Descripción: La presente Tesis describe el metabolismo de esteroides del testículo de Bufo arenamrm como así también algunos aspectos de la regulación del mismo. Durante el período no reproductivo, la biosíntesis de andrógenos (T y DHT) se realiza por una vía Δ5 que incluye al 5Diol como intermediario. P4 se transforma mayoritariamente en derivados reducidos como 5αP y 5αP3αol,20ona. La función biológica de estos esteroides reducidos en el testiculo de B. arenam se desconoce hasta el momento. En los animales capturados durante el período de reproducción, la capacidad biosintética del testículo se modifica. Este cambio va desde el predominio de esteroides con 19 átomos de carbono, que se observa en el período no reproductivo, hacia la formación de esteroides de 21 átomos de carbono. Así, se encuentra aumentada la transformación de P5 en P4 y la producción de 5αP; 5αP3α,20ona; 5αP3α,20(α/β)diol y un metabolito no caracterizado. La disminución de la síntesis de andrógenos, in vitro, se correlaciona con una disminución de la concentración plasmática de los mismos. Este cambio en el patrón esteroidogénico podría relacionarse con el final de la espermatogénesis (que depende de andrógenos) y el comienzo de la época de apareamiento. El mecanismo por el cual ocurren estos cambios consistiría, principalmente, en la reducción de la actividad de la enzima P450C17. Se confirma el fuerte efecto inhibitorio de CNK sobre la actividad de 3βHSD reportado previamente para interrenal de esta especie. SPNL ejerce un 50 % de inhibición de la actividad de C17-20 liasa, pero presenta un menor efecto sobre la hidroxilación en la posición C17. Finasteride es incapaz de inhibir a la 5αRed de sapo independientemente del sustrato utilizado. Esta enzima es de localización microsomal, tiene dependencia de NADPH como cofactor, presenta un Km menor para P4 que para T y un amplio rango de pH óptimo, entre 6 y 8. Las características mencionadas previamente son válidas tanto para la conversión de P4 como de T, lo que estaría sugiriendo la existencia de un único tipo enzimático para ambas reacciones. La falta de sensibilidad a Finasteride y el rango de pH óptimo de esta enzima se asemejan al tipo I caracterizado en mamíferos. Independientemente de la concentración utilizada, el tratamiento agudo con hCG in vitro no tiene efecto sobre la actividad de 5αRed. Sin embargo, el tratamiento crónico con hCG y FSH provoca una reducción de la actividad enzimática. Por otro lado, GnRH induce un aumento de la actividad de 5αRed, sólo en la menor concentración utilizada. Las actividades asociadas a la enzima P450c17 son inhibidas por el tratamiento crónico tanto con FSH como con GnRH en todas las concentraciones utilizadas y con hCG sólo en la mayor concentracion ensayada. Sin embargo, la actividad de 3βHSD no se ve influenciada por ninguno de estos tratamientos. GnRH, cuyos receptores testiculares se caracterizan en esta tesis, reduce la liberación de T inmunoreactiva tanto basal como estimulada por hCG. El efecto sobre la liberación basal de T solo se observa en la concentración más baja, al igual que lo que ocurre sobre la 5αRed. Por otro lado, el bloqueo de la acción de hCG sobre la secreción de andrógenos se ejerce en todas las concentraciones probadas. Estas diferencias sugieren que los mecanismos subyacentes para cada una de las inhibiciones provocadas por GnRH son diferentes.

Descripción: Los hongos causantes de pudrición blanca, producen enzimas lignolíticas, inespecíficasy altamente oxidativas, con capacidad para degradar distintos contaminantes. Loscompuestos fenólicos son un grupo de moléculas orgánicas cuyo uso masivo industrialcondujo a la contaminación de ecosistemas acuáticos y terrestres, resultando en suclasificación como contaminantes prioritarios. En el presente trabajo se realizó unrelevamiento de cepas nativas de hongos de pudrición blanca en búsqueda demicroorganismos capaces de ser empleados en la degradación y detoxificación defenoles y derivados. Como resultado de dicho relevamiento se seleccionó a Trametesversicolor BAFC 2234 por su capacidad para degradar distintos compuestos fenólicos (fenol, ácido gálico, 2,6 dimetoxifenol y guayacol) y por su habilidad para utilizar elfenol como única fuente de carbono. Se analizó el secretoma de T. versicolor creciendoen medio de cultivo natural jugo de tomate suplementado con cobre y manganesoempleando el enfoque proteómico. Se identificó un número considerable de lasproteínas relacionadas con la degradación de la biomasa lignocelulósica y entre éstas,hidrolasas, peroxidasas y oxidasas fueron las enzimas más abundantes. Se purificarondiversas enzimas lignolíticas: una polifenol oxidasa (lacasa), tres Mn-peroxidasas y unaversatil peroxidasa. Esta última enzima no había sido purificada previamente en estaespecie. Se detectó también por primera vez presencia de peroxidasa decolorante detintes en T. versicolor. Cultivos de T. versicolor removieron eficientemente fenol ynitrofenol, pudieron también decolorar el tinte Azure B y el licor negro, residuoproveniente de la producción de papel. T. versicolor removió el 71, 62, 74 y 73% delfenol 15 mM adicionado en tres ciclos repetidos en un periodo de 23 días, inmovilizadoen esponja vegetal (Luffa aegyptiaca). El hongo inmovilizado removió el 97% del 4-nitrofenol (1 mM) luego de 3 días. Esta cepa además disminuyó la fitotoxicidad de lasrespectivas muestras tratadas. Se investigó la transformación del fenol por acción de susenzimas purificadas lacasa y Mn-peroxidasa; y la del 2-, 3- y 4-nitrofenoladicionalmente por la enzima versatil peroxidasa. El hongo produjo lacasa como principal enzima lignolítica, pero esta enzima purificada no fue capaz de degradar elnitrofenol. Mn-peroxidasa y versatil peroxidasa degradaron 2- y 4-nitrofenol in vitro enporcentajes cercanos al 50%. La lacasa de T. versicolor removió 84% del fenol en 4 hs,mientras que un 43% fue removido por la Mn-peroxidasa. Tanto el estudio delsecretoma de esta cepa como los ensayos de degradación in vivo e in vitro llevados acabo, aportan información valiosa sobre el potencial empleo de esta cepa de T.versicolor en la biorremediación de efluentes industriales.

Descripción: Los hongos descomponedores de hojarasca (LDF) son un grupo ecofisiológico de hongos, mayormente basidiomicetes, que crecen sobre material vegetal muerto colonizando las capas superiores del suelo presentes en bosques y pastizales. Son numerosos los estudios existentes que apuntan a la búsqueda de enzimas lignocelulolíticas de interés industrial provenientes de hongos causantes de pudrición blanca. Contrariamente, los LDF son un grupo poco explorado con similar poder enzimático y, su habilidad para colonizar el suelo, sobrevivir durante largo tiempo y competir con otros microorganismos, les confiere ventajas para su utilización en procesos de biorremediación de suelos. Con el fin de colectar especímenes de hongos basidiomicetes LDF, se realizó un relevamiento en distintos sitios localizados dentro de la ecoregión del Delta del Río Paraná y Ribera Platense, con un total de 19 cepas aisladas e identificadas exitosamente. Las mismas, fueron evaluadas en función de su habilidad para producir sistemas enzimáticos extracelulares lignocelulolíticos. Además, se investigó la capacidad de Marasmiellus candidus (BAFC 4532), Leratiomyces ceres (BAFC 4533) y Marasmius haematocephalus (BAFC 4531) para descomponer in vitro la hojarasca de la especie nativa Celtis tala y la hojarasca de la especie exótica Ligustrum lucidum, dos representantes vegetales abundantes en la región de estudio. Sólo para L. ceres se registraron diferencias significativas entre los dos tipos de hojarasca, con una mayor pérdida de peso con la hojarasca exótica, lo que estuvo asociado principalmente a la producción de la enzima ligninolítica Manganeso peroxidasa y a la degradación preferencial de compuestos carbonados alquílicos y lignificados. Por otro lado, Hypholoma fasciculare (BAFC 4546) fue seleccionada en función de su mayor velocidad de crecimiento en un medio agarizado conteniendo 1 g/L del detergente NP10EO, la clase más común de nonilfenol etoxilado (NPnEO). En dicho medio, H. fasciculare removió hasta un 75% aprox. del detergente sin la formación de productos de degradación como el nonilfenol, más tóxicos y recalcitrantes. Por último, se evaluó el efecto del NP10EO en la descomposición de hojarasca de C. tala y L. lucidum. Esta tesis aporta una contribución al conocimiento de la biodiversidad de hongos LDF pertenecientes a la ecoregión del Delta del Río Paraná y Ribera Platense y su potencial aplicación en procesos tecnológicos de bioconversión de biomasa vegetal y degradación de uno de los surfactantes no iónicos más ampliamente utilizados en el comercio y la industria, el nonilfenol etoxilado.

Descripción: Muchos de los hongos lignocelulolíticos de los bosques andino patagónicos poseen un alto valor culinario y, además de ser comestibles y nutritivos, presentan también propiedades medicinales; sin embargo, casi no han sido tenidos en cuenta en la Argentina debido a las dificultades para su cultivo y producción. Los hongos causantes de pudrición blanca son los únicos organismos capaces de degradar la lignina hasta su completa mineralización, lo cual hace de este grupo el único que posee todos los grupos de enzimas necesarios para degradar todos los componentes de la madera, siendo estas de interés para aplicaciones biotecnológicas. Los hongos de pudrición castaña remueven selectivamente celulosa y hemicelulosa de la pared celular, sin alterar mayormente la lignina. La explotación forestal de la región andino patagónica genera desechos de aserríos en gran proporción, en su mayoría de forestaciones de Pinus sp. y de maderas del bosque nativo, los cuales podrían ser aprovechados por estos organismos. Esta tesis aborda diferentes objetivos de estudio centrándose en los hongos comestibles degradadores de la madera y nativos de la Patagonia andina, siendo estos Pleurotus ostreatus, Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina antarctica y Fistulina endoxantha. Los mismos fueron coleccionados durante los otoños de 2013 y 2014 en bosques de Nothofagus dombeyii (coihue), Nothofagus obliqua (Roble Pellín) y Araucaria araucana, luego aislados en medios de cultivo tradicionales y, finalmente, preservados como cultivos puros para el trabajo de laboratorio. Se realizaron ensayos de crecimiento en placa de Petri a diferentes temperaturas, resultando la temperatura óptima de crecimiento miceliar para todas las cepas entre 20-23 ºC. Sin embargo, las tasas de crecimiento de Grifola (0,20 – 0,30 cm/día) y Fistulina (0,07 – 0,10 cm/día) fueron sumamente menores respecto a Pleurotus (0,8 – 1,0 cm/día). Grifola gargal y G. sordulenta presentaron actividad lacasa y celulasa, mientras que P. ostreatus presentó actividad lacasa, MnP y celulasa. En ninguna cepa se detectó actividad LiP positiva.. La decoloración de diferentes colorantes textiles (RBBR -Azul brillante de remazol R-, Xilidina, Verde de malaquita y Azure B) fue utilizada para corroborar la actividad enzimática. Pleurotus ostreatus decoloró todos ellos en las dos concetraciones ensayadas (10 y 50 μM), Grifola gargal y G. sordulenta mostraron degradación efectiva de todos los colorantes a 10 μM. Fistulina spp. degradaron ligeramente RBBR, xilidina y verde de malaquita en 10 μM. A partir de medios de cultivo líquido se realizó la cuantificación de la actividad enzimática. Grifola gargal presentó mayor actividad lacasa, con el máximo al día 45 en medio GPY, siendo de 0,100 UE/ml.. El cultivo líquido de P. ostreatus mostró el máximo de actividad entre el día 20 y 25, alcanzando 0,150 UE/ml. Por otro lado, se evaluó cualitativamente la degradación de diferentes especies forestales mediante técnicas de histoquímica. Con estos datos se pudo seleccionar a la lenga como el mejor sustrato para el cultivo en el caso de las especies de Grifola y Fistulina. No se observaron diferencias respecto a los sustratos usados por P. ostreatus. Gracias a la abundancia de desechos agrícola-forestales de la región, se realizaron formulaciones para la producción de las especies comestibles. El enfoque principal se realizó con las cepas de P. ostreatus que crecen naturalmente en Araucaria con el fin de aprovechar su adaptación a los sustratos resinosos y generar una producción sobre residuos de las plantaciones, aserraderos y/o plantas de procesamiento de Pinus sp., abundante por las forestaciones zonales. Se suplementó el material con residuos de las industrias vitivinícola y cervecera regionales. Las eficiencias biológicas (EB) obtenidas en virutas de pino resultaron superiores por parte de las cepas nativas respecto a la cepa comercial utilizada. Los otros sustratos ensayados fueron virutas de lenga, álamo y paja grámon, en los cuales la cepa comercial arrojó mayores EB. Para evaluar el crecimiento y la actividad lacasa frente a compuestos volátiles presentes en las resinas se cuantificó la biomasa fúngica del cultivo líquido y el diámetro de la colonia. El crecimiento fue menor en los tratamientos con limonelo y δ-3-careno, y prácticamente nulo con 4-carvomentenol, citronelol, y ρ-cimen-8-ol respecto al control (Medio MEA). Por otro lado, la actividad ligninolítica lacasa fue inhibida en todos los tratamientos. Estos datos sustentan la baja producción en los sustratos resinosos como las virutas de Pinus sp. Para complementar esta información y comprender la capacidad degradativa natural de P. ostreatus en A. araucana, se evaluó su capacidad de degradación de los lignanos presentes en la células vegetales, revelando una alta degradación de la mayoría de los compuestos, a excepción de los dos más complejos y recalcitrantes, como son el eudesmin y el secoisolariciresinol-4-metil eter-9´-acetato. El máximo de actividad lacasa en el medio de cultivo sólido a base de A. araucana fue de 0,111 ± 0,067 U/gps y el de MnP de 0,220 ± 0,109 U/gps. Se detectaron diferentes isoenzimas de lacasa con peso molecular de entre 35-41 KDa y 75-92 KDa. Los problemas productivos modificaron el foco de la investigación hacia el sustrato colonizado por las especies de Grifola como fuente de compuestos de interés.. La colonización de los sustratos utilizados (lenga, sauce y pino) fue óptima y estos cultivos se utilizaron para el análisis de la capacidad inmunomoduladora en la línea de macrófagos J774A.1 y de citotoxicidad con líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7), osteosarcoma (SAOS-2) y cáncer de colon (HCT116). En cuanto a los esteroles obtenidos el ergosterol resultó el de mayor importancia. Los ácidos grasos que se detectaron fueron ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido araquídico y ácido behénico. Los polisacáridos de G. gargal sobre madera de sauce presentaron un aumento en el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de óxido nítrico (NO) en una concentración de 50 μg.mL−1. Los efectos citotóxicos más relevantes se obtuvieron con los extractos del micelio de G. gargal y del cultivo en las diferentes maderas sobre la línea de cáncer de colon HCT116. Se realizaron ensayos específicos de degradación del azure B con los hongos de pudrición castaña Fistulina antarctica y F. endoxantha por lo observado en las placas con medio agarizado. Se observó mayor decoloración por parte del micelio, obteniéndose un máximo del 53,65% a las 96 horas.

Descripción: La biomasa lignocelulósica consiste principalmente en polisacáridos estructurales y es considerada una materia prima con gran potencial para la producción sustentable de biocombustibles y bioproductos. Sin embargo, la viabilidad económica de estos procesos depende de la conversión eficiente de los polisacáridos estructurales, celulosa y hemicelulosa, en oligosacáridos cortos y azúcares monoméricos fermentables (glucosa y xilosa). Para lograrlo es necesario desarrollar cócteles enzimáticos compuestos por múltiples enzimas activas sobre carbohidratos, o CAZimas, con actividades complementarias y que pueden provenir de distintos organismos lignocelulolíticos. Estas incluyen glicosil hidrolasas (GHs) y enzimas auxiliares con actividad oxidativa (Aas) que son clasificadas en familias según su secuencia de aminoácidos y estructura tridimensional. La hipótesis de esta Tesis es que las enzimas secretadas por hongos y bacterias celulolíticas aeróbicas tienen actividades complementarias que pueden resultar en sinergismo para la degradación de biomasa lignocelulósica residual. Su caracterización y producción en sistemas recombinantes permite su aplicación en procesos de bioconversión específica de polisacáridos estructurales a monómeros fermentables. El objetivo principal del presente trabajo es el clonado, expresión recombinante y caracterización bioquímica y funcional de CAZimas fúngicas y bacterianas para ser aplicadas en procesos de deconstrucción de biomasa lignocelulósica residual. Se seleccionaron enzimas de dos organismos altamente eficientes en la degradación de lignocelulosa: el hongo Pycnoporus sanguineus y la bacteria Cellulomonas sp. B6. Los hongos del género Pycnoporus son productores de extractos enzimáticos extracelulares con actividad ligno-celulolítica y se destacan por su eficiencia para la degradación de la pared celular vegetal, en especial de celulosa y lignina. Por otro lado, las bacterias del género Cellulomonas codifican para numerosas CAZimas extracelulares. En particular, el aislamiento Cellulomonas sp. B6 se caracteriza por su alta actividad xilanolítica extracelular. Por ello, este trabajo se enfoca en la caracterización de enzimas activas sobre celulosa de P. sanguineus y de xilano de Cellulomonas sp. B6. Entre las enzimas fúngicas se clonaron dos exoglucanasas o celobiohidrolasas I (CBH I) (EC 3.2.1.176), de la familia GH7 (PsCel7A y PsCel7B) y tres monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMO) (EC 1.14.99.54) de la familia AA9 (PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C). Las celobiohidrolasas I son exoglucanasas que actúan procesivamente desde el extremo reductor de la celulosa cristalina liberando celobiosa y en los hongos se encuentran clasificadas como GH7. Son secretadas en gran abundancia por hongos celulolíticos y cumplen un rol fundamental en la deconstrucción de la biomasa, siendo componentes mayoritarios de los cócteles enzimáticos comerciales. Para la expresión de PsCel7A y PsCel7B se utilizó una plataforma de expresión semi-industrial basada en una cepa mutante ΔcbhI del hongo filamentoso Trichoderma reseei. Las enzimas se purificaron del sobrenadante de cultivo y se caracterizaron bioquímicamente. La actividad de ambas enzimas recombinantes purificadas sobre biomasa lignocelulósica (rastrojo de maíz), en combinación con endoglucanasas y β-glucosidasas comerciales, generó una conversión de glucanos a glucosa de aproximadamente 40%, lo cual es aproximadamente el 67% relativo a la actividad de la enzima de referencia comercial Cel7A de T. reesei. Esto indica un potencial para su uso ya que se utilizaron las condiciones de reacción óptimas de TrCel7A. Restan realizarse futuras optimizaciones de las condiciones de reacción para evaluar la eficiencia de PsCel7A y PsCel7B en bioprocesos. A su vez, para la deconstrucción de la fracción cristalina de la celulosa son necesarias enzimas auxiliares capaces de generar cortes en los enlaces glucosídicos de la celulosa cristalina, con un mecanismo oxidativo y en presencia de un dador de electrones, llamadas LPMOs y clasificadas en la familia AA9. La acción de estas enzimas facilitaría el acceso de las GHs a estas regiones altamente recalcitrantes de la celulosa, mejorando la eficiencia en la conversión de la biomasa. De las 16 AA9 codificadas en el genoma de P. sanguineus, se seleccionaron tres en base a estudios previos. Las enzimas recombinantes PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C se expresaron utilizando la plataforma fúngica de la levadura Pichia pastoris. PsAA9A y PsAA9B se purificaron exitosamente desde el sobrenadante de cultivo mientras que PsAA9C se detectó en la fracción intracelular. La actividad de ambas enzimas se ensayó sobre sustratos celulósicos, aunque solo se detectó actividad para PsAA9A, por lo que se realizó su caracterización exhaustiva. PsAA9A, en presencia de un dador de electrones, genera cortes por oxidación en sustratos celulósicos, produciendo celo-oligosacáridos solubles, nativos y oxidados, de grado de polimerización entre 2 y 6. En ensayos de complementariedad con celulasas individuales se demostró el sinergismo para la degradación de celulosa con endoglucanasas (GH5), celobiohidrolasas II (extremos no reductores) (GH6) y β-glucosidasa (GH1), aunque no con celobiohidrolasas I (extremo reductor) (GH7). Esta falta de sinergismo podría deberse a un efecto inhibitorio generado por el ácido gálico, compuesto utilizado como dador de electrones en la reacción. Por ello, en el diseño de un cóctel enzimático que incluya LPMOs se deberán optimizar las proporciones para evitar la inhibición de las GH7. A su vez, Cellulomonas sp B6 secreta un amplio repertorio de enzimas activas sobre xilanos, en presencia de biomasa. Por ello, se estudiaron en esta Tesis dos enzimas desramificantes del xilano y su sinergismo con xilanasas, paso crítico para su aprovechamiento. La degradación eficiente de arabinoxilanos (AXs) y glucuronoxilanos (GXs) es de gran interés debido a que son los tipos predominantes de hemicelulosa en cereales y pasturas (AXs) y en maderas duras (GXs). Para ello, resulta clave la utilización de enzimas con actividad α–L-arabinofuranosidasa y α-glucuronidasa debido a que son capaces de hidrolizar sustituciones de arabinosa y ácido 4-O-metil D-glucurónico, respectivamente, y permiten un mejor acceso para otras enzimas con actividad sobre la cadena principal, como las β-1,4-endoxilanasas. Se estudiaron entonces una α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) de la familia GH62 (CsAbf62A) y una α–glucuronidasa (EC 3.2.1.139) de la familia GH67 (CsAgu67A) para clonar y expresar de manera recombinante en una plataforma bacteriana de Escherichia coli. Ambas enzimas se purificaron del citoplasma de células de E. coli recombinantes y se caracterizaron bioquímica y funcionalmente. Las familias GH62 y GH67 tienen hasta el momento 24 y 25 enzimas caracterizadas, respectivamente. CsAbf62A presentó actividad α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) sobre arabinoxilanos y arabino-xilo-oligosacáridos, hidrolizando específicamente las sustituciones simples de arabinosa unidas con enlaces α-1,2 o α-1,3 a los residuos de xilosa que forman el esqueleto del polisacárido, aunque no las sustituciones dobles. También se detectó la liberación de arabinosa a partir de las sustituciones del arabinano, otro polisacárido de la pared celular vegetal. CsAgu67A presentó actividad α-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), removiendo sustituciones de ácido 4-O-metil D-glucurónico desde el extremo reductor de glucurono-xilo-oligosacáridos, pero no de sustituciones internas ni del polisacárido. Ambas enzimas se evaluaron en combinación con tres β-1,4-endoxilanasas (EC 3.2.1.8) de las familias GH10 (CsXyn10A y CsXyn10B) y GH11 (CsXyn11A), previamente expresadas en el laboratorio. En ensayos de degradación de biomasa residual, la eliminación de residuos de arabinosa por CsAbf62A mejoró la accesibilidad de la xilanasa CsXyn10A al AX de trigo, aumentando la concentración de xilobiosa liberada, en comparación a la actividad de CsXyn10A sola. Por otro lado, la liberación de xilosa a partir de GX de madera de haya por CsXyn10A y CsXyn10B aumentó significativamente en presencia de CsAgu67A y una β-1,4-xilosidasa comercial GH43. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron tener un repertorio de actividades enzimáticas complementarias, necesarias para mejorar la eficiencia de degradación de los polisacáridos presentes en la biomasa lignocelulósica. La disponibilidad de estas enzimas permitirá el desarrollo de formulaciones óptimas de complejos enzimáticos, específicas para cada tipo de biomasa y proceso de aplicación. Así se sientan las bases para el diseño de cnsorcios enzimáticos “a medida”, para su aplicación en la producción de hexosas y pentosas y/o en la funcionalización de polisacáridos.

Descripción: En la presente Tesis, se estudió la capacidad de factores propios a los entornos inflamatorios e inherentes a los complejos inmunes (CI), de condicionar distintas respuestas biológicas inducidas a consecuencia de la interacción del fragmento Fc de los anticuerpos IgG con sus receptores celulares específicos (RFcg). Respecto a los primeros se evaluó el efecto de dos enzimas proteolíticas de distinta especificidad, pronasa y quimotripsina. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteasas incrementan marcadamente la avidez y la funcionalidad del RFcgII expresado por neutrófilos, condicionando la magnitud de las respuestas biológicas que involucran la participación de este receptor. Este efecto, sin embargo, parece ser dependiente de las características del CI empleado como estímulo, puesto que las proteasas aumentaron notablemente las respuestas inducidas por eritrocitos sensibilizados con anticuerpos IgG y por CI solubles, pero no modificaron aquellas inducidas por CI precipitantes. La acción potenciadora de las proteasas parece ser selectiva del RFcgII, pues este efecto no fue observado en otros receptores operativos en neutrófilos. Considerando la existencia de altos niveles de proteasas en reas inflamatorias, es posible que este mecanismo sea relevante in vivo en la regulación de la actividad del RFcgII del neutrófilo humano. En cuanto a los factores inherentes a los CI, se analizó el impacto de la carga eléctrica de los antígenos y anticuerpos que los conforman, sobre su capacidad de inducir respuestas proinflamatorias y trombóticas mediadas por células fagocíticas y plaquetas, respectivamente. La cationización de la fracción IgG de los CI, procedimiento que incrementó sus pI desde 5,8-8,2 hasta 8,0-9,5, aumentó, al menos en un orden de magnitud, su capacidad de inducir funciones dependientes de los RFcg expresados por células fagocíticas tales como la citotoxicidad, la emisión de quimioluminiscencia y la liberación extracelular de elastasa. El efecto potenciador de la cationización fue a£n m s notable empleando plaquetas. Los CI que incluían anticuerpos IgG cationizados fueron capaces de inducir fuertes respuestas de activación de plaquetas lavadas, filtradas o plaquetas suspendidas en plasma, mientras que aquellos formados con componentes nativos fueron incapaces de inducir la activación plaquetaria bajo condiciones experimentales similares. La cationización del componente antigénico de los CI, también incrementó marcadamente su potencia biológica. En conjunto, estos hallazgos indican que la carga eléctrica de los CI constituye una propiedad critica que condiciona su capacidad de inducir la activación celular y sugieren que los anticuerpos y antígenos catiónicos podrían ser relevantes en eventos inflamatorios asociados a enfermedades que cursan con altos niveles de CI circulantes. Durante el transcurso de estos estudios se realizaron observaciones adicionales relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios agudos. El paradigma corriente asume que las capacidad quimiot ctica de la IgG reside en su habilidad para formar CI e inducir la activación del sistema complemento y la subsecuente producción de péptidos quimiot cticos como el C5a. En la presente Tesis, se observó que los CI son capaces, per se, de estimular la quimiotaxis de neutrófilos a través de su interacción con el RFcgII. Esta actividad quimiot ctica intrínseca de los CI podría ser responsable, al menos en parte, delreclutamiento de neutrófilos observado en sitios inflamatorios de huéspedes deficientes de complemento.

Descripción: Por miles de años, los peces antárticos han estado aislados en un ambientecon temperaturas muy bajas (con poca fluctuación estacional) y con un altocontenido de oxígeno. En tales condiciones, el estrés oxidativo pudo ser uno delos factores más importantes que afectaron sus estrategias adaptativasmetabólicas. Se tomaron muestras de tejidos de especies pertenecientes a dosfamilias de peces antárticos Nototheniidae (nototénidos) y Channichthyidae (caníctidos o peces de hielo). En homogenatos de hígado, branquias, corazón ymúsculo, fue medida la actividad de las enzimas antioxidantes: superóxidodismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx); los niveles devitamina E y la capacidad antioxidante total (TRAP). También se analizó Iaactividad de SOD en muestras de sangre. La actividad de SOD branquial es 3 veces mayor en caníctidos comparadacon la de los nototénidos, mientras que la actividad de CAT y GPx essignificativamente mas alta en las branquias de los nototénidos. El aumento de laactividad de SOD branquial podría ser reflejo del importante gradiente de P02 queocurre a través del epitelio branquial de los caníctidos. La baja actividad de CAT y GPx hallada en las branquias de estas especies sugeriría que la H2O2 producidasería eliminada preferentemente por difusión. Por el contrario, la actividad de SODsanguínea es 5 veces más alta en los nototénidos, los cuales poseen eritrocitos ensangre que aumentan la capacidad de transporte de oxígeno. En estos peces, laactividad de CAT es más alta en todos los tejidos estudiados excepto en músculo. Comparando los niveles de vitamina E entre ambas familias no se observanclaras diferencias salvo para aquellos valores que corresponden a músculo. El altocontenido de vitamina E medido podría estar correlacionado con la alta densidaddel volumen de mitocondrias por volumen de fibra muscular de los caníctidos,dado que la vitamina E es responsable de la protección de los lípidos demembrana frente a su peroxidación. De manera coincidente el valor de TRAP (querepresenta la capacidad antioxidante total asociada a moléculas hidrosolubles) estambién alto en el músculo de los caníctidos. Esto está probablemente relacionadocon la función del ácido ascórbico (un compuesto hidrosoluble), que regenera lacapacidad antioxidante dela vitamina E. La característica más saliente del epitelio que recubre las laminillassecundarias en las branquias de los peces de hielo es su borde externo ondeado,característica ausente en el epitelio branquial de los nototénidos. Los valores de las distancias de difusión sangre-agua, medidas en lasbranquias de las especies de los peces estudiados, se correlacionanpositivamente con el hábito descripto para cada especie, sin importar a que familiapertenecen.

Descripción: El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es la endocrinopatía más frecuente en las mujeres en edad reproductiva y constituye la causa más común de esterilidad femenina. Su característica principal es el hiperandrogenismo, una condición que ha sido asociada a la insuficiencia lútea y a un incrementado riesgo de pérdida de la preñez temprana. A pesar de la relevancia del cuerpo lúteo (CL) en la reproducción, prácticamente no existen investigaciones abocadas al estudio de esta glándula en SOP. Por ello, en este trabajo evaluamos los mecanismos por los cuales el exceso de andrógenos modula la funcionalidad e involución del CL, en un modelo murino de androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). También determinamos la capacidad de metformina de revertir dichas alteraciones. Durante la etapa funcional del CL, el hiperandrogenismo indujo la disminución de la progesterona sérica mediante la modulación de las enzimas esteroidogénicas. Por el contrario, la administración de DHEA durante la regresión funcional provocó el “rescate” del CL, incrementando los niveles de progesterona mediante la regulación de su biosíntesis y degradación, su acción anti-oxidante y la modulación de las prostaglandinas. El hiperandrogenismo durante la regresión estructural incrementó la apoptosis y reguló la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica en las células del CL. La metformina previno muchos de los efectos del hiperandrogenismo en la luteólisis, pero no evitó la disfuncionalidad lútea en su etapa funcional. Concluimos que el hiperandrogenismo posee un efecto dual sobre el CL, dependiendo del estado de desarrollo lúteo en el cuál actúe, generando estados patológicos y disfuncionales, la mayoría de los cuales pueden ser evitados por la metformina.

Descripción: La lignocelulosa es el componente mayoritario de la biomasa vegetal. Está formada por celulosa embebida en una matriz de hemicelulosa y lignina. Los microorganismos celulolíticos aerobios secretan un conjunto de enzimas que les permiten degradar los polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosas) para utilizarlos como fuente de carbono. Estas enzimas son ampliamente estudiadas y tienen gran importancia, particularmente por su potencial aplicación en el aprovechamiento de biomasa no-alimenticia, como residuos agro-foresto industriales, principalmente para obtener biocombustibles o alimento animal. El aislamiento bacteriano Cellulomonas sp. B6, obtenido a partir de un consorcio celulolítico de suelo forestal, fue capaz de crecer en numerosos sustratos celulósicos, incluyendo biomasa. Los sobrenadantes de cultivo presentaron principalmente actividades endo y exoglucanasa y xilanasa y en los extractos intracelulares se detectaron actividades β-glucosidasa y β-xilosidasa. El crecimiento en biomasa lignocelulósica (residuo de cosecha de caña de azúcar, RAC) resultó en la mayor actividad enzimática en el sobrenadante (0,2 y 0,6 UI/ml para las actividades endoglucanasa y xilanasa, respectivamente). Estas actividades se mantuvieron en un rango de pH de 5 a 8 y de temperatura de 40 a 55°C, indicando la potencialidad del extracto para aplicaciones de degradación de biomasa en esas condiciones. Por zimografía, estas actividades se correlacionaron con proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo. El genoma de Cellulomonas sp. B6 fue secuenciado por Illumina MiSeq y ensamblado en 279 contigs, resultando en una cobertura de 83X. El tamaño total del genoma se estimó en 4 Mb y el contenido de GC fue de 75,1%, similar a lo reportado para cepas de referencia del género. Por análisis filogénetico a partir de la secuencia de la subunidad 16S de ARN ribosomal, Cellulomonas sp. B6 se encuentra relacionado con las especies Cellulomonas flavigena y Cellulomonas persica, aunque presenta características genotípicas y metabólicas distintivas, lo que sugiere que podría tratarse de una nueva especie. Mediante anotación del genoma Cellulomonas sp. B6 por las plataformas NCBI y RAST, seguido de análisis por la plataforma dbCAN, se identificaron 3443 secuencias codificantes para proteínas, de las cuales 205 corresponden a enzimas activas sobre carbohidratos (CAZimas). De las CAZimas predichas, 91 son glicosil hidrolasas (GH), de las cuales 32 poseen secuencia codificante para péptido señal, lo que indica que podrían ser extra-celulares. Para identificar las proteínas responsables de la actividad enzimática previamente observada, se analizó por espectrometría de masas el secretoma completo (conjunto de proteínas extracelulares) en sobrenadantes de cultivo en celulosa (carboximetilcelulosa, CMC), residuo agrícola de caña de azúcar molido (RAC) o paja de trigo pretratada por extrusión (PTE), como únicas fuente de carbono. En el sobrenadante de cultivo en CMC se identificaron 2 exoglucanasas (GH6 and GH48) y tres xilanasas GH10, mientras que el crecimiento en biomasa (RAC o PTE) resultó en la identificación de 22 CAZimas, incluyendo endo- y exoglucanasas (2 GH6, 2 GH9 y 1 GH48), xilanasas (7 GH10 y 1 GH11), una xiloglucanasa (GH74), una arabinofuranosidasa/ β-xilosidasa (GH43), una β-glucosidasa (GH3) y una α-glucuronidasa (GH62), entre otras. Adicionalmente, se identificó una oxígenasa lítica de polisacáridos (LPMO) AA10, potencialmente involucrada en la deconstrucción de celulosa cristalina por un mecanismo oxidativo. La diversidad de GH10 secretadas (todas las extracelulares codificadas en el genoma) remarca la importancia de estas enzimas en la deconstrucción de biomasa. Para comenzar a evaluar la contribución individual de las xilanasas de la familia GH10 a la actividad del extracto, una GH10 con un módulo de unión a sustrato CBM2, a la que denominamos GH10XynC, fue expresada de manera recombinante en Escherichia coli y purificada en forma soluble. La enzima recombinante presentó actividad endoxilanasa (EC 3.2.8.1) en el rango de 300 UI/mg, sobre xilano de abedul y sobre arabinoxilano. No presentó actividad sobre celulosa, confirmando que es una xilanasa libre de actividad celulolítica. Los productos de hidrólisis de xilano fueron xilobiosa (X2) y xilosa (X1) en menor proporción y la actividad fue óptima a 50ºC, en un rango de pH de 5 a 7,5. Ensayos de hidrólisis con GH10XynC de paja de cebada y de trigo y el marlo de maíz dulce (MMD) (pre-tratados por extrusión) resultaron en la conversión a xilooligosacáridos, X2 y X1, demostrando la habilidad de la enzima de actuar sobre el xilano contenido en la biomasa. En conjunto, estos resultados demuestran que Cellulomonas sp. B6 constituye una fuente de enzimas con potencial aplicación agro-industrial en el aprovechamiento de biomasa lignocelulósica. Es más, la enzima GH10XynC podría ser aplicada en la utilización de xilanos para las indutrias de biocombustibles, prebióticos y alimento animal.

Descripción: En este trabajo se estudió la capacidad de algunas especies de Trichoderma, en particular T. harzianum, como antagonistas del patógeno vegetal Sclerotinia sclerotiorum. En las pruebas de antagonismo "in vierto" se comprobé dicha capacidad en términos de la disminución del crecimiento de la colonia del patógeno y la reducción tanto de la viabilidad de los esclerocios como del desarrollo de otros nuevos. También se describió el proceso del micoparasitismo por parte del antagonista Trichoderma spp. sobre dos fases somóticas del patógeno: sus esclerocios y el micelio. En el primer caso se observó, con microscopía óptica, la colonización de los tejidos de los esclerocios infectados por parte del antagonista, comprobándose la total destrucción de la médula de los mismos. En el segundo, se observaron las interacciones hifales entre el micoparásito (T. harzianum BAFC cult. N§ 742) y el hospedante, tanto en cultivo dual como en un suelo estéril, con microscopía óptica y de barrido. En los cultivos duales, las hifas de T. harzianum crecieron hacia las de S. sclerotiorum enrollándose alrededor de ellas. En los últimos estadíos del proceso micoparasítico, se observaron enrollamientos o "coilings" muy densos y una degradación parcial de las paredes celulares de las hifas del patógeno. En suelo estéril, los conidios de T. harzianum germinaron y el micelio en desarrollo alcanzó al de S. sclerotiorum. Trichoderma formó ramificaciones cortas y cuerpos similares a apresorios los cuales podrían contribuir con la penetración de la pared del hospedante. Por otro lado se comprobé la capacidad del aislamiento de T. harzianum BAFC cult. N§ 742 para producir enzimas extracelulares que degradan las paredes celulares de S. sclerotiorum. Paralelamente se verificó la presencia de lectinas en una medio de cultivo líquido de S. sclerotiorum. En este trabajo se estudió además, la supervivencia de esclerocios de S. sclerotiorum en un suelo inoculado con T. harzianum en función de la concentración de inóculo del antagonista, de la temperatura y del pH. Posteriormente se llevaron a cabo pruebas preliminares sobre control biológico. Primero se desarrolló un sistema "in vierto" para evaluar la habilidad de Trichoderma para controlar la marchitez producida por S. sclerotiorum en plantas de pepino y lechuga: el recubrimiento de semillas con conidios de T. harzianum result¢ en reducciones del efecto de S. sclerotiorum sobre la emergencia y post-emergencia de las plantas de ambos hospedantes. Luego se realizó una búsqueda o "screening" en invernadero, con lechuga, en el cual se ensayaron varios aislamientos de Trichoderma spp. algunos de los cuales aumentaron los porcentajes de semillas germinadas y la supervivencia de las plantas, aunque no significativamente desde el punto de vista estadístico. Uno de estos aislamientos, T. harzianum BAFC cult. N§ 742, indujo además un incremento significativo en el peso seco del vástago de las plantas. Se realizaron dos ensayos independientes con lechuga en los cuales se empleó el aislamiento mencionado anteriormente como antagonista, obteniéndose, en uno de los ensayos, una reducción no significativa en la incidencia de la enfermedad. Sin embargo, se observaron aumentos en la mayoría de los parámetros de crecimiento de la planta medidos, todos estadísticamente significativos. Se efectuaron otros dos ensayos empleando plantas de soja como hospedante, uno en invernadero y el otro a campo. En ambos se verificó un control significativo de la enfermedad en los tratamientos con la aplicación de T. harzianum BAFC cult. N§ 742. En cambio, no se registraron diferencias significativas en el desarrollo de las plantas en ninguno de los dos casos. Se realizaron dos ensayos de biocontrol más, empleando girasol como hospedante, de los cuales se extrajeron resultados significativos referentes al aumento en el desarrollo de las plantas y la reducción de la incidencia de la enfermedad producida por S. sclerotiorum. Los resultados se discuten en forma independiente por capítulos y finalmente en forma global.

Descripción: Los materiales lignocelulósicos dan origen a múltiples industrias, siendo la fabricación depulpa y papel una actividad económica de importancia global. Estudios previosdemostraron que las enzimas de hongos ligninolíticos podrían resultar útiles en distintasetapas del procesamiento de la madera, así como en la biorremediación de los efluentes. El presente trabajo se centró en el relevamiento y la caracterización enzimática de 35cepas de hongos causantes de pudrición blanca de la República Argentina y en su posibleutilización en tres etapas específicas de la producción de pulpa y papel: biopulpado,bioblanqueo y degradación del licor negro. Los resultados de esta investigaciónpermitieron identificar una cepa con potencial para el biopulpado de madera de Pinustaeda. Pycnoporus sanguineus no sólo fue capaz de reducir el contenido de lignina un 11% en 14 días de tratamiento, sino que también produjo cambios estructurales notablesen la lignina y la hemicelulosa, incrementando la porosidad 15%. Además de lamodificación química causada por delignificación selectiva, los cambios físicosproducidos, como el aumento del tamaño de poro, afectan directamente la penetración deproductos químicos de cocción, reduciendo el consumo de energía en el proceso. Enreferencia al bioblanqueo, se lograron resultados promisorios mediante una secuenciasencilla, totalmente libre de cloro, que involucró sobrenadantes de cultivo de Trametestrogii y Coriolus antarcticus, y posterior blanqueo con peróxido de hidrógeno. La mismafuncionó aun en condiciones moderadas (28°C) lo que permite minimizar el consumo deenergía y la pérdida de pulpa. La utilización de crudos enzimáticos evita el costo elevadode la purificación enzimática y el uso de mediadores adicionales. Entre las cepasinvestigadas para su posible uso en el tratamiento del licor negro, Lenzites elegans fuecapaz de lograr buenos porcentajes de decoloración, y sólo requirió para ello de ladisminución del pH del efluente con el agregado de ácido cítrico. Irpex lacteus tambiénresultó capaz de decolorarlo, pero fue necesario un dializado previo. Como resultado deesta investigación, se identificaron nuevas cepas de hongos ligninolíticos con potencial enbiopulpado, bioblanqueo y decoloración del licor negro y se analizaron condiciones a sertenidas en cuenta a la hora de utilizar a estos organismos o sus enzimas en dichosprocesos.

Descripción: Los hongos causantes de la pudrición blanca de la madera son los únicos capaces de despolimerizar la lignina y degradarla hasta su completa mineralización por acción de las ligninasas. Stereum hirsutum es un Basidiomycete que pertenece a este grupo fisiológico de hongos, presenta actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP). Se optimizaron las condiciones para la producción de estas enzimas en medio líquido. Los metales pesados produjeron mejores resultados al ser utilizados como inductores de la producción de ligninasas con respecto a los compuestos aromáticos. Una característica relevante de la cepa fue que sometida a estrés por pH, temperatura y xenobióticos como metales pesados y aromáticos no se produjo una reducción del crecimiento y se detectó actividad de ligninasas. Los cultivos en sustrato sólido presentaron como ventaja un importante incremento en la producción de enzimas y una estructura micelio sustrato de difícil disgregación que permitió realizar ensayos de decoloración en forma aeróbica originando como productos de la degradación del Verde de Malaquita, un fungicida, compuestos no tóxicos. Las ligninasas producidas tanto en SmF (fermentación sumergida) como en SSF (fermentación en sustrato sólido) fueron dos isoenzimas de lacasa de 66 y 102 kDa y una MnP de 26 kDa. Los ensayos de electroforesis permitieron establecer que ambas isoenzimas de lacasa y la MnP tienen acción decolorante sobre el índigo carmín y sobre el verde de malaquita.

Descripción: Se comparan datos experimentales de respuesta amperométrica para biosensores enzimáticos con modelos que acoplan procesos de difusión-reacción. Se trabajó con Glucosa Oxidasa (GOx, E.C. 1.1.3.4) y mediadores redox artificiales: el complejo [Os(bpy)2ClpyCOOH]+ en el caso homogéneo; y un análogo del mismo unido covalentemente a polialilamina (PAH-Os), que se autoensambla electrostáticamente capa-por-capa junto a GOx dando lugar a un biosensor totalmente integrado. Se ajustaron datos experimentales para el sistema homogéneo a las fórmulas analíticas aproximadas del modelo de Albery (JEC, 323, (1992), 97). A baja concentración de glucosa se observaron voltagramas cíclicos no estacionarios, con desarrollo de un pico de corriente y marcada histéresis, contrariamente a lo predicho por el modelo. Se compararon voltagramas experimentales y simulados numéricamente, en el marco de un modelo más completo que considera el desarrollo de perfiles de concentración. Se reporta además inactivación de la enzima presente en solución de glucosa. Se analizaron cambios en la estructura y la electrocatálisis de películas al variar la densidad de carga lineal de PAH-Os modificando el pH de las soluciones de autoensamblado. La respuesta del sistema inmovilizado se analizó según el modelo de Pratt-Bartlett (JEC, 397, (1995), 61) con el objeto de validar el mismo. Se trabajó con películas de espesor variable y un amplio intervalo de concentraciones de glucosa. Los datos experimentales arrojaron un buen ajuste a las fórmulas aproximadas. También se ajustaron usando una rutina Simplex combinada con la resolución numérica de las ecuaciones diferenciales sin emplear simplificaciones. Los parámetros de ajuste fueron acotados alrededor de los valores hallados con las fórmulas aproximadas. El análisis combinado mediante fórmulas analíticas aproximadas y simulaciones numéricas resultó útil para la extracción de parámetros desconocidos y comprender mejor los factores que afectan la respuesta amperométrica.

Descripción: La langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus, presenta numerosascaracterísticas biológicas y comerciales que la convierten en una especie apropiada para laacuicultura. Sin embargo, el crecimiento productivo ha sido poco significativo en la Argentina debido a diferentes motivos tales como la ausencia de tecnologías de cultivo,elección inadecuada del sitio de cultivo y, principalmente, por la falta de ―semilla" endistintas fases para su comercialización. Dada la escasa información existente sobre elcultivo de esta especie, se plantearon los siguientes objetivos generales: evaluar y compararlos efectos de alimentos comerciales y formulados especialmente para esta especie sobre lafisiología digestiva; estudiar el ritmo diario de secreción de las enzimas digestivas y suposible modificación en función del momento de alimentación y el período de ayuno;evaluar la inclusión de la harina de calamar como atractante y analizar el efecto de ladisponibilidad de alimento luego de un ayuno corto o moderado sobre la actividad deenzimas digestivas y estudiar el efecto del ayuno prolongado y posterior alimentación sobrelas respuestas bioquímicas y fisiológicas de C. quadricarinatus. Los animales alimentadoscon el alimento especialmente formulado presentaron una buena condición fisiológica enfunción de la actividad enzimática digestiva y una estructura celular y tisular conservada dela glándula digestiva. Sin embargo, la dieta diseñada para esta especie presentó bajadigestibilidad in vitro de proteínas. La secreción de las enzimas digestivas no mostró unpatrón diario y el momento de alimentación (matutina o vespertina) afectó la actividad delas enzimas digestivas. El ayuno moderado provocó modificaciones en el patrón de ritmodiario de secreción de las enzimas digestivas. La harina de calamar no actuó comoatractante para C. quadricarinatus, mientras que la disponibilidad de alimento luego de unperíodo de ayuno corto no causó modificaciones en la actividad de las enzimas digestivas;por el contrario, dicha actividad se vio alterada por la disponibilidad de alimento cuando losanimales fueron expuestos previamente a un ayuno prolongado. En función de losresultados obtenidos sobre la disponibilidad de alimento y a estudios previos de otrosautores, se propone una posible vía de regulación de la actividad de la lipasa digestiva. Finalmente, el ayuno prolongado provocó la disminución de reservas energéticas (glucógeno y lípidos), niveles de glutatión reducido, actividad de lipasa y proteasa; yalteraciones en la estructura celular y tisular de la glándula digestiva, aunque no causó unincremento en el daño oxidativo. La posterior alimentación, luego del ayuno prolongado,provocó que se restablecieran todos los parámetros anteriormente descriptos. La presentetesis aporta información novedosa e importante sobre la respuesta fisiológica de la langostade agua dulce C. quadricarinatus que podría ser de gran utilidad para el cultivo de laespecie.

Descripción: En el presente trabajo se estudió la obtención de fracciones enriquecidas en fibra alimentaria soluble a partir de mesocarpio de calabaza (Cucurbita moschata Duch ex Poiret) obtenido en el mercado Argentino. Se aplicaron técnicas de extracción de fibra soluble las cuales involucraban el uso de una solución buffer de citrato de sodio con y sin presencia de enzima (hemicelulasa y/o proteasa). La extracción enzimática se llevó a cabo durante 4 horas a 45 °C y se estudió el efecto de las técnicas extractivas en el rendimiento y funcionalidad de los productos obtenidos al incluir o no una enzima degradadora de la pared celular. Asimismo, se realizó el aislamiento de fibra soluble mediante técnicas convencionales utilizadas a nivel industrial con fines comparativos (extracción con HCl a pH = 2 a 85 °C durante 60 min). Se caracterizó la composición química, capacidad emulsificante y espesante de cada fracción aislada. Las pectinas obtenidas presentaron propiedades fuertemente influenciadas por la técnica de extracción utilizada.

Descripción: La Dirección Nacional de Acuicultura propone la investigación de las especies exóticasya introducidas y el mejoramiento de las tecnologías de cultivo actualmente utilizadas. Por esto, la presente tesis abordó dos temas principales para contribuir coninformación relevante al cultivo de Cherax quadricarinatus: el estudio de lavulnerabilidad nutricional de los juveniles en la fase de hatchery y la optimización deluso de refugios durante la fase de pre‐engorde para disminuir el canibalismo. Seobservó que los juveniles III (primer estadio de alimentación exógena) y 1 de gramonecesitan sólo 2 y 9 días de alimentación inicial, respectivamente, para acumular lasreservas necesarias para mudar al estadio siguiente. El tiempo sin alimento que lleva ala muerte a los juveniles III y de 1 gramo sin poder mudar al estadio siguiente es de 9 y 51 días respectivamente, y son los valores más altos reportados para especies dedecápodos. Durante largos periodos de inanición los juveniles consumen las reservasde proteínas y lípidos almacenadas en hepatopáncreas y músculo abdominal. Sinembargo, al suministrarles alimento los juveniles muestran gran capacidad derecuperación, reanudando su crecimiento rápidamente, completando sus reservas ygenerando nuevas reservas de glucógeno en el músculo abdominal. No se observóactividad enzimática asociada a la movilización de reservas y solo la actividad lipasa (digestiva) se mostró afectada por la inanición. Respecto del uso de refugios, por cadam2 de tanque en la fase de pre‐engorde, 2,55 m2 de red cebollera colocada en formaaleatoria es suficiente para disminuir la mortalidad. Esta información constituye unavance en el conocimiento teórico y un aporte directo al mejoramiento de laproducción de una especie con importancia para la acuicultura de nuestro país.

Descripción: La expansión e intensificación de la agricultura implica cambios en la condición de los ambientes naturales y en el paisaje que afectan la conservación de anuros en los agroecosistemas. Existe un debate sobre la importancia relativa de los factores de cambio locales y del paisaje para las especies y comunidades de anuros. Además, existe preocupación sobre el impacto de la contaminación por agroquímicos en la calidad ambiental y la salud de los anuros. La combinación de estos múltiples factores que operan a diferentes escalas podría tener fuertes efectos en la biodiversidad de anuros. El objetivo de este estudio fue comprender los efectos de los múltiples factores relacionados con la expansión e intensificación de la agricultura y sus interacciones a múltiples escalas espaciales sobre la diversidad de anuros en los agroecosistemas de la ecorregión Espinal en Argentina. En el Capítulo 1, evalué la respuesta de los anuros a la composición y configuración del paisaje en dos paisajes del centro-este de Argentina con diferentes grados de agriculturización. Identifiqué especies sensibles y evalué la influencia del paisaje en comunidades y especies individuales a dos escalas espaciales. Comparé la riqueza de anuros, la frecuencia de ocurrencia y la actividad entre paisajes utilizando datos de encuestas de llamadas de 120 puntos de muestreo de 2007 a 2009 y evalué las respuestas de anuros a las variables de la estructura del paisaje dentro de los búferes de 250 y 500 metros de radio. En el Capítulo 2, comparé la respuesta de anuros a la condición local del hábitat reproductivo y la estructura del paisaje a diferentes escalas espaciales. Realice relevamiento de anuros en 103 nacientes de arroyos independientes y distribuidos al azar desde septiembre de 2012 hasta marzo de 2013. Evaluamos la respuesta de la riqueza y la presencia de especies a variables locales fisicoquímica, morfometría y de la vegetación acuática y terrestre de la ribera, y a las variables de composición y configuración de los paisajes cuantificados dentro de 250, 500 y 1000 m de radio. En el capítulo 3, evalué los efectos individuales y combinados de la estructura del paisaje y la contaminación agroquímica de cuerpos de agua a diferentes escalas espaciales (subcuenca y escala local). Seleccioné un subconjunto de 35 sitios del capítulo 2 que difería en la cantidad de bosque dentro del área de drenaje (sub-cuenca) y en el ancho de los márgenes ribereños del bosque. Medí la concentración de agroquímicos en agua y sedimentos. Finalmente, en el capítulo 4, evalué si los niveles ambientales de contaminación por agroquímicos y el ancho de buffer de bosque sobre la salud y condición física de larvas. Realicé un ensayo de campo de exposición in situ con larvas de R. fernandezae de octubre a diciembre de 2013 en 13 sitios que se agruparon en cuatro clases según el ancho del bosque ribereño. En el capítulo 1, encontré que los anuros en los paisajes agrícolas de la zona centro-este de Argentina están respondiendo fuertemente a la estructura del paisaje. La riqueza de anuros fue menor en el paisaje con un mayor nivel de agricultura con menor cantidad de cobertura forestal y longitud de arroyo. Las respuestas varían según la especie y la escala de estudio. Los rasgos de vida de las especies contribuyen a diferencias en su respuesta. En el capítulo 2, se observó que la riqueza y la presencia de todas las especies sensibles respondían a factores locales y del paisaje, siendo el paisaje más relevante para la mayoría de las especies. La riqueza disminuye a medida que aumenta la profundidad del agua y la pendiente de los márgenes, y aumenta con la cobertura y heterogeneidad de la vegetación acuáticas, así como con la cobertura total de bosques a 250 m y la conglomeración de parches de bosques a 1000 m. Se encontraron diferentes asociaciones de factores locales y del paisaje para algunas especies que nuevamente correspondían con rasgos de vida particulares de las especies. En el capítulo 3, la diversidad de anuros se vio favorecida por una mayor cobertura de bosque a escala de subcuenca y el ancho del bosque adyacente al arroyo local. La diversidad de anuros disminuye en sitios con mayor glifosato; 2,4-D y nitratos. Finalmente, encontré que los efectos negativos de los agroquímicos sobre la diversidad de anuros se reducirían frente a una mayor proporción de cobertura de bosque en el área de drenaje o un ancho adyacente del bosque más grande. Finalmente, en el capítulo 4, el glifosato y el 2,4-D redujeron la condición corporal, el desarrollo y la proporción de individuos que alcanzaron la metamorfosis al final del ensayo. El clorpirifos mostró un efecto perjudicial más consistente sobre las larvas. Se observó una respuesta diferente para la atrazina, cipermetrina y dimetoato que se relacionaron positivamente con el desarrollo. Los herbicidas e insecticidas afectaron la actividad de las enzimas del estrés oxidativo de diferentes maneras. Los herbicidas mostraron la activación de algunas enzimas, mientras que los insecticidas son una inhibición. El desarrollo de las larvas no mostró una respuesta clara al ancho del buffer de bosque, y no encontré evidencias de la contribución del ancho de buffer a la reducción de agroquímicos. Por lo tanto, el proceso de agriculturización tiene implicaciones sustanciales para la conservación de anuros en los agroecosistemas de la ecorregión Espinal en Argentina, principalmente a través de la perdida y fragmentación de hábitat. Los anuros son impactados negativamente por múltiples factores de cambio que ocurren en diferentes escalas espaciales que llevan a la pérdida de algunas especies sensibles y la reducción de la diversidad de anuros. La biodiversidad de los anuros responde de manera compleja, ya que está influenciada no sólo por la estructura del paisaje y los cambios del hábitat local, sino también por la forma en que estos cambios interactúan cuando ocurren conjuntamente en un sitio. Además, la respuesta de los anuros a cada factor y la escala de influencia son específica para cada especie. La respuesta de los anuros a estos cambios está relacionada con sus rasgos biológicos particulares, incluido su complejo ciclo de vida bifásico y las escalas espaciales en las que las especies perciben sus hábitats. Las acciones de manejo deben mejorar la calidad del hábitat local necesaria para las diferentes etapas de anuros (en particular para las larvas y especies más sensibles) y la estructura del paisaje para favorecer la complementación del hábitat mejorando la dispersión de anuros a través de la matriz agrícola. Las regulaciones y el control sobre el uso de agroquímicos alrededor de cuerpos de agua es clave para reducir los riesgos de anuros y el manejo desde una perspectiva de ecotoxicología del paisaje debe considerarse para favorecer la conservación de anuros en nuestros agroecosistemas. Una estrategia de gestión integrada a múltiples escalas para los agroecosistemas mejoraría sustancialmente la diversidad y el estado de conservación de los anuros, manteniendo los valiosos servicios de los ecosistemas que contribuyen a tener agroecosistemas sostenibles a largo plazo.