirio. Continuando con el uso de lipasas, se preparó una serie de ésteres derivados del 3,17β-estradiol a partir de una metodología enzimática. Se obtuvieron once productos 17- monoacilados (cinco compuestos de ellos novedosos) de una manera altamente regioselectiva por acilación de 3,17β-estradiol o por alcohólisis de los derivados diacilados correspondientes. Fue evaluada la influencia de varios parámetros experimentales tales como: relación agente acilante/3,17β-estradiol, relación enzima/sustrato y temperatura. Entre las lipasas probadas, la lipasa de Candida rugosa (CRL) resultó ser la más apropiada en la reacción de monoacilación, mientras que el uso de la lipasa de Candida antarctica tipo B (CAL B) permitió obtener los mejores resultados en la reacción de alcohólisis. Las ventajas presentadas por esta metodología, tales como: condiciones suaves de la reacción, economía y bajas consecuencias para el medio ambiente, hacen de la biocatálisis una manera conveniente de preparar derivados monoacilados de 3,17β-estradiol conteniendo el grupo 3-hidroxilo aromático libre. Algunos de estos compuestos son reconocidos como productos útiles en la industria farmacéutica. Por otra parte, se describe un procedimiento catalizado por lipasas para la preparación de N-(hidroxialquil)acrilamidas, útiles en electroforesis capilar. Las N- (hidroxialquil)acrilamidas fueron preparadas a partir de la reacción de aminólisis de acrilato de etilo y alcanolaminas. La reacción fue catalizada por lipasa de Candida antarctica tipo B (CAL B). La adición de inhibidores de radicales mejoró la quimioselectividad permitiendo obtener las amidas con altos rendimientos y elevada pureza trabajando a temperatura ambiente. Fueron obtenidos varios co- y terpolímeros que contenían, secuencias al azar, de poli(acrilato de etilo), poli(N-(2-hidroxietil)-acrilamida) y ácido poliacrílico. Estos productos fueron obtenidos utilizando acrilato de etilo como único monómero vinílico de partida. El proceso fue catalizado por CAL B. En presencia de etanolamina, la enzima catalizó no solamente la polimerización en cadena de acrilato de etilo, sino también la aminólisis y la hidrólisis de los grupos éster pendientes de la cadena poliacrílica. Los productos fueron caracterizados por espectroscopía FTIR y de RMN de 1H y 13C, y espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. La actividad demostrada por CAL B en la reacción de polimerización es un nuevo ejemplo de promiscuidad enzimática. Finalmente, se aplicó una estrategia innovadora consistente en la combinación de enzimas puras y células enteras para preparar 3-carboxialquil-γ-butirolactonas enantioméricamente puras y varios alquilésteres del ácido 2-hidroxiglutárico a partir de ácido 2-oxoglutárico. El método implica dos pasos biocatalíticos consecutivos. En el primer paso, se convierte el ácido 2-oxoglutárico en los dialquilésteres correspondientes, dicha transformación fue catalizada por lipasas. En el segundo paso, por reducción microbiana de una serie de 2-oxoglutaratos de alquilo fue posible obtener 3-carboxialquil-γ-butirolactonas o 2-hidroxiésteres dependiendo de la longitud de la cadena de los sustituyentes alcoxilo de los ésteres y del estado fresco o liofilizado de las células del hongo Mucor rouxii. En esta parte del trabajo también fue estudiado el comportamiento de levaduras de Saccharomyces cerevisiae en las reacciones de descarboxilación, hidrólisis y reduccción de los 2-oxoglutaratos de dialquilo.