Descripción: Las proteínas E6 de papilomavirus humano de alto riesgo participan en la progresión tumoral, mayoritariamente por su habilidad de promover la degradación de p53. Los transcriptos de HPV muestran un patrón de procesamiento complejo, donde E6*I es el transcripto más abundante en HPV de alto riesgo, correspondiendo en secuencia de aminoácidos a los primeros 50 aminoácidos de E6. Actualmente, no hay información estructural o bioquímica de este polipéptido que contiene la mitad del primer motivo de unión a Zn de E6, debido a la dificultad de obtener una estructura compacta y monomérica en tan pequeño polipéptido. En este trabajo se muestra que E6*I de HPV16 puede plegarse en oligómeros con alto contenido de hélice-α o láminas-β a pH 7.5 y 5.0 respectivamente, en ausencia de Zn. Los oligómeros-β son altamente estables y no se ven afectados por la presencia de Zn, mientras que los oligómeros-α tienden rápidamente a agregar, evitando esto la presencia de Zn. Dos moléculas de E6*I unen una molécula de Zn, sugiriendo una coordinación tetraédrica de alta afinidad (KD < 10⁻¹² M), que resulta en un dímero de E6*I mediado por Zn con significativa estructura secundaria. Previamente se encontraron en el citosol de líneas celulares transformadas por HPV oligómeros endógenos de E6, y nosotros proponemos que las características determinantes de esta agregación se encuentran dentro de E6*I. Los efectos reportados de E6*I están asociados a la regulación negativa de la proteína E6, y la relación entre ambas especies modula la degradación de p53 y otras cascadas de señalización de apoptosis. En este trabajo, demostramos la interacción directa y específica entre las proteínas E6 y E6*I de HPV16. La abundancia en la célula de E6*I con una naturaleza “camaleón” correlaciona con la plasticidad para unir blancos celulares, y su destino está asociado a un balance entre los niveles de proteína, la disponibilidad de Zn, el potencial redox y la oligomerización. Este pequeño pero complejo polipéptido está asociado a un efecto más que a una función de un producto viral que, cuando se encuentra en altas concentraciones, puede directa o indirectamente afectar varios procesos celulares.

Descripción: El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar alguno de los aspectos de la relación estructura-función del receptor colinérgico nicotínico (nAChR) α9α10. En la primera parte, analizamos el papel que juegan tres anillos de residuos hidrofóbicos (17´, 13´ y 9´) del dominio transmembranal dos (TM2) en la función de dicho receptor. Para ello, realizamos un estudio sistemático de mutagénesis de estos tres residuos a treonina y comparamos las propiedades de los receptores mutantes expresados en oocitos de Xenopus laevis. Los cambios fenotípicos de los receptores mutantes incluyeron: una disminución de la tasa de desensibilización, una disminución de la CE50 para ACh, un aumento de la eficacia a agonistas parciales, y una reducción de la modulación alostérica por Ca2+ extracelular. Los receptores mutantes exhibieron aperturas espontáneas y, al nivel de canal único, un incremento del tiempo medio aparente del estado abierto sin cambios en la conductancia, sugiriendo que el mecanismo que subyace a estos cambios es un aumento en el gating del canal. En todos los casos los cambios fenotípicos fueron más drásticos para la mutación del residuo 13´, ubicado en la mitad del TM2. Teniendo en cuenta el modelo atómico del poro del canal del órgano eléctrico de la raya Torpedo, proponemos que las interacciones de las cadenas laterales de los residuos 13´ son las que juegan un papel clave en la creación de una barrera energética al paso de los iones. En la segunda parte, tratamos de determinar la estequiometría del nAChR α9α10 mediante el empleo de la mutagénesis dirigida de un residuo de valina del TM2 (V13´) a treonina. La coexpresión, en oocitos de Xenopus laevis, de subunidades salvajes y mutantes de cada clase (por ejemplo, α9 y α9V13´T) con su contraparte salvaje (por ejemplo, α10), resultó en poblaciones mixtas de receptores con diferentes sensibilidades por la ACh. Esto es consistente con la interpretación de que la mutación V13´T aumenta la sensibilidad a ACh en proporción al número de subunidades mutadas incorporadas al receptor. El número aparente de subunidades de cada clase incorporadas al receptor pudo ser deducido del número de componentes que comprende la curva de concentración–respuesta para ACh. Nuestros resultados sugieren que el nAChR recombinante α9α10 es un pentámero compuesto por 2 subunidades α9 y tres α10. En la tercer parte, reportamos la caracterización funcional de una nueva toxina, la α-conotoxina PeIA (α-CTx PeIA), la cual discrimina entre los nAChRs sensibles a la α-bungarotoxina α9α10 y α7. La α-CTx PeIA, presentó una sensibilidad 260 veces mayor por los nAChRs α9α10 (CI50, 6.9 ± 0.5 nM) que por los receptores α7 (CI50, 1.8 ± 0.1 µM). A pesar de que la α-CTx PeIA presenta una alta homología con la α-CTx MII y la α–CTx GIC, a concentraciones de 10µM, ninguna de ellas bloqueó las respuestas a ACh del nAChR α9α10. Entre los receptores neuronales no sensibles a α-bungarotoxina, la toxina fue activa sobre los nAChRs α3β2. De esta manera, la α-CTx PeIA resultaría una herramienta útil para diferenciar las respuestas mediadas por los nAChRs α9α10 o α7 en aquellos tejidos donde ambos receptores se expresan.