Descripción: En esta Tesis se presenta un bioensayo microbiano amperométrico para ladeterminación rápida de BOD (demanda bioquímica de oxígeno) en muestras de aguabasado en la utilización de ferricianuro como aceptor de electrones del metabolismobacteriano. Se logró simplificar la metodología generalmente utilizada en este tipo debioensayos y el rango lineal obtenido representa una gran mejora frente al rango lineal quepresenta el ensayo BOD5. Mediante este bioensayo se determinó la BOD de varias muestrasde agua obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5 y un RSD ≤ 10%. De manera de diseñar un sistema portátil a partir de este bioensayo amperométrico,se obtuvieron cultivos liofilizados de K. pneumoniae metabólicamente activos, hasta 35días después de realizar la liofilización y se estudió la posibilidad de utilizar electrodos detinta de Au descartables realizados por screen-printing, en ensayos de convección forzada. Otra alternativa analizada para la determinación rápida de BOD de muestras realesfue el desarrollo de un biosensor potenciométrico basado en el empleo de un electrodopotenciométrico sensible a CO2 y la inmovilización en membrana de distintosmicroorganismos. Este biosensor también permitió determinar la BOD de muestras de aguareales obteniéndose una buena correlación con los resultados del test BOD5. Como último trabajo de esta Tesis, se desarrolló un bioensayo para ladeterminación de toxicidad aguda de nanopartículas de Ag, basado en la técnica deespectroscopía de impedancia electroquímica, empleando electrodos interdigitados de Au ycélulas NHDF (normal human dermal fibroblasts) como material biológico. Este trabajo serealizó en parte en el Austrian Institute of Technology (AIT) bajo la dirección del Dr. Peter Ertl.

Descripción: Se comparan datos experimentales de respuesta amperométrica para biosensores enzimáticos con modelos que acoplan procesos de difusión-reacción. Se trabajó con Glucosa Oxidasa (GOx, E.C. 1.1.3.4) y mediadores redox artificiales: el complejo [Os(bpy)2ClpyCOOH]+ en el caso homogéneo; y un análogo del mismo unido covalentemente a polialilamina (PAH-Os), que se autoensambla electrostáticamente capa-por-capa junto a GOx dando lugar a un biosensor totalmente integrado. Se ajustaron datos experimentales para el sistema homogéneo a las fórmulas analíticas aproximadas del modelo de Albery (JEC, 323, (1992), 97). A baja concentración de glucosa se observaron voltagramas cíclicos no estacionarios, con desarrollo de un pico de corriente y marcada histéresis, contrariamente a lo predicho por el modelo. Se compararon voltagramas experimentales y simulados numéricamente, en el marco de un modelo más completo que considera el desarrollo de perfiles de concentración. Se reporta además inactivación de la enzima presente en solución de glucosa. Se analizaron cambios en la estructura y la electrocatálisis de películas al variar la densidad de carga lineal de PAH-Os modificando el pH de las soluciones de autoensamblado. La respuesta del sistema inmovilizado se analizó según el modelo de Pratt-Bartlett (JEC, 397, (1995), 61) con el objeto de validar el mismo. Se trabajó con películas de espesor variable y un amplio intervalo de concentraciones de glucosa. Los datos experimentales arrojaron un buen ajuste a las fórmulas aproximadas. También se ajustaron usando una rutina Simplex combinada con la resolución numérica de las ecuaciones diferenciales sin emplear simplificaciones. Los parámetros de ajuste fueron acotados alrededor de los valores hallados con las fórmulas aproximadas. El análisis combinado mediante fórmulas analíticas aproximadas y simulaciones numéricas resultó útil para la extracción de parámetros desconocidos y comprender mejor los factores que afectan la respuesta amperométrica.

Descripción: Un biosensor constituye un dispositivo de reconocimiento molecular donde una macromolécula,generalmente de origen biológico interactúa con un analito en forma específica e inicia asi un proceso quese transduce en una señal eléctrica. Dentro de esta categoría podemos distinguir a los electrodosenzimáticos amperométricos, donde son medidos cambios de corriente eléctrica sobre un electrodo detrabajo a partir de variaciones en el estado rédox de un mediador que participa del proceso biocatalítico conla enzima rédox. La regeneración del estado rédox inicial del mediador sobre la superficie de un electrodo —aplicando potenciales apropiados — permite que se produzca un estado estacionario en la catálisis y porende una corriente eléctrica también estacionaria. Este flujo de electrones se halla correlacionado en formadirecta con el consumo del analito. El estudio de electrodos enzimáticos amperométricos ha estado tradicionalmente ligado a lainmovilización de las enzimas rédox en matrices poliméricas. Lamentablemente, estos sistemas integradospresentan dificultades para su estudio a escala molecular dadas por la complejidad y falta de control en laorganización espacial del biosensor. Esto impide un análisis microscópico de las variables que afectan larespuesta de estos biosensores tales como el espesor, la concentración de enzima y mediador rédox o lacinética de reacción entre la enzima rédox y el mediador. La presente tesis propone una estrategia para el diseño de electrodos enzimáticos amperométricospara su utilización como biosensores. Esto involucra el empleo de técnicas de autoensambladoelectrostático con el objetivo de depositar en forma altemada y secuencial la enzima rédox y el mediador. De esta manera es posible evaluar distintos parámetros de la película formada: la cantidad de enzimaadsorbida, empleando la microbalanza de cuarzo (QCM); los sitios rédox depositados, por medio detécnicas electroquímicas; el espesor, mediante elipsometría y la morfología de la superficie, utilizandomicroscopía de fuerza atómica (AFM). Por otra parte, es evidente que el grado de control en el diseño delelectrodo enzimático amperométrico permite analizar su respuesta en función de la estructura construida. En este contexto, se trabajó con dos enzimas rédox aniónicas: glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa de soja (SBP), mientras que se empleó polialilamina catiónica modificada con un complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+(PAH-Os) y un polielectrolito rédox globular de origen dendrítico, poliamidoaminamodificada con el mismos complejo (PAMAM-Os) como mediadores rédox. En una primera etapa, se estudió el efecto de la estructura electrostática sobre la respuestaelectroquímica de la PAH-Os. Dado que el film depositado es multi-bipolar, posee la propiedad de excluiriones por fuerzas electrostáticas repulsivas. En este sentido, el autoensamblado de PAH-Os conpolielectrolitos aniónicos como poliestirensulfonato (PSS) y polivinilsulfonato (PVS) permitió elaborar unmodelo de membrana permselectiva para analizar este comportamiento. Las cargas positivas - dadas porlos grupos amino - y negativas — dadas por los grupos sulfonato - determinan la aparición de un potencialde membrana que puede ser interpretado en términos del potencial de Donnan. De esta manera, ensoluciones de baja fuerza iónica, la permselectividad impuesta por este potencial se torna evidente y el tipode ion excluido depende de la identidad de la capa terminal y del pH de la solución, afectando el potencialformal de la cupla de PAH-Os en la estructura. Por otra parte, en soluciones de alta fuerza iónica, elpotencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura se aproxima al valor del complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+ en solución. El uso de la microbalanza de cuarzo electroquímica (EQCM) demostróla naturaleza de los iones intercambiados entre la película depositada y solución de electrolito en cada unade las situaciones descriptas anteriormente. Se reconocen tres procesos asociados en el diseño de un biosensor. Por un lado el mediador rédoxinmovilizado electrostáticamente sobre el electrodo debe intercambiar electrones con esta superficie. Enuna segunda etapa, la carga rédox debe propagarse a lo largo de las capas sucesivas. Finalmente, elmediador rédox debe alcanzar el grupo prostético rédox de la enzima para realizar la transferenciaelectrónica. De esta forma es posible transducir el proceso de reconocimiento molecular del sustratoefectuado por la enzima en una corriente catalítica. En particular, un aumento de la concentración delsustrato resultará en un incremento de la señal amperométrica. En el marco de los procesos que hemos identificado, estudiamos la influencia de la disposiciónespacial de la GOx adsorbida en una monocapa sobre la comunicación eléctrica entre el mediador y laenzima. En este contexto, mediante medidas de QCM, AFM y técnicas electroquímicas determinamos queel nivel de agregación de proteína sobre la superficie del electrodo incide de manera negativa en laconstante de velocidad aparente de la mediación catalítica de la PAH-Os en la oxidación del sustrato de la GOx, β-D-glucosa. Más aún, la cantidad de enzima que interactúa con el mediador es mucho menor a laenzima pesada por QCM. Sin embargo, al aumentar la relación de concentración superficial entre los sitiosde Os adsorbidos y la enzima depositada, se incrementaba tanto la cantidad de enzima “cableada” por la PAH-Os como así también la constante de velocidad aparente con el grupo FADH2 de la GOx. El mecanismo de transporte de carga rédox en el sistema PAH-Os / GOx fue estudiadointercalando una capa de GOx activa con capas de apoenzima inactiva, apo-GOx. Ubicando la capa reactivaa distancia variable del electrodo fue posible determinar el coeficiente de difusión de la carga rédox, De, enla estructura electrostática autoensamblada. El valor de De obtenido - en el orden de 10ˉ9 cm² sˉ¹ — implicaque el transporte de carga ocurre a través de un mecanismo de saltos electrónicos ya que la difusión fisicade las cadenas poliméricas de la PAH-Os se halla impedida. De esta manera, la construcción capa por capade estos electrodos permitió definir espacialmente el sistema y estudiar el transporte de carga rédox a lolargo de distancias nanométricas. La posibilidad de propagar la estructura en forma repetida y construir un sistema de multicapas de PAH-Os / GOx permitió establecer similitudes y diferencias entre las distintas capas depositadas. Enparticular, se encontró que la primer bicapa de PAH-Os / GOx difiere notablemente del resto que le siguendebido a que la PAH-Os interactúa con la enzima únicamente por “debajo”. Por otra parte, al aumentar elpH desde donde se adsorbía la solución de PAH-Os las cantidades de enzima y carga rédox depositadaseran mayores. Esto es debido a que el polielectrolito rédox tiende a adoptar una conformación que exponeuna mayor proporción de segmentos poliméricos sobre la superficie que inducen la agregación de enzimas. Si bien la proporción de enzimas que reaccionan con la PAH-Os es mayor en este caso, la constante develocidad permanece relativamente invariable. Exploramos también el uso de un mediador rédox globular de origen dendrítico, PAMAM-Osautoensamblado con la enzima GOx. Los estudios elipsométricos indicaron un ligero comportamientoelástico del dendrímero modificado al adsorberse en forma electrostática sobre una superficie. Más aún, sibien se encontró que la PAMAM-Os participa activamente en el proceso de catálisis de oxidación de laglucosa se encontraron dificultades para definir la concentración volumétrica de sitios de Os en el film. Finalmente, el autoensamblado electrostático permitió analizar la comunicación eléctrica entre la PAH-Os y SBP que posee un centro prostético constituido por un grupo hemo y reduce H2O2 a expensas delos sitios de PAH-Os reducidos. Por otra parte, dado que la GOx en presencia de O2 oxida la glucosaproduciendo H2O2, se ensayó un esquema bienzimático donde se depositaron capas de SBP intercaladascon PAH-Os y una capa de GOx en el tope de la estructura. Trabajando a potenciales reductores se registró la respuesta amperométrica debida a la formación de peróxido de hidrógeno por la capa de GOx. En estesentido se logró definir con precisión de nanometros las distintas capas reactivas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que el estudio de electrodos enzimáticosamperométricos autoensamblados electrostáticamente constituye una poderosa herramienta para analizardistintos aspectos relacionados a la transferencia electrónica entre enzimas y el mediador rédox, losmecanismos de propagación de electrones en sistemas químicos integrados y la distribución espacial dearreglos multienzimáticos.

Descripción: El presente trabajo de tesis se basa en el estudio de multicapas enzimáticas y electrodos enzimáticos destinados a la fabricación de biosensores y biocátodos para celdas de combustible. Las multicapas, de espesores nanométricos, se fabricaron utilizando el método de autoensamblado capa por capa, empleando enzimas y el polielectrolito electroactivo PAH-Os. El primer objetivo es extender el sistema de reconocimiento molecular de glucosa integrado por una enzima redox (GOx) mediada por su cable molecular (PAH-Os) (que ha sido estudiado previamente en este laboratorio) al diseño de un nuevo biosensor que brinde posibilidades de sensado únicas y permita sensar diferentes analitos. A este respecto se construyó el primer nanobiosensor óptico autoensamblando capa por capa esos dos componentes sobre la superficie de nanopartículas de Oro para dar una transducción óptica que además aprovecha las propiedades plasmonicas de las nanopartículas de Oro. El segundo objetivo es extender ese mismo sistema (GOx/PAH-Os) a un sistema que emplee una enzima redox diferente, y que también posea interés industrial. En esta dirección, se estudió el sistema Lacasa/PAH-Os como biocátodo para celdas de combustible (la Lacasa es una enzima redox que cataliza la oxidación de bifenoles reduciendo O2 a H20). Se encontró que durante la electroreducción de oxígeno, catalizada por Lacasa y mediada por PAH-Os, la enzima produce pequeñas cantidades de peróxido de hidrógeno (que además la inhiben), demostrándose que el mecanismo de Solomon, que predice la reducción de oxígeno por 4 electrones sin producción de H2O2 es incompleto, al no tener en cuenta el camino de la desorción del H2O2 observado en el presente estudio. Este biocátodo, en condiciones de convección forzada, posee una actividad específica considerable de 0.3mA.cm^-2 a un potencial de 0.3V lo cual lo convierte en un posible candidato para su implementación en celdas de biocombustible. Se comparó además este biocátodo con el sistema que emplea transferencia electrónica directa de la enzima con una superficie de carbono grafitico, mostrándose además por primera vez las curvas de calibración de de un sistema de este tipo. Se compararon ambos biocátodos entre sí y a éstos con un cátodo de Platino, concluyendo que el biocátodo no mediado no es apto para la producción de potencia eléctrica debido a una bajísima actividad específica. En base a las evidencias previas a esta tesis, sobre el marcado efecto de la naturaleza y carga de la ultima capa de multicapas electroactivas en el fenómeno de transporte electrónico, se estudió este mismo fenómeno en los dos electrodos enzimáticos (PAH- Os/Lac, PAH-Os/GOx), observándose que el proceso biocatalítico es seriamente impedido por la adsorción de un polianión, reflejado a través de la abrupta caída en el coeficiente de difusión del electrón.

Descripción: El interior de las células se caracteriza por su alto contenido de macromoléculas que pueden ocupar hasta un 40% del volumen total, dependiendo del tipo celular y su estado fisiológico. Esta variable característica de los entornos biológicos se conoce como hacinamiento macromolecular. El volumen excluido por el hacinamiento genera importantes consecuencias termodinámicas y cinéticas sobre procesos biológicos como el plegado y la agregación de proteína, reacciones de asociación o disociación, entre otros, convirtiéndolo en un parámetro de gran relevancia biológica. En este trabajo se desarrollaron sensores basados en FRET que permiten detectar variaciones en el nivel hacinamiento molecular en células vivas. Su diseño se basa en una fusión de proteínas capaces de realizar transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) unidas por un segmento espaciador desestructurado y flexible, de manera que puedan adoptar conformaciones más compactas en medios hacinados. Los estudios in vitro de los sensores muestran que la eficiencia de FRET se incrementa al aumentar el nivel de hacinamiento del medio, lo que confirma que en condiciones hacinadas los sensores se compactan. Para probar su funcionamiento en células vivas, los sensores se expresaron en bacterias (E. coli BL26) a las que se les aplicó un shock osmótico exponiéndolas a medios con alta concentración de NaCl. Los resultados muestran que la eficiencia de FRET aumenta instantáneamente luego del shock, indicando que la respuesta al estrés osmótico va acompañada por un aumento en el nivel de hacinamiento celular. Además, al revertir el shock osmótico volviendo a concentraciones fisiológicas de sal, se vio que la eficiencia de FRET vuelve a bajar, comprobando que la respuesta de los sensores es modulada y reversible. En conclusión, gracias a la flexibilidad del linker los sensores se compactan para ubicarse en los espacios libres que quedan entre las moléculas presentes en medios hacinados, donde el grado de compactación aumenta al incrementarse el nivel de hacinamiento. La eficiencia de FRET de los sensores varía según el grado de compactación, permitiendo su aplicación para el estudio in vivo de cambios de hacinamiento producidos durante procesos biológicos relevantes, como la respuesta a proteínas mal plegadas y la compactación de la cromatina en los núcleos de células eucariontes.