Descripción: El picudo del algodonero, Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), esconsiderado una de las plagas más importantes de algodón en América, presente en Argentinadesde 1993. El objetivo general del trabajo fue seleccionar aislamientos nativos de los hongosentomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hypocreales)virulentos para el picudo del algodonero. Para ello se obtuvieron aislamientos nativosprovenientes de muestras de suelo e insectos, así como cepas pertenecientes a la micoteca del Laboratorio de Hongos Entomopatógenos (IMYZA, INTA). Se evaluó la patogenicidad yvirulencia de 28 aislamientos de M. anisopliae y 66 aislamientos de B. bassiana sobre adultosde picudo y se estudiaron los efectos subletales sobre la alimentación y oviposición producidospor estos hongos. Por otro lado, fueron evaluadas distintas características de los aislamientosseleccionados, como la compatibilidad con los insecticidas químicos utilizados en campo, elefecto conjunto de los insecticidas químicos y los aislamientos sobre la plaga, y la tolerancia aaltas temperaturas de los aislamientos. Finalmente, se evaluaron parámetros de producciónmasiva de conidios de los aislamientos seleccionados y se realizaron evaluaciones en campo delas formulaciones experimentales. Los aislamientos de M. anisopliae (Ma 50 y Ma 20)resultaron los más virulentos donde la concentración letal media fue 1,13 x 10*7 y 1,20 x 10*7conidios/ml, respectivamente. Además, se encontró una disminución en la alimentación de lashembras infectadas con los aislamientos Ma20 y Bb23, y una disminución de la oviposición con Ma 20. Por otro lado, los aislamientos de M. anisopliae evaluados fueron compatibles con losinsecticidas piretroides y más tolerantes a temperaturas altas. Los resultados obtenidos indicanla posibilidad de utilizar M. anisopliae como agente de control microbiano incluyéndolo en unprograma de Manejo Integrado del Picudo del Algodonero.

Descripción: Las "moscas blancas" (Homoptera: Aleyrodidae), se encuentran entre los insectosplaga de mayor importancia económica a nivel mundial. La presente tesis tuvo como objetivo conocer las especies de moscas blancaspresentes en la Argentna su distribución, sus plantas hospederas y sus enemigosnaturales parasitoides asociados; con particular énfasis en el complejo Bemisia tabaci y suposible control biológico. Como principales aportes de la investigación realizada pueden mencionarse:l-el mayor conocimiento de los aleiródidos de interés económico, sus plantashospederas y sus enemigos naturales parasitoides. Estos resultados incluyen el registro deespecies no citadas con anterioridad para la Argentina; 2-respecto al complejo B. tabaci, se ha registrado un aumento de su distribucióngeográfica original, las plantas hospederas que afecta y sus enemigos naturales parasitoides. Asimismo se ha determinado la presencia de diferentes biotipos para el mencionadocomplejo: el biotipo B y dos biotipos de carácter local; 3-la caracterización biológica y taxonómica de uno de los biotipos locales registradospara el complejo B. tabaci afectando cultivos de soja y algodón. Se ha propuesto denominareste biotipo como ARG1 (Argentina l); y 4-el análisis de los aspectos biológicos básicos de Encarsia porteri (Hymenoptera: Aphelinidae), el parasitoide más frecuentemente encontrado sobre el complejo B. tabacibiotipo ARGl.

Descripción: En las campañas algodoneras 2009-2010 en varias regiones de la provincia de Chaco se detectó una virosis en cultivares de algodón resistentes al cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), que producía leve enrollamiento de las hojas y desregulaba la dominancia apical sin afectar la altura de la planta. Se tomaron muestras de plantas de un cultivar resistente (aislamiento M3) y uno susceptible (aislamiento M5) al CLRDV que presentaban la nueva sintomatología y se realizaron ensayos de PCR con primers diagnósticos para tres familias virales que infectan algodón: Luteoviridae, Geminiviridae y Bromoviridae. Además, se usaron primers diagnóstico para la familia Potyviridae ya que son capaces de infectar a más de 200 especies vegetales. Las muestras resultaron positivas cuando se analizó al grupo taxonómico de los Luteoviridae, indicando que el virus desconocido pertenece a esta familia y descartando, en principio, una coinfección con virus conocidos. Se secuenció la región amplificada de 1065 pb y se observó alta identidad de secuencia, tanto en nucleótidos como en aminoácidos, con el CLRDV. En el presente trabajo se completó la secuenciación de ambos aislamientos y se analizó su organización genómica. Ambos genomas virales resultaron de una longitud de 5.866 nucleótidos, presentaron la organización típica de los Polerovirus y se identificaron siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Se analizaron las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de ambos aislamientos y las diferencias encontradas entre sí fueron menores al 2%, concluyendo que corresponden a una misma cepa viral. Por otro lado, las proteínas de ambos aislamientos mostraron una identidad de secuencia que variaba entre el 88% y el 98% con respecto a las correspondientes proteínas codificadas por el CLRDV. A pesar que el International Committe on Taxomy of Viruses (ICTV) establece que diferencias mayores al 10% en cualquier producto génico son suficientes para definir una nueva especie dentro del género Polerovirus, los aislamientos M3 y M5 sólo mostraron una baja identidad en la secuencia de la proteína más variable entre las especies del género (proteína P0). Por ese motivo, consideramos que ambos aislamiento corresponden a una cepa atípica del CLRDV, CLRDV-at, que produce distinta sintomatología y es capaz de quebrar la resistencia presente en el germoplasma de algodón que se siembra localmente. Se estudió el origen evolutivo del CLRDV-at con respecto a otras especies de la familia Luteoviridae. Para ello, se construyeron árboles filogenéticos utilizando las secuencias de aminoácidos de la proteína P0, supresor de silenciamiento génico, y la proteína P3, correspondiente a la cápside viral. En ambos dendogramas, los dos aislamientos de CLRDV-at se agruparon en un mismo cluster separados de los aislamientos brasileros del CLRDV y del aislamiento argentino de CLRDV. Con el objetivo de confirmar que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector Aphis gossypii, se tomó una colonia de áfidos de una planta de algodón resistente a enfermedad azul y con síntomas de CLRDV-at y se transfirieron a plantas de algodón de la variedad NuOpal (resistente a CLRDV) y al cabo de 3 semanas se observaron los primeros síntomas de la enfermedad. La presencia del virus fue analizada mediante RT-PCR y posterior secuenciación, confirmando que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector A. gossypii. Con el objetivo de caracterizar al CLRDV-at a nivel molecular y biológico se construyó un clon infectivo de cDNA del virus. El clon infectivo permitió la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector. Se infectaron distintas variedades de G. hirsutum resistentes y susceptibles a CLRDV y 3 semanas postinfección, las plantas desarrollaron hojas en las yemas laterales, las nervaduras se curvaron y las hojas adquirieron una coloración verde oscura. El RNA viral fue detectado en las hojas sistémicas mediante RT-PCR y Northern blot, confirmando la funcionalidad del clon infectivo. Dado que los síntomas no se correspondían completamente con los observados en el campo y con la premisa de que la enfermedad se manifiesta al final del ciclo del cultivo, se infectaron plantas con cuatro meses de desarrollo con el clon infectivo del CLRDV-at. Los síntomas característicos de la enfermedad a campo se observaron a las 3 semanas postinfección y la infección fue confirmada por RT-PCR. En el género Polerovirus, la proteína P0 fue inicialmente descripta como un factor de patogenicidad y recientemente fue caracterizada como supresor del silenciamiento del RNA. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del turnip yellow virus (TuYV), en la planta modelo A. thaliana, está dada por la interacción con las proteínas ASK1 y ASK2. ASK1 y ASK2 son componentes del complejo SKP1-Cullin F-Box (SCF) y pertenecen a la familia de proteínas E3 ubiquitin ligasas. Cuando se produce la interacción del complejo SCF con P0, la proteína Argonauta 1 (AGO1) de la vía del silenciamiento de la planta es ubiquitinilada y degradada por una vía dependiente de autofagia. La interacción ocurre a través del dominio F-Box (LPXXL/IX(10-13)P) que poseen las proteínas P0, y que está presente en el P0 del CLRDV, y parcialmente en CLRDV-at, donde se encuentra mutado el aminoácido Leucina (L) por el aminoácido Valina (V), perdiendo, en parte, el dominio consenso. Para analizar si la proteína P0 del CLRDV-at (P0CLR-at) posee actividad supresora de silenciamiento génico al igual que la proteína P0 del CLRDV (P0CLR), se utilizaron dos sistemas experimentales que permitieron obtener diferente información acerca del mecanismo de supresión. En el primer sistema se evaluó la capacidad de la proteína P0 de inhibir el silenciamiento génico gatillado al agroinfiltrar una segunda copia del transgén de la proteína verde fluorescente de aguaviva (GFP) en la línea 16c de N. benthamiana (expresa la proteína GFP en forma constitutiva) y en el segundo sistema, se estudió la capacidad de la proteína P0 de suprimir el silenciamiento del RNA disparado por secuencias de RNA doble cadena (dsRNA). En ambos sistemas se observó que la proteína P0CLR-at posee actividad supresora del silenciamiento local, aunque su actividad es más suave que la observada en la proteína P0CLR y al igual que esta última, no posee actividad supresora del silenciamiento sistémico. También, se demostró que la proteína P0CLR-at es capaz de interactuar con la proteína SKP y GSK (ortólogos de ASK en N. benthamiana y G. hirsutum) y esa interacción conlleva a la desestabilización de la proteína AGO1. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del TuYV (P0Tu) es menor cuando se realiza el ensayo de supresión con el clon infectivo del virus, posiblemente porque P0Tu presenta niveles muy bajos de expresión durante la infección viral. Para evaluar si P0CLR-at también posee la misma actividad supresora de silenciamiento en el contexto de la infección viral, se realizaron ensayos de coinfiltración, como los mencionados anteriormente, pero utilizando en este caso el clon infectivo de cDNA del CLRDV-at. Cabe destacar que el clon infectivo mostró una mayor actividad supresora con respecto a la observada cuando se expresa P0CLR-at sola, lo que probablemente se deba a que la proteína P0CLR-at es más estable en el contexto de la infección viral, o bien a que el virus posee otra proteína con actividad supresora del silenciamiento. También se estudió la patogenicidad de la proteína P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo, como es el sistema de PVX. Se infectaron plantas N. benthamiana y se observó que las construcciones PVX-P0CLR y PVX-P0CLR-at producían una exacerbación de los síntomas de infección con respecto al PVX wild type pero el PVX-P0CLR-at desarrollaba síntomas más suaves de infección con respecto al PVX-P0CLR. Estos ensayos nos permitieron concluir que las proteínas P0CLR-at y P0CLR no sólo poseen diferencias en su actividad supresora del silenciamiento, sino también en la severidad de los síntomas que producen. A pesar de la alta identidad de secuencia entre CLRDV y CLRDV-at, ambos virus producen distintos síntomas y el CLRDV-at es capaz de sobrepasar la resistencia a CLRDV de las variedades de algodón. Con el objetivo de identificar la(s) proteína(s) responsable(s) del quiebre de la resistencia y del cambio de la sintomatología, se reemplazaron la proteína P4, implicada en el movimiento viral de célula-célula, y la proteína P0 del CLRDV-at en forma individual en el clon infectivo del CLRDV, que estaba disponible en el laboratorio, dando a lugar a las construcciones quiméricas: 35S/CLRDV-MPCLR-at y 35S/CLRDV-P0CLR-at, respectivamente. La construcción 35S/CLRDV-MPCLR-at no fue capaz de infectar plantas de cultivares resistentes a CLRDV, mostrando que esta proteína por sí sola no logra sobrepasar la resistencia; sin embargo, se observó una disminución en la severidad de los síntomas con respecto a las plantas inoculadas con el clon infectivo del CLRDV. La construcción 35S/CLRDV-P0CLR-at logró establecer la infección en variedades de algodón resistentes al CLRDV y los síntomas observados correspondieron a los del CLRDV-at, indicando que la proteína P0 sería la responsable de sobrepasar la resistencia y del cambio de síntomas. Los resultados del presente trabajo de tesis permitieron la caracterización de una nueva variante del virus cotton leafroll dwarf virus, CLRDV-at, que causa la enfermedad azul atípica del algodón, se identificó el insecto vector y la proteína responsable del desarrollo de síntomas y el quiebre de la resistencia. Además, se construyó un clon infectivo de cDNA, que permitirá acelerar la búsqueda de germoplasma resistente en los programas de mejoramiento de algodón.

Descripción: El algodón (Gossypium spp.) es un cultivo regional económicamente clave en el noreste argentino, cubriendo en la actualidad 500.000 hectáreas. La enfermedad azul es la principal enfermedad viral del algodón y causa importantes pérdidas en el cultivo si no se implementan medidas adecuadas de control consistentes en la siembra de cultivares resistentes a la enfermedad y en el control de los insectos vectores mediante insecticidas. La enfermedad es producida por el cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), una especie dentro del género Polerovirus de la familia Luteoviridae. Los síntomas característicos de la enfermedad son enanismo, enrollamiento de las hojas, textura coriácea con coloración verde oscura‐azulada y clorosis en las nervaduras. El virus es transmitido en forma circulativa y no propagativa por el pulgón del algodón Aphid gossypii, no siendo posible su transmisión mecánica. El CLRDV posee un genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positiva de 5,866 kb. El genoma de los virus pertenecientes al género Polerovirus está formado por siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Los ORFs 0, 1 y 2 se traducen a partir del RNA viral dando como producto las proteínas P0, P1 y la proteína P1‐P2 a partir de un cambio de marco traduccional. La proteína P0 corresponde en algunos virus del género al supresor del silenciamiento génico, las proteínas P1 y P1‐P2 serían componentes de la RNA polimerasa dependiente de RNA. Los ORFs 3, 3a, 4 y 5, se traducen a partir de un RNA subgenómico, dando lugar a las proteínas P3, P3a, P4 y P3‐P5. La proteína P3 corresponde a la cápside viral, P3a y P4 corresponderían a las proteínas de movimiento viral y P3‐P5 al dominio readthrough de la proteína de cápside que estaría implicada en la transmisión del virus por el insecto vector. En los programas de mejoramiento del cultivo de algodón, la selección de variedades de algodón con resistencia genética a la enfermedad azul se realiza mediante la infección de las plantas con insectos vectores que son criados en el laboratorio y que poseen el virus. En el presente trabajo se construyó y caracterizó un clon infectivo de cDNA del CLRDV. Este sistema permitió desarrollar una estrategia alternativa de infección mediante la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector, y por otro lado es esencial para el desarrollo de un sistema de genética reversa que permita el estudio de la expresión y función de los genes virales, de la replicación del virus y la interacción plata‐virus a nivel molecular. Se caracterizó el clon infectivo del virus mediante ensayos de agroinfección en plantas de G. hirsutum NC33B (variedad susceptible a la infección por CLRDV). Se registró la aparición de síntomas típicos de la enfermedad en las plantas bajo estudio y se confirmó la infección a distintos tiempos postinfiltración en las hojas sistémicas mediante las técnicas de RTPCR, Northern y Western blot. A su vez, se demostró la transmisibilidad del virus desde plantas agroinfiltadas hacia plantas sanas mediada por áfidos, corroborando así que las partículas virales producidas por la agroinfección son infectivas y transmisibles por el vector natural. Además, se agroinfiltraron plantas de G. hirsutum variedad Guazuncho 2 (resistentes a la infección por CLRDV) y se comprobó que el virus no logra infectar esta variedad. Realizando el mismo tipo de ensayos, se comprobó que el clon infectivo del CLRDV tiene la capacidad de infectar las plantas modelo Arabidopsis thaliana y Nicotiana benthamiana. Si bien en ambas especies los ensayos moleculares demostraron la infección y la movilidad del virus sistémicamente, solo se observaron síntomas (clorosis internerval) en N. benthamiana. El estudio y la caracterización del clon infectivo de CLRDV permitieron desarrollar una técnica más sencilla de infección, que actualmente se está utilizando como sistema de infección de rutina en el programa de mejoramiento de algodón del INTA para la selección de germoplasma resistente a CLRDV. Para la caracterización de las proteínas CLRDV, se estudiaron las interacciones entre proteínas virales mediante el sistema de doble híbrido en levaduras. Se detectó interacción entre la proteína de cápside viral (P3) entre sí y con la proteína minoritaria de capside P3P5 y además se observó interacción de la proteína de movimiento (P4) entre sí. El silenciamiento génico constituye un mecanismo de defensa antiviral en plantas desencadenado por el RNA doble cadena. Como mecanismo de contra defensa, la mayoría de los virus vegetales poseen proteínas con función supresora del silenciamiento. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad se investigó si el CLRDV posee una proteína capaz de suprimir el silenciamiento génico. Para ello se utilizaron dos sistemas basados en el silenciamiento de la proteína GFP, que permiten describir el mecanismo de acción y la etapa en la vía del silenciamiento que estaría afectada por el supresor. Estos estudios permitieron determinar que la proteína P0 del CLRDV es un supresor de silenciamiento local, que actúa bloqueando la vía del silenciamiento río arriba del proceso de amplificación. A su vez, no es capaz de inhibir la síntesis de RNAs pequeños (siRNAs) a partir de RNA de doble cadena ni es capaz de bloquear la movilidad sistémica de la señal de silenciamiento. Utilizando los mismos sistemas de silenciamiento se probó la actividad supresora del silenciamiento del clon infectivo de cDNA del CLRDV y se observó que la proteína P0 expresada en el contexto viral conserva la misma actividad supresora. Mediante un software de predicción se identificaron las proteínas P3 y P4 del CLRDV como otros potenciales supresores del silenciamiento génico postranscripcional, y se analizó su actividad de la misma forma que fue evaluada la proteína P0, pero estas proteínas no presentaron actividad supresora del silenciamiento en ninguno de los sistemas utilizados. Además, se evaluó comparativamente la virulencia de la proteína P0 del CLRDV y la proteína P0 del Cotton leafroll dwarf virus‐at (CLRDV‐at). Este virus es una variante nueva del CLRDV que quiebra la resistencia del germoplasma local estableciendo una infección suave con síntomas diferentes a enfermedad azul. Para ello se estudió la virulencia de P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo. Se analizó la exacerbación de los síntomas de PVX en presencia de las proteínas P0 en plantas de N. benthamiana. Se observó que la construcción PVX‐P0^CLRDV desarrollaba síntomas severos con respecto al PVX salvaje y el PVX^P0CLRDV-at desarrollaba síntomas suaves, mostrando que P0^CLRDV presenta mayor virulencia que P0^CLRDV-at. Según se describe en bibliografía la proteína P0 de algunos polerovirus interactúan con la proteína ASK1 del sistema SCF ubiquitina ligasa. Al interaccionar con dicho complejo median la degradación de la proteína ARGONAUTA 1 (AGO1) de la vía de silenciamiento génico de la planta. Utilizando la técnica de doble hibrido en levaduras se determinó que la proteína P0 del CLRDV también interacciona con el sistema SCF ubiquitina ligasa. Para ello se evaluó la interacción de las proteínas ASK de A. thaliana y sus correspondientes ortólogos: SKP1 de N. benthamiana y GSK1 de Gossypium hirsutum. Se determinó que la proteína P0 es capaz de interaccionar con SKP1 y GSK1, pero no fue posible determinar su interacción con ASK mediante la técnica utilizada. Estudios previos indican que la interacción entre la proteína P0 y ASK ocurre a través del dominio F‐box (LPXXL/IX_10-13P) de la proteína P0. Con el objetivo de determinar si la interacción con el sistema SCF ubiquitina ligasa de la proteína P0 del CLRDV es dependiente de la conservación del dominio F‐Box se realizaron mutantes en la región consenso del dominio. A partir del dominio F‐box de P0^CLRDV (LPFIIX_10P) se desarrollaron las mutantes P0^mut1 (LPFIvX_10P), P0^mut2 (aaFIIX_10a) y P0^mut3 (aaFIIX_10P). Teniendo en cuenta la secuencia del P0^CLRDV-at (LPFLvX_10P) se desarrolló el mutante P0^mut1 sobre la secuencia del P0^CLRDV y el mutante P0^mut4 (LPFLiX_10P) sobre la secuencia del P0^CLRDV-at. Se analizó la actividad supresora de los mutantes en el dominio mediante ensayos basados en el silenciamiento de la proteína GFP, en los cuales los mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron completamente la actividad supresora mientras que los mutantes P0^mut1 y P0^mut4 conservaron su actividad supresora con una leve variación en las intensidades de supresión. Mientras P0mut1 disminuyó su actividad respecto de P0^CLRDV, P0^mut4 la aumentó respecto de P0^CLRDV‐at. Consistente con los resultados in planta las mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron la interacción con las proteínas SKP1 y GSK1 en el sistema de doble híbrido en levaduras, mientras que P0^mut1 y P0^mut4 conservaron la capacidad de interaccionar con ellas. Estos resultados indican que la conservación del consenso LP de dicho dominio es indispensable para que ocurra la interacción y para que la proteína P0 posea su actividad supresora. Por último, mediante ensayos de coagroinfiltración de las proteínas P0 y AGO1, se logró determinar que en presencia de la proteína P0 la proteína AGO1 es degradada. De esta manera se confirmó que el mecanismo de acción de la proteína P0^CLRDV es conservado respecto de otras proteínas P0 caracterizadas previamente. A su vez, aquellos mutantes que perdieron su capacidad supresora tampoco fueron capaces de inducir la degradación de AGO1 señalando que el dominio F‐box está implicado en el mecanismo de patogenicidad de la proteína P0. Finalmente, se analizó la localización subcelular de la proteína P0 mediante la expresión de P0 fusionada a GFP. Mediante microscopía confocal se determinó que la proteína P0 se localiza en citoplasma y núcleo de células del mesófilo foliar de N. benthamiana. El clon infectivo del CLRDV constituye una herramienta que permitirá avanzar en el estudio de la expresión y función de los genes virales y de la replicación viral por genética reversa. Se trata del primer clon infectivo capaz de infectar plantas de algodón y permite acelerar los procesos de búsqueda de genes de resistencia en bancos de germoplasma de algodón. Además, facilitará el trabajo en plantas modelo utilizadas para el estudio de la interacción planta‐patógeno tales como N. benthamiana, así como el uso de las colecciones de mutantes de A. thaliana para profundizar en el estudio de las funciones virales y su interacción con el hospedador. Estos resultados representan un importante avance en el conocimiento de la función de las proteínas codificada por el CLRDV, especialmente en la comprensión de la función e interacciones de P0 con proteínas de sus hospedantes. En conclusión, proporcionan un punto de partida para la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad azul producida por la infección del CLRDV.