Descripción: En esta Tesis de Doctorado hemos estudiado la activación hormonal de la esteroidogénesis en una línea murina de células de Leydig MA-10, en relación con la activación de las quinasas reguladas por estimulación extracelular (ERK1/2, de la familia de MAP quinasas, MAPKs). Los estudios incluyeron la estimulación hormonal de las células MA-10 y el seguimiento de la distribución subcelular de fosfo-ERK1/2 por inmunoblot y microscopía confocal. Se halló que bajo estimulación con la hormona trófica gonadotrófina coriónica (hCG) u 8Br-AMPc (un análogo permeable de su segundo mensajero, AMPc) ERK1/2 es activada y retenida en mitocondria por efecto de PKA. Este efecto está mediado por el aumento de MEK1/2 (quinasa río arriba de ERK1/2) fosforilada en mitocondria. Está bien estudiado que uno de los factores que incrementa el transporte de colesterol a la mitocondria y la producción de esteroides es la proteína StAR (Steroidogenic Acute Regulatory). Hallamos que la estimulación hormonal promueve su interacción con ERK dado que StAR posee un dominio de interacción para MAPKs. Demostramos que ERK1 fosforila StAR in vitro en el residuo de Serina232 sólo en presencia de colesterol. Se determinó su importancia al observar que la mutación de este residuo disminuye marcadamente la esteroidogénesis in vivo. De este modo, la máxima producción de progesterona se observó en mitocondrias aisladas suplementadas con colesterol más ERK1 y PKA activas. Estas observaciones nos llevan a concluir que la doble fosforilación de StAR ligado a colesterol por ERK y PKA en mitocondria, aporta cargas negativas en la proteína. Estas cargas permitirían la interacción de StAR con VDAC (voltage-dependent anion channel) asociado a multicomplejos mitocondriales, favoreciendo el transporte de colesterol a la membrana mitocondrial interna y el mantenimiento de la esteroidogénesis.

Descripción: Se evidenció que a partir de la activación nuclear hepática del tetracloruro de carbono (CCl4) se forman radicales libres triclorometilo (*CCl3). Los radicales *CC13 y los CCl3O2* derivados de la reacción de los primeros con el oxígeno, promueven reacciones de adición y de abstracción de H desde los lípidos nucleares. Las reacciones de adición son más intensas con los *CCl3 ; mientras que las de abstracción de H son promovidas más fuertemente por los CCl302*. Los *CCl3 se adicionan preferentemente a los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos (PUFA) de la membrana perinuclear. Los CCl3O2* y los *CCl3 abstraen hidrógenos de los PUFA (especialmente ac. araquidónico) e inician procesos de peroxidación de lípidos de la membrana perinuclear que conducen a la formación de aldehídos reactivos (ej. malondialdehído). También abstraen H del colesterol de la membrana perinuclear formando productos de oxidación y cetoderivados del mismo. Por estudio comparativo en dos cepas de ratas con distinta susceptibdidad a sufrir cáncer hepático por efecto del CCl4, se deduce que la intensidad de producción de los radicales *CCl3 en las cercanías del ADN y la unión covalente de los mismos a fosfolípidos específicos, colesterol y ésteres de colesterol podrían tener relación con la susceptibilidad a sufiir los efectos carcinogénicos ejercidos por el CCl4. En resumen: Los resultados evidencian que durante la biotransformación nuclear hepática del CCl4 se forman radicales libres *CCl3 y CCl302*. Dichos radicales interactúan con los lípidos de la membrana perinuclear y generan productos potencialmente capaces de reaccionar o regular la función del ADN y/o las proteínas nucleares, con consecuencias potencialmente graves a nivel celular.

Descripción: Si bien la LH a través de su segundo mensajero, el AMPc, es el principal regulador de la esteroidogénesis testicular, existen otros factores secretados en el microambiente del testículo que pueden ejercer un efecto modulador local sobre este proceso. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la acción del EGF sobre la esteroidogénesis en las células de Leydig tumorales MA-10 y células de Leydig de ratas adultas y prepúberes, e investigar los posibles mecanismos que participan en estas respuestas. Los experimentos mostraron que, en los tres tipos de células de Leydig, el EGF modula postivamente la esteroidogénesis incrementado la producción basal de esteroides y potenciando los efectos estimulatorios de gonadotrofinas o análogos de AMPc. En las células MA-10, la potenciación observada al combinar EGF y concentraciones submáximas de análogos de AMPc se correlaciona con un aumento en la hidrólisis de los ésteres de colesterol y en la internalización del colesterol de membrana plasmática. En cambio, el tratamiento con EGF solo no modifica estos eventos indicando que los mismos serían consecuencias de un aumento en la esteroidogénesis que excede las reservas citoplasmáticas de colesterol libre (no esterificado). Además, los resultados permitieron sugerir que el EGF podría ejercer sus efectos esteroidogénicos a través de un incremento en los niveles de la proteína StAR, la cual regula el paso limitante de la esteroidogénesis: el ingreso de colesterol a la mitocondria. En cuanto a los sistemas transductores involucrados, se observó que las respuestas esteroidogénicas del EGF dependerían de la liberación de ácido araquidónico y su posterior metabolización (en particular a través de la acción de las epoxigenasas dependientes de citocromo P450), así como también de la activación temprana de ERKs.

Descripción: Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT-PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV-1 cepa Hawaii y DENV-2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, y K562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti-DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV-2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor FcR involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV-2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección con DENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.