Descripción: La tuberculosis (TB) es considerada la segunda causa de muerte por infección, causando 1.7 millones de muertes al año. Se estima que un tercio de la población mundial está actualmente infectada con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y que sólo entre el 5‐10% de aquellos infectados desarrollarán la enfermedad, siendo desconocidos los mecanismos que conducen al establecimiento de la enfermedad tuberculosa latente o activa. El éxito de la infección depende principalmente de las estrategias de evasión de la respuesta inmune y de la capacidad de las células presentadoras de antígeno (CPA) de iniciar una eficiente respuesta. En este sentido, las células dendríticas (CD) son críticas para el desarrollo de la respuesta inmune antibacteriana y, por lo tanto, constituyen un blanco fundamental en la inmuno‐evasión inducida por Mtb. Nuestra hipótesis de trabajo es que durante la infección con Mtb se inducirían alteraciones en las CPA determinando la eficiencia de la respuesta inmune así como el curso de la infección; teniendo en cuenta esto, nuestro objetivo fue investigar las alteraciones en la generación de las CPA y su impacto en el desarrollo de la respuesta inmune en pacientes con TB. Para ello, caracterizamos el efecto de la bacteria sobre la diferenciación de monocitos (Mo) en controles sanos, observando que Mtb altera la diferenciación hacia CD a través de la secreción de IL‐10 y la activación de TLR‐2. Las células obtenidas presentaron baja expresión de receptores de entraba para la bacteria, baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos en el contexto de moléculas CD1 y mayor proliferación de clones T específicos de perfil TH2. Por otro lado, caracterizamos el fenotipo y la función de las CD obtenidas a partir de los Mo de pacientes con TB, las cuales presentaron alteraciones en la expresión de los marcadores típicos de CD así como una baja capacidad de presentación de antígenos micobacterianos. Finalmente, los Mo de los pacientes con TB mostraron un alto grado de activación y un enriquecimiento en la población de Mo CD16+, la cual fue previamente descripta como proinflamatoria. Esta población resultó ser menos eficiente para diferenciarse hacia CD y ha sido asociada a la severidad radiológica de la TB y a los niveles plasmáticos de TNF‐α, poniendo de manifiesto la relevancia clínica del hallazgo. En conclusión, en este trabajo de Tesis describimos un nuevo paso en la regulación de la respuesta inmune contra Mtb a través de la modulación de la capacidad de diferenciación de los Mo. Nuestros resultados amplian el conocimiento de los mecanismos involucrados en la evasión de la respuesta inmune ejercida por Mtb y, de ese modo, podrían contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos y vacunas en esta enfermedad re‐emergente tanto a nivel local como mundial.

Descripción: En el Sistema Nervioso Central (SNC) la apotransferrina (aTf) es producida por los oligodendrocitos (OLGs). Previamente demostramos que la aTf acelera la diferenciación oligodendroglial in vivo. Para profundizar en el papel de la aTf, investigamos su efecto en dos estadíos diferentes del desarrollo de la rata. Para ésto, aislamos OLGs de ratas de 4 y 10 días de edad. Encontramos que la acción de la aTf observada in vivo sobre la maduración oligodendroglial era reproducida in vitro solamente en OLGs de ratas de 4 días, sugiriendo la existencia de una “ ventana temporal” estrecha para su efecto. Posteriormente analizamos el papel segundos mensajeros en el efecto de la aTf en distitnas etapas del desarrollo oligodendroglial. Observamos que la aTf activa la vía de AMPc/CREB solamente en etapas tempranas del desarrollo y sobre una cierta población celular, acelerando su diferenciación. Finalmente estudiamos si la diferenciación oligodendroglial observada con aTf era por aceleración de este proceso, una salida prematura del ciclo celular o una combinación de ambos. La aTf disminuye el número de células BrdU+, aumentando la duración del ciclo celular y disminuyendo el número de células en fase S. Los inhibidores del ciclo celular aumentaron y la actividad in vitro de los complejos involucrados en la progresión G1-S disminuyó. Observamos una inhibición parcial del mitógeno PDGF cuando los OLGs se co-cultivaron con aTf. Nuestros resultados indican que la aTf inhibe la progresión del ciclo celular en OLGs, produciendo un retiro prematuro que resulta en un comienzo temprano del programa de diferenciación.

Descripción: Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo mientras que, ante estímulos adecuados, pueden dar origen a todos los tipos celulares del organismo adulto, propiedad conocida como pluripotencia. En esta tesis, estudiamos la relación de las propiedades fundamentales de CME de ratón con diversos aspectos del ciclo celular. En primer lugar, caracterizamos en detalle la dinámica poblacional de proliferación celular, tanto en estado indiferenciado naïve como durante la salida del mismo. Demostramos que la duración de la fase G1 del ciclo celular está pre-determinada en gran medida por la célula parental. Asimismo, determinamos que durante la salida del estado indiferenciado naïve la duración total del ciclo celular, de la fase G1 y de las fases S/G2/M disminuye, en contraposición con lo que ocurre en tipos celulares más diferenciados. Por otra parte, estudiamos la relación entre los cambios transcripcionales que ocurren durante la diferenciación celular con dos procesos en los que ocurre una reconfiguración de la estructura epigenética: la replicación del ADN y la división celular. Mediante la generación de cultivos sincrónicos y un protocolo de diferenciación dirigida, mostramos que las células comienzan a modificar sus patrones de expresión génica en la misma generación que recibe la señal de diferenciación, demostrando que la división celular no es un proceso indispensable para el inicio de los cambios transcripcionales requeridos para la salida del estado indiferenciado naïve. Por otra parte, determinamos que la inhibición de la replicación del ADN reprime severamente el cambio transcripcional durante la diferenciación. Dicho bloqueo en el cambio del perfil de expresión génica fue independiente de la activación de las vías de daño al ADN, evaluado mediante la generación de una línea knock out para p53 con la tecnología de CRISPR/Cas9. Nuestros resultados sugieren que la replicación del ADN podría ser necesaria para que ocurra el cambio en los programas transcripcionales durante la salida del estado indiferenciado, indicando que la síntesis de ADN podría estar acoplada a la modificación de los patrones epigenéticos durante la diferenciación celular. Este resultado podría contribuir a una explicación mecanística para la reciente observación de que las CME sólo responden a señales de diferenciación durante la fase G1 del ciclo celular, es decir, antes de la replicación del ADN. Creemos que los resultados de este trabajo pueden contribuir al entendimiento de los procesos moleculares que controlan las propiedades fundamentales de CME, lo cual no sólo es importante dentro del área de la biología del desarrollo, sino además para su futura aplicación en el área de terapias regenerativas.

Descripción: Los progenitores neurales generan todas las neuronas del sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario -proceso conocido como neurogénesis-, manteniéndose algunos nichos neurogénicos activos en el cerebro adulto. Es necesaria una regulación precisa de la neurogénesis, para el correcto funcionamiento del sistema nervioso, debido a que fallas en este proceso están asociadas al desarrollo de diversas patologías. La transición desde un estado multipotente y proliferativo de los progenitores a un estado de diferenciación neuronal, está estrictamente regulada por diferentes programas moleculares intrínsecos y factores extrínsecos. Entre estos últimos, los factores neurotróficos cumplen roles cruciales para el desarrollo, el mantenimiento y la sobrevida de diferentes poblaciones neuronales. El factor neurotrófico derivado de la glía, GDNF (del inglés, Glial Derived Neurotrophic Factor), fue originalmente descripto por su capacidad de promover la sobrevida de neuronas dopaminérgicas, aquellas afectadas en la enfermedad de Parkinson. GDNF señaliza a través de GFRα1, una proteína anclada a membrana por un dominio glicosil-fosfatidilinositol, en complejo con el receptor canónico Ret, o la molécula de adhesión neural, NCAM. El objetivo general de la presente tesis consistió en identificar y analizar nuevas funciones de GDNF y sus receptores durante la proliferación y diferenciación de progenitores neurales, tanto embrionarios como adultos. En la primera sección de la tesis se estudió el rol del sistema GDNF y su receptor GFRα1 durante el desarrollo de la corteza cerebral. El análisis de la expresión de GFRα1 durante el desarrollo indicó que GFRα1 se expresa desde edades tempranas en la corteza, incrementando sus niveles en forma inversamente proporcional a los niveles de expresión del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos básico, bFGF (del inglés, basic fibroblast growth factor), un factor que promueve la proliferación de los precursores corticales. Se observó que los niveles de expresión de GFRα1 se correlacionan con la diferenciación neuronal. Ensayos utilizando precursores corticales aislados en cultivo demostraron que GDNF inhibe la respuesta de los precursores a bFGF, reduciendo los niveles de expresión de su receptor. De acuerdo con estos resultados, el análisis de animales transgénicos en los cuales la expresión de GFRα1 fue suprimida en precursores neurales, presentaron una reducción en la complejidad neurítica de neuronas corticales y un aumento durante el desarrollo del número de precursores en proliferación. En su conjunto, estos resultados evidenciaron que el sistema GDNF/ GFRα1 cumple un rol fisiológico clave durante el desarrollo cortical, permitiendo una correcta sincronización entre los eventos de proliferación y diferenciación celular de los progenitores neurales. Por otro lado, se estudió la función del sistema GDNF/GFRα1 en la neurogénesis adulta. Estudios de la expresión de GFRα1 demostraron que éste se encuentra altamente expresado en el giro dentado del hipocampo, un nicho neurogénico en el cerebro adulto. Utilizando ratones transgénicos en los cuales la expresión de GFRα1 fue suprimida en progenitores neurales del hipocampo adulto, se observó que aquellas neuronas deficientes para este receptor presentaron una complejidad neurítica menor que aquellas neuronas generadas en animales control. Estos animales presentaron además defectos en su comportamiento, evidenciando un rol fisiológico del sistema GDNF/ GFRα1 en el desarrollo, diferenciación e integración de las neuronas generadas en el hipocampo adulto. De esta manera, en este trabajo de tesis doctoral se han identificado nuevas funciones para GDNF y su receptor, GFRα1, relevantes en la regulación de la fisiología de los precursores neurales tanto embrionarios como adultos. Si bien existen diferencias entre ambas poblaciones celulares, el sistema GDNF/GFRa1 emergería como un sistema de regulación general involucrado en procesos de diferenciación neuronal.

Descripción: Los genes homeóticos codifican para reguladores transcripcionales involucrados en la formación de patrones y las decisiones de destino celular durante la embriogénesis. Recientemente, ha despertado gran interés la función de dichos genes en tejidos adultos en continuo desarrollo así como también en procesos tumorigénicos. La mayor parte del crecimiento y morfogénesis de la glándula mamaria ocurre durante la vida subadulta y adulta del animal y ciertos estadios de la glándula postnatal presentan características de tipo embrionarias. Regulación de fomación de patrones, diferenciación celular e interacciones epitelio-estroma tienen lugar una vez finalizada la embriogénesis y reocurren durante cada ciclo de preñez, lactancia e involución. Debido a que la matriz extracelular influencia el desarrollo funcional y morfogenético de la glándula mamaria, investigamos si las señales provenientes de dicha matriz podrían estar involucradas en la expresión y regulación de genes homeóticos. Mediante una estrategia basada en reacciones en cadena de polimerasa, identificamos la expresión de 5 genes homeóticos pertenecientes a dos "clusters" del complejo Hox, en células mamarias murinas en cultivo. Un gen de cada uno de estos "clusters", Hoxa-1 y Hoxb-7, fue elegido para una caracterización más profunda. Encontramos que Hoxb-7 se expresa tanto en cultivo como in situ, donde su expresión es regulada a lo largo del desarrollo glandular y se localiza en el epitelio mamario. Hoxa-1 no se expresa en ningún estadio del desarrollo de la glándula murina normal pero sí se expresa en algunos tumores mamarios y en células mamarias funcionales, no malignas, cultivadas sobre plástico de cultivo. La expresión de ambos genes es reprimida cuando las células son cultivadas sobre una membrana basal reconstituída. Mientras que la regulación negativa de Hoxb-7 requiere estrictamente la presencia de membrana basal y cierta conformación celular, la de Hoxa-1 se logra mediante el cultivo de las células sobre un sustrato inerte antiadhesivo que permite una reorganización del citoesqueleto y concomitantemente cambios de morfología celular. En celulas tumorales, la expresión de Hoxb-7 es prácticamente indetectable y la expresión de Hoxa-1 no es regulada por ninguno de estos factores microambientales.

Descripción: Esta tesis consiste en el estudio del ciclo celular de células madre pluripotentes (CMP) en diferenciación y los mecanismos moleculares que pueden almacenar memoria de un estímulo externo. Pretende mostrar cómo existen factores hereditarios que determinan el ciclo, y estudiar los mecanismos de herencia y memoria molecular dentro de las redes de regulación génica. Se divide en 3 capítulos. El primero aborda el estudio del ciclo celular y sus fases durante el proceso de diferenciación temprana en las CMP de embrión de ratón. Estas células fueron genéticamente modificadas para fluorescer en dos colores marcando las fases del ciclo, y ser filmadas por microscopía de time-lapse. Los análisis incluyen medidas del ciclo celular a nivel de célula única, construcción de dendrogramas de linajes celulares y el diseño y aplicación de algoritmos para probar si las relaciones familiares determinan la duración del ciclo celular. El resultado principal es que, durante la diferenciación, el ciclo se acorta y las células proliferan a mayor velocidad. Además, la duración del ciclo de una célula está determinada por las células progenitoras, probando que existen factores parentales que controlan la tasa de proliferación. Sin embargo, una de las dificultades a la hora de encontrar cuáles son estos factores, encontrar candidatos y compararlos es, por un lado, la falta de cuantificadores de memoria almacenada en las redes de regulación génica y, por otro, la falta de un catálogo de mecanismos moleculares capaces de almacenar memoria. El segundo capítulo, por su parte, consiste en el desarrollo de un cuantificador matemático de la memoria molecular en redes complejas, aplicado principalmente a vías de señalización celular y redes de regulación génica, que guardan información de estímulos transitorios. Una vez definido el cuantificador, se utilizó para buscar mecanismos o motifs de 1, 2 y 3 nodos que fueran capaces de almacenar información de estos estímulos. Los resultados principales consisten en que los ciclos de retroalimentación positiva son esenciales para dar multiestabilidad y memoria a las redes. Además, las redes capaces de oscilar de manera autónoma también pueden guardar información en la fase de la oscilación. El tercer y último capítulo consiste en una serie de experimentos en las mismas células que se utilizaron en el primer capítulo. El objetivo es detectar la existencia de mecanismos capaces de almacenar memoria. Para esto, tratamos a las células con un estímulo de diferenciación transitorio y luego aplicamos el cuantificador desarrollado en el segundo capítulo. El resultado es que, luego de solo un día expuestas al estímulo de diferenciación, las células lo recuerdan y continúan con el proceso de diferenciación. Asimismo, es probable que esta memoria se deba a la existencia de alguna retroalimentación positiva entre los factores de transcripción marcadores de la pluripotencia.

Descripción: La maduración del sistema nervioso es el resultado de un intrincado balance entre mecanismos de proliferación y diferenciación neuronal, apoptosis y refinamiento sináptico. Estos procesos no son exclusivos de la vida embrionaria, sino que algunas estructuras nerviosas se recambian continuamente aun durante la vida adulta. El caso mejor conocido es el de las neuronas receptoras olfatorias (ORNs), en las cuales este fenómeno se verifica durante toda la vida en todos los vertebrados analizados. El recambio cíclico de las ORNs ocurre también en respuesta a la muerte neuronal masiva provocada por la destrucción del epitelio olfatorio (EO), haciendo de este sistema un excelente modelo para el estudio de la neurogénesis y de la regeneración neuronal. El propósito de esta tesis es analizar algunos aspectos poco conocidos del proceso de neurogénesis usando un modelo de destrucción del EO en larvas de anuros por inmersión en sulfato de zinc (ZnSO4) desarrollado previamente en nuestro laboratorio. Para ello diseñamos una prueba comportamental con el fin de evaluar la capacidad de los animales de responder a estímulos olfatorios durante el proceso de regeneración. Esta herramienta nos permite analizar la funcionalidad del EO y luego procesar a los mismos animales para estudiar los fenómenos de proliferación celular, diferenciación neuronal y participación de factores tróficos en ese proceso mediante técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Observamos que los animales que responden al estímulo presentan niveles normales de proliferación celular y un grado avanzado de diferenciación de las ORNs a nivel histológico y de expresión de marcadores de maduración neuronal, aunque el tamaño de esta población celular es pequeño en relación a los animales intactos. A partir de esto concluimos que el grado de avance de la recuperación morfológica del EO requerido para la readquisición de la funcionalidad es relativamente escaso. Por otro lado, el análisis de la distribución del Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) indica que aumenta su expresión en regiones específicas del sistema olfatorio luego del tratamiento con ZnSO4, lo que sugiere que desempeña un papel importante en la reconstitución del EO y su reconexión con el bulbo olfatorio.

Descripción: Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipocelular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, laspruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que puedenobtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embrionesy con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lotanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante paramejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción confactores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factoresinducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso dereprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticashumanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, loshemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condicionesde generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación,moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir deello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemoscultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fidede las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estadoindiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro,e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhibencaracterísticas morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios decélulas madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares encultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estadopluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad decolonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con lascolonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estadopluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas enhipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando lascolonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, perose indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa deproliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectoresretrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células areprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en losplásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a lasproteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad deactivación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectoresgenerados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posibleefecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en lacélula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muertecelular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlardebido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con elagente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducircon estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a lacomprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollode protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVEcélulas madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas,hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

Descripción: Las células madre amnióticas epiteliales (hAECs) son aisladas del amnios de la placenta humana a término. Son pluripotentes, no son tumorigénicas y poseen propiedades inmunomoduladoras. Estas características las vuelven candidatas ideales para la medicina regenerativa. La falla hepática es una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Si bien el trasplante representa el mejor tratamiento, existen varios obstáculos al respecto. Recientemente, las hAECs han sido propuestas como fuente alternativa de hepatocitos debido a su potencial de diferenciación hepatogénica. Por otro lado, el amnios presenta potencial terapéutico para tratar diferentes enfermedades, incluido el cáncer. Varios estudios indican que la membrana amniótica posee propiedades antiproliferativas, antiangiogénicas y proapoptóticas, concertando de esta manera una actividad antitumoral. El carcinoma hepatocelular (HCC) es el tercer tipo de cáncer que más muertes causa a nivel mundial. Actualmente, se buscan tratamientos alternativos a la radio o quimioterapia, con mayor efectividad. El presente trabajo de Tesis ha sido desarrollado con el objetivo de estudiar y caracterizar a las hAECs durante su diferenciación hepática, evaluando los mecanismos celulares relativos a la proliferación y a los caminos de transducción de señales activados, así como su potencial regenerativo. Por otro lado, se analizaron las propiedades antiproliferativas del medio condicionado de la membrana amniótica (MC-MA) en modelos de hepatocarcinoma, evaluando su potencial antitumoral. En primer lugar, demostramos utilizando un protocolo con factores de diferenciación (DH), que las hAECs se diferencian eficientemente a células símil-hepáticas, incrementándose la expresión de marcadores hepáticos y la síntesis de glucógeno, así como la proliferación y la progresión del ciclo celular; y activándose las vías de MAPK y de PI3K. El tratamiento de las hAECs con medio condicionado de hepatocitos en cultivo (MC) no resultó eficiente para inducir la diferenciación hepática y la proliferación de las hAECs. En este contexto, nos planteamos evaluar la capacidad regenerativa de las hAECs diferenciadas con el medio DH, en un modelo murino de daño hepático inducido con CCl4. Observamos que el trasplante de hAECs diferenciadas disminuye parámetros característicos de la fibrosis hepática como la necrosis, los depósitos de colágeno y los niveles de enzimas hepáticas. En conjunto, nuestros resultados evidencian la potencial aplicación de las hAECs diferenciadas en el tratamiento de enfermedades hepáticas en el contexto de la medicina regenerativa. Por otro lado, demostramos que el MC-MA disminuye significativamente la proliferación y la viabilidad de células HepG2 y HuH-7 y regula la expresión de microARNs involucrados en el desarrollo del HCC, contribuyendo a su posible efectiva acción antitumoral. Nuestros estudios amplían el conocimiento acerca de las propiedades antitumorales de la membrana amniótica, representando un avance para los futuros tratamientos alternativos contra el HCC.

Descripción: El primer paso para la construcción del sistema nervioso de los vertebrados es laformación de la placa neural. Varios reportes sugieren que la señal retinoide esesencial para el establecimiento normal del patrón neural y la diferenciaciónneuronal. Aunque se ha progresado mucho en este sentido, quedan aún muchaspreguntas sin respuestas para tratar de elucidar el rol que los retinoides juegandurante el desarrollo embrionario. En este trabajo, dentro del contexto de la cascada de la neurogénesis primaria de Xenopus laevis, exploramos la habilidad de los retinoides de regular diferentespasos de la cascada que lleva a la diferenciación neuronal. Mostramos que eltratamiento con ácido retinoico (RA) produjo un sustancial aumento en el númerode neuronas primarias que expresan N-tubulina debido a un incremento de ladiferenciación neuronal sin involucrar cambios en la proliferación o muerte celularprogramada. Las evidencias indican que este efecto se origina en los pasos inicialesde la cascada neurogénica, ya que este tratamiento alteró el balance entre dos genesde prepattern de expresión temprana. Por un lado, se observó inducción de laexpresión de Gli3, que promueve el destino neuronal y por otro, inhibición de Zic2,un represor de la neurogénesis. Además, se modificó la expresión de otrosmarcadores que participan en los pasos intermedios de la cascada como Neurogenina, MyT1 y X-Delta-1. Paralelamente, determinamos que los retinoidesreprimen la expresión de sonic hedgehog (shh) en la línea media del embrión tantoen la placa del piso como en la notocorda y establecímos por primera vez un nexoentre shh, el RA y la neurogénesis primaria. En experimentos de rescate fenotípico demostramos que el RA no es capaz derevertir el efecto inhibitorio de shh, Zic2 o una versión costitutivamente activa de Notch (NotchICD) sobre la neurogénesis primaria. Estos resultados, junto con elhecho de que un pulso corto de RA alrededor del comienzo de la gastrulación essuficiente para desencadenar la inhibición de la expresión de shh, sugieren que el RA participa muy tempranamente en la regulación de esta vía. El tratamiento con agonistas y antagonistas selectivos de los receptores de ácidoretinoico (RAR) nos permitió, por un lado, confirmar que la activación de los RARes suficiente para inhibir la expresión de shh e inducir la neurogénesis y por otro,determinar que RARα es necesario in vivo tanto para regular la expresión de shh,como para establecer el patrón normal de neuronas primarias. Mediante una estrategia de dominancia negativa establecimos que el receptor RARα1 es requerido para la correcta regulación de shh, ya que cuando se interfierecon su función, la expresión de shh se desinhibe. Finalmente, el bloqueo específico de la síntesis de RARγ1 por microinyección deun oligo morfolino antisentido produjo un aumento muy marcado de la expresiónde shh, sugiriendo que esta isoforma también es necesaria para mediar laregulación negativa que los retinoides ejercen sobre la expresión de shh. Contrariamente, mostramos mediante esta misma estrategia, que el receptor RARα2.2 no es necesario para ejercer in vivo esta regulación. Todos estos resultados en conjunto proveen nuevas evidencias que profundizan lacomprensión del rol de los retinoides durante el desarrollo embrionario, enparticular durante la neurogénesis primaria y aportan herramientas críticas paraayudar a descifrar los mecanismos moleculares que determinan la construcción enespacio y tiempo de la placa neural.