Descripción: La catepsina-L (CTSL) es una proteasa lisosomal de expresión ubicua que presenta funciones diversas y específicas. Entre ellas, participa en la selección positiva de las células T CD4+ y en la homeostasis de las células T. Utilizando como modelo experimental ratones CTSLnkt/nkt, portadores de una deleción en el gen que codifica para la CTSL, estudiamos la influencia de la CTSL sobre la homeostasis de las células B. Observamos un incremento en el número de células B en los ganglios linfáticos (GL), el bazo y la sangre periférica (SP) de los ratones CTSLnkt/nkt. En el bazo, este incremento estuvo restringido a las células B transicionales T1 y T2 y a las células B de la zona marginal (ZM). No se detectaron alteraciones en los niveles de proliferación y apoptosis basales de las células B periféricas en los ratones CTSLnkt/nkt. La frecuencia y el número de células B en los distintos estadios de maduración de la médula ósea (MO) en los ratones CTSLnkt/nkt resultó normal. Sin embargo, experimentos in vitro e in vivo demostraron que la linfopoyesis B se encuentra incrementada en los ratones CTSLnkt/nkt. Tanto los precursores de las células B como el microambiente de la MO de los ratones CTSLnkt/nkt contribuyen a dicho incremento. Además la emigración de células B de la MO hacia el bazo se encuentra incrementada en los ratones CTSLnkt/nkt. El conjunto de estos resultados indica que la CTSL regula negativamente la producción y exportación de los linfocitos B por la MO y el número de células B periféricas.

Descripción: La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) es la enfermedad parasitaria de mayor impacto en América Latina y un problema de salud creciente en países no endémicos debido alos flujos migratorios. Una gran limitación para evaluar la eficacia el tratamiento conbenznidazol es la falta de pruebas diagnósticas que muestren a corto plazo los efectos deltratamiento. Los ensayos de serología convencional requieren un largo tiempo de seguimientopara observar la negativización completa, algo que ocurre en alrededor de un 30% de lospacientes tratados. Se desconoce si los anticuerpos que se detectan en la circulación de los pacientes con infección crónica provienen de células B vírgenes o linfocitos B de memoria que se diferencian continuamente a plasmablastos ante la persistencia del parásito o de linfocitos de larga vida que pueden persistir aún en ausencia del antígeno que le dieron origen. La presencia de linfocitos B de larga vida alojados en médula ósea o ganglios linfáticos podría enmascarar la desaparición de plasmablastos dependientes de la presencia de antígeno luego del tratamiento específico. En este trabajo nos propusimos medir los niveles de linfocitos B secretores de anticuerpos y células B de memoria específicas para T. cruzi y totales en la circulación de pacientes adultos y pediátricos con enfermedad de Chagas crónica mediante el ensayo de ELISPOT previamente a recibir el tratamiento con benznidazol y a distintos tiempos postratamiento. Los cambios en las poblaciones de linfocitos B se correlacionaron con la evolución serológica de los pacientes medida por técnicas de serología convencional y no convencionales. Mediante un método de tinción por citometría de flujo que utiliza proteínas recombinantes de T. cruzi marcadas con fluorocromos como "cebos", analizamos el fenotipo de las células B específicas para T. cruzi. Finalmente, se evaluó la capacidad funcional de las diferentes subpoblaciones de linfocitos B totales en la circulación de pacientes con distinto grado de disfunción cardíaca. La mayoría de los individuos infectados con T. cruzi presentaron CSAs (plasmablastos) específicos para un lisado de T. cruzi en su circulación, y estas células desaparecieron luego del tratamiento con benznidazol sólo en aquellos pacientes que mostraron una disminución de los niveles de anticuerpos indicativos de eficacia (ya sea negativización completa de la serología o caída significativa de títulos), pero no en aquellos pacientes con títulos serológicos inalterados. Con respecto a los niveles de células B de memoria, estos fueron bajos, ya sea antes, así como después del tratamiento. La disminución en los niveles de células secretoras de anticuerpos específicos para T. cruzi se correlación con la disminución en los niveles de anticuerpos medidos por el ensayo de multiplex y precedió la disminución de anticuerpos medidos por serología convencional. Las células B específicas para las proteínas recombinantes de T. cruzi se componen principalmente de células de memoria atípicas, células vírgenes en reposo y plasmablastos. Del análisis del fenotipo B total observamos una distribución anormal de células B en individuos con enfermedad crónica, particularmente un aumento en la frecuencia de células B de memoria atípicas y plasmablastos tanto en adultos como en niños infectados con T. cruzi. El tratamiento con benznidazol logró restaurar un fenotipo similar al observado en personas no infectadas. En el análisis funcional observamos que existe una disfunción en la producción de citocinas inflamatorias en los pacientes con compromiso cardíaco avanzado Particularmente pudimos ver que, luego de la estimulación policlonal, las células B de memoria atípica presentan poca capacidad para secretar IL-6 y TNF-α, mientras que observamos que la mayor producción de citocinas se da por parte de células B vírgenes activadas y células B CD27+CD21+HLADR+ que probablemente corresponda a un fenotipo de memoria previo a la activación y perdida de la molécula CD21. Estos hallazgos en conjunto muestran la viabilidad de detectar células B específicas para T. cruzi en la fase crónica de la enfermedad de Chagas. La lenta caída en los niveles de anticuerpos específicos para el parásito luego del tratamiento puede deberse a la presencia de linfocitos B de larga vida confirmando la hipótesis de esta tesis. La infección crónica también induciría alteraciones en la diferenciación y función de células B. El seguimiento de CSAs específicas para el parásito serviría como una herramienta útil para determinar la eficacia de tratamiento en protocolos de ensayos clínicos [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].

Descripción: El curso clínico de la enfermedad de Chagas crónica (EChC) depende tanto de la respuesta inmune generada por el huésped como de la capacidad de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) para evadirla. El desarrollo de una potente respuesta inflamatoria es nece sario para la eliminación del parásito, pero a su vez contribuye al daño tisular. Así, los mecanismos reguladores de la inmunidad constituyen elementos claves para contener esta respuesta exacerbada y su estudio es fundamental para entender los factores involucrados en la inmunopatología. La función regulatoria de las células B (Bregs), a través de la secreción de citoquinas anti-inflamatorias, principalmente IL-10 (B10), ha sido de interés en el estudio de enfermedades infecciosas y autoinmunes en humano, siendo las poblaciones CD24highCD38high (transicionales) y CD24highCD27+ (memoria), las más enriquecidas en IL-10 en san gre periférica. En el contexto de la EChC, se sabe que T. cruzi modifica la distribución fenotípica de las células B de sangre perifé rica, sin embargo, la población de células B10 continúa siendo poco estudiada. En la presente Tesis se evaluó la frecuencia y la distribución fenotípica, en base a los marcadores CD24, CD27 y CD38, de las células B y en particular de las células B10 de sangre periférica en pacientes con distintas formas clínicas de la EChC, en condiciones ex vivo y frente al estímulo in vitro. Asimismo, se estudió la expresión de la molécula regulatoria PD-L1 en las células B estimuladas in vitro. Para ello, las células mononucleares de sangre periférica (CMN) de pacientes con EChC (con o sin cardiopatía) e individuos no infectados (NI-contro les) se incubaron con PMA+Ionomicina junto con Brefeldina A (PIB) durante 5 hs (condición ex vivo) ó las células B aisladas se estimularon con lisado de T. cruzi, CpG+CD40L o CpG+CD40L+T. cruzi durante 48 hs y las últimas 5 hs junto con PIB, y se marca ron para su análisis por citometría de flujo. Los resultados ex vivo mostraron que los pacientes con cardiopatía presentaron una expansión de las células B transicionales, así como una distribución fenotípica diferencial de las células B10, en particular un incremento de las células B10 vírgenes y B10 CD24-CD27-. La frecuencia de células B10 totales y la expresión de IL-10 en las mismas fueron similares entre los grupos, evidenciando que estas células en los pacientes infectados con T. cruzi mantienen la capacidad para producir IL-10. Adicionalmente, la distribución fenotípica de las células B10 ex vivo fue similar en pacientes sin alteraciones cardíacas e individuos NI. In vitro, el estímulo con T. cruzi indujo una disminución de las células B transicionales en los pacientes con EChC, así como un aumento de las células B10 y de la secreción de IL-10 en todos los grupos, siendo menos pronunciado en los pacientes con compromiso cardíaco. La distribución fenotípica de las células B10 mostró una disminución de las B10 transicionales en los pacientes sin cardiopatía y un aumento de las B10 CD24-CD27- y CD27-CD38+ en los pacientes con la forma cardíaca. Estos resultados sugieren que la estimulación con T. cruzi induce un aumento de tipo innato de células B10, que en los pacientes con cardiopatía estaría asociado con el incremento de poblaciones B10 CD27-, mientras que en los pacientes sin alteraciones y en los NI, estaría dado por poblaciones fenotípicas diferentes a las analizadas en este trabajo. A su vez, las células B de los pacientes con cardiopatía evidenciaron una menor diferenciación a células B10 frente al estímulo con CpG+CD40L. Por otra parte, los pacientes con EChC mostraron un aumento de células B PD-L1+ frente al estímulo con T. cruzi y una menor expre sión de esta molécula regulatoria en las células estimuladas de forma inespecífica. Estos hallazgos muestran una relación entre las alteraciones fenotípicas en las células B10 y las distintas formas clínicas de la EChC, sugiriendo la potencial contribución de estas células en el curso clínico de la infección crónica con T. cruzi.

Descripción: Las células leucémicas de pacientes con Leucemia Linfocítica Crónica de células B (LLC) proliferan en los órganos linfoides, donde la quimiocina CXCL12 proveniente de células estromales y de células de tipo nodriza (NLC), y moléculas como CD40L e IFNγ producidas por linfocitos T CD4+ activados, favorecen su expansión y sobrevida. Existen numerosos estudios donde se evalúa el efecto del CXCL12 sobre el clon leucémico, pero no había sido estudiado hasta el momento el impacto de dicha quimiocina en la fisiología de los linfocitos T de pacientes con LLC. Los resultados presentados en este trabajo demuestran que el CXCL12 induce la migración de linfocitos T de pacientes LLC, aunque en menor medida que la de linfocitos T de dadores sanos, hecho que se correlaciona con una menor polimerización de actina en respuesta al CXCL12. Además, observamos que los linfocitos T de pacientes de buen pronóstico migran menos en respuesta al CXCL12 en comparación a linfocitos T de pacientes de mal pronóstico debido a señales provenientes del clon leucémico. También demostramos que el CXCL12 actúa como un factor coestimulante de linfocitos T CD4+ de pacientes LLC, incrementando su activación y proliferación, y que los linfocitos T activados en presencia de CXCL12 inducen una mayor proliferación del clon leucémico. Por último, demostramos que las NLC contactan con linfocitos T CD4+ y aumentan su activación y proliferación, en parte, a través del receptor para CXCL12, el CXCR4. Como conclusión, nuestros resultados demuestran que el CXCL12 tiene un rol dual sobre los linfocitos T de pacientes LLC, induciendo la migración y también aumentando su activación y proliferación, favoreciendo en última instancia la expansión del clon leucémico. Considerando que la presencia de los linfocitos T en los órganos linfoides favorece que las células leucémicas sobrevivan y proliferen, la menor migración al CXCL12 de los linfocitos T de pacientes de buen pronóstico podría estar involucrada en el curso clínico indolente característico de esos pacientes.

Descripción: La infección de ratones con el Virus de la Fiebre Aftosa (VFA) induce una respuesta de anticuerpos neutralizantes en forma timo-independiente (TI), que rápidamente elimina al virus del organismo. Por el contrario, la vacunación con el virus inactivado induce una típica respuesta timo-dependiente (TD). En este trabajo de tesis se demuestra que las células dendríticas (CDs) murinas son susceptibles a la infección con el VFA in vitro. Sin embargo, la replicación viral en ellas es abortiva. En células infectadas, la expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II y CD40 decrece, mientras que la expresión de la molécula CD11b aumenta. Junto con estas alteraciones en el fenotipo, las células infectadas presentan modificaciones en su morfología y en su funcionalidad que, en conjunto, son indicativas de la adquisición de un fenotipo macrofágico. Asimismo, las CDs infectadas son incapaces de estimular la proliferación de linfocitos T in vitro y de inducir una respuesta de anticuerpos secundaria in vivo. La infección de las CDs induce en ellas la secreción de IL-6 y además induce la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y de IL-10 en los co-cultivos CDs y esplenocitos. Estas mismas citoquinas son detectadas en los bazos de ratones infectados con el VFA, pero no en los bazos de ratones vacunados. El pico de la secreción de IFN-γ y de IL- 10 se produce en forma simultánea con la supresión de la proliferación inducida por Concanavalina-A de los linfocitos T obtenidos de los bazos de ratones infectados. A pesar de suprimir las TD durante la infección temprana con el VFA, las CDs infectadas estimulan eficientemente a los linfocitos B del bazo, quienes producen anticuerpos TI contra el virus en forma rápida. La secreción de estos anticuerpos es dependiente de la presencia de las citoquinas IL-6 e IL-10. Por el contrario, los linfocitos B de los ganglios linfáticos son incapaces de responder a la estimulación con las CDs infectadas. Los linfocitos B CD9+ localizados en el bazo son los principales productores de los anticuerpos TI contra el VFA y de la secreción de IL-10. En efecto, la esplenectomía de los 2 ratones produce un cambio en el tipo de respuesta, la cual se vuelve TD. La eliminación funcional de los linfocitos B de la zona marginal inhibe significativamente la secreción de anticuerpos luego de la infección con el VFA, indicando que esta población de linfocitos B cumple un importante papel en la respuesta temprana contra este virus. Contrariamente a lo observado con las CDs infectadas, las CDs que internalizaron al VFA inactivado estimulan linfocitos B con menor eficiencia y no inducen la secreción de IL-10 por los mismos. En conjunto, estos resultados indican que luego de la infección con el VFA, las CDs adquieren un perfil funcional que les permite la eficiente estimulación de los linfocitos B, mientras que la capacidad de estas células para estimular a los linfocitos T se encuentra inhibida. Por lo tanto, durante la respuesta inmune temprana contra el VFA, se produce una supresión selectiva del compartimiento del sistema inmune involucrado en las respuestas TD, mientras que el compartimiento involucrado en la producción de anticuerpos TI protectores es eficientemente estimulado.