Descripción: Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.

Descripción: Previamente demostramos que el ADN bacteriano extracelular activa a los neutrófilos a través de un mecanismo diferente al canónico CpG-dependiente. El ADN extracelular es un componente central en la formación y estructura de los biofilms bacterianos, comunidades responsables de más del 60% de las infecciones ocasionadas por estos microorganismos. La presente tesis tuvo como objetivos centrales determinar el impacto del ADN de la matriz de los biofilms en la activación de los neutrófilos humanos y la identificaron del receptor involucrado en el reconocimiento de ADN. Los estudios realizados indicaron que la degradación con DNAsa I del ADN de la matriz extracelular de los biofilms de P. aeruginosa redujo marcadamente su capacidad de inducir la activación de los neutrófilos, determinada en función de su habilidad para producir citoquinas proinflamatorias, incrementar marcadores de activación fisiológicamente relevantes, de mediar la fagocitosis y de liberar trampas extracelulares de los neutrófilos (NET). La aplicación de técnicas de MALDI-TOF nos permitió identificar, en el neutrófilo, 16 proteínas con capacidad de unir ADN bacteriano. A pesar de que ninguna de ellas resultó ser el receptor de la superficie celular para ADN, es posible que dos de las proteínas encontradas constituyan sensores intracelulares de ADN, cuya relevancia queda por ser explorada. Los hallazgos realizados en la presente Tesis confirman la existencia de una proteína de la superficie del neutrófilo capaz de mediar el reconocimiento de ADN y la activación celular por esta molécula. Además, indican que el ADN de la matriz extracelular representa un componente proinflamatorio relevante de los biofilms de P. aeruginosa. Los mismos permiten especular que el reconocimiento del ADN de la matriz de biofilms podría representar un mecanismo seleccionado evolutivamente para permitir al huésped incrementar su capacidad de responder a este tipo de infecciones bacterianas persistentes

Descripción: Rhizobium leguminosarum es una α-proteobacteria que puede establecer simbiosis con ciertas leguminosas. La formación de un biofilm puede favorecer la persistencia en suelos y en la rizosfera y también contribuir a la competitividad para la infección de la leguminosa. En esta tesis se estudiaron factores importantes para la adhesión a diversos sustratos y la formación de biofilms. Uno de los factores estudiados fue la proteína de adhesión RapA1, secretada a través del sistema PrsDE. Se sobreexpresó RapA1 y se observó que esto produjo diversos fenotipos de superficie, incluido el aumento de adhesión a sustratos abióticos y la formación aumentada de biofilms in vitro. Se estudió la relación entre RapA1 y el exopolisacárido acídico (EPS) y el requerimiento del EPS y PrsDE para formar biofilms en flujo continuo. Se analizó la localización de RapA1 y de otras proteínas relacionadas y se estudiaron posibles mecanismos involucrados en la localización. Algunos estudios complementarios sobre el efecto de RapA1 sobre la superficie, efecto de expresión de otras Raps y regulación de genes relacionados con la adhesión fueron encarados de manera inicial. La interacción entre Polisacáridos de superficie y adhesinas proteicas resulta clave para la adhesión y formación de biofilms, dos fenómenos importantes en la biología de Rhizobium y de relevancia para la humanidad.

Descripción: La langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (Crustacea, Decapoda, Parastacidae), originaria de los ríos del norte de Australia, ofrece grandes ventajas para la cría comercial, siendo cultivada en varios países del mundo. En Argentina se la cultiva desde hace algunas décadas, si bien no posee un clima óptimo para su cría, por lo cual se hace necesario desarrollar estrategias compensatorias que maximicen la producción en criadero. En el cultivo de esta especie, los primeros estadios de vida son esenciales para conseguir un buen rendimiento en la producción final, siendo las fases de hatchery (juveniles tempranos de hasta 1 gramo de peso corporal) y de nursery (juveniles avanzados de pre-engorde, de 1 a 5 gramos de peso corporal) de extrema importancia ya que durante éstas se presentan elevadas tasas de mortalidad, siendo entonces necesario optimizar las condiciones específicas de cultivo. En el presente trabajo se evaluaron diferentes tipos de sustratos, refugios y fuentes de alimentación en el cultivo de juveniles tempranos y avanzados, a fin de optimizar el crecimiento y la supervivencia. A partir de los resultados obtenidos, se recomienda complejizar el hábitat, es decir, utilizar un sustrato que otorgue sostén y resguardo durante la ecdisis (como piedras o canto rodado) y un refugio vertical (diseño tipo torre) que optimice la disponibilidad de lugares de amparo, aprovechando toda la columna de agua del acuario de cultivo; esta metodología demostró mejorar significativamente la supervivencia y el crecimiento de los juveniles tempranos, que resultaron ser los más susceptibles durante el cultivo. Además, utilizando un refugio vertical durante esta fase del desarrollo, se podría incrementar la densidad de siembra, sin afectar el crecimiento y la sobrevida de los juveniles. Por otro lado, la Artemia sp. como fuente de alimentación resultó favorable para el crecimiento y sobrevida de los juveniles tempranos, pudiendo reemplazar al costoso alimento balanceado que se utiliza actualmente en los criaderos. Asimismo, la incorporación al cultivo de biofilm adherido a un sustrato artificial, resultó beneficiosa para ambos tipos de juveniles cuando se lo administró como fuente complementaria de alimento, manteniendo la calidad del agua y resultando en un incremento en la sobrevida de los animales. Los avances obtenidos en la presente Tesis podrían ser transferidos al ámbito productivo, a fin de ofrecer soluciones concretas a problemas reales que manifiestan los mismos productores.

Descripción: El género Xanthomonas incluye a más de 300 especies que atacan a una gran variedad de plantas, entre ellas muchas de interés comercial. En esta tesis se trabajó en la caracterización de la interacción entre dos patovariedades de Xanthomonas y sus hospedadores. En la primera parte de la tesis se describe la interacción entre Xanthomonas campestris pv. campestris, agente causal de la putrefacción negra de las crucíferas y su hospedador Arabidopsis thaliana, y Nicotiana benthamina, un nuevo modelo de interacción, focalizándonos en cual es el rol del glucano cíclico beta-(1,2) en el proceso infectivo. Este compuesto demostró ser un supresor de la respuesta de defensa de la planta, a través de un mecanismo que involucra su capacidad de diseminarse sistémicamente dentro de la misma. En la segunda parte de estas tesis se estudió la interacción entre Xanthomonas citri susp. citri, uno de los agentes causales de la Cancrosis Bacteriana de las Cítricos (CBC) y su hospedador Citrus limon. En particular se estudió el rol de exopolisacárido xantano producido por la bacteria en la formación de biofilms y en su virulencia. Encontramos que el xantano es fundamental para la formación de complejos multicelulares bacterianos, y que la formación de estos mismos tiene un rol central en la sobrevida de la bacteria en la planta y en la virulencia de la misma. En la tercera, y última sección de esta tesis, se propuso la aplicación de los conocimientos adquiridos sobre la CBC en el desarrollo de un método de diagnóstico para la enfermedad. El método desarrollado se basó en una amplificación de ADN isotérmica acoplada a tiras del tipo test de embarazo. Los resultados obtenidos muestran que el desarrollo es altamente específico, sensible, transportable y fácil de ser llevado a cabo.

Descripción: Fil: Saavedra Olaya, Albert Ulises. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Pseudomonas extremaustralis es un organismo Antártico, que presenta alta resistencia al estrés y produce polihidroxibutirato (PHB). En este trabajo, se estudió su metabolismo microaeróbico, que está regulado en Pseudomonas por Anr. Se observó que es capaz de utilizar nitrato, reduciéndolo solo a nitrito. El genoma posee todos los genes involucrados en la desnitrificación, con excepción de los genes nir. Los genes de la fermentación de L-arginina son funcionales en esta especie. Anr afectó positivamente la síntesis de PHB. Asimismo, influenció el estado redox celular, el consumo de oxígeno, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la producción de exopolisacáridos (EPS) y proteínas extracelulares, la biosíntesis de aminoácidos y la utilización de distintas fuentes de carbono. Los biofilms presentan gradientes de O2. El PHB contribuyó a la supervivencia en forma planctónica en biofilms en frío y su ausencia resultó en una mayor formación de biofilms y EPS y menor movilidad. Anr también afectó el desarrollo de biofilms, dado que mutantes anr mostraron defectos en su formación, así como menor adhesión, agregación y mayor movilidad. En el genoma de esta especie se detectaron 167 probables blancos de regulación (Regulon Anr). Los resultados en conjunto muestran la importancia de Anr sobre la fisiología de P.extremaustralis.

Descripción: El género Xanthomonas está constituido por al menos 20 especies de bacteriasfitopatógenas que afectan a unas 350 especies vegetales, la mayoría de ellas de graninterés económico. X. citri subsp. citri (Xcc) es el agente causante de la cancrosis de loscítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. En esta tesis se buscó comprenderlos distintos aspectos relacionados con las distintas estrategias que posee Xcc paracolonizar el tejido vegetal y favorecer así el proceso de patogénesis. Ejemplos de estasestrategias son la producción de exopolisacáridos, enzimas extracelulares y toxinas. Como objetivo general se planteó el estudio de algunas proteínas implicadas en laregulación a nivel transcripcional de los genes que codifican factores de virulencia en Xanthomonas spp., sobre todo aquellos relacionados en la formación de biofilm. Asimismo, se estudió la producción del glucano cíclico β-(1,2), uno de los factores másimportantes para el desarrollo de la enfermedad. En la primera sección de esta tesis se abordó la síntesis del glucano cíclico β-(1,2),principalmente en Xcc, comprobándose la implicancia de dos proteínas en esteproceso: HrpM y NdvB protein. Además, se analizó la implicancia de esta molécula enla patogenicidad de la bacteria en plantas de cítricos. En la segunda sección de la tesis se examinó el efecto que ejerce un reguladortranscripcional de la familia NtrC sobre la virulencia de Xcc. En particular, se analizócómo este regulador afecta la síntesis de los genes flagelares y su facultad dedesarrollar biofilm, estableciendo un vínculo entre la actividad de éste y el segundomensajero di-GMP cíclico. Finalmente, se realizó un análisis del efecto del gen hupB de Xcc, con alta identidad desecuencia a una subunidad de la histona HU, sobre la producción de los factores devirulencia. La mutante de pérdida de función de este gen presentó una severadisminución de la síntesis del flagelo, traduciéndose en la ausencia del mismo, lareducción significativa de su movilidad y su capacidad de formar biofilm. Dichamutante mostró menor capacidad infectiva que podría asociarse a la ausencia delflagelo conjuntamente con otras alteraciones fenotípicas observadas. Los resultados de esta tesis aportan nuevos participantes en la compleja red de regulación de la producción de factores de virulencia.

Descripción: Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) y Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) son los agentes causales de la pudrición negra en crucíferas y de la cancrosis de los cítricos, respectivamente. En ambas bacterias la producción de diversos factores de virulencia está regulada por un grupo de genes denominados rpf (por regulation of pathogenicity factors) a través de la síntesis y percepción de moléculas difusibles que ellas mismas producen y que se denominan DSF (diffusible signal factor). RpfF y RpfB son responsables de la biosíntesis de DSF y RpfC y RpfG están involucrados en su detección y posterior transducción de la señal al interior de la bacteria. Mutaciones en los genes rpfF y rpfC producen una reducción en la producción de enzimas y polisacáridos extracelulares, formación de biofilm y patogenicidad cuando son comparadas con las respectivas cepas silvestres, lo que involucra a estos genes en la regulación de factores involucrados en todos éstos procesos. Entre éstos, hemos detectado un nuevo factor que es secretado por Xcc, que tiene la propiedad de revertir el cierre de estomas inducido por ácido Absísico (ABA), Lipopolisacárido (LPS) o bacterias. Las mutantes rprF y rpfC no pueden revertir el cierre de estomas, demostrando que la síntesis de este factor es también regulada por el sistema rpf/DSF.

Descripción: Rhizobium leguminosarum sintetiza un polisacárido acídico secretado mayormente al medio extracelular (EPS) y parcialmente retenido en la superficie bacteriana como polisacárido capsular (CPS). Las proteínas Rap son sustratos del sistema de secreción tipo I PrsDE (SSTI) que comparten al menos un dominio Ra/CHDL (cadherina-like). Se ha demostrado que algunos de estos sustratos están involucrados en el desarrollo de la matriz del biofilm ya sea por clivaje del polisacárido que emerge de la superficie de la célula (las glicanasas Ply) o alterando las propiedades adhesivas de la bacteria (proteínas RapA). En esta tesis se demuestra que una nueva proteína Rap (RapD) se libera completamente al medio extracelular co-secretada con otras proteínas Rap de manera PrsDE dependiente. Más aún, en biofilms se encontraron niveles extracelulares incrementados de RapD en condiciones de cultivo que favorecen la producción de EPS. No se observaron fenotipos evidentes asociados a las propiedades adhesivas o formación de biofilms en la mutante deficiente en rapD. Sin embargo, por cromatografía de exclusión molecular del EPS producido por la cepa silvestre (wild type) de R. leguminosarum bv viciae 3841, las mutantes isogénicas simples rapA2 y rapD y la doble mutante rapA2rapD, se demostró que ambas proteínas Rap tienen un rol en la regulación del tamaño de las cadenas del EPS que se libera al medio extracelular. Los estudios biofísicos indicaron que el calcio gatilla cambios conformacionales en la proteína RapD hacia una estructura dominada por láminas β, como ocurre en las cadherinas. Más aún, la presencia de calcio induce la multimerización de RapD mientras que el agregado de EPS indujo cambios conformacionales adicionales en la proteína. Estudios de ELISA y BIA (binding inhibition assay) indicaron que RapD se une específicamente al EPS y que la galactosa estaría involucrada en esa interacción. Estas observaciones indican que RapD es una proteína lectina que interacciona con calcio y que es capaz de establecer multímeros y modificar las propiedades del EPS, el principal componente estructural de la matriz del biofilm del rizobio.

Descripción: El avance de la industrialización, junto con el consumo de productos procesados puede provocar la contaminación de recursos naturales como los cursos de agua. Constatar su calidad requiere de técnicas analíticas que en su mayoría son costosas. Por ello, una alternativa es el desarrollo de nuevos dispositivos económicos, de fácil uso y transportables a campo. Asimismo, estudios previos mostraron que Pseudomonas veronii 2E (actualmente reclasificada como Pseudomonas extremaustralis 2E-UNGS, microorganismo autóctono aislado del Río Reconquista, AMBA, Argentina), es capaz de formar biopelículas sobre diversas superficies, biosorber metales de relevancia ambiental como Cd(II) y Cu(II) y, además, biotransformar Cr(VI). A partir de estas características el objetivo del presente trabajo fue estudiar la aplicabilidad de este microorganismo, inmovilizado por distintas estrategias, para la detección de metales de relevancia ambiental utilizando técnicas electroquímicas. Primeramente, se evaluó la formación de biopelículas desarrolladas sobre diferentes perfiles de superficies conductoras como barras de grafito comerciales y barras de soldadura, cuantificando a través de la tinción con Cristal Violeta y estudiando el comportamiento electroquímico por Voltamperometría Cíclica (VC). Encontrando los mejores resultados para las barras de soldadura. Aprovechando las propiedades biosortivas de este microorganismo se desarrolló un sistema para la detección de Cd(II) y Cu(II) inmovilizando a la bacteria en Electrodos de Pasta de Carbono modificados. Se obtuvieron los mejores resultados con una mezcla de biomasa/aceite/grafito (10-30-60 % respectivamente), caracterizando la respuesta electroquímica por VC y Espectroscopía de Impedancia Electroquímica. Luego de exponer 5 minutos a soluciones de Cd(II) a pH 7,5; 32°C y Cu(II) a pH 5,5 a temperatura ambiente, se evaluó la presencia del metal retenido por Voltamperometría de Onda Cuadrada, preconcentrando a -1,2 V durante 60 segundos en NaNO3 0,1 M y HNO3 0,003 M para Cd(II) y Cu(II) respectivamente. Además, se reutilizó la superficie de los electrodos exponiéndolos a MES 0,5 M, pH 5,5 durante 5 minutos para el Cd(II) y a HNO3 1,5 M durante 30 segundos para el Cu(II). Se evaluó para ambos casos la respuesta electroquímica para soluciones de Cd(II) entre 1 – 25 μM y de Cu(II) soluciones 1 – 50 μM, encontrando en ambos casos una región lineal. Por otro lado, aprovechando la biotransformación de Cr(VI) se evaluó la respuesta electroquímica por VC en presencia de éste para el microorganismo inmovilizado por secado en Papel Toray y en alginato de calcio sobre Papel Toray o Fieltro de Carbono. Como mediadores redox se estudiaron p-benzoquinona y un polímero lineal de naftoquinonas (NQ-LPEI). Se evaluaron las respuestas electroquímicas ante concentraciones de Cr(VI) en el rango 1 – 50 mg L-1, encontrando un mejor desempeño para el sistema de Fieltro de Carbono–alginato de calcio con NQ-LPEI como mediador, el cual se utilizó en el armado de una Celda de Combustible Microbiana. Esta posibilitó, simultáneamente, detectar Cr(VI) y producir corriente. Las interacciones de este microorganismo con metales permitieron el desarrollo de biosensores para su potencial aplicación en matrices ambientales.