Descripción: La síntesis de novo de colesterol y su enzima limitante, hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa (HMGCR), es crítica para la regulación de la proliferación y la supervivencia celular en cáncer. El objetivo general del presente trabajo es estudiar el papel de la vía del colesterol en la adquisición de propiedades de células madre en modelos de cáncer de mama (CM). Con ese propósito, se analizaron bases de datos públicas, compiladas de pacientes con CM, mediante una herramienta bioinformática online (SurvExpress; Tecnológico de Monterrey, México). Los resultados muestran que la alta expresión de varias enzimas involucradas en la síntesis del colesterol, incluyendo a: hidroximetilglutaril-CoA sintasa 1 (HMGCS1), HMGCR, mevalonato quinasa (MVK), farnesil pirofostato sintasa (FDPS) y escualeno monooxigenasa (SQLE), está significativamente asociada con menor sobrevida libre de enfermedad. Adicionalmente, la herramienta bioinformática online CellMiner (Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos) que integra datos de expresión génica y farmacológicos provenientes del panel de líneas celulares NCI-60, indica que HMGCR se expresa en varios tipos de tumores, incluyendo CM. Estos datos se validaron experimentalmente por qRT-PCR. Para evaluar si existe una asociación entre la expresión de HMGCR y características de células madre, se desarrolló un modelo de sobreexpresión de HMGCR en la línea celular MCF-7 utilizando un sistema CRISPR activador (CRISPRon). La generación de dicho sistema comprendió las siguientes etapas: 1-diseño y síntesis de las sondas (sgRNAs); 2-clonación de las sondas; 3-transformación de bacterias con los plásmidos clonados; 4-verificación de dichas construcciones por secuenciación; 5- transfección de líneas celulares; 6-caracterización del sistema. La expresión de HMGCR aumenta significativamente en las células MCF-7/CR en comparación al control de transfección (MCF-7/TC) y se observan niveles similares a los detectados en otros modelos de células madre (normales y tumorales). El fenotipo HMGCRon se asocia a un incremento de los niveles de los marcadores de pluripotencia Nanog y Sox2, un aumento en la población CD44+/CD24- y CD133+ [fórmula aproximada, revisar la misma en el original] y un aumento en la frecuencia de formación de mamoesferas, características asociadas a células madre tumorales (CMTs) en CM. A continuación, se evaluó la respuesta de líneas celulares de CM con distintos niveles de HMGCR al tratamiento con las estatinas simvastatina (SIM) y lovastatina (LOVA). Los resultados muestran una mayor sensibilidad en las líneas basales Hs578T y MDA-MB-231 (CM humano triple negativo) en comparación con las líneas luminales MCF-7 y T47D [CM humano, receptor de estrógeno (ER) y progesterona (PR) positivo, receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2/neu negativo], que son más resistentes. Estos datos fueron corroborados con la herramienta CellMiner. Sin embargo, la línea T47D que expresa altos niveles de HMGCR es más sensible a SIM que MCF-7, indicando que en un contexto ER positivo, la sensibilidad a estatinas podría estar parcialmente determinada por HMGCR. Esto se corroboró en el sistema HMGCRon, ya que las células MCF-7/CR muestran mayor sensibilidad a SIM que la línea control MCF-7/TC. Estos datos sugieren que la expresión de HMGCR está asociada a características de CMTs y determina, al menos en parte, la sensibilidad a estatinas, sentando las bases para estudios posteriores orientados a una terapéutica anti-colesterol específica para el compartimiento de células madre en CM.

Descripción: El factor de transcripción maestro GATA3 se encuentra involucrado en el desarrollo de laglandula mamaria y es requerido para el mantenimiento del estado diferenciado de lascélulas epiteliales luminales. El rol de GATA3 en cáncer de mama como supresortumoral ha sido establecido, a pesar de que el mecanismo de la pérdida de expresión de GATA3 es no ha sido descrito hasta el momento. En el presente trabajo, demostramosque la activación del Receptor de Progesterona (RP) promueve el co-reclutamiento de lametiltransferasa de histonas Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) río arriba del locus de GATA3, incrementando los niveles de trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) e induciendo la compactación de la cromatina, lo cual resulta en ladisminución de los niveles del ARNm de GATA3. Esta regulación se encuentra acopladaa una disminución de la estabilidad de la proteína GATA3, mediante la fosforilacióninducida por progestágenos en el residuo serina 308 (pSer308-GATA3), seguida pordegradación vía proteasoma 26S. Ambos mecanismos moleculares convergen paralograr reducir la expresión de GATA3 en células de cáncer de mama tras la activacióndel RP. Además, demostramos que la reducción en los niveles de GATA3 es requeridapara lograr el incremento inducido por progestágenos de la ciclina A2, la cual media latransición de la fase G1 a S del ciclo celular, y se encuentra asociada a un peorpronóstico en pacientes de cáncer de mama. Finalmente, demostramos que ladisminución de los niveles de GATA3 son necesarios para la proliferación celular in vitroy el crecimiento tumoral in vivo inducidos por progestágenos.

Descripción: El receptor con actividad de tirosina quinasa ErbB2 y la proteína transductora de señales y activadora de la transcripción 3 (Stat3) juegan un rol importante en el desarrollo del cáncer de mama. Distintas evidencias sugieren la existencia de interacciones cruzadas entre ErbB2 y Stat3. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a esta interacción en tumores mamarios permanecen poco estudiados. En este trabajo identificamos un nuevo mecanismo de interacción entre ErbB2 y Stat3 que involucra la translocación nuclear de ErbB2 y la formación de un complejo en el que ErbB2 actúa como coactivador transcripcional de Stat3. Mostramos que la formación de este complejo es inducida tanto por el ligando de los receptores ErbBs, heregulina, como por los progestágenos a través del receptor de progesterona (PR). Demostramos también que la función de ErbB2 como coactivador de Stat3 promueve la activación del promotor de ciclina D1. Cuando la formación del complejo Stat3/ErbB2 es inducida por progestágenos, encontramos al PR co-reclutado en el promotor de ciclina D1, revelando un nuevo mecanismo de acción genómico no clásico del PR. Demostramos que la presencia de ErbB2 en el núcleo celular ejerce un rol fundamental en la proliferación in vitro e in vivo en tumores mamarios. Estos hallazgos revelan una posible intervención terapéutica nueva en tumores de mama que sobreexpresan ErbB2, mediante la inhibición de la translocación nuclear de ErbB2, dado que esta estrategia es efectiva en células tumorales resistentes a las terapias anti ErbB2 convencionales.

Descripción: La proteína transductora y activadora de la transcripción 3 (STAT3) es un nodo de señalización para múltiples vías oncogénicas y se encuentra frecuentemente activada en diversos tipos de cánceres, incluyendo el de mama. Las evidencias experimentales y clínicas vinculan a los progestágenos con la carcinogénesis mamaria. Por ello, estudiamos la participación de los progestágenos en la activación de STAT3. En esta Tesis demostramos que los progestágenos inducen la fosforilación de STAT3 en el residuo serina 727 por medio de la activación de la vía c-Src/p42/p44 MAPK y que ésta fosforilación es necesaria para su completa activación transcripcional y para promover la proliferación tumoral mediada por progestágenos. Por otro lado, considerando que la inhibición de STAT3 en células tumorales induce la expresión de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias, desarrollamos una inmunoterapia basada en la utilización de células de cáncer de mama que tienen inhibida la activación de STAT3 como inmunógeno. La administración de estas células en ratones indujo una respuesta anti-tumoral mediada por células T CD4+ y células NK citotóxicas que inhibió el crecimiento del tumor primario y la de sus metástasis. Además, la inhibición de la activación de STAT3 indujo un programa de senescencia celular, contribuyendo probablemente con su fenotipo inmunogénico. Los resultados expuestos demuestran el papel crítico de STAT3 en la tumorigénesis mamaria inducida por progestágenos y proporcionan las primeras evidencias preclínicas que la inhibición de STAT3 en células de cáncer de mama resulta en inmunoterapia eficaz contra el crecimiento tumoral.

Descripción: En este trabajo de tesis estudiamos los mecanismos de acción y resistencia al anticuerpo monoclonal Trastuzumab (Tz) anti HER2+, empleando un modelo de cultivo 3D que mimetiza tumores sólidos y avasculares. Generamos esferoides a partir de las células de adenocarcinoma mamario humano BT474 (HER2+) y evidenciamos la existencia de subpoblaciones celulares heterogéneas, con un gradiente de células proliferantes, quiescentes, hipóxicas, apoptóticas y autofágicas hacia su interior. Esta organización 3D moduló la respuesta al Tz, demostrando menor sensibilidad a su efecto antitumoral que las mismas células cultivadas como monocapas tradicionales. Para investigar la participación del sistema inmune, co-cultivamos esferoides con macrófagos y encontramos un mayor efecto antitumoral de Tz. Al analizar los mecanismos de acción de Tz, no detectamos inducción de apoptosis pero sí un arresto de las células en G0/G1. Tz disminuyó la población apoptótica descripta sólo en esferoides y fue capaz de inducir autofagia. Al inhibir la autofagia, logramos aumentar la sensibilidad al Tz y describimos una interacción clave entre apoptosis y autofagia. Confirmamos este resultado estableciendo una línea celular resistente al Tz que demostró ser más sensible a la inhibición de la autofagia que la línea parental BT474. En síntesis, este trabajo demuestra que en una organización en 3D existe una interacción entre los mecanismos de muerte y sobrevida celular en respuesta a Tz y que de su balance depende el desarrollo de resistencia. Esto podría ser la clave para reconocer nuevos blancos terapéuticos y superar la resistencia a Tz.

Descripción: Normal cells in culture divide a certain amount of times and undergo a processtermed replicative senescence. Telomere loss is thought to control entry intosenescence. Activation of telomerase in tumors bypasses cellular senescence and isthus a requirement for tumor progression. In this work, we have investigated theeffects of chronic in vitro 3'-azido-2', 3'-dideoxythymidine (AZT)exposure on humanand murine carcinoma cells. We demonstrate the irreversible telomere shortening inhuman cervical cancer cells (HeLa) cultured for long-term with AZT, but withoutevidence of senescence. Furthermore, we demonstrate, for the first time, that AZT-treatedmurine mammary carcinoma cells (F3II) have a reduced tumorigenicity insyngeneic BALB/c mice. Tumor incidence was reduced and survival was prolonged inanimals inoculated with AZT-treated cells when comparing with control counterparts. The number and size of spontaneous metastases were also decreased in animalsreceiving AZT-treated F3II cells. In addition, we present morphological and biochemicalevidence of senescence, and induction of apoptosis in tumor cells exposed to AZT. These data indicate that chronic exposure of mammary carcinoma cells to AZT may besufficient to induce a senescent phenotype and to reduce tumorigenicity.

Descripción: El cáncer de mama HER2 positivo es un subtipo molecular agresivo que afecta al ~15-20% de los pacientes diagnosticados. A pesar que el tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-HER2, trastuzumab, mejoró la sobrevida de estos pacientes, los fenómenos de resistencia de novo o adquirida se presentan en un 27-42% de los casos. Es sabido que la inflamación de bajo grado juega un rol clave en la patogénesis y en la progresión del cáncer de mama. En ese sentido, está demostrado que la estimulación con TNFα in vitro induce resistencia al trastuzumab en líneas celulares de cáncer de mama HER2 positivas. Los objetivos de este trabajo fueron estudiar los mecanismos de resistencia a terapias anti-HER2 mediados por TNFα, obtener marcadores predictivos que puedan guiar alternativas terapéuticas para evitar fenómenos de resistencia, evaluar la expresión de mucina 4 (MUC4) como marcador del carcinoma micropapilar invasor. Por último, nos propusimos también explorar nuevos genes involucrados en la resistencia a trastuzumab mediada por TNFα. En particular, encontrar aquellos que sean susceptibles a drogas y que puedan ser combinados con las terapias anti-HER2 actuales para ampliar las posibilidades terapéuticas de los pacientes y quizás también validar algunos de ellos como biomarcadores que permitan dirigir la terapia. Estos objetivos en su conjunto pretenden obtener la remisión del cáncer de mama evitando los fenómenos de resistencia y a su vez contribuir a los tratamientos disponibles en la actualidad. Comprobamos que la sobreexpresión de TNFα convierte células y tumores sensibles al trastuzumab en resistentes a dicho anticuerpo. Los hallazgos histopatológicos revelaron focos de mucina en los tumores que producen TNFα. En este sentido, pudimos demostrar que el TNFα, a través de la activación del factor de transcripción NF-κB, induce la expresión de mucina 4. Comprobamos que la inducción de MUC4 vía TNFα, reduce la unión del trastuzumab a su epitope y disminuye la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC). Asimismo, el silenciamiento de la expresión de MUC4 con RNA de interferencia, aumentó la citotoxicidad mediada por trastuzumab y sensibilizó las células tanto al trastuzumab como al trastuzumab-emtansina (T-DM1, trastuzumab conjugado con un disruptor de microtúbulos, tratamiento utilizado como segunda línea en cánceres de mama metastásicos). El tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos de tumores resistentes a trastuzumab con etanercept, anticuerpo bloqueante de TNFα, junto con trastuzumab, logró la disminución de la expresión de MUC4 y la regresión de los mismos. Luego analizamos la expresión de MUC4 por inmunohistoquímica en una cohorte de 78 tumores HER2 positivos obtenidos previamente al tratamiento con trastuzumab en adyuvancia. Pudimos comprobar que la expresión de MUC4 es un predictor independiente de peor sobrevida libre de enfermedad. En esta Tesis Doctoral comprobamos también que MUC4 es un marcador de la presencia del componente micropapilar en cáncer de mama HER2 positivo, subtipo histológico agresivo que no posee una terapéutica específica y suele ser subestimado en la clínica. Aquí proponemos el uso de la determinación de MUC4 junto con otras proteínas, como p120 y VEGF por inmunohistoquímica, así como la determinación de la densidad de vasos sanguíneos en el corte histológico para establecer la presencia del carcinoma micropapilar invasor. Demostramos también que, además de ser subestimado, el carcinoma micropapilar invasor de mama que expresa HER2 y MUC4 tiene una peor respuesta al trastuzumab en adyuvancia. También evaluamos la expresión génica diferencial por secuenciación masiva de RNA en líneas celulares resistentes al trastuzumab debido a la expresión de TNFα. Encontramos múltiples genes modulados tanto por la acción del TNFα como del trastuzumab, que pueden ser novedosos blancos terapéuticos que contribuyan al tratamiento del cáncer de mama.

Descripción: El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) yprogesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo,algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no respondenal tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizandomodelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumoresrespondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresiónde la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistenciaconstitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a laresistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4)y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 ylas de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que,en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre laexpresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapiaendocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a travésde la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada ennumerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer demama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de laenfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante laadquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluarel rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados ennuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que lasvariantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayoresniveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos queel FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresiónde las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayoresniveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayosde ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localizaciónes mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios decélulas epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta laproliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, eltratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibesignificativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familiastumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivocon el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobreel crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos deregresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e invivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlaciónpositiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que,en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en elepitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en lasvariantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos oadquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano,para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con altaexpresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistentea MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistentepresenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las treslíneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformasde 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. Enensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamientoendocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaronsignos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Estose evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo ytejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambasvariantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumoressensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de susreceptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes,el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales deproliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. Nodescartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmentelas HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina ydiseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en laprogresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonalvinculada a HMW-FGF2.

Descripción: Los genes R-spondin (Rspo) codifican para una familia de proteínas de secreción quemodulan las vías de señalización Wnt y están involucradas en múltiples procesos normales ypatológicos, de desarrollo y diferenciacion. Nuestro grupo determinó que particularmente Rspo3, aparece frecuentemente mutado y sobre-expresado en tumores inducidos por el virus deltumor mamario murino (MMTV), induciendo la transformación de células mamarias. Estosresultados también fueron corroborados posteriormente por otro grupo de trabajo. En el marco de esta tesis doctoral, demostramos que Rspo3 puede ser expresado porcélulas mamarias, no infectadas por MMTV, particularmente en aquellas que presentanmarcadores basales. De hecho, líneas tumorales mamarias que no expresan receptoreshormonales y poseen un fenotipo altamente metastásico son las que expresan niveles más altosde este gen. A continuación, nos propusimos determinar si Rspo3 se expresa en la glándulamamaria murina normal. Para ello, a partir de tejido de hembras vírgenes de la cepa C57B/L6, sesepararon las diferentes poblaciones celulares mediante citometría de flujo, y por RT-PCRcuantitativa se pudo determinar que la subpoblación basal enriquecida en células stem (Lin- /CD24+/CD29hi) expresa Rspo3, mientras que este ARNm no fue detectado en la subpoblaciónluminal. Al evaluar el efecto de RSPO3 sobre la línea epitelial mamaria no-tumoral NMuMG,hallamos que esta proteína favorecía características celulares asociadas a la transición epiteliomesenquimal,como la reducción en los niveles de E-cadherina y el incremento en la expresiónde Fibronectina, así como cambios morfológicos característicos de este proceso. Para investigar las consecuencias de la disminución de la expresión endógena de Rspo3 enlas células tumorales mamarias, se transfectó de manera estable células de la línea murina SCg6con diferentes secuencias de shRNA específicos para Rspo3. En aquellos clones en los que severificó una importante disminución en la expresión de dicha proteína se observó, por análisis de RT-PCR cuantitativa e inmunofluorescencia, una reducción en los niveles de marcadores basalescomo Vimentina. También, pudimos determinar en dichos clones la inhibición de la capacidadmigratoria de estas células así como la reducción en los niveles de actividad nuclear de β-catenina, lo que sugiere que Rspo3 estaría participando a través de la activación de la víacanónica de Wnt. Finalmente, se inocularon células de la línea SCg6 con Rspo3 efectivamente silenciado enlas glándulas mamarias o subcutáneamente y se evaluó la capacidad tumorigénica de lasmismas. Hallamos que estos clones no generaban tumores o lo hacían con una latencia mayorque las células SCg6 parentales. En conjunto, estos resultados demuestran que Rspo3 es relevante para el mantenimientode la capacidad tumorigénica de las células mamarias y sugieren que participaría en elmantenimiento del fenotipo basal tanto de células mamarias normales como tumorales.

Descripción: El cáncer de mama es la neoplasia maligna con la incidencia y mortalidad más alta en mujeres en el mundo. Aproximadamente el 70% de los tumores de mama expresan receptores de estrógenos (ER) y de progesterona (PR) y son por eso susceptibles al tratamiento con inhibidores hormonales como el tamoxifeno. Si bien la terapia hormonal es eficaz para el tratamiento de estos tumores, un alto porcentaje de los pacientes eventualmente recae a esta terapia. Recientemente se ha aprobado el uso de inhibidores de ciclo celular, como el palbociclib, para el tratamiento de los pacientes que recaen a la terapia endócrina o que presentan cáncer de mama metastásico. Sin embargo, de igual forma que con el tratamiento hormonal, estos pacientes eventualmente dejan de responder al tratamiento o incluso algunos no responden desde el comienzo. El objetivo general de este trabajo fue estudiar los mecanismos de resistencia asociados al tratamiento con tamoxifeno y con palbociclib, para poder proponer mejores estrategias terapéuticas para los pacientes que recaen a los mismos, así como también para evitar o retrasar el desarrollo de resistencia. Para esto, utilizamos las líneas de cáncer de mama humano T47D y MCF-7 para generar variantes resistentes a ambas drogas por presión selectiva con dichos agentes por 12 a 24 meses. Generamos primero las variantes resistentes a tamoxifeno (T47D-TR y MCF-7-TR) y a palbociclib (T47D-PR y MCF-7-PR), y luego a partir de las resistentes a tamoxifeno generamos las variantes doble resistentes a tamoxifeno y palbociclib (T47D-TPR y MCF-7-TPR), simulando la secuencia terapéutica utilizada en la clínica. Evaluamos la morfología de las líneas resistentes creciendo en 2D y observamos que presentan mayor atipia celular que las líneas parentales, forman estructuras irregulares y desorganizadas creciendo en 3D sobre Geltrex y en suspensión como mamosferas, lo cual se correlaciona con una expresión aberrante o reducida de E-cadherina. Además, encontramos que la variante resistente a tamoxifeno T47D-TR presenta un aumento en la capacidad de formar mamosferas, así como en la expresión de marcadores de stemness. A su vez, tanto la variante resistente a tamoxifeno MCF-7-TR como la resistente a palbociclib MCF-7-PR presentan una mayor capacidad migratoria que la línea wild type. Por otra parte, las variantes resistentes presentan una menor tasa de proliferación que la línea parental, tanto in vitro como in vivo. En contraposición a esto, encontramos aumento en la expresión de proteínas del ciclo celular como ciclina D1, ciclina E2, CDK4, CDK6 y CDK1 y disminución en Rb, dependiendo de la variante analizada. Encontramos también una menor expresión de ER y PR en las variantes resistentes, así como también un aumento en la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR a nivel de AKT o de la proteína ribosomal S6, y un aumento en PKCα. Evaluamos la sensibilidad in vitro de las variantes a inhibidores de PI3K/AKT/mTOR que actúan a distintos niveles de la vía, y encontramos un mayor efecto inhibitorio utilizando rapamicina (inhibidor de mTOR) que utilizando alpelisib (inhibidor de PI3Kα). Además, observamos que la combinación de rapamicina con palbociclib es más efectiva que los tratamientos, tanto in vitro como in vivo, no solo en reducir la proliferación y el crecimiento tumoral, sino también inhibiendo la expresión de proteínas del ciclo celular y la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Finalmente, para validar los resultados obtenidos en las líneas celulares, utilizamos xenotrasplantes derivados de pacientes (PDX) obtenidos a partir de biopsias de pacientes con tumores de mama ER+, sensibles y resistentes a tamoxifeno y palbociclib. Disgregamos los PDXs para obtener células individuales, las cuales fueron crecidas ex-vivo en 3D sobre Matrigel. Observamos que la mayoría de los cultivos son sensibles al tratamiento con alpelisib (inhibidor de PI3Kα). Por otra parte, la totalidad de los PDXs analizados son sensibles al tratamiento con everolimus (inhibidor de mTOR), independientemente de la presencia de mutaciones o alteraciones en genes de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Además, la triple combinación de palbociclib con everolimus y fulvestrant (inhibidor de ER) es más efectiva que las drogas individuales, no solo inhibiendo proteínas del ciclo celular sino también la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR. En conjunto, nuestros resultados indican que el tratamiento combinado de palbociclib con inhibidores de mTOR es efectivo tanto en un contexto de resistencia a tamoxifeno como a palbociclib, inhibiendo en paralelo tanto la proliferación celular y el crecimiento tumoral como la activación del eje ciclina D1/CDK4/6/Rb y de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Esta combinación podría evitar una reactivación de esta vía downstream mTOR y así retrasar el desarrollo de resistencia. En conclusión, en este trabajo generamos y caracterizamos modelos experimentales de resistencia adquirida a tamoxifeno y a palbociclib, simulando la secuencia terapéutica utilizada en la clínica. Estos modelos son útiles para estudiar tanto en cultivo celular como in vivo los mecanismos asociados al desarrollo de resistencia, para de esta manera poder proponer mejores estrategias terapéuticas para el tratamiento de los tumores de mama que recaen a estos esquemas, así como también contribuir a la identificación de posibles biomarcadores de respuesta terapéutica.

Descripción: Breast cancer represents the most common kind of cancer in women and it is estimatedthat more than one million new cases are diagnosed each year worldwide. It is a complexdisease, which presents a variety of subgroups with different genetic and histopathologicfeatures and therefore with different responses to treatments. Multiple signaling pathways are involved in malignant progression. Some of them arepromising targets for therapeutic intervention, including protein kinase C (PKC), involvedin cellular events such as proliferation, differentiation and apoptosis and the retinoidsystem, widely implicated in cell differentiation. Since different mammary malignancies exhibit differential expression of PKC isoforms, wehave developed (human and murine) mammary cell models overexpressing α or δ PKCisoforms. Using these models we studied how PKCα or PKCδ alters cell parametersassociated with tumor progression and metastatic dissemination while we assessed theresponse to treatment with retinoids (ATRA). Our results suggest that PKCα overexpression confers to the cells a retinoic acid-sensitivephenotype, through an arrest in the G0 / G1 phase of the cell cycle. Overexpression of PKCδ, in MDA-MB231 cells, induced a less aggressive phenotype, significantly reducing itsinvasive capability. Finally the lack of response of this cell line to ATRA treatment could bedue to the inability to trans-repress AP-1 sites.

Descripción: La progresión tumoral es un proceso complejo con múltiples etapas.En este trabajo estudiamos el rol de los macrófagos (Mfs) de portadores del tumor LMM3, derivado de un adenocarcinoma mamario murino metastásico de aparición espontánea en la cepa BALB/c, en la angiogénesis y linfoangiogénesis, dos procesos cruciales en la tumorigénesis, así como su regulación por el sistema colinérgico no neuronal. En nuestro modelo se purificaron Mfs peritoneales de portadores del tumor LMM3 a los 5, 7 y 14 días (MfsT5, MfsT7 y MfsT14) post-inoculación subcutánea. Observamos que el co-cultivo de células LMM3 con MfsT7 en la relación 100:1 potenció la neovascularización dérmica producida por las células LMM3, concomitantemente con un aumento en la expresión de CD31 y del factor de crecimiento del endotelio vascular-A (VEGF-A) marcadores angiogénicos. Sólo los MfsT7 y los MfsT14 indujeron per se, una respuesta angiogénica positiva tan potente como la que producen las células LMM3. En esta respuesta participan principalmente productos de las enzimas arginasa y ciclooxigenasa (COX) que se expresan en ambas poblaciones celulares. Demostramos que los Mfs expresan constitutivamente receptores muscarínicos y su estimulación con el agonista carbacol (CARB) potencia la respuesta angiogénica exclusivamente en los MfsT7, principalmente por activación de los subtipos M1 y M3 que se acoplan a las enzimas arginasa y COX. Los MfsT estimulan la linfoangiogénesis tumoral y son linfoangiogénicos per se porque producen un aumento de la expresión de LYVE-1 y VEGF-C, marcadores de vasos linfáticos, en el sitio de inoculación. El tratamiento de los MfsT7 con CARB sólo incrementó la expresión de VEGF-C. Concluimos que sólo los MfsT7 potencian e inducen la respuesta angiogénica, efecto que es regulado por receptores muscarínicos. Además los MfsT promueven la linfoangiogénesis desde estadíos precoces de portación del tumor y este proceso no parece estar controlado por el sistema colinérgico no neuronal.

Descripción: Se han descripto interacciones entre las vías de los receptores de hormonas esteroideas y de las proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción (Stats). En este trabajo, se exploró la capacidad de los progestágenos de modular la activación transcripcional de Stat3 en un modelo experimental de carcinogénesis hormonal en donde el progestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA) indujo adenocarcinomas mamarios en ratones hembras de la cepa BALB/c y en la línea celular de cáncer de mama humano, T47D. Se encontró que las células epiteliales C4HD, del modelo tumoral C4HD inducido por MPA, expresan Stat3 y que el tratamiento de las células C4HD con MPA aumenta la expresión de la proteína Stat3. Además, el MPA induce un efecto no genómico, rápido de fosforilación en tirosina de Stat3, Jak1 y Jak2 en las células C4HD y en las T47D. El tratamiento con MPA de las células C4HD también resultó en una rápida fosforilación en tirosina de c-Src. Estos efectos fueron completamente inhibidos por el antagonista de progestágenos RU486. El bloqueo de las actividades de Jak1 y Jak2 mediante la transfección transiente de las células C4HD con vectores dominantes negativos (DN) para Jak1 o Jak2, o la inhibición de la actividad de c-Src con el inhibidor selectivo de quinasas de la familia Src, PP2, bloqueó la capacidad del MPA de inducir la fosforilación de Stat3. El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo la unión de Stat3 al ADN. También, el MPA promovió una fuerte activación transcripcional de Stat3 en las células C4HD y en las T47D, la cual fue inhibida por RU486 y por el bloqueo de las actividades de Jak1, Jak2 y Src. Para investigar la correlación entre la activación de Stat3 inducida por MPA y el crecimiento celular, las células C4HD fueron transfectadas con un vector de expresión para una forma DN de Stat3, Stat3Y705-F, o con un mutante de Stat3 constitutivamente activo, Stat3-C. Mientras que la expresión del mutante Stat3Y705-F ejerció un efecto inhibitorio en el crecimiento celular inducido por MPA de las células C4HD, la transfección con el vector de Stat3 constitutivamente activo, provocó proliferación independiente del MPA. Finalmente, se investigó el efecto de bloquear la activación de Stat3 en el crecimiento in vivo de los tumores mamarios C4HD. La inhibición de la activación de Stat3 mediante la transfección de las células C4HD con el vector de expresión para DN Stat3Y705-F, inhibió significativamente la habilidad de estas células de formar tumores en ratones singeneicos. Estos resultados demuestran por primera vez, que los progestágenos son capaces de inducir la activación transcripcional de Stat3, la cual es un requisito obligatorio para la estimulación del crecimiento inducido por MPA de las células tumorales mamarias, tanto in vivo como in vitro.

Descripción: El receptor de factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-IR) pertenece a la familia de los receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo II, su ligando más afín es el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y es un factor clave en el desarrollo y la progresión del cáncer. Está demostrado que el IGF-IR es un requerimiento absoluto para el establecimiento y mantenimiento del fenotipo transformado, no siéndolo para el crecimiento de células normales, por lo que se lo considera un blanco ideal en la terapia antitumoral. Previamente demostramos que el bloque in vitro de la expresión del IGF-IR, utilizando oligodeoxinucleótidos antisentido (ASODN) al ARNm del IGF-IR, resultó en la inhibición de la proliferación mediada por el acetato de medroxiprogesterona (progestágeno sintético) de células C4HD pertenecientes a un tumor mamario murino progestágeno-dependiente. El objetivo del presente trabajo fue inhibir in vivo el crecimiento del tumor mamario C4HD empleando dos estrategias antisentido diferentes. En la primera estrategia, demostramos que la administración diaria intratumoral o sistémica en ratones hembra BALB-c de un ASODN fosfotiolado (AS[S]ODN) al IGF-IR resultó en la inhibición del crecimiento in vivo del tumor C4HD. El tratamiento indujo una disminución significativa en el volumen tumoral y en la velocidad de crecimiento, sin observarse ningún signo de toxicidad en los ratones tratados. El efecto antitumoral fue específico debido a su dosis-dependencia y a la falta de efecto en ratones tratados con [S]ODN sentido. Dado que la activación del IGF-IR resulta en la estimulación de varias cascadas intracelulares, incluyendo la vía de las proteínas quuinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la vía de la fosfatidil-inositol-3-quinasa/Akt (PI-3K/Akt), decidimos estudiar que vías estaban afectadas por el bloqueo in vivo de la expresión de IGF-IR. Los tumores obtenidos de ratones tratados con AS[S]ODN mostraron disminución en la expresión y fosforilación del IGF-IR y en la fosforilación del sustrato del receptor de insulina-1, inhibición de la activación de PI-3K/Akt y p42/p44MAPK. Más aun, la inhibición in vivo de la expresión del IGF-IR resultó en la inhibición de la fosforilación del ErbB-2 y del ErbB-3 (RTK tipo I) y la inhibición de la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3, demostrando in vivo la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y los ErbBs. Sin embargo, no encontramos regulación en la expresión y/o activación del receptor de progesterona inducida por el tratamiento in vivo con el AS[S]ODN. Por otra parte, numerosas evidencias indican que el efecto antitumoral del bloqueo de la expresión del IGF-IR involucra también una respuesta inmune del huésped. Por lo tanto en la segunda estrategia experimental, evaluamos la capacidad que tiene la inoculación de células tumorales C4HD tratadas con AS[S]ODN al IGF-IR para proteger de un posterior desafío tumoral y estudiamos la respuesta inmune desencadenada. Para ello, se inyectaron repetidamente ratones hembra BALB-c con células del tumor C4HD tratadas in vitro con el AS[S]ODN e irradiadas y se desafiaron luego con el tumor C4HD. La inmunización con células tratadas con el AS[S]ODN indujo una inhibición significativa del crecimiento del tumor C4HD con respecto a los tumores de los grupos controles. El efecto antitumoral resultó ser específico para el tumor C4HD, pues no se observó protección cuando se desafió con los tumores mamarios singeneicos 60HI o LM3. La inmunización en ratones nude no inhibió el crecimiento del tumor C4HD demostrando la dependencia de linfocitos T en el efecto protector. Además, no se detectaron anticuerpos específicos contra el tumor en los sueros de los ratones inmunizados, por lo que se descartó una respuesta de tipo humoral. Mediante ensayos de hipersensibilidad retardada, citotoxicidad por liberación de 51Cr y proliferación de esplenocitos, se confirmó que la inoculación de células tratadas con el AS[S]ODN desencadenó una respuesta inmune de tipo celular. Mediante un ensayo de citotoxicidad, previa depleción selectiva de las poblaciones de linfocitos T CD4+ o CD8+, se demostró que el efecto citotóxico era CD8+-dependiente. La inmunización provocó también la inducción de la producción de IFN-γ por los esplenocitos al ser enfrentados con el tumor, induciendo, a la vez, la lisis de las células tumorales por activación de la vía de muerte de Fas. El aumento de antigenicidad inducido por el tratamiento de las células tumorales con el AS[S]ODN al IGF-IR estuvo acompañado con un aumento en la expresión de la proteína chaperona de péptidos Hsp70 y de la molécula coestimuladora CD86. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que el crecimiento de un tumor mamario puede ser inhibido tanto por la administración directa in vivo de AS[S]ODN al IGF-IR, o a través de la inducción de una respuesta inmune protectora al inyectar inmunógenos derivados de células tumorales tratadas con el AS[S]ODN al IGF-IR.

Descripción: Existe numerosa evidencia que indica que los progestágenos estáninvolucrados en el control de la tumorigénesis mamaria. A pesar de ello, losmecanismos por los cuales las hormonas esteroideas estimulan el crecimientode células de cáncer de mama no han sido todavía descifrados completamente. Uno de los mecanismos propuestos ha sido la regulación de la expresión defactores de crecimiento que actuarían como mitógenos de las célulastumorales. En particular, se ha demostrado previamente en el laboratorio que Heregulina (HRG), ligando de receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo I, estimula el crecimiento de células epiteliales provenientes decultivos primarios del tumor mamario progestágeno-dependiente C4HD ypotencia los efectos mitogénicos del acetato de medroxiprogesterona (MPA) (Balañá et al., 1999; 2001). La primera parte del presente trabajo se centró en el estudio deinteracciones entre los caminos de señalización activados por progestágenos ypor RTKS tipo I y II en el modelo de carcinogénesis mamaria inducida poracetato de medroxiprogesterona en ratones Balb/c (Molinolo et al., 1987; Lanari et al., 1989). El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo tanto el aumentode los niveles proteicos de ErbB-2 como el aumento de su fosforilación. Habíamos demostrado anteriormente que el receptor tipo I del factor decrecimiento similar a la insulina (IGF-IR) y el ErbB-2 están involucrados en laproliferación de estas células mediada por MPA. Al estudiar el bloqueosimultáneo de ErbB-2 y IGF-IR sobre la proliferación inducida por MPA, no seobservaron efectos aditivos ni sinérgicos. Efectos aditivos hubieran sidoesperados si IGF-IR y ErbB-2 activaran vías de señalización independientes. Una interacción sinérgica hubiera existido si el camino de transducción deseñales activado por uno de los receptores potenciara el del otro receptor. Porlo tanto tan sólo un mecanismo que involucrara una interacción jerárquicaentre IGF-IR y ErbB-2, en el cual uno de ellos es esencial para la activación dedel otro, podía explicar nuestros resultados. En efecto, al suprimir la expresióndel IGF-IR, la fosforilación del ErbB-2 inducida por MPA se vio totalmenteinhibida. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de ErbB-2 no afectó lafosforilación del IGF-IR. Estos resultados muestran la existencia de unainteracción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2; por medio de la cual IGF—IR dirigela activación de ErbB-2. Se demostró, por primera vez, que esta interaccióninvolucra la asociación física de ambos receptores en un complejoheteromérico. Es más, experimentos de microscopía confocal laser mostraronque el MPA fue capaz de inducir la co-localización de ErbB-2 y IGF-IR. El propósito de la segunda parte del trabajo fue el de investigar lacapacidad de HRG de activar al receptor de progesterona (RP) utilizando elmismo modelo experimental que en la primera parte. Es así que pudimosobservar que HRG fue capaz de regular las características bioquímicas del RPen forma similar a la efectuada por la activación del receptor luego de la unióna un progestágeno. Se encontró que HRG fue capaz de inducir una disminuciónde los niveles proteicos de ambas isoformas, A y B, del RP y de disminuir lacantidad de sitios específicos de unión a progestágenos. Además, eltratamiento con HRG produjo un aumento de la proporción de RP conlocalización nuclear. Estudios posteriores nos permitieron saber que eltratamiento con HRG podía también inducir la unión del RP a su elementorespondedor en el ADN(PRE) y aumentar la transcripción de un gen reporteroque contenía dos PRE en su promotor. Un antiprogestágeno como el RU486provocó la inhibición de la activación transcripcional del RP mediada por HRG. Al profundizar en los mecanismos moleculares que estaban involucrados en losefectos de la HRG sobre el RP, pudimos observar que era necesaria lapresencia de ErbB-2 funcional así como de proteínas quinasas activadas pormítógenos (MAPK) en su estado activo. Es más, MAPKs activadas por HRGtuvieron la capacidad de fosforilar al RP en ensayos de fosforilación in vitro. Losmismos estudios se realizaron en la línea de carcinoma mamario humano T47Dobteniéndose resultados similares. Nuestros resultados mostraron que, en ausencia de progestágenos, HRG activa al RP tanto murino como humano mediante un mecanismo querequiere la presencia de ErbB-2 funcional así como la activación de MAPKs.

Descripción: Aproximadamente el 70% de los carcinomas mamarios (CaM) expresan receptores de estrógeno (ER) y de progesterona (PR) y se tratan con terapia endócrina sola o en combinación con, por ejemplo, inhibidores de ciclo celular (iCDK4/6). Sin embargo, un alto porcentaje recae, por lo que es importante desarrollar nuevos agentes terapéuticos y mejorar los criterios para elegir a las pacientes que pueden responder a las distintas terapias. En el laboratorio hemos demostrado que los antiprogestágenos inhiben el crecimiento de tumores de CaM que expresan mayores niveles de isoforma A de PR (PRA) que de PRB, denominados PRA-H. Postulamos que la administración conjunta de iCDK4/6 (palbociclib, PALBO) y antiprogestágenos (mifepristona, MFP) es beneficiosa para el tratamiento de tumores luminales PRA-H. En este trabajo de tesis nos propusimos: a) Desarrollar un Biobanco de PDX de CaM humano para contar con modelos fidedignos de la enfermedad y que estén disponibles para la comunidad científica, b) Estudiar el efecto de la combinación de MFP y PALBO en el crecimiento tumoral de distintos modelos de CaM, c) Investigar el mecanismo molecular asociado al efecto terapéutico del tratamiento combinado haciendo foco en la regulación del eje RB-E2F. En este trabajo de tesis se estableció un total de 8 PDX de CaM: 2 luminales, 1 HER2+ y 5 triples negativos. Los PDX mantuvieron la expresión de marcadores con respecto al tumor parental. Se realizó una secuenciación para caracterizar el exoma de los PDX. Se evaluó in vivo y ex vivo la respuesta a distintas drogas elegidas según el subtipo tumoral de cada PDX. En particular, se evaluó in vivo la sensibilidad a PALBO y a MFP en el PDX luminal ER+ PRA-H, donde los tratamientos simples inhibieron el crecimiento tumoral. En modelos experimentales murinos sensibles a MFP y a PALBO, se demostró un efecto terapéutico beneficioso al combinar ambos fármacos. En células T47D y sus variantes T47D-YA e -YB, que expresan solo PRA o PRB respectivamente, se demostró que las 3 variantes son sensibles a PALBO, pero la combinatoria con MFP fue eficiente solo en las células que expresan PRA. El efecto inhibitorio de la proliferación celular estuvo asociado a una disminución de los niveles de pRB y de E2F1. Por último, realizamos ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) en las células T47D-YA. Observamos que el tratamiento con MFP aumenta el reclutamiento de PRA sobre regiones regulatorias del gen E2F1, demostrando una regulación directa del antiprogestágeno sobre dicho gen. Los resultados presentados en este trabajo de tesis muestran que MFP disminuye los niveles de fosforilación de RB y la expresión de E2F1 en modelos de CaM que expresan altos niveles de PRA, existiendo una convergencia a este nivel con los iCDK4/6. Esto sugiere la posibilidad de utilizar combinaciones de ambos compuestos a bajas dosis para tratar pacientes con tumores PRA>PRB, con el fin de disminuir los efectos secundarios de los iCDK4/6.

Descripción: Los receptores β-adrenérgicos (β-RA) median la respuesta al estrés a través de su unión a las catecolaminas endógenas. Se ha descripto a los β-RA como reguladores de numerosos procesos asociados a la progresión tumoral. En el presente trabajo de Tesis se demostró que no solo la activación sino también los niveles de expresión de los β2-RA determinan el comportamiento benigno de las células mamarias, lo cual explica el comportamiento diferencial entre las células tumorales y no tumorales ante la catecolamina endógena, epinefrina. Se demostró que la estimulación β-adrenérgica regula el desarrollo normal de la glándula mamaria, conduciendo a un fenotipo diferenciado. Se estudiaron mecanismos dependientes del receptor de estradiol e independientes del mismo, y se describieron posibles mediadores moleculares. Además, el efecto diferenciante observado en la glándula mamaria normal resultó ser trasladable a modelos tumorales. Se demostró que el antagonista propranolol se comporta como agonista, regulando procesos celulares como los de adhesión y proliferación. Se profundizó en las vías de señalización que regulan la adhesión celular inducida por el isoproterenol (agonista) y el propranolol (antagonista). Los resultados obtenidos en el presente trabajo aportan nuevas perspectivas en el estudio del estrés y el cáncer de mama. Comprender cómo los β-RA inciden sobre el desarrollo de la glándula mamaria es prometedor y relevante en la investigación del cáncer.

Descripción: El crecimiento tumoral depende en gran medida en la interacción de las células tumorales con elmicroambiente que las circunda. Entre otras células que componen el estroma tumoral seencuentran precursores locales y precursores estromales o células madre mesenquimales (MSCs) que se alojan en el tumor tras ser reclutadas desde la médula ósea. En base a esto surgela pregunta: ¿cuáles de los factores del microambiente tumoral son los responsables de lamigración de MSCs provenientes de médula ósea? Utilizando un modelo in vitro del microambiente tumoral representado por medioscondicionados (MC) por muestras humanas de adenocarcinomas mamarios realizamos unestudio proteómico de citoquinas y quimioquinas sobre 8 muestras tumorales, destacándose IL-6, GRO, IL-8 y MCP-1 como los factores más representados de los medios condicionados portumores, siendo el perfil muy similar entre todas las muestras tumorales. En busca de unmodelo que remede el aporte de factores quimiotácticos por parte de los tumores humanos, secrecieron tumores ortotópicos en ratones nude combinando una línea tumoral mamariahumana con fibroblastos humanos adultos. Utilizando este modelo, se logró cuantificar las MSCsllegadas tras migración local luego de ser inyectadas de modo peritumoral. En una validación técnica y funcional in vitro, IL-6 resultó ser quimiotáctico para MSCs pero enconcentraciones mucho mayores a las encontradas en los tumores; sin embargo no se descartaun rol de IL-6 directo o indirecto. Por otra parte los ejes quimiotácticos de GRO, IL-8 y MCP-1 norevelaron un aporte significativo sobre la migración de MSCs. Por otro lado, de un análisis estadístico y funcional comparando los MC provenientes detumores y tejidos adyacentes libres de patología, resultó una lista de factores diferencialmenterepresentados de los cuales MIP-3α o proteína inflamatoria de macrófagos 3 alfa surge como elfactor más relevante como posible mediador del reclutamiento de las MSCs hacia el tumor. Lavalidación funcional del eje quimiotáctico MIP-3α / CCR6 sugiere que este eje estaríainvolucrado, al menos en parte, en la migración de MSCs hacia tumores. En suma, hemos logrado identificar un factor relevante para la modulación de la migración delas MSCs hacia el tumor, factible de ser utilizado en estudios posteriores para el diseño deterapias celulares contra el cáncer.

Descripción: La alta incidencia de cáncer de mama ha creado la necesidad de comprender elfuncionamiento de las vias regulatorias de la glándula mamaria. Las alteraciones en laexpresión y vias de señalización de los factores de crecimiento parecen críticas en eldesarrollo y progresión de las neoplasias de mama. El conocimiento de los circuitosregulatorios del crecimiento celular en la glándula mamaria es de suma importancia parala prevención, diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama. Con este objetivo, se haprestado significativa atención a los miembros de la familia de ligandos de los erbBs y susreceptores con actividad de tirosina-quinasa en células mamarias tanto normales comotransformadas. En el presente estudio se demostró la existencia de interacciones entre lasvías de señalización de los progestágenos y las vias de la heregulina (HRG) y los erBs entumores mamarios. Se utilizó un modelo de carcinogénesis hormonal, en el cual elprogestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA) indujo la aparición deadenocarcinomas mamarios en hembras vírgenes de la cepa Balb/c. Los estudios de losreceptores con actividad de tirosina quinasa tipo I (erbB-2, erbB-3 y erbB-4 ) y de suligando, HRG, fueron realizados utilizando tres tipos de tumores del modelo decarcinogenesis inducida por MPA: tumores ductales progestágeno- dependientes (HD) conaltos niveles de receptores para estrógenos (RE) y progesterona (RP), las variantestumorales progestágeno - independientes (HI) de los anteriores, que si bien conservan los RE y RP proliferan de manera MPA- independiente y tumores hormono- independientesde origen lobulillar que carecen de RE y RP. Se encontró sobreexpresión de erbB-2 yerbB-3 y bajos niveles de expresión de erbB-4 en todos los tumores estudiados. En todoslos tumores lobulillares y en uno de los ductales la sobreexpresión del erbB-4 se debió aamplificación génica. Los mismos patrones de expresión se mantuvieron en los cultivosprimarios de células epiteliales provenientes de estos tumores. El MPA indujo unaregulación positiva de la expresión de ARNm de HRG, erbB-2 y erbB-3 en las líneastumorales HD. La progresión hacia un fenotipo progestágeno independiente (HI) seacompañó de una mayor expresión constitutiva de HRG, erbB-2 y erbB-3. La expresiónde HRG se detectó en las células tumorales epiteliales, indicando que la HRG actuaría através de un mecanismo autocrino en cancer de mama. Al tratar células epiteliales malignas con oligodeoxinucleótidos antisentido (ASODN-1)al ARNm del erbB-2, se encontró una inhibición del crecimiento inducido por MPA enlas líneas tumorales HD y del crecimiento autónomo de las líneas tumorales HI. Losmismos niveles de inhibición se obtuvieron usando ASODN-2 dirigidos a la secuenciaconsenso de tirosina- quinasa. El hecho de no haber encontrado efectos sinérgicos al tratarcon una combinación de ambos ASODNs y MPA, otorgaria al oncogen erbB-2 unaparticipación crítica en la proliferación mediada por MPA y el crecimiento autónomo decélulas HI. La HRG indujo un potente efecto proliferativo en en cultivos primarios decélulas HD y potenció el efecto mitogénico del MPA. En las células HI, que exhibieronfosforilación constitutiva del receptor erbB-2 , el tratamiento con HRG no tuvo efectoalguno sobre la proliferación, aportando evidencias de que la sobreexpresión del erbB-2 ysu activación constitutiva conferida a estas células una ventaja proliferativa. El bloqueo dela síntesis endógena de HRG con ASODNs al ARNm de HRG en células HD inhibió elcrecimiento inducido por MPA. El tratamiento de estas células tanto con HRG como con MPA resultó en la fosforilación en tirosina del erbB-2 y el erbB-3. Estos resultadosindican que la HRG actuaría como mediador del efecto proliferativo del MPA. Seencontraron los mismos resultados in vivo, en tumores proveniente de ratones tratadoscon MPA. Además, los efectos proliferativos tanto del MPA como de HRG, fueronabolidos cuando las células se trataron con ASODNs al ARNm del erbB-2, otorgando alerbB-2 una participación fundamental en el crecimiento inducido por HRG. Finalmente, elbloqueo de la expresión del receptor tipo l de IGF (IGF-R I) con ASODNs especificosresultó en la completa inhibición de los efectos proliferativos de HRG, demostrando que lapresencia de un IGF-R I funcional es esencial para la actividad mitogénica de HRG. Estosresultados aportan la primera evidencia de interacciones entre las vias de transducción deprogestágenosy de HRG/erbBs en cáncer de mama y la primera demostración de que losefectos proliferativos de HRG requieren de IGF- R I.